Báo Cáo Nckh Năm 2023 (Hoàn Chỉnh).Docx

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1021.35 KB, 79 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH

ĐỒNG THỜI NHIỀU CORTICOID TRONG MỸPHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO NĂM 2023

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: Ds.CKI Lê Văn Bẩy

Cộng sự: Ds.CKII Trần Thành Trung Ds.CKI Trần Xuân ThuỷDs.CKI Hồng Văn Bảo

Ths.CNTP Nguyễn Thị Thanh HươngDs. Trần Thanh Liêm

Kiên Giang, năm 2023

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

TRUNG TÂM KIỂM NGHIỆM THUỐC, MỸ PHẨM, THỰC PHẨM

BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

XÂY DỰNG QUY TRÌNH

PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI NHIỀU CORTICOIDTRONG MỸ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC

KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO NĂM 2023

TRUNG TÂM KIỂM NGHIỆM THUỐC, MỸ PHẨM, THỰC PHẨM

Ds.CKI Lê Văn BẩySỞ Y TẾ

Kiên Giang, tháng 5 năm 2023

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

1.1.1 Nguồn gốc của Corticoid ...3

1.1.2 Tác dụng sinh lý của Corticoid ...3

1.1.3 Chỉ định của Corticoid ...3

1.1.4 Tác dụng phụ của Corticoid ...4

1.1.5 Tính chất lý hóa của các Corticoid trong nghiên cứu...4

1.2Thực trạng sử dụng và chất lượng mỹ phẩm...8

1.2.1 Thực trạng sử dụng Mỹ phẩm hiện nay tại Việt Nam...8

1.2.2 Tình trạng trộn Corticoid vào mỹ phẩm tại Việt Nam...11

1.3Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (HPLC)...12

1.3.1 Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký lỏng [3]...13

1.3.2 Một số đại lượng đặc trưng của sắc ký lỏng [2][3]...16

1.4.1 Nghiên cứu phân tích định tính và định lượng...20

1.4.2 Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu...21

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...23

2.1. Đối tượng nghiên cứu...24

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

2.1.1 Đối tương nghiên cứu :...23

2.1.2 Thời gian nghiên cứu:...23

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu:...23

2.1.4 Cách chọn mẫu nghiên cứu:...23

2.1.5 Cỡ mẫu trong nghiên cứu:...23

2.2Phương pháp nghiên cứu...24

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu:...23

2.2.2 Nội dung nghiên cứu:...24

2.2.3 Phương pháp tiến hành nghiên cứu:...24

3.2.2.6. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)...56

3.3. Áp dụng phương pháp phân tích trên một số mẫu mỹ phẩm...58

3.4... Đánh giá hiệu quả của phương pháp xây dựng được với các phương phápthường quy đang áp dụng...60

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN...61

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC Association of Official

Analytical Chemist Hội phân tích hóa họcASEAN Association of South East

Asian Nations

Hiệp hội các Quốc gia Đông Nam Á

CE Capillary Electrophoresis Điện di mao quản

GC–MS Gas chromatography - Mass

HPLC High performance liquid

Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao

International Council for Harmonisation of Technical Requirements for

Pharmaceuticals for Human Use (ICH)

Hội đồng quốc tế về hài hòa các yêu cầu kỹ thuật đối với dược phẩm dùng cho người

LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiệnLOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đốiUV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại và khả kiến

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1.1: Tính chất lý hóa của các Corticoid trong nghiên cứu...4

Bảng 1.2: Tần xuất sử dụng dịch vụ chăm sóc sắc đẹp ở phụ nữ...9

Bảng 1.3: So sánh các điều kiện sắc ký tối ưu trong các qui trình nghiên cứu...21

Bảng 1.4: So sánh quy trình xử lý mẫu giữa các tài liệu nghiên cứu...21

Bảng 3.1: Bảng 3.1. Bảng Gradient pha động...30

Bảng 3.2: Bảng kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống sắc ký (n = 6)...31

Bảng 3.3. Thứ tự rửa giải và thời gian lưu của 6 Coticoid cần phân tích...51

Bảng 3.4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Prednison...52

Bảng 3.5. Bảng test các giá trị tuyến tính của Prednison...58

Bảng 3.6. Bảng phân tích tuyến tính của Prednison ...58

Bảng 3.8. Bảng test các giá trị tuyến tính của Prednisolon ...37

Bảng 3.9. Bảng phân tích tuyến tính của Prednisolon ...38

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Triamcinolon...38

Bảng 3.11. Bảng test các giá trị tuyến tính của Tramcinolon ...39

Bảng 3.12. Bảng phân tích tuyến tính của Tramcinolon...39

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Dexamethason...40

Bảng 3.14. Bảng test các giá trị tuyến tính của Dexamethason ...40

Bảng 3.15. Bảng phân tích tuyến tính của Dexamethason...41

Bảng 3.16: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Clobethason...41

Bảng 3.17. Bảng test các giá trị tuyến tính của Clobethason ...42

Bảng 3.18. Bảng phân tích tuyến tính của Clobethason...42

Bảng 3.19: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Betamethason...43

Bảng 3.20. Bảng test các giá trị tuyến tính của Betamethason ...43

Bảng 3.21. Bảng phân tích tuyến tính của Betamethason...44

Bảng 3.22. Phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan giữa diện tích pic vànồng độ các Corticoid trong nghiên cứu...44

Bảng 3.23. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp của Prednison...45

Bảng 3.24. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp của Prednisolon...46

Bảng 3.25. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp của Triamcinolon...46

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

Bảng 3.26. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp của Dexamethason...47

Bảng 3.27. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp của Clobethason...48

Bảng 3.28. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp của Betamethason...48

Bảng 3.29. Bảng tổng hợp kết quả khảo sát độ thu hồi...49

Bảng 3.30. Lượng cân chất chuẩn cho thử nghiệm độ lặp lại...50

Bảng 3.31. Diện tích pic của các corticoid thu được sau các lần thử nghiệm...51

Bảng 3.32. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp...51

Bảng 3.33. Lượng cân chất chuẩn cho thử nghiệm của kiểm nghiệm viên 1...52

Bảng 3.34. Diện tích pic của các corticoid thu được sau các lần thử nghiệm của kiểmnghiệm viên 1...52

Bảng 3.35. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp của kiểm nghiệm viên 1...52

Bảng 3.36. Lượng cân chất chuẩn cho thử nghiệm của kiểm nghiệm viên 2...53

Bảng 3.37. Diện tích pic của các corticoid thu được sau các lần thử nghiệm của kiểmnghiệm viên 2...53

Bảng 3.38. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp của kiểm nghiệm viên 2...53

Bảng 3.39. Lượng cân chất chuẩn cho thử nghiệm của kiểm nghiệm viên 3...54

Bảng 3.40. Diện tích pic của các corticoid thu được sau các lần thử nghiệm của kiểm nghiệm viên 3...54

Bảng 3.41. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp. của kiểm nghiệm viên 3....54

Bảng 3.42: Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp...55

Bảng 3.43: Kết quả giá trị LOD và LOQ của các corticoid trong nghiên cứu...57

Bảng 3.44. Kết quả kiểm tra các mẫu mỹ phẩm...58

Bảng 3.45. Bảng đánh giá hiệu quả của phương pháp phân tích...60

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1.1. Một số loại cột sắc ký thường dùng trong phân tích...13

Hình 1.2. Các loại dung mơi dùng làm pha động trong sắc ký...14

Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC...15

Hình 1.4. Hệ thống HPLC Chromaster 5430 dùng trong nghiên cứu...15

Hình 1.5. Cấu tạo detector mảng diod (DAD)...19

Hình 3.1. Sắc ký đồ sáu lần tiêm của mẫu hỗn hợp chuẩn...31

Hình 3.2. Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu...34

Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát tuyến tính của các corticoid...35

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ củaPrednison...36

Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ củaPrednisolon...37

Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ củaTriamcinolon...39

Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ củaDexamethason...41

Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ củaClobethason...42

Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ củaBetamethason...43

Hình 3.10. Sắc ký đồ đánh giá độ đúng của phương pháp...45

Hình 3.11. Sắc ký đồ sáu lần tiêm của 6 mẫu trắng thêm chuẩn...50

Hình 3.12. Sắc ký đồ của mẫu có chứa Triamcinolon acetonid...59

Hình 3.13. Sắc ký đồ của mẫu có chứa Betamethason dipropiat...60

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, mỹ phẩm đang được ưa chuộng và sử dụng ngày càng rộng rãi, đa dạngcác sản phẩm khác nhau như: dầu gội, sữa tắm, kem chống nắng, kem trắng da, kem trịmụn, nám, nước hoa… nó trở thành vật dụng không thể thiếu của mỗi người kể cả namvà nữ, người già và trẻ nhỏ. Lợi dụng điều này, một số nhà sản xuất, cơ sở chăm sóc sắcđẹp (Spa) và cơ sở kinh doanh mỹ phẩm nhằm tạo lợi thế cạnh tranh không lành mạnhcho sản phẩm Mỹ phẩm của mình bằng cách trộn trái phép (khơng cơng bố) thuốc tândược vào các sản phẩm của mình, gây ra nguy cơ tổn hại lớn về kinh tế cũng như sứckhoẻ của cộng đồng.

Theo “Hiệp định hoà hơp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm” và Thông tư số06/2011/TT-BYT ngày 25 tháng 11 năm 2011 của Bộ Y tế về quản lý mỹ phẩm,Corticoid là một trong các nhóm chất bị cấm sử dụng trong Mỹ phẩm. Nhóm chất này cónhiều tác dụng phụ khi dùng tại chỗ như: teo da, xơ cứng bì, viêm da ửng đỏ, mụn trứngcá hoặc bội nhiễm nấm, vi khuẩn và virus, chậm liền sẹo, đục thuỷ tinh thể hoặc tăngnhãn áp [1], [2], [3], [5].

Tuy nhiên, do Corticoid có tác dụng chống viêm rất tốt, giữ nước làm cho da sángmịn [1], [2], [5], nên dễ bị lợi dụng cho các sản phẩm mỹ phẩm bôi da để chống viêm, trịnám, mụn, làm trắng… nhằm đánh lừa người sử dụng với hiệu quả điều trị rất tốt tronggiai đoạn ban đầu, nhưng sau đó đã để lại hậu quả nghiêm trọng cho người dùng. Khi sửdụng các loại Mỹ phẩm này lâu dài dẫn đến những tác dụng phụ nặng nề trên da, thậmchí một số trường hợp còn gây tổn thương đến thận, xương, dạ dày, … tạo ra những gánhnặng to lớn cho người sử dụng và ngành y tế.

Corticoid bao gồm nhiều chất khác nhau như: dexamethason, betamethason,prednisolon, cortison, clobetasol, triamcinolon, nếu kiểm tra riêng từng thành phần sẽ tốnrất nhiều hoá chất phân tích đồng thời mất rất nhiều thời gian và cơng sức. Thêm vào đó,cho đến nay Dược điển Việt Nam V, Dược điển Anh (BP 2020), Dược điển Mỹ(USP43) ...vẫn chưa có qui trình định lượng đồng thời các corticoid này. Măt khác việckiểm tra, giám sát chất lượng thuốc, mỹ phẩm hiện nay địi hỏi phải có những phương

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

pháp phân tích hiện đại với độ tin cậy, độ nhạy và độ đặc hiệu cao đồng thời phải nhanhvà chính xác, đáp ứng được yêu cầu rà soát trên số lượng mẫu lớn là rất cần thiết.

Với yêu cầu thực tế hiện nay, việc kiểm soát các corticoid trong mỹ phẩm là rất

cần thiết. Từ đó chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Xây dựng quy trình phân tíchđồng thời nhiều corticoid trong Mỹ phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năngcao năm 2023”.

Mục tiêu nghiên cứu:

1. Xây dựng và chuẩn hóa quy trình phân tích đồng thời nhiều Corticoid trong mỹphẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao tại Trung tâm Kiểm nghiệmthuốc,mỹ phẩm,thực phẩm năm 2023.

2. Ứng dụng quy trình phân tích đồng thời nhiều Corticoid trong mỹ phẩm bằngphương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để đánh giá thực trạng Corticoid có trong mộtsố mỹ phẩm trên thị trường Kiên Giang.

CHƯƠNG 1

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về Corticoid (GC) [1][2][3][5][6][7].

1.1.1. Nguồn gốc của Corticoid

Corticoid (GC) có nguồn gốc thiên nhiên gồm hai chất chính: hydrocortison(cortisol) và cortison.

Corticoid bán tổng hợp: sự thay đổi nhóm thế trên phân tử hydrocortison làm thayđổi cường độ các hoạt tính của hợp chất thiên nhiên này, với mục đích có được tác độngGC mạnh, ít hoặc khơng có tác động giữ muối và nước.

1.1.2. Tác dụng sinh lý của Corticoid

Tác dụng kháng viêm và ức chế miễn dịch: GC chống lại các biểu hiện của quátrình viêm dù do bất kỳ nguyên nhân gì (cơ học, hóa học, nhiễm khuẩn, tia xạ, miễn dịch,…)

Tác dụng chuyển hóa glucid, protein, lipid: GC làm tăng đường huyết lúc đói đểđảm bảo cung cấp glucose cho các mô phụ thuộc glucose như não và tim,…làm tăngthối hóa và tổng hợp triglycerid nhưng q trình sau chiếm ưu thế hơn nên làm tăng dựtrữ mỡ, có sự tái phân phối mỡ khơng đồng đều: mỡ tích tụ ở xương đòn, sau cổ và mặtnhưng lại mất mỡ ở chi.

Tác dụng trên chất điện giải và cân bằng nước: GC liều cao gây giữ muối, nước vàthải trừ K+ nên có thể dẫn đến phù và nhược cơ, ngăn hấp thu calci ở ruột và tăng đào thảiqua thận nên giảm dự trữ calci trong cơ thể.

Tác dụng khác: kých thích thần kinh, tăng tiết dịch vị và pepsin, giảm tiết chất nhầy,giảm tổng hợp prostaglandin, gây ra tăng huyết áp thường xảy ra khi dùng liều cao.

1.1.3. Chỉ định của Corticoid

Các bệnh về khớp: viêm khớp gout cấp, viêm khớp do thấp khớp, viêm xươngkhớp.

Thiểu năng thượng thận tiên phát hoặc thứ phát.

Bệnh thận: viêm cầu thận, hội chứng thận nhiễm mỡ. Rối loạn collagen: viêm da,động mạch kết hòn.

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Bệnh dị ứng: mề đay, viêm mũi dị ứng, các dạng ban da,…

Bệnh về hô hấp: hen phế quản, viêm phổi do hút nước hoặc dị vật, triệu chứng ứcchế hô hấp ở trẻ sơ sinh.

Bệnh ung thư: u lympho bào, bệnh bạch cầu.

Bệnh gan: viêm gan mãn tiến triển, viêm gan do rượu.

Các bệnh khác: sốc do nhiễm khuẩn, tăng calci máu, ghép cơ quan,… Liều dùngcủa Corticoid : dao động rộng từ 0,5 – 20 mg/lần tùy theo loại thuốc và mục đích điềutrị.

Rối loạn dịch và chất điện giải: tăng cân do giữ muối, nước và thải trừ ion K+.Ức chế sự phát triển chiều cao của trẻ em.

Bệnh Cushing.Loét dạ dày tá tràng.

1.1.5. Tính chất lý hóa của các Corticoid trong nghiên cứu

Bảng 1.1: Tính chất lý hóa của các Corticoid trong nghiên cứu

Corticoid Công thứcphân tử

Khốilượngphân tử

a1,4-diene-C21H26O5 358,43 Dạng tinh thểhoặc bột mịnmàu trắng,khơng mùi vàcó vị hơi đắng.Độ tan: Tan

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

3,11,20- trion

trong ethanol,metanol,

axeton. Tantrong nước tạodung dịch cótính axit yếu.

Độ hòa tantrong nước:0,1mg/mL ở25°C

Quang phổ: Cócực đại hấp thụở 243nm khihịa tan trongethanol.

Tính ổn định:Ổn định trongmôi trườngaxit và trungtính. Khơng ổnđịnh trong môitrường Kiềmvà dễ bị oxyhóa.

C21H28O5 360,44, Bột kết tinhmàu trắnghoặc gần nhưtrắng.

Độ tan: Tantrong ethanol96%, metanol,axeton. Tantrong nước tạodung dịch cótính axit yếu.Độ hịa tan:0,1 mg/mLtrong nước ở25°C

pKa: 12,7 ở25°C

Quang phổ:Dung dịchprednisolone

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

trong ethanolcó cực đại hấpthụ ở bướcsóng 237 - 242nm.

Ổn định trongmôi trườngđiều kiện axitnhẹ và trungtính. Bị phânhủy nhanh

trường Kiềm.Không ổn địnhkhi ánh sáng.

Dexamethason acetat

9fluoro11β 17-dihydroxy-16α – methyl-

-dioxopregna-1,4-dien-21 -yl

C24H31FO6 434,5

Bột kết tinhtrắng hoặc gầnnhư trắng, đahình.

Độ tan: Tantrong axeton,etanol,

metanol. Thựctế khơng tantrong nước.Độ hịa tantrong nước:0,1 mg/mL ở25°C

Quang phổ:Có cực đại hấpthụ ở 238nmkhi hòa tantrong metanol.Tính ổn định:Ổn định trongmơi trường

Không ổn địnhtrong môitrường Kiềm.

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

Triamcinolone acetonide

C24H31FO6 435,50

Tinh thể màutrắng, nhiệt độnóng chảy220-2400CĐộ tan: Tantrong axeton,etanon. Thựctế không tantrong nước.Độ hòa tantrong nước:0,1 mg/mL ở25°C

Quang phổ :Có cực đại hấpthụ ở 238-242nm khi hịa

Tính ổn định:Ổn định trongmôi trường

C27H37FO6 476.58 Bột kết tinhtrắng hoặc gầnnhư trắng.Độ tan: Tantrong axeton,ete, cloroform.Thực tế khôngtan trong nước.Độ hòa tantrong nước:0,1 mg/mL ở25°C

Quang phổ: Cócực đại hấp thụở 238-242 nmkhi hòa tantrong metanol.

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

Tính ổn định:Ổn định trongmôi trườngaxit đến trungtính. Khơng ổnđịnh trong mơitrường Kiềm.Chảy ở khoảng192 °C kèmtheo phân hủy.

(11β, 16β) 21-Chloro-9-

-hydroxy-16-metyl-17- (1-oxopropoxy) -

Dạng tinh thểtrắng hoặc gầnnhư trắng,khơng mùi,khơng hịa tantrong nước,nóng chảy ở196oC.

Độ tan: Tan

trường hữu cơnhư ethanol,metanol,

Khơng tantrong nướcĐộ hịa tantrong nước:0,1 mg/mL ở25°C

Quang phổ: Cócực đại hấp thụở 236 - 240nm khi hịa tantrong metanol.Tính ổn định:Ổn định trongmôi trườngaxit, không ổnđịnh trong môitrường Kiềm.Nhạy cảm vớiánh sáng vànhiệt độ cao.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

1.2. Thực trạng sử dụng và chất lượng mỹ phẩm

1.2.1. Thực trạng sử dụng Mỹ phẩm hiện nay tại Việt Nam

Từ xưa đến nay vẫn đề làm đẹp luôn được mọi người quan tâm. Một biện pháp phổbiến nhất để làm đẹp là sử dụng mỹ phẩm. Mọi người sử dụng mỹ phẩm với mong muốnhoàn thiện thêm vẻ đẹp hình hài và hiện tại sử dụng mỹ phẩm đã là xu hướng chung trêntoàn thế giới.

Theo khảo sát được thực hiện bởi Công ty Cổ phần GMPC Việt Nam:

-

Số đơng có thói quen chăm sóc sắc đẹp nhiều lần/tuần: Theo kết quả thu được,

95% người tham gia khảo sát chăm sóc da một lần/tuần trở lên 62% trang điểm một lầntuần trở lên.

- Tỷ lệ phụ nữ trang điểm cao hơn ở nhóm tuổi 25 – 32:

+ Độ tuổi từ 25 đến 32: Tần suất sử dụng mỹ phẩm mỗi ngày là 33%, 34% sử dụngmỹ phẩm vài lần mỗi tuần, 5% sử dụng mỹ phẩm 1 lần/ tuần, 27% sử dụng mỹ phẩm íthơn 1 lần/ tuần và 1% không bao giờ sử dụng mỹ phẩm.

+ Độ tuổi từ 33 đến 39: Tần suất sử dụng mỹ phẩm mỗi ngày là 21%, 28% sử dụngmỹ phẩm vài lần mỗi tuần, 5% sử dụng mỹ phẩm 1 lần/ tuần, 37% sử dụng mỹ phẩm íthơn 1 lần/ tuần và 9% không bao giờ sử dụng mỹ phẩm.

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

+ Độ tuổi từ 40 trở lên: Tần suất sử dụng mỹ phẩm mỗi ngày là 20%, 29% sử dụngmỹ phẩm vài lần mỗi tuần, 3% sử dụng mỹ phẩm 1 lần/ tuần, 39% sử dụng mỹ phẩm íthơn 1 lần/ tuần và 9% khơng bao giờ sử dụng mỹ phẩm.

Kết quả này cũng không quá bất ngờ bởi nhóm phụ nữ trong độ tuổi từ 25 – 32thường có xu hướng thích làm đẹp và quan tâm đến bản thân hơn. Trong khi đó từ sautuổi 32 hầu hết phụ nữ đều chú trọng đến con cái, gia đình và ít chăm chút cho bản thânhơn. Ngoài ra, mỗi người cũng sẽ lựa chọn những sản phù hợp với điều kiện kinh tế củamình.

- Trong khi đó, thói quen trang điểm cũng có sự khác nhau theo thu nhập của từnghộ gia đình:

+ Dưới 20 triệu/ tháng: Mức chi tiêu cho mỹ phẩm dưới 300 ngàn là 22%, chi từ300 ngàn – 500 ngàn cho mỹ phẩm là 35%, 18% dành cho mức chi tiêu từ 500 ngàn –700 ngàn, 17% chi tiêu từ 700 ngàn – 1 triệu, chi tiêu 1 – 2 triệu/ tháng cho mỹ phẩm là6% và chi tiêu trên 2 triệu là 2%.

+ Từ 20 triệu đến 30 triệu/ tháng: Mức chi tiêu cho mỹ phẩm dưới 300 ngàn là 8%,chi từ 300 ngàn – 500 ngàn cho mỹ phẩm là 35%, 29% dành cho mức chi tiêu từ 500ngàn – 700 ngàn, 15% chi tiêu từ 700 ngàn – 1 triệu, chi tiêu 1 – 2 triệu/ tháng cho mỹphẩm là 9% và chi tiêu trên 2 triệu là 4%.

Trên 30 triệu/ tháng: Mức chi tiêu cho mỹ phẩm dưới 300 ngàn là 12%, chi từ 300ngàn – 500 ngàn cho mỹ phẩm là 31%, 24% dành cho mức chi tiêu từ 500 ngàn – 700ngàn, 7% chi tiêu từ 700 ngàn – 1 triệu, chi tiêu 1 – 2 triệu/ tháng cho mỹ phẩm là 10%và chi tiêu trên 2 triệu là 16%.

Hiện nay tại Việt Nam, việc sử dụng các sản phẩm dùng để trang điểm vẫn đangtăng lên. Về cả mức độ sử dụng lẫn chi tiêu cho nó. Số người trang điểm hàng ngày tănglên con số trên 30%. Số người hồn tồn khơng trang điểm giảm từ 24% (2016) xuống14% (2019).

Theo xu hướng phát triển của thế giới ngày nay. Nhu cầu sử dụng mỹ phẩm khôngnhững chỉ dành cho các phái đẹp mà còn dành cho phái mạnh. Với sự phát triển mạnh mẽcủa thương mại điện tử. Số lượng mua mỹ phẩm trên các sàn thương mại điện tử gia tăngmột cách đáng kể. Trong đó, Facebook là trang mạng xã hội phổ biến nhất. Được dùng để

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

buôn bán cũng như mua sắm mỹ phẩm. Bên cạnh đó, các trang thương mại điện tử lớn ởViệt Nam như Tiki, Shopee, Lazada, Sendo,… cũng được người tiêu dùng sử dụng đểmua sắm mỹ phẩm hàng ngày [17].

Từ đó cho thấy nhu cầu sử dụng mỹ phẩm tại việt nam ngày càng nhiều, với lượngngười tiêu thụ ngày càng tăng.

1.2.2. Tình trạng trộn Corticoid vào mỹ phẩm tại Việt Nam

Thế nhưng, ngồi những cơng dụng do mỹ phẩm đem lại thì mỹ phẩm cịn gây racho người tiêu dùng khơng ít hậu quả, có những hậu quả gây ảnh hưởng nghiêm trọng.Trong đó việc sử dụng phải các loại mỹ phẩm có chứa Cortcoid tràn ngập trên thị trườngmỹ phẩm hiện nay đang trở thành nỗi lo của người tiêu dùng.

Hiện nay, thị trường kem trộn ngày càng phát triển đặc biệt là trên các nền tảng xãhội, người bán thậm chí cịn livestream để trộn kem và chia sẻ hiệu quả mà loại kem“thần thánh” này mang lại khi sử dụng.

Corticoid có thể được tìm thấy trong hầu hết các sản phẩm kem trộn, mỹ phẩm nháivà hàng dỏm, bởi chúng có tác dụng làm cho làn da tươi đẹp hơn trong thời gian ngắn,thậm chí chỉ cần qua một đêm sử dụng, làn da đã có thể trở nên trắng, mụn và vết thâmcũng mờ dần. Ít ai biết rằng, corticoid chính là thủ phạm đáng sợ đối với chị em muốnlàm đẹp hiện nay. Khi sử dụng mỹ phẩm có corticoid một thời gian dài, da mặt sẽ trắngbất thường so với các vùng cổ, ngực. Các mao mạch trên da bắt đầu có hiện tượng giãnnở, làn da lúc nào cũng ửng hồng. Nhưng sau đó, da từ từ mỏng dần, gân và vết námcũng dần dần xuất hiện. Vết nám ngày càng sâu, đậm, lan rộng dần, càng diễn tiến nặngkhi gặp nắng. Da có cảm giác rát, ngứa, ửng đỏ hơn khi đi ra nắng hoặc khi đứng gần bếplửa. Nếu ngưng sử dụng thì diễn biến cịn khủng khiếp và phức tạp hơn. Da trở nên sầnsùi, đen sạm lan rộng, nhăn nheo, khô, tiết nhiều chất nhờn và mụn bắt đầu thi nhau mọc,tạo nên từng quầng như miếng cơm cháy trên mặt. Nhiều người thậm chí cịn mưng mủ.

Do tác dụng phụ rất nguy hiểm, nên corticoid bị cấm tuyệt đối trong sản xuất mỹphẩm. Tuy nhiên, mới đây, Phân viện Pháp y Quốc gia tại TPHCM đã tiến hành kiểmnghiệm và phát hiện nhiều mẫu mỹ phẩm làm đẹp chứa loại chất nguy hại trên. Theo đó,mẫu thứ nhất được phát hiện có chứa Clobetasol propionate - một dẫn xuất nhóm

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

corticoid - là sản phẩm Sắc Ngọc Khang loại bỏ tàn nhang làm tan vết nám do Công tymỹ phẩm Tân Đại Dương tại quận Bình Tân, TPHCM sản xuất.

Tiếp đó là sản phẩm Sắc hoa Thiên giữ mãi tuổi xuân - collagen - tổ yến - siêu trắngcó chứa Dexamethasone là dẫn xuất nhóm corticoid do Cơng ty Gia Việt tại quận NinhKiều, TP Cần Thơ sản xuất. Ba sản phẩm khác được phát hiện chứa Clobetasolpropionate gồm: Whitening cream - Sắc Ngọc Hương - Sheap placenta - kem nhau thaicừu do Công ty Sắc Ngọc Hương tại quận 8, TPHCM sản xuất; Cream Q - 10 Sắc NgọcTrai Khang thành phần thảo dược thiên nhiên do Cơng ty Lê Hồng Hà My tại huyện CủChi, TPHCM sản xuất; Sắc Thể Ngọc Hoàn Khang thành phần đến từ thiên nhiên doCông ty mỹ phẩm Thái Ngọc Nguyên tại quận Tân Phú, TPHCM sản xuất. [18]

Tại Việt Nam có một số nghiên cứu xác định Corticoid có trong mỹ phẩm như: - Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Văn Hà và cộng sự tại Viện Kiểm nghiệmthuốc Trung Ương (2020), kết quả cho thấy trong 48 mẫu mỹ phẩm được kiểm tra có 2mẫu có chứa trái phép GC (clobetasol propionat, dexamethason, dexamethason acetat).Trong 2 mẫu có trộn trái phép GC có 1 mẫu chứa đồng thời 2 GC là dexamethason vàdexamethason acetat. Với hàm lượng dexamethason trong mẫu là 11,7µg/g [8].

- Kết quả nghiên cứu trong Luận án tiến sỹ của Nguyễn Thị Hường Hoa (2013) tạitrường Đại học Dược Hà Nội, kiểm tra trên 11 mẫu mỹ phẩm bao gồm các loại như kemdưỡng, kem trị nám, nước hoa hồng, sữa dưỡng da cho thấy có 3 mẫu có chứa GC(clobetason dipropionat) [6].

Khóa luận tốt nghiệp Đại học của Nguyễn Thị Mỹ Linh tường Đại học Dược HàNội.Tại địa bàn huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An năm 2017, có một nghiên cứu xác địnhCorticoid có trong 11 mẫu mỹ phẩm thuộc dạng kem bơi da, đã xác định có một mẫu cóchứa dexamethason acetat [7].

Trên thế giới, một số quốc gia lớn như Hàn Quốc, Italy cũng xảy ra vấn đề trộnCorticoid vào mỹ phẩm [13,15]. Sỡ dĩ, một số nhà sản xuất bất chấp sự an toàn của ngườitiêu dùng đã trộn Corticoid vào trong mỹ phẩm là do đây là một trong những thành phầncó tác dụng chống viêm mạnh, chống dị ứng và ức chế miễn dịch, làm nhẵn bóng da, mịnda, giảm ngứa. [9]

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

Từ thực tế trên cho thấy, không chỉ có các loại mỹ phẩm trơi nổi trên thị trường cóchứa các loại Corticoid mà ngay cả sản phẩm của những cơ sở sản xuất có thương hiệutrên thị trường cũng có chứa các thành phần bị cấm này.

1.3. Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (HPLC)

1.3.1. Nguyên tắc chung của phương pháp sắc ký lỏng [3]

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn hoặc chấtlỏng và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn, lỏng - lỏng). Mẫu phân tích được chuyểnlên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích đượcphân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúcphân tử và tính chất lí hố của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng vớipha tĩnh và pha động khác nhau, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏinhau.

 Pha tĩnh trong sắc ký lỏng

Trong sắc ký lỏng, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chấtphân tích. Đó là những chất rắn, xốp và kých thước hạt rất nhỏ, từ 3-7µm. Tuỳ theo bảnchất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng pha liên kết thường chia làm 2 loại: sắcký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC).

- Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó là các silica trầnhoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN v.v.)

- Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hố, khơng phân cực,loại thơng dụng nhất là :–C18H37

Ưu điểm của sắc ký pha đảo là tách và phân tích các chất có độ phân cực rất đadạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới khơng phân cực. Hơn nữa, trong rất nhiều trườnghợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế.

Hình 1.1. Một số loại cột sắc ký thường dùng trong phân tích.

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

 Pha động trong sắc ký lỏng

Trong sắc ký lỏng pha động là thành phần được cho đi qua cột liên tục để phân táchcác hợp chất trong một hỗn hợp, có những yêu cầu sau:

- Pha động phải trơ với pha tĩnh.

- Bền vững, ổn định và khơng bị phân huỷ trong q trình chạy sắc ký. - Hồ tan được mẫu.

- Phải có độ tinh khiết cao, có độ nhớt thấp và phù hợp với detector

Hình 1.2. Các loại dung mơi dùng làm pha động trong sắc ký.

Có thể chia pha động làm hai loại: pha động có độ phân cực cao và pha động có độphân cực thấp.

Để phân tích một nhóm chất, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung mơi để cóđược dung mơi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích. Sự thay đổithành phần pha động đôi khi diễn ra theo thời gian, trường hợp này người ta gọi làgradient pha động.

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

- Detector khối phổ: thường được dùng để nhận biết và xác định các hợp chất khichúng rất khó tách bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ, chẳng hạn như các chất cókhối lượng phân tử lớn, các hợp chất không bền nhiệt và các hợp chất phân cực.

 Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp đầu dò DAD

▪ Hệ thống bơm (Pumpsystem)

▪ Hệ thống tiêm mẫu (Injectionsystem)

▪ Buồng cột (Column ovent - điều chỉnh nhiệt độcột) ▪ Cột sắc ký (pha tĩnh – stationaryphase)

▪ Pha động (mobile phase – (hỗn hợp) dungmôi) ▪ Đầu dò DAD Diod Array Detector)

▪ Hệ thống xử lý dữ liệu

Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

Hình 1.4. Hệ thống HPLC Chromaster 5430 dùng trong nghiên cứu

1.3.2. Một số đại lượng đặc trưng của sắc ký lỏng [2][3]

 Thời gian lưu (tR)

Thời gian lưu Khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi píc đến detectorđược gọi là thời gian lưu tR. Đối với những chất không lưu giữ thì tốc độ di chuyển củanó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử pha động. Thời gian tM của chấtkhông lưu gọi là thời gian chết.

 Đô ̣phân giải

Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc ký: trong đó:

RS: độ phân giải

(tR)1, (tR)2: thời gian lưu chất 1, 2

W1, W2: lần lượt là độ rộng pic 1, 2 ở các đáy pic

W1/2 1, W1/2 2: lần lượt là độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic RS ≥ 1,5 thì 2 pic coi như tách được hồn tồn.

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

 Tính đối xứng của píc sắc ký

- Hệ số bất đối:

b: nửa chiều rộng phía sau píc. a: nửa chiều rộng phía trước píc - Hệ số kéo đuôi:

 Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Cột sắc ký được coi là có N lớp mỏng, ở mỗi lớp, sự phân bố chất tan vào hai phađược coi là đạt đến trạng thái cân bằng. Những lớp mỏng này được gọi là đĩa lý thuyết.Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhấtđịnh. Cột có số đĩa lý thuyết lớn sẽ có hiệu lực cao, khi đó độ dỗng píc nhỏ.

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

1.3.3.2. Phân tích định lượng:

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc [2]: nồngđộ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Có 4 phương pháp định lượngthường được sử dụng trong sắc ký:

➢ Phương pháp chuẩn ngoại ➢ Phương pháp chuẩn nội ➢ Phuơng pháp thêm chuẩn

➢ Phương pháp chuẩn hóa diện tích

Trong tiểu luận này phương pháp chuẩn ngoại được chọn sử dụng. Đây là phươngpháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành trong cùngđiều kiện. So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiềucao) của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử. Có thể sử dụngchuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm.

❖ Chuẩn hóa 1 điểm

Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ củamẫu thử theo cơng thức:

trong đó:

- CX: nồng độ chất thử - CS: nồng độ chất chuẩn

- SX: diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử - SS: diện tích (chiều cao) của pic mẫu chuẩn

❖ Chuẩn hóa nhiều điểm

Cách tiến hành: Chuẩn bị một dãy chuẩn với các nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắcký. Các đáp ứng thu được là diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn. Vẽ đồ thịchuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ củachất chuẩn (C). Sử dụng đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính tốn nồng độ của chấtcần xác định. Có thể tính theo 2 cách:

- Áp dữ kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ suy rađược nồng độ của nó.

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

- Xây dựng đường hồi quy tuyến tính mơ tả quan hệ giữa diện tích (hoặc chiều cao)pic với nồng độ chất cần xác định.

S = a x C + b

S: Diện tích pic

a: Độ dốc của đường chuẩn

b: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung C: Nồng độ của chất thử

Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ chất thử: C = (S-b)/a

Chú ý: Độ lớn của diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu thử phải nằm trong khoảngnồng độ tuyến tính của đường chuẩn.

1.3.4. Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector) dùng trong nghiên cứu.

Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – Vis, được dùng phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – Vis (trong khoảng 190 – 800 nm)của các chất phân tích. Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau đó được tách ra thành các bước sóng đơn. Detector có mảng diod để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách tử. Mỗi diod nhạy với một bước sóng nhất định, do đó detector DAD cho phép đo nhiều bước sóng khác nhau cùng một lúc. Thơng thường, chỉ có một hoặc hai bước sóng được theo dõi trong q trình chạy sắc ký. Phổ DAD của các pic có thể cung cấp thơng tin về độ tinh khiết của pic.

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Hình 1.5. Cấu tạo detector mảng diod (DAD).

Quang phổ và sắc ký đồ có thể được biểu thị trên màn hình nhờ phần mềm của hệthống xử lý tín hiệu bằng máy tính. Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnhdetector đo ở bước sóng cố định hoặc thay đổi. Mặt khác, hệ thống này có thể cho đồ thị3D: độ hấp thụ, bước sóng và thời gian.

Ứng dụng: Đầu dò DAD giúp lựa chọn bước sóng phù hợp cho phân tích, có khảnăng vẽ phổ UV – Vis của pic chuẩn và pic thử rồi chồng hai phổ với nhau để thấy sựgiống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match.

Khi hệ số match xấp xỉ 1 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hồn tồn. Hệ sốmatch trên 0,90 thì chỉ ra hai phổ tương tự. Hệ số match càng gần 1 thì sự tương tự củahai phổ càng cao. Hệ số match dưới 0,90 chỉ ra hai phổ khác nhau.

1.4. Các nghiên cứu phân tích định tính, định lượng Corticoid trong mỹ phẩm

1.4.1. Nghiên cứu phân tích định tính và định lượng

Trên thế giới, các nghiên cứu định tính và định lượng các GC đã áp dụng phươngpháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò khối phổ cho độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao.Tuy nhiên phương pháp này hiện nay không phù hợp với đa số phịng thí nghiệm trongnước vì chưa được trang bị hệ thống đầu dị này. Có một số nghiên cứu dùng phươngpháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA. [2][3][4][5][6][7].

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

Phương pháp hòa hợp ASEAN mã số ACM MAL 07 (được ban hành ngày02/12/2005) cũng chỉ giới hạn dùng để định tính 5 Corticoid bằng phương pháp HPLC[8], tuy nhiên giới hạn phát hiện tươn đối cao so với các phương pháp HPLC khác.

Tại Việt nam, các nghiên cứu áp dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng cho việc địnhtính các GC cho độ nhạy và tính đặc hiệu kém. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng caovới đầu dò khối phổ với chế độ tiêm mẫu trực tiếp thì cần trang bị đầu dị khối phổ rất đắttiền. Có một số nghiên cứu định tính, định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệunăng cao với đầu dò Uv-Vis và PDA được công bố cho thấy số lượng các GC được địnhtính, định lượng đồng thời cịn hạn chế, chưa tận dụng được ưu điểm vượt trội về hiệunăng tách làm tăng tính đặc hiệu của phương pháp, giúp giảm thời gian và tiế t kiệm dungmơi phân tích [2].

Một số nghiên cứu về định tính và định lượng các GC được tóm tắt trong bảng 1.3.Bảng 1.3: So sánh các điều kiện sắc ký tối ưu trong các qui trình nghiên cứu

Tốc độdòng (ml/

Nhiêt độcột (0C)

Số GCphân

Nguyễn VănHà và cộng sự

Acquity UPLCBEH C18 (50 x

2,1 mm;1,7 mm)

Methanol acid formic

Nhiệt độ

Nguyễn Thị MỹLinh [14]

Thermo ScientificAcclain C18(250x4,6mm;

Phenomenex LunaC18 (250x4,6mm;

Vĩnh Thọ

Thermo ScientificAcclain C18(250x4,6mm;

ACN-H2O (70: 30)

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

5μm)m)Andersen J.H.

và cộng sự[23]

Thermo ScientificHypersil GoldPFP (100 x 2,1

mm; 1,9 μm)m)

Axit formic/ACN 1% -Axit formic1% (gradient)

1.4.2. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu

Với nền mẫu phức tạp, các nghiên cứu tập trung vào dùng phương pháp chiết pharắn để chiết các corticoid và loại tạp. Phương pháp có thể cho độ tự động hóa cao, rấtthuận tiện khi áp dụng vào thực tế khi có sự hỗ trợ của bộ chiết pha rắn. Tuy nhiên, vớiphương pháp này, sẽ khó đảm bảo về độ phục hồi và khó áp dụng vào thực tế ở Việt Namvì đa số phịng thí nghiệm chưa được trang bị bộ chiết pha rắn.

Bên cạnh phương pháp chiết pha rắn, có một số nghiên cứu phát triển phương phápchiết có hỗ trợ của nhiệt hoặc siêu âm. Đây là phương pháp đơn giản, dễ áp dụng vàothực tế vì không yêu cầu cao về trang thiết bị và cho độ phục hồi cao [2].

Bảng 1.4: So sánh quy trình xử lý mẫu giữa các tài liệu nghiên cứu

lượng mẫu

Phương phápchiết – loại tạp

Dung môichiết/cột

Nguyễn Văn Hà vàcộng sự [7]

Kem Bôi da,0,2g

Dicloromethan –MeOH (90:10) Huỳnh Lâm Tú Anh,

Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ[2]

Kem bơi da Chiết lỏng, có hỗ

trợ nhiệt và ly tâm MeOH - H2O (90:10)Nguyễn Thị Mỹ Linh [6] Kem bơi da Chiết lỏng, có hỗ

trợ nhiệt và ly tâm

Dicloromethan –MeOH (90:10)Emerson A.N. và cộng sự

Chiết lỏng, có hỗ

lắc và ly tâm Acetonitrin

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

2.2.1. Đối tượng nghiên cứu

Mẫu dùng trong nghiên cứu để xây dựng phương pháp: Sữa rửa mặt Sắc ngọc

khang, số lô: D42122, NSX: 220822, HD: 220824, Kem dưỡng trắng da Impress ICcủa Kanebo Nhật bản số lô: 14345377, NSX: 271021, HD: 261025 đã được kiểm trakhơng có Corticoid. Được sử dụng như là mẫu placebo

Mẫu kiểm tra: Mẫu mua đề giám sát chất lượng và mẫu gửi đến Trung tâm Kiểm

nghiệm Thuốc – Mỹ phẩm – Thực phẩm tỉnh Kiên Giang từ tháng 01/2023 đến hếttháng 10/2023.

2.1.2. Thời gian nghiên cứu:

Thời gian tiến hàng nghiên cứu từ tháng 05/2023 đến tháng 10/2023.

2.1.3. Địa điểm nghiên cứu:

Nghiên cứu được tiến hành tại: Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc – Mỹ phẩm –Thực phẩm tỉnh Kiên Giang

2.1.4. Cách chọn mẫu nghiên cứu:

Việc lấy mẫu tuân thủ theo quy định của ISO 17025 – 2017 (QT.10/TTKN).Các mẫu được chọn là các mẫu mỹ phẩm còn nguyên vẹn, chưa mở nắp, còn hạnsử dụng.

2.1.5. Cỡ mẫu trong nghiên cứu:

Toàn bộ các mẫu mỹ phẩm được kiểm tra, giám sát tại Trung tâm Kiểm nghiệmThuốc – Mỹ phẩm – Thực phẩm tỉnh Kiên Giang từ tháng 01/2023 đến hết tháng10/2023 (bao gồm: Mẫu mua đề giám sát chất lượng và mẫu gửi đến).

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Thiết kế nghiên cứu:

Nghiên cứu mô tả.

2.2.2. Nội dung nghiên cứu:

Xây dựng và chuẩn hóa được quy trình phân tích đồng thời nhiều Corticoid

gồm: Prednison, Prednisolon, Dexamethason acetat, Triamcinolon acetonid,

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

Betamethason dipropiat, Clobetason propionat trong mỹ phẩm bằng phương pháp

 Xây dựng quy trình xử lý mẫu;

 Xây dựng quy trình phân tích đồng thời nhiều Corticoid gồm: Prednison,Prednisolon, Dexamethason acetat, Triamcinolon acetonid, Betamethasondipropiat, Clobetason propionat trong mỹ phẩm bằng phương pháp

+ Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng.

 Ứng dụng quy trình phân tích đồng thời nhiều Corticoid trong mỹ phẩm bằngphương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để đánh giá thực trạng Corticoid cótrong một số mỹ phẩm trên thị trường Kiên Giang năm 2023.

2.2.3. Phương pháp tiến hành nghiên cứu:

2.2.3.1. Thiết bị và dụng cụ

- Hệ thống máy HPLC – DAD Chromaster gồm: module điều khiển, bơm gradient 4 kênh tích hợp đuổi khí, bộ tiêm mẫu tự động, detector DAD 5430, buồng điều nhiệt.

- Cân phân tích chính xác tới 0,01mg (cân 5 số lẻ). - Máy lắc siêu âm.

- Máy ly tâm

- Bộ dụng cụ lọc (0.45µm).

- Dụng cụ thủy tinh: Bình định mức các loại, cốc thủy tinh các loại, đũa thủy tinh, vial chứa mẫu phân tích.

2.2.3.2. Dung mơi và hóa chất

- Chất chuẩn Prednison (98.1%)– Viện kiểm nghiệm TP.HCM;- Chất chuẩn Prednisolon (99.1%) – Viện kiểm nghiệm TP.HCM;

- Chất chuẩn Dexamethason acetat (99.6%) – Viện kiểm nghiệm TP.HCM;

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

- Chất chuẩn Triamcinolon acetonid (98.12%)- Viện kiểm nghiệm TP.HCM;- Chất chuẩn Betamethason dipropionat (99.5%) – Viện kiểm nghiệm TP.HCM;- Chất chuẩn Clobetason propionat (99.4%) – Viện kiểm nghiệm TP.HCM.- Methanol HPLC, Acetonitril HPLC, Ethyl acetate, Amoni hydroxyd, acid hydrocloric 0,5 M

- Nước tinh khiết (DĐVN V).

2.2.3.3. Thực nghiệm:

Mẫu sử dụng là mẫu đại diện cho 2 nhóm mỹ phẩm dạng lỏng và dạng kem đểxây dựng và thẩm định phương pháp phân tích với HPLC/DAD. Tiến hành thựcnghiệm để tìm ra điều kiện sắc ký thích hợp, sau đó xử lý các kết quả thu được bằngthuật tốn thống kê.

❖ Xây dựng quy trình xử lý mẫu:

Chọn dung môi và phương pháp chiết sao cho chiết được hồn tồn chất phântích từ nền mẫu, loại bỏ tối đa ảnh hưởng của nền mẫu, chất phân tích bên trong môitrường pha mẫu (dựa vào 3 yếu tố: tính tan của chất phân tích, đặc điểm nền mẫu,phương pháp phân tích).

❖ Lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp:

- Tiến hành khảo sát chọn cột sắc ký, nhiệt độ cột, pha động, tốc độ dịng, bướcsóng phân tích với detector DAD, thể tích tiêm mẫu.

- Định tính bằng so sánh thời gian lưu, chồng phổ UV-VIS và so sánh hệ sốtương đương của píc nghi ngờ thu được từ mẫu thử với píc thu được từ mẫu chuẩn.

- Định lượng bằng cách so sánh diện tích hoặc chiều cao píc thu được từ mẫu thửvới mẫu chuẩn.

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

- So sánh phổ UV-VIS của píc thu được từ dung dịch thử có thời gian lưu tươngứng với píc thu được từ dung dịch chuẩn và hệ số chồng phổ của các píc này phải đạttừ 0,99 trở lên.

❖ Độ đặc hiệu:

Tiến hành sắc ký các loại mẫu: Mẫu trắng (mẫu mỹ phẩm khơng có chất cầnphân tích -plazebo); Mẫu chuẩn; mẫu trắng thêm chuẩn (mẫu mỹ phẩm khơng có chấtcần phân tích đã được cho thêm chất chuẩn cần phân tích (mẫu tự tạo) và được chuẩnbị theo quy trình).

Yêu cầu:

- Trên sắc ký đồ của Mẫu trắng/Mẫu tự tạo: píc của chất cần phân tích phải tách

hồn tồn khỏi các píc khác (nếu có trong nền mẫu), píc của chất cần phân tích có thờigian lưu khác nhau khơng có ý nghĩa thống kê với píc của chất chuẩn thu được từ mẫuchuẩn.

- Sắc ký đồ của Mẫu trắng, dung môi pha mẫu không xuất hiện píc ở trongkhoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng pícphải khơng q 1,0% so với đáp ứng píc của mẫu chuẩn.

- Píc của chất cần phân tích trong sắc ký đồ dung dịch thử phải tinh khiết. Hệ sốchồng phổ UV-VIS của píc hoạt chất cần phân tích thu được trong sắc ký đồ của dungdịch thử/mẫu tự tạo với píc tương ứng trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn phải đạt từ0,99 trở lên.

❖ Khoảng nồng độ tuyến tính:

Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn ( ≥5 dung dịch ). Xác định phương trìnhhồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đápứng píc thu được trên các sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu.

Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995). Trường hợp r <0,997 phải có sự giải thích phù hợp.

❖ Độ thu hồi (Độ đúng):

Xác định trên các trắng thêm chuẩn (mẫu tự tạo). Chuẩn bị 03 loại mẫu tự tạobằng cách thêm chính xác một lượng chất chuẩn chất cần phân tích vào các nền mẫu

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

khơng có chất cần phân tích. Với phép thử định lượng, lượng chất chuẩn thêm vàotương ứng với 3 mức nồng độ. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập.Tính kết quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính.

Tính lượng thu hồi theo cơng thức:

Tỉ lệ thu hồi 95,0-105,0% và RSD của tỉ lệ thu hồi không quá 2,0% ở mỗi mức

nồng độ (Hướng dẫn của ICH, ASEAN và AOAC, yêu cầu với phép thử định lượng).❖ Độ chính xác:

 Độ tái lập (độ chính xác trung gian):

Độ chính xác trung gian được tiến hành thử nghiệm trên 6 mẫu tự tạo được chuẩnbị giống phần độ lặp lại nhưng được thực hiện khác ngày và khác kiểm nghiệm viên,kết quả phân tích giữa các kiểm nghiêm viên ( ≥ 03 kiểm nghiêm viên) phải cho chogiá tri ̣RSD ≤ 2% đối với hàm lượng các Corticoid trong mẫu tự tạo thì phương pháp

có đơ ̣chính xác đạt yêu cầu (Hướng dẫn của ICH, ASEAN và AOAC, yêu cầu với phépthử định lượng).

❖ Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):

Có thể tiến hành theo 3 cách:

Cách 1: phân tích các dung dịch pha lỗng của mẫu trắng thêm chuẩn (mẫu tự

tạo). Giới hạn phát hiên chính là nồng độ thấp nhất của dung dịch pha loãng mà tại đókhi tiêm vào hệ thống sắc ký, tín hiệu thu được cao gấp 3 lần so với nhiễu đường nềnvà đáp ứng đầy đủ các yêu cầu đối với các thông số sắc ký như: thời gian lưu (tR);diện tích đỉnh (S); độ phân giải (Rs): hệ số đối xứng (As), số đĩa lý thuyết (N)thiết.

Cách 2: dựa vào chỉ số S/N (signal/noise) do hệ thống sắc ký thu được.

LOD = S/N x C(kl/tt)LOQ = 3,3 x LOD (kl/tt)

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

trong đó:

C: nồng độ chất phân tích.

Cách 3: dựa vào đường tuyến tính và độ lệch chuẩn của đáp ứng.

Giá trị LOD: LOD = (3,3 x δ)/a (kl/tt))/a (kl/tt)trong đó:

δ: Độ lệch chuẩn đáp ứng.

a: Hệ số góc của đường hồi quy tuyến tính (y = ax +b) giữa nồng độ và đáp ứng

píc của chất cần phân tích.

Giá trị LOQ: LOQ = (10 x δ)/a (kl/tt))/a (kl/tt)

2.3. Xử lý thông kê kết quả thực nghiệm

Các kết quả thực nghiệm được tính tốn và xử lý thống kê bắng test ANOVAtrên Microsoft Excel 2013 với các hàm thống kê thơng dụng như:

- Hàm tính trung bình cộng AVARAGE. - Hàm tính độ lệch chuẩn STDEV. - Test T, Test F

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ

3.1. Xử lý mẫu

3.1.1. Điều kiện xử lý mẫu

Các mẫu phân tích được bảo quản và xử lý ở nhiệt độ phịng thí nghiệm.

3.1.2. Cách chuẩn bị mẫu

Chuẩn bị mẫu thử: Tiến hành theo quy trình sau :

- Mẫu thử dạng lỏng: lấy chính xác khoảng 1g mẫu thử, trung tính hóa đến pH 7bằng dung dịch acid hydrocloric 0,5 M hoặc dung dịch amonium hydroxyd 0,5 M ,chiết 2 lần mỗi lần với 20 ml ethyl acetat , loại bỏ lớp nước, lọc và tập trung dịch chiếtethyl acetat, bay hơi và cô cạn trên bể điều nhiệt , hòa tan cắn trong 10 ml pha động,lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC.

- Mẫu thử dạng kem: cân chính xác khoảng 1g mẫu thử trong ống ly tâm 20 ml,thêm 20 ml methanol , làm ấm trên bể điều nhiệt ở 60oC khoảng 10 phút lắc mạnhtrong 5 phút. Ly tâm ở 3000 – 4000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó để tủ lạnh 10phút, lọc lấy dịch trong bay hơi đến khô trên bể điều nhiệt ở 60oC, hòa tan cắn trong 10ml pha động, lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiêm vào hệ thống HPLC.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, dung dịch chuẩn làm việc, mẫu trắng (plazebo),mẫu trắng thêm chuẩn (mẫu tự tạo):

- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 10,0 mg từng chất chuẩn

Prednison, Prednisolon, Dexamethason acetat, Triamcinolon acetonid, Betamethasondipropionat, Clobetason propionat… vào các bình định mức 10,0 ml, thêm 5 ml phađộng, lắc cho tan. Thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều.

- Dung dịch chuẩn làm việc: Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng với pha động để

được dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 100 µg/ml. Dung dịch chuẩn làm việc đượclọc qua màng lọc 0,45 µm vào Vial trước khi tiêm vào hệ thống HPLC.

- Dung dịch hỗn hợp chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng với pha động để

được dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ từng Corticoid khoảng 100µg/ml. Dungdịch hỗn hợp chuẩn được lọc qua màng lọc 0,45µm vào Vial trước khi tiêm vào hệthống HPLC.

Từ dung dịch chuẩn gốc tiến hành pha lỗng thành các dung dịch chuẩn có nồngđộ khác nhau, phù hợp cho việc xây dựng đường chuẩn và xác định giới hạn phát hiện(LOD).

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

- Dung dịch mẫu trắng (plazebo): cân chính xác khoảng 1g mẫu trắng đã chọn

(2.1.1.) vào cốc có mỏ 50ml và xử lý theo phương pháp đã chọn (mục 3.1.2.). Gồm 01mẫu Sữa rửa mặt và 01 mẫu kem.

- Dung dịch mẫu trắng thêm chuẩn: cân chính xác khoảng 1g mẫu trắng (Gồm 01

mẫu Sữa rửa mặt và 01 mẫu kem) vào cốc có mỏ 50ml, thêm một lượng mẫu chuẩnsao cho đạt nồng độ 80%-120% của quy trình phân tích và xử lý giống như mẫu trắng.

3.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích

3.2.1. Điều kiện sắc ký

Qua thực nghiệm lựa chọn được điều kiện tối ưu như sau:

- Cột C18, (250 x 4,6 mm), 5 µm có sử dụng tiền cột thép khơng gỉ (3 cm x 4,6mm) được nhồi pha tĩnh C18 (5 µm);

- Nhiệt độ cột: 40oC;

- Pha động: chạy theo chế độ Gradient (bảng 3.1) - Tốc độ dòng: 0,8 – 1,5 ml/ phút;

- Bước sóng phát hiện: 240 nm; - Thể tích tiêm: 20 µl.

- Thời gian phân tích: 20 phútBảng 3.1. Bảng Gradient pha động

Thời gian(Phút)

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

3.2.2. Thẩm định quy trình

3.2.2.1. Đánh giá độ thích hợp hệ thống

Tiêm 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp, dung dịch trắng thên chuẩn có nồng độtừng Corticoid khoảng 100µg/ml vào hệ thống sắc ký, sau đó tiến hành sắc ký theođiều kiện đã chọn ghi lại sắc ký đồ, kết quả thu được ghi vào bảng 3.2.

Hình 3.1. Sắc ký đồ sáu lần tiêm của mẫu hỗn hợp chuẩnBảng 3.2: Bảng kết quả đánh giá độ thích hợp của hệ thống sắc ký (n = 6).

gian lưu

Diện tíchpic.

Hệ sốbấtđối

Độ phângiải

Số đĩa lýthuyết

</div>