Luận án tiến sĩ sinh học: Nghiên cứu mô hình bệnh loãng xương trên cá Medaka chuyển gen và đánh giá tác dụng chống loãng xương của một số hoạt chất

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (36.41 MB, 148 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Thị Minh Tâm

NGHIÊN CỨU MƠ HÌNH BỆNH LOANG XƯƠNG

TREN CÁ MEDAKA CHUYEN GEN VÀ ĐÁNH GIA TÁC DUNGCHÓNG LOANG XƯƠNG CUA MOT SO HOẠT CHAT

Hà Nội - 2023

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

ĐẠI HỌC QUOC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Hà Thị Minh Tâm

Chuyên ngành: Sinh lý người va động vat

Mã số: 9420101.04

LUẬN AN TIEN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Tô Thanh Thúy

Hà Nội - 2023

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu được tôi thực hiên dưới sự

hướng dẫn khoa học của TS.Tô Thanh Thúy.

Các kết quả của luận án là trung thực và có một số phan đã được công bốtrong các bài báo khoa học. Luận án chưa từng được cơng bó.

Nghiên cứu sinh

Hà Thị Minh Tâm

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Tơ Thanh Thúy đã tận tình hướng

dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu khoa học để có được kết quả nhưngày hơm nay.

Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Lai Thành - Bộ môn Sinh học Tếbào, TS.Trần Đức Long - Bộ môn Di truyền học đã giúp đỡ trong quá trình thiết kế

các thí nghiệm và phân tích hình ảnh, TS. Vũ Thị Thu - Bộ môn Sinh lý học và Sinh

học người đã cung cấp chất cho nghiên cứu và tư vấn thiết kế thí nghiệm, TS. Đỗ

Minh Hà - Bộ môn Sinh lý học và sinh học người đã giúp đỡ trong quá trình xử lý

thống kê số liệu, Ths. Nguyễn Thị Thu Huyền, TS. Nguyễn Văn Sáng - Phòng sinh

học phân tử tế bào, Trung tâm Khoa học sự song, Khoa Sinh hoc, Truong Dai hoc

Khoa hoc Tu nhién, Dai hoc Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ trong q trình thực hiệncác thí nghiệm liên quan đến Sinh học phân tử. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộcủa Trung tâm Khoa học sự sống Celife đã giúp đỡ về các kĩ thuật kính hiển vi.

Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các Thầy Cô và Cán bộ Bộ môn Sinh lý

học và Sinh học người cũng như Ban lãnh đạo Khoa Sinh học - Trường Đại học

Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, độngviên, giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập, nghiên cứu tại Bộ môn.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thành viên trong Phịng thí nghiệm cá medaka

BoneMed đã giúp đỡ tơi chăm sóc cá và thu phơi cá thí nghiệm

Tơi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể các thầy cô, anh chị em trong Bộ môn Động

vật và Ban lãnh đạo cũng như các thầy cô trong Khoa Sinh — KTNN, Khoa Giáo

dục Mầm non_ Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện, động viên, chia

sẻ công việc giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu sinh.

Nghiên cứu này được tài trợ từ nguồn kinh phí đề tài thuộc Quỹ Nafosted mãsố: 106-YS.06-2014.15

Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, ln ở bêncạnh động viên, giúp đỡ tơi trong suốt q trình học nghiên cứu sinh.

Hà Nội, ngày tháng năm 2023Nghiên cứu sinh

Hà Thị Minh Tâm

ii

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

DANH MỤC CHỮ VIET TAT

STT | Chữ viết tắt Chú giải viết tất :

Tên Tiêng Anh Tên Tiêng Việt

1 nt ngay tudi

2 SN soc nhiét

3 ALC Alizarin complexone

4 S.E.M Standard Error of the Mean | Sai sô chuẩn của giá trị5 Ip Index of mineralization chi s6 bao vé xuong

9 pBMD peak Bone Mineral Density mật độ xương đỉnh

10 RANKL Receptor activator of

nuclear factor kappa-betaligand

11 OPG Osteoprotegerin

12 NFATc1 Nuclear Factor of Activated

T-cell cytoplasmic 113 TRAF6 Tumor necrosis factor

Receptor- Associated Factor6

14 ROS Reactive Oxygen Species

15 DC-STAMP Dendritic cell specific

transmembrane protein

16 MMP-9 Matrix metallopeptidase 9

iii

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

17 TNFa Tumor Necrosis Factor a

18 PTH Parathyroid hormone

19 wnt Wingless and Int-1

20 CFP Cyan Blue Protein Protein huynh quangmau xanh lo

21 GFP Green Fluorescent Protein Protein huynh quangmau xanh lá cây

20 | col10a1:nIGEP | collagen10al: nuclear Green

Fluorescent Protein

21 Real-time Real-time quantitative Phan img tong hop

qPCR polymerase chain reaction | chuỗi polymerase thời

gian thuc22 DMSO Dimethyl sulfoxide

23 NecX NecroX

24 WT Wild type25 Alen Alendronate

26 Eti Etidronate

27 RES Resveratrol

iv

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

MỞ DAU essssssssssssssssssssssssssssssssssssssssesssssssssssssssssssssssssssssscsssssssesssssssssssssseessssssssessesses 1

CHUONG I. TONG QUAN TÀI LIBU ...2- 2° 2s se sees<essesseessese 5

1.1, Bệnh lỗng xương và thực trạng VỀ DENN cecceccssescscssescscssesvecesssvsesssvsuesssvenseeseevene 5

1.2. Sinh NOC CUA MO XIƠH... HT HH Hệ 6

1.2.1 COic logit DdO KWONG nang nh. .ad..ẢẢ.. 71.2.2. Hoạt động mơ hình và tái mơ hình xương giúp xương phát triển và đổi mới . 9

1.2.3. Tai mơ hình xương và lOGNg XƯƠH... SG Tnhh ghe 10

1.2.4. Con đường RANKL/RANK va sự tham gia cua sốc tự do cho sự biệt hĩa vàhoạt động của tế bào llủ XWƠNg,... - c5 St EEEEEEEEEEEEEEEEE1212111 1111k. 12

1.3. Con đường RANKL/RANK và bệnh lỗng XHƯƠNG... cài sieeecke 15

1.4. Các liệu pháp điểu trị lỗng XưƠNg...----©525ccteEtSEEEEEEEEEEErrerkerrrres 171.4.1. Tổng quan về các liệu pháp điều trị lỗng XIƠIg...---2-55c55e©cz5csz: 17

1.4.2. Thuốc chống lỗng xương nhĩm bisphosphonate, tác dụng và hiệu quả... 181.5. Nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên và tổng hợp cĩ tiềm năng chống lỗng

2,008. ...

—...HHẰỀPĂỶẢẲŸẼÃ£.45d.4... 20

1.5.1 Tiềm năng chống lỗng xương Của reSVeFdfFỌL...-- + +©se+ce+xeceerersscez 211.5.2. Các chất NecroX và tiềm năng chống lỗng xương của NecroX-ä... 231.5.3. Dung mơi DMSO và khả năng ảnh hưởng đến xương...-- 5-55 55¿ 251.6. Mơ hình động vật dùng cho nghiên cứu về lỗng XƯƠNg...--.----©5: 55-552 26

1.6.1. Mơ hình động vật cĩ vú cho nghiên cứu lỗng xương... 24

1.6.2. Cá medaka làm mơ hình cho các nghiên cứu VỀ XưƠng...---:--: 28

1.7. Nghiên cứu sử dụng cá medaka chuyển gen rankl:HSE:CFP làm mơ hình bệnh

LOGI NUON. 00080886... Ả... 32LE. (28.08... ..18..nn668ẦốẦẦ5Ắ... 36

CHƯƠNG II. DOI TƯỢNG, VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU... 37

2.1. Đối tượng NNIEN CUP ... 5-5 5< St EtEEEEEEEEEE122112112111111211.1 111 xe 372.2. Vật liệu, thiết bị, dụng cụ và hĩa chất dùng trong nghiÊH CỨU...- 37

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

2.2.1. VGt TEU NQhien CUU nố.ố.ốố.ố.ố... 37

2.2.2. Hóa chất dùng trong nghién CÚI cecceccesceccssscescessessesseessessessesssessessessesssesseeseeses 372.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí HghÏỆH... nhi ri rrirrrrrrrvee 372.3. Phương pháp nghiên CỨU... -- + 5+6 6+ ‡E‡E‡E£E£ESESEEEEkEteketeterererrrrkrkrkrkrrrrerrrke 382.3.1. Phương pháp nuôi và duty tri CONG CO ...o--c-55cct‡cs+teterkerketsrksrersrkerkererkrre 382.3.2 Phương pháp sốc nhiệt tạo kiểu hình lỗng xương cho cá...-..--- 40

2.3.3Phương pháp chon dòng cá rankl:HSE:CFP và thời gian sốc nhiệt đánh giásốc nhiệt tạo kiểu hình lỗng XUONG vesceccscescesvessesvessssseseesessessessessesesesesseeseeseesessesses 402.3.4.Phương pháp sang lọc xác định cá dHKÏL... . cccckssseesseersseeree 412.3.5. Phương pháp pha chất cho thí nghiệm đánh giá tác dụng của chất trên cá777 8PẺẼẼẼ...-... 41

2.3.6. Phương pháp xử lý, đánh giá tác dung của chất trên cá Rankl...- 44

2.3.7. Phương pháp nhuộm xương cá CO định ...--©-scs+csecee+ec+rsrkerxerrerreee 482.3.8. Phương pháp chụp ảnh và xử lý hình ảnh cá nhuộm C6 định... .. - 49

2.3.9 Phương pháp nhuộm xương huỳnh quang trên cá SONG ...---: 49

2.3.10. Phương pháp Iy đánh giá mức độ khống hóa và tốn thương xương cá ... 49

2.3.11. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của resveratrol/ NecroX-5 đến tế bào tạoxương và sự tạo xương trên cá chuyển gen coll0a1:nlGFP...-.---- s-cs+cs+cs JI2.3.12. Phương pháp đánh giá anh hưởng của chất NecroX-5 đến sự biểu hiện cácgen tham gia vào con đường RdafnKÏ/TQHĂ... - cv kkikkssikereerereere 532.3.13. Phương pháp xử lý thống kê số liỆM...---- 2-2 + +E+EE+EkeEE+EzEzEerterxee 562.3.14. Các phan mém được sử Cur cescesccsscescessessesssessessesssessessessesssessessessssesseesecses 57CHƯƠNG III. KET QUÁ NGHIÊN CUU ...---ccccess<cccccceesse 583.1. Nghiên cứu chọn dòng cá rankl:HSE:CFP và thời gian sốc nhiệt phù hợp... 58

3.2. Anh hưởng của bisphosphonate đến sự ton thương xương ở cá Rankl... 62

3.2.1. Ảnh hưởng cua alendronate đến sự ton thương xương trên cá RÑankl... 62

3.2.2. Ảnh hưởng của etidronate đến sự ton thương xương trên cá RanÄl... 66

3.3. Anh hưởng của DMSO đến mức độ tổn thương xương trên cá Ranll... 69

3.4. Đánh giá kha năng bảo vệ xương của một số hoạt chất trên cá Rankl... 72

vi

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

3.4.1. Anh hưởng của chất tự nhiên resveratrol đến sự ton thương xương trên cá Rankl ... 72

3.4.2. Ảnh hưởng của chất tổng hop NecroX-5 đến sự tổn thương xương của cá Ranll... 77

CHƯƠNG IV. BAN LUẬN ...-5-5< 5< ©c<cesersersereerrerrssrssrsrssrrsrrssrssrssre 914.1. Alendronate va etidronate có tác dung bảo vệ xương cá medaka khỏi ton

thương gây ra bởi Rankl và có thé được dùng như đối chứng dương cho các thửnghiệm đánh giá tác dụng của hoạt Chất ATEN CỐ...-.- 5: Set EE+ESEEEEEESEeErtrtervrs 914.2. DMSO có thé ảnh hưởng đến mức độ ton thương xương của cá Rankl, sử dungDMSO làm dung môi cần chủ ý đến nơng độ ...--:- + +55 ©s+c++£+£zEzxrxeei 944.3. Nghiên cứu đã tìm ra dịng cá và xác định được thời gian sốc nhiệt phù hợp,hồn thiện qui trình sử dụng cá rankl:HSE:CFP dé đánh giá tác dung bảo vệ xương

của các CHấT... cee cee se es es tee bes tes tes ces toe SH HH HH Hs sex se se sec se ĐỐ

4.4. Resveratrol có tác dụng bảo vệ xương cá, làm giảm ton thương xương gây ra bởi4.5. NecroX-5 có tác dụng bảo vệ xương cá theo hướng ức chế hủy xương và kích

thích tạobi —... e een e rete eee e been e eed 101

0000005755 ... 105KIÊN NGHỊ VE NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO...---- 106

DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐÉN LUẬN ÁN. 107

TÀI LIEU THAM KHẢO ...- 2-2 se s£©s£sseEss£+sEssevseerseesserssers 108

);00809 92022257. ...H.... 125

Vil

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

DANH MỤC BANG

Bảng 1.Pha stock cho các nồng độ Resveratrol ...--- 2 sc©s£++++£x++E£+Ext£x+Exvrxerrerrxees 42Bang 2. Pha các nồng độ Resveratrol thử nghiệm ...---- 2 + +£+z+£x+£x+EE+rxezreerxees 42

Bang 3. Pha stock cho các nồng độ NecroX-5...----¿- 2© 2++k‡EE2E2EEEEE2EEEEEerrrrrreeg 43

Bảng 4. Pha các nồng độ NecroX-5 thử nghiệm ...---- 2 2£ 52+ 2+EE+£E£+EEeEEezErrveei 43Bảng 5 . Pha các nồng độ DMSO thử nghiệm...-- 2-2 ©525++E2E£2EEC£E2EEvrxerrerrrees 44Bang 6. Thanh phần phản ứng tổng hop cDNA từ RNA đã tinh sạch (chu trình nhiệt 42°C

trong 1 BIO) TT... ... 54

Bảng 7. Thành phan phản tng ...cecccscccscessessessessessessesssessessecssessesssessesssssessesseessessessesseesees 55

Bảng 8. Các cặp môi sử dung cho phan ứng realtime-qPCR...csccsscsssessesssessesssessesseesseesees 56Bảng 9. Giá trị Ct phản ứng realtime qPCR của cDNA mau xử lý với đối chứng DMSO vàNecroX_5 125uM ở dải pha loãng theo tỉ lệ 1, 1/2, 1⁄4, 1/8 lần với cặp môi J-actin... 84

Bảng 10. Giá trị và Ct, ACt, AACt TRAF6, NFATc1, C-Fos của mau cDNA từ cá xử lý với

NecroX-5 125uM và đối chứng DIMSO...- 5-52 52SE 2E 2EEEEE2EEEEEE21122121 211212. cex 87

Vili

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Mật độ xương khi bình thường (normal bone), khi thiếu xương (osteopenia) vàloãng xương (osteoporosis) được đánh giá bang chỉ số T-score ...-- 2-2 5552 5

Hình 1.2. Hoạt động của tế bào hủy xương ...---¿- ¿+ e+SkeEE£EESEE2E12E1211221 211.11 rxe 9

Hình 1.3 Sự thay đổi của mật độ xương theo tuổi...---¿ 2© 10

Hình 1.4. Các giai đoạn của q trình tái mơ hình xương...---- -- --«++s++x£+ex+eesse++ 11

Hình 1.5. Sự điều hịa biệt hóa và chức năng của tế bào hủy xương bởi tế bào tao xương. 13Hình 1.6. Con đường tín hiệu RANKL/RANK kích thích biệt hóa và hoạt động của tế bào

AUY XUONG 211777 ...a:. .... 14

Hình 1.7. Suy giảm estrogen làm tăng biểu hiện RANKL và giảm biểu hiện OPG dẫn đến

¬... 23

Hình 1.13. Cá medaka và phơi cá 5 ngày tuổi (Oryzias latipes)...-.----:---z-csz5c5z-: 29Hình 1.14: Ảnh chụp huỳnh quang của một ấu trùng cá col10al:nIGFP 11 ngày tuổi đượcnhuộm xương bằng thuốc nhuộm huỳnh quang alizarin eomplexone...---: 32Hình 1.15. Cá chuyển gen rankl :HSE:CFP ban dau và kiểu hình giống lỗng xương của

SP... . 15A1... 33

Hình 1.16. Sơ đồ quy trình nghiên cứu luận ánn...-- 2-2 +£+£++£+£++£+£+£z+zxzzezzxees 36Hình 2.1. Hệ thống ni cá lọc nước tuần hồn tại PTN cá medaka...---- 2 2s: 38

Hình 2.2. Bộ kit huỳnh quang...-- --- - - c1 3118111311191 91119 111 119111 HH tr 41

Hình 2.3. Qui trình xử lý cá dé đánh giá ảnh hưởng của chất nghiên cứu đến sự tổn thươngxương cá; Nt: ngầy tuÔi...-¿-:-2sSt2 2 xEEE211271211271711211 111112111111. T1 11.1111 re 45Hình 2.4. Xử lý hình ảnh, đo chiều dai 15 cung thần kinh dé xác định chỉ số khống hóa Iy

¬——... 50

1X

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

Hình 2.5. Qui trình đánh giá tác dụng của chất đối với tạo xương...---:--s-: 52Hình 2.6. Quy trình tách chiết và tỉnh sạch RNA...-LLQ HS Hs HH HH 54

Hình 2.7. Chu ki nhiệt phan ứng realtime QPCR ... -- ---- cee eeeesecaeceeesetsetseeeeeseaes 55

Hình 3.1. Kiểu hình xương của cá clc6 và clc8 khi sốc nhiệt ở 30,60,90,120 phút... 59

Hình 3.2. Chỉ số khống hóa trung bình Iy và chi số tơn thương xương Ip của các nhóm cá

Rankl dịng clc6 và clc8 phụ thuộc vào thời gian sốc nhiỆt...---¿- 5: 5¿©5s+c5+2 60Hình 3.3. Ảnh hưởng của alendronate đến sự ton thương xương trên cá Rankl... 64Hình 3.4 . Chi số khống hóa Iụ của các nhóm cá Rankl được xử lý với alendronate (A) và

chỉ số bảo vệ xương Ip của alendronate ở các nồng độ thử nghiệm (B)... 65

Hình 3.5. Ảnh hưởng của etidronate đến sự tổn thương xương của cá Rankl... 67Hình 3.6. Chi số khống hóa Iy của các nhóm cá Rankl được xử lý với etidronate (A) vachỉ số bảo vệ xương Ip của etidronate ở các nồng độ thử nghiệm (B)...--- 68

Hình 3.7. Ảnh hưởng của DMSO đến sự tổn thương xương trên cá Rankl...-- 70

Hình 3.8. Chỉ số khống hóa Iy của các nhóm ca Rankl được xử lý với DMSO (A) và chỉ

số bảo vệ xương Ip của DMSO ở các nồng độ thử nghiệm (B)...--- 55555752 71Hình 3.9. Anh hưởng cua Resveratrol đến sự tổn thương xương của cá Rankl... 73

Hình 3.10. Chi số khống hóa Iụ của các nhóm cá Rankl được xử lý với Resveratrol (A) và chỉsố bảo vệ xương Ip của Resveratrol ở các nơng độ thử nghiệm (B)...-.-- ---- 74

Hình 3.11. Resveratrol không ảnh hưởng đến tế bào tạo xương và mức độ khống hóa của

cá col1Oal:nÏTEEP... - 4 <9 HH Tp 76

Hình 3.12. Ảnh hưởng của NecroX-5 đến sự tơn thương xương của cá RankIl... 77Hình 3.13 Chỉ số khống hóa Iy của các nhóm cá Rankl được xử lý với NecroX-5 (A) vàchỉ số bảo vệ xương Ip của NecroX-5 ở các nồng độ thử nghiệm (đ)...-...--- 79

Hình 3.14. Sơ đồ quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của NecroX-5 đến mức độ biéu

hiện các gen liên quan đến tế bào hủy xương...--- + 2 +£++++E++EE++E++EEt£E++rxerxerrxsrxee 80Hình 3.15. Kết qua tách và tinh sạch RNA của hai mẫu xử lý NecroX-5 125 uM và đối

chứng DMSO w...ceessssesssesssesssesssesssecssecssecssessvessvessvessecssessseessecssesssessseessesssecasessuessssssesseesees 82

Hình 3.16. Ảnh điện di kiểm tra sản phim PCR cDNA được tơng hop từ RNA đã được xử

lý DNĐAsef và của hai nhóm cá được xử lý với NecroX-5 và cá đối chứng (DMSO)... 83

Hình 3.17. Giá trị Ct của phản ứng reatime qPCR mẫu cDNA được xử lý với DMSO và

NecroX-5 ở dải pha loãng theo tỉ lệ 1, 1/2, 1/4, l/6...-- c5 << k*sskEsseEeekeeseesse 84

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

Hình 3.18. Đường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ cDNA và giá trị Ct tương ứng củaphản ứng realtime qPCR hai mẫu xử lý DMSO (A) và NecroX-5 (B) với mồi gen nội001 :800.100.0 AE... ...-...Ả... 85

Hình 3.19. Đồ thị giá trị nhiệt độ nóng chảy (Melt curve) (Tm) của sản phẩm qPCR khuếch

đại từ các mau cDNA của cá được xử lý DMSO (Hình A) và NecoroX-5 (Hình B) với mỗi

100 06)929000)027.0100201600u. 11-5 ... $6

Hình 3.20. Chênh lệch mức độ biểu hiện các gen C-Fos, NEATcl, TRAF6 của cá được xử1¥ NecroX-5 so vOi ca Oi CHUNG. nh... .-.-.Ả.. 87Hình 3.21. NecroX-5 làm tăng biểu hiện biểu hiện collagen10al của tế bào tạo xương va

mức độ khống hóa của cá col10a1[:nÏGFE... .-- c6 s9 nh ng ng 89

Hình 4.1 Mơ hình con đường tín hiệu RANKL tạo gốc tự do ROS và sự biệt hóa và hìnhthành của tế bào hủy XưƠNg...---2¿- 2:2 22x2EE2EE2E1221221221221211211211 21121... crye. 103

XI

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

KÍ HIỆU TÊN GENE, PROTEIN THEO LOÀI

Tên gen và protein của cá medaka, chuột và người được việt dựa theo hướng

dẫn về cách viết trên cá zebrafish ( Ví du, tên

gen và protein RANKL của cá medaka, chuột và người được viết như sau:

Loài Gene Protein

Medaka rankl Rankl

Chuột Rankl RANKL

Người RANKL RANKL

xH

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

MỞ ĐẦU

Loãng xương (osteoporosis) là bệnh xương pho biến, nhất là ở phụ nữ sau mãnkinh và người cao tuổi, biểu hiện bởi mật độ xương giảm thấp, cấu trúc xương bịphá hủy làm xương xốp, giòn và tăng nguy cơ bị gay. Bệnh có diễn tiến thầm lặng

và thường chỉ được phát hiện khi xương bi gay do trượt ngã hay do tác động ngoại

lực. Gẫy xương do loãng xương gây hệ lụy rất nghiêm trọng tới người bệnh, giađình và xã hội vì bệnh nhân có thể bị tử vong hay phải sống phụ thuộc với thời gianđiều trị lâu dài với chi phí rất cao [Tu; 2018].

Lỗng xương được chia thành hai loại là loãng xương nguyên phát do già hóa

và lỗng xương thứ phát do các ngun nhân khác. Với tốc độ già hóa dân số tăng

nhanh trên toàn cầu cũng như ở Việt Nam hiện nay, cùng với những yếu tố nguy cơnhư lối sống ít vận động, dùng nhiều rượu, thuốc lá, có các bệnh lý nền cũng nhưviệc lạm dụng thuốc (glucocorticoid), s6 lượng người bị bệnh ngày càng tăng, làthách thức rất lớn cho y tế cơng cộng [Tu; 2018].

Các thuốc chống lỗng xương hiện nay có tác dụng theo một hoặc hai hướng

ức chế hủy xương hoặc/và kích thích tạo xương, bao gồm các hormone và dẫn xuất

của hormone, các kháng thể; phổ biến nhất là các thuốc thuộc nhómbisphosphonate. Tuy nhiên, với hiệu quả còn hạn chế, mỗi loại thuốc đều có nhữngtác dụng phụ khơng mong muốn [Green; 2010, Kennel;2009, Maraka; 2015, Watts;2003]. Vì vậy nghiên cứu tìm ra các thuốc điều trị lỗng xương mới hiệu quả, an

tồn hơn ln được quan tâm.

Mơ hình truyền thống cho các nghiên cứu đánh giá tác dụng bảo vệ xương củacác hoạt chất dé phát triển thuốc thường là động vật có vú. Tuy nhiên, gần đây, hailoài cá là cá medaka (Oryzias latipes) và cá ngựa văn (Damio rerio) được sử dụngngày càng nhiều vì có nhiều ưu điểm của động vật thí nghiệm như đẻ nhiều, thờigian thé hệ ngăn, chi phí thấp, dé chuyên gen, tao đột biến và quan sát các q trìnhsơng bằng các kĩ thuật hình anh. Chúng đặc biệt phù hợp cho nghiên cứu in vivo

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

sàng lọc hoạt chất ở những bước đầu của quá trình phát triển thuốc [Wittbrodt;20021.

Năm 2012, cá medaka chuyền gen rankl:HSE:CFP được tạo ra tại Đại họcQuốc gia Singapore làm mơ hình bệnh lỗng xương và sàng lọc chất có hoạt tínhchống lỗng xương. Kiéu hình giống lỗng xương ở cá này có thé gây được bangcách sốc nhiệt vì hệ gen của cá chứa cấu trúc gen chuyển chứa gen rankl mã hóacho yêu tố kích thích hủy xương Rankl (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) được điều khién bởi promotor cảm ứng nhiệt [To; 2012]. Tang RANKLđã được biết có liên quan đến cả loãng xương nguyên phat va thứ phát

[Cheng;2022, Choi;2013], do vậy mơ hình bệnh lỗng xương gây ra bởi tăng

RANKL có ưu thế hơn mơ hình được tạo ra bởi các cách khác. Do đó, từ khi tiếp

nhận cá chuyền gen ban đầu từ Đại học Quốc gia Singapore, nhóm chúng tơi đã tiếptục nghiên cứu hồn thiện cá va và qui trình sử dung nó dé đánh giá tác dung của

chất có hoạt tính chống lỗng xương.

Đầu tiên, nhóm nghiên cứu đã lai tách cá gốc ban đầu thành các dưới dịng cá

trong đó có dịng clc6 và clc8, mỗi dịng có các cá thé có biểu hiện gen rankl vàkiểu hình tơn thương xương đồng đều, chỉ thể hiện ở xương cung thần kinh ở một

mức độ nhất định, làm cơ sở cho việc phát triển phương pháp định lượng mức độton thương xương dựa trên chiều dài của các xương này [Cường; 2015].

Luận án “Nghiên cứu mô hình bệnh lỗng xương trên cá medaka chuyển genvà đánh giá tac dụng chống loãng xương của một số hoạt chất” được thực hiện với

hai mục tiêu chính:

1. Nghiên cứu cá chun gen rankl:HSE:CFP, hồn thiện phương pháp và quytrình sử dụng cá làm mơ hình bệnh lỗng xương dé đánh giá hoạt tính bảo vệ xương

của các chất

2. Đánh giá tác dụng bảo vệ xương của một số hoạt chất sử dụng mơ hình cá

và qui trình xây dựng được.

Đề thực hiện được các mục tiêu này, cá rankl:HSE:CFP dịng clc6 và clc8

tiép tục được nghiên cứu, sơc nhiệt ở các thời gian khác nhau đê chọn ra dòng ưu

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

thế hơn; tác dụng của hai dược chất chống lỗng xương nhóm bisphosphonate làalendronate và etidronate với sự ton thương xương cá được đánh giá để góp phan

xây dựng phương pháp định lượng mức độ khống hóa và tổn thương xương cũngnhư tìm ra nồng độ chất phù hợp dé làm đối chứng dương cho thí nghiệm. Thêmvào đó, ảnh hưởng của dung mơi DMSO dé hịa tan các chất với sự tơn thươngxương cá cũng được xác định dé hồn thiện qui trình sử dụng dịng cá này làm mơ

hình bệnh lỗng xương sử dụng cho việc đánh giá hoạt tính bảo vệ xương của hai

hoạt chất tiềm năng là chất tự nhiên resveratrol và chất tổng hợp NecroX-5.

Kết quả nghiên cứu đã hoàn thiện được phương pháp và qui trình sử dụng cárankl:HSE:CFP làm mơ hình bệnh lỗng xương, lần đầu tiên phát hiện ra ảnh hưởng

theo nồng độ của dung môi DMSO đến chuyền hóa xương cá cũng như cho thấy tácdụng bảo vệ xương của chất tông hợp NecroX-5. Đây cũng là nghiên cứu của nhóm

đầu tiên ở Việt Nam sử dụng cá làm mơ hình bệnh xương.

* Tính mới của luận án

1. Tìm được dịng cá rankl:HSE:CFP phù hợp (dịng clc8), b6 sung một số chỉsố dé hoàn thiện được qui trình sử dụng dịng cá này cho việc đánh giá tác dụng bảo

vệ xương của các chất: chế độ sốc nhiệt với thời gian 90 phút ở nhiệt độ 39°C; nồng

độ dung mơi DMSO được dùng dé hịa tan chất có thé xử lý trên cá là dưới 0,5%;nơng độ alendronate có thé được sử dung làm đối chứng đương là 25Iig/ml hay 50

2. Khang định tác dung ức chế hủy xương của hai thuốc chống lỗng xương

bisphosphonate thơng dụng là alendronate và etidronate trên mơ hình cá medakarankl:HSE:CFP khi được phân tích bằng cách nhuộm xương cố định. Kết quả này

góp phần xây dựng được phương pháp Iy xác định mức độ khống hóa và tổn

thương xương của cá.

3. Lần đầu tiên xác định được dung mơi DMSO có thé anh hưởng đến mức độton thương xương gây ra bởi Rankl trên cá medaka và đưa ra khuyến cáo về việc sử

dụng DMSO cho nghiên cứu trên cá này.

Ww

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

4. Khang định được resveratrol có tác dung làm giảm tốn thương xương gây ra

bởi Rankl trên cá rankl: HSE:CFP mơ hình bệnh lỗng xương.

5. Lần đầu tiên cho thấy chất tổng hợp NecroX-5 có tác dụng bảo vệ xươngtrên cá medaka thé hiện qua tác dung ức chế hủy xương và kích thích tạo xương.Điều này gợi ý tiềm năng nghiên cứu phát triển chất và các hợp chất NecroX-5

thành thuốc chống loãng xương.

* Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Các kết quả nghiên cứu của luận án cũng khăng định thêm giá trị của cá

medaka rankl:HSE:CFP làm mơ hình bệnh lỗng xương va góp phan phát triển việc

dùng cá làm động vật mơ hình nghiên cứu ở Việt Nam, tiệm cận với nghiên cứu

trên thế giới.

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

CHUONG I. TONG QUAN TÀI LIEU

Tình trạng bệnh loãng xương được xác định khi người bệnh có chỉ số T

(T-score) nhỏ hơn -2,5 (Hình 1). T-score được tính dựa trên giá trị mật độ xương (Bone

mineral density -BMD) đo được bằng phương pháp hấp thụ tia X năng lượng kép

(dual — energy x-ray absorptiometry) DXA và giá tri mật độ xương đỉnh (pBMD)

được xác định trong quan thé [35].

Trên thế giới hàng năm có khoảng 200 triệu người bị loãng xương và khoảng8,9 triệu người bị gãy xương, trong đó chủ yếu là gãy xương hơng [67]. Theo dự

báo tại Mỹ, trong năm 2020 có khoảng 10 — 14 triệu người bi loãng xương với tỷ lệ

người trên 50 tudi bị loãng xương tăng 60% trong giai đoạn từ năm 2000 đến năm

2025 [166]. Ước tính rằng có khoảng 50% phụ nữ và 20% nam giới trên 50 tuổi sẽ

bị gãy xương trong phần đời cịn lại của họ [146]. Lỗng xương làm tăng nguy cơ

gãy xương, đặc biệt là gãy xương hông [63].

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

Gãy xương hông (thường do ngã) là biến chứng nghiêm trọng nhất của lỗng

xương vì nó làm mat sự độc lập, làm suy giảm đáng ké chất lượng sống, thậm chí

làm tăng nguy cơ tử vong của người bệnh tới 20%; hơn nữa nó cịn dễ dẫn đến biếnchứng gay xương cột sống, dễ bị tái phát, đặc biệt là ở người cao tuổi [79, 120].Đáng chú ý, tỷ lệ gãy xương hông tăng theo cấp số nhân ở nữ từ 60 — 85 tuổi [36].

Ở Việt Nam, nghiên cứu cho thấy phụ nữ sau mãn kinh, cứ 100 người thì có25 đến 30 người; nam giới trên 50 tuổi, cứ 100 người thì có 10 người bị lỗngxương. Điều này cho thấy tình trạng lỗng xương ở Việt Nam tương đương với cácnước phương Tây [57]. Dựa vào cơ cau dân số Việt Nam năm 2010 và dự báo dânsố đến năm 2050, ước tính số ca loãng xương năm 2010 là khoảng 2,9 triệu ngườiloãng xương, trong đó có 2,36 triệu là nữ [56]. Con số lỗng xương này có thể tăng

lên 4,3 triệu vào năm 2020 và xấp xi 11 triệu người vào năm 2050. Tỉ lệ biến chứnggãy xương sau loãng xương ở Việt Nam cũng tương đối cao, ở Thành Phố Hồ Chí

Minh cho thấy cứ 10 phụ nữ sau mãn kinh ở độ tuổi trên 50 thì có đến 2-3 người có

dau hiệu gãy xương đốt sống, còn ở người trên 70 tuổi thì tỉ lệ gãy xương đốt sống cóthé lên đến 40% [57].

Chi phí điều trị các biến chứng của loãng xương rất tốn kém và tăng liên tục

trong những năm gan đây. Cụ thé năm 2015 Mỹ đã tốn khoảng 637,5 triệu đơ la chiphí điều trị cho các chấn thương do ngã gãy xương và biến chứng cũng như xử lýkhi tử vong; trong đó, chi phí nhập viện trung bình cho một năm điều trị gãy xươngđã là trên 300 triệu đô la. Đến năm 2025, chỉ phí điều trị gãy xương do lỗng xươngở Mỹ dự kiến sẽ vượt 25 tỷ đô la [166].

1.2. Sinh học của mô xương

Mô xương là mô liên kết đặc biệt ln có khả năng tự đổi mới và có nhiều chức

năng trong cơ thé. Xương làm khung, là chỗ dựa, bảo vệ cho các cơ quan, đặc biệt, nó

phối hợp với hệ co đảm nhiệm chức năng vận động cho cơ thé. Ngồi ra, xương cịn là

nơi sản xuất các tế bào tạo máu và là kho dự trữ canxi và phospho [51].

Mơ xương gồm có các tế bào xương được bao quanh bởi chat nền xương(bone matrix) là dịch ngoại bào được khống hóa. Chất nền xương có 65% là thành

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

phần vô cơ gồm các tinh thể hydroxyapatite có tác dụng làm xương chắc, cứng và35% là thành phần hữu cơ (osteoid) chứa collagen, proteoglycan làm xương dẻo,

đàn hồi. Các loại tế bào xương chính bao gồm tế bào tạo xương (osteoblast), tế bàohủy xương (osteoclast) và tế bào xương (osteocyte) [45]. Khi các thành phần trongxương được duy trì cân băng thì xương khỏe, chịu lực tốt và thực hiện được các

chức năng [43].

1.2.1 Các loại tế bào xương

Xương phát triển theo sự phát triển của cơ thể, luôn đổi mới trong suốt cuộcđời nhờ hoạt động chuyền hóa được thực hiện bởi các tế bào xương bao gồm tế bàotạo xương, tế bào hủy xương và tế bào xương trong các quá trình mơ hình (bone

modeling) và tái mơ hình hay tái tạo xương (bone remodeling) [8].

1.2.1.1. Tế bào tạo xương và hoạt động khống hóa xương

Tế bao tạo xương (osteoblast) có nguồn gốc từ tế bào gốc trung mô

(mesenchymal stem cells (MSCs) và chiếm 5% trong tổng số các tế bào của mơ

xương. Sự biệt hóa tế bào gốc trung mơ thành tiền tế bào tạo xương và tế bào tạoxương chịu ảnh hưởng của các yếu tố điều hòa như BMPs (Bone morphogenetic

proteins), các yếu tố trong con đường tín hiệu Wtn và các yếu tố phiên mã như

Twist, Runx2, Osterix (Osx) [156].

Tế bao tạo xương sản xuất chất nền xương, bắt dau bằng việc tiết ra phan hữucơ của chất nền, sau đó khống hóa phần hữu cơ này (q trình khống hóa xương -mineralization). Trong bước đầu tiên, tế bào tạo xương tiết protein collagen, chủyêu là collagen I và các protein không phải collagen như osteonectin, osteopontin,

proteoglycan, osteocalcin. Sau đó, tế bào này tiết ra các ống dé liên kết các thành

phần hữu cơ trong chất nền xương và các enzym giúp giải phóng canxi và phosphat,điển hình là alkaline phosphatase (ALC) để khống hóa chất nền (bone

mineralization). Tại đây, ion canxi kết hợp với phosphat tạo thành hợp chất

hydroxyapatit dạng tinh thê tạo nên độ cứng của xương [17]. Cùng với việc sản xuất

chất nền xương, các tế bào tạo xương tiếp tục phát triển thành tế bào tạo xương

trưởng thành có hình khối đa giác; tiếp theo đó, một số tế bào tạo xương trưởng

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

thành giảm hay dừng sản xuất chất nền xương, nằm hay bị “chơn” trong khối chấtnền xương khống hóa trở thành tế bào xương trưởng thành (osteocyte), hay có thétồn tại ở dạng khơng hoạt động, hoặc bị chết hay có thê trở thành tế bào lót (lining

cells) [46].

Tế bào tạo xương hoạt động trong mối tương tác chat chẽ với tế bao xương vàtế bào hủy xương dé duy trì sự phát triển và sức khỏe của xương. Nó tiết ra các utố điều hịa sự biệt hóa và hoạt động của tế bào hủy xương cũng như tiếp nhận tínhiệu từ tế bào xương và hủy xương điều hịa hoạt động của mình (xem thêm ở phần

1.2.3) [29].

1.2.1.2. TẾ bào xương

Tế bào xương (osteocyte) chiếm hon 90% số tế bào trong mơ xương. Nó có ởcả lớp xương đặc tạo vỏ ngoài của mỗi xương và lớp xương xốp nằm trong xươngđặc. Các tế bào xương liên kết với nhau thông qua các tua, nhánh dé trao đôi chất

dinh dưỡng, chất thải, cũng như truyền các kích thích cơ học. Tế bào xương cũng có

có vai trò quan trọng trong việc điều hòa cả tế bào tạo xương và hủy xương cũngnhư sự trao đôi phosphat [19].

1.2.1.3. Tế bào hủy xương

Tế bào hủy xương (osteoclast) có nguồn gốc từ tế bào gốc tạo máu dòng bạchcầu đơn nhân (monocyte) và đại thực bào (macrophage)[102]. Nó có kích thước lớn(đến vài trăm pm) , nhiều nhân (từ 10-100 nhân) do được tạo thành từ sự dung hợpcủa nhiều tế bào đơn nhân [21]. Tế bào hủy xương phá hủy xương cũ hay xương bịtôn thương dé đổi mới mơ xương.

Tế bào hủy xương có phần màng có nhiều chân nhánh (ruffled border) tiếp xúc

và gắn với bề mặt xương bị hủy thông qua vitronectin là một protein của xương.Phần màng này có nhiều bom ion HỶ tạo mơi trường axit hịa tan tinh théhydroxyapatit và phần vơ cơ của chất nền xương. Các protease và enzym nhưTRAP (Tartrate — Resistant Acid Phosphatase) được tế bào hủy xương tiết ra dé

thủy phân collagen và phần hữu cơ của xương [169] (Hình 1.2).

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

Hoạt động của tế bào hủy xương được kích hoạt thơng qua thụ thé IL-6 vàRANK và ức chế bởi hormon calcitonin (Hình 1.2) do tuyến giáp tiết ra [42].

Calcitonin —G, chế quá trình

hủy xương

Adenylyl cyclase Thụ thể IL6, RANK

Dan TaVsjorossem Ẵ resistant

Hình 1.2. Hoạt động của tế bào hủy xương [169]

1.2.2. Hoạt động mơ hình và tái mơ hình xương giúp xương phát triển và đổi

Mơ xương rất năng động, nó thay đổi trong suốt cuộc đời nhờ các q trình

mơ hình xương hay tạo xương (bone modeling) và tái mơ hình xương hay tái tạo

xương (bone remodeling) (Hình 1.3) [87].

Xương phát triển về kích thước, hình thái và sức mạnh trong giai đoạn pháttriển đầu của cơ thể nhờ hoạt động mơ hình xương, trong đó tạo xương và hủy

xương xảy ra độc lập ở các vi trí khác nhau và tạo xương mạnh hơn hủy xương [97].

Mật độ xương đỉnh đạt được vào khoảng 25—30 ti [15, 99]. Sau đó, mật độ xương

bắt đầu giảm dần do tái mơ hình xương chiếm ưu thế, trong đó hủy xương lnđược tiếp theo bởi tao xương tại cùng một vi trí và thường mạnh hon tạo xương.

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

Tuy nhiên, mật độ xương được duy trì tương đối ổn định trong khoảng 5-10 năm

sau tuổi 30 do hủy xương chỉ tăng nhẹ so với tạo xương. Sau tuôi 35, cả nam và nữsẽ mat dan khoảng 0,3-0,5% mật độ xương mỗi năm [37, 173]. Mật độ xương giảmmạnh nhất ở phụ nữ trong tuôi từ tiền mãn kinh đến 4-8 năm sau mãn kinh khi nồngđộ hormon estrogen giảm mạnh (45-60 tuổi) gây tăng nguy cơ loãng xương [117].Ở độ tuổi 65 trở lên, tỉ lệ loãng xương ở nam và nữ gần như nhau; quá trình matxương diễn ra từ từ, kéo đài cho tới cuối đời (Hình 1.3).

Mơ hình Tái mơ hình

xương :/J——— xương ————>Suy giảm khối lương xương

Mat xương dan dan

Hình 1.3 Sự thay đổi của mật độ xương theo tuổi [85]

Từ 0-20 tuổi, xương bắt đâu phát triển, từ tuổi 20-30, q trình tạo xương haymơ hình xương chiếm wu thé và sự phát triển xương đạt đỉnh (peak bone growth).Sau tuổi 30, hoạt động tái mơ hình hay tái tạo xương chiếm ưu thế, xương mắt dân.

Như vậy, mat xương và loãng xương xảy ra khi xương được tái mơ hình, do sự

mat cân bang của hủy xương và tạo xương.

1.2.3. Tái mơ hình xương và lỗng xương

10

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

Tái mơ hình xương hay tái tạo xương (bone remodeling) xảy ra ở bề mặt của

các xương xốp và ở lớp nội màng của xương đặc (endocortical surface/endosteum).

Tái mơ hình xương diễn ra trong đơn vị cơ bản đa tế bao (basic multicellular BMU) trên bề mặt xương theo các giai đoạn (Hình 1.4): (1) Khởi đầu: tiền tế bàohủy xương nhận tín hiệu (RANKL) từ tế bào tạo xương dé di chuyên đến vị trí, biệthóa thành tế bào hủy xương hoạt động. (2) Giai đoạn hủy xương: tế bào hủy xươnggắn vào bề mặt xương, phân hủy xương cũ, hỏng và giải phóng các yếu tố kíchthích sự biệt hóa tế bào tạo xương. (3) Giai đoạn đảo ngược: tế bào hủy xương chết,các tiền tế bào tạo xương nhận tín hiệu, di chuyên đến vị trí xương mới bị hủy débiệt hóa. (4) Giai đoạn tao xương: tiền tế bào tạo xương biệt hóa thành tế bào tạoxương trưởng thành sản xuất chất nền khống hóa tạo xương mới thay thế. Một số

unit-tế bào tạo xương có thê trở thành unit-tế bào xương hay unit-tế bào lót [39].

Tái mơ hình xương

Giai đoạn khởi đầu ! - Giai doạn Giai đoạn Giai đoạn hình

Tiền tế bào hủy phân hủy đảo ngược thành xương

Tiên tê bào tao

Chết theo Tế bảo tạo

Tebaohuy | chutrình XƯƠNg

Tế bao lót

Cement line

Hình 1.4. Cac giai đoạn của qua trình tai mơ hình xương [38]

Tế bảo xương xuong

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

trì. Khi phụ nữ mãn kinh hay lão hóa, hủy xương lan át tạo xương dẫn đến mat

xương và nguy cơ lỗng xương [152]. Các yếu tơ tham gia điều hịa hoạt động của

tế bào hủy xương đóng vai trò rất quan trọng trong các rối loạn này.

1.2.4. Con đường RANKL/RANK và sự tham gia của gốc tự do cho sự biệt hóa vàhoạt động của tế bào hủy xương

Tế bào hủy xương được hình thành và biệt hóa dưới sự điều khiển của hai utố chính là RANKL (receptor activator of nuclear factor kappa beta (NFkB) ligand))va M-CSF (marcrophge colony-stimulating factor) [155] được sản xuất bởi tế bao

tao xuong [171].

M-CSF có vai trị duy trì sự tồn tại va tăng sinh của tiền tế bào hủy xương [9].

RANKL, còn được gọi là OPGL (osteoprotegerin ligand), hay ODF (osteoclastdifferentiation factor), hay TRANCE (TNF related activation-induced cytokine) là

protein thuộc họ protein yếu tô hoại tử khối u (TNF) và được xác định có vai trịchủ yếu trong việc kích thích biệt hóa và hoạt động của tế bào hủy xương thơng qua

con đường tín hiệu RANKL/RANK [86].

RANKL được tế bào tạo xương sản xuất đưới hai dạng, một dạng gắn VỚI

màng tế bào và một dạng phân tử tự do. RANKL gắn với thụ thể RANK trên bề mặt

tiền tế bào hủy xương và kích hoạt loạt tín hiệu dé biệt hóa và hoạt hóa tế bào hủy

xương (Hình 1.5) [91].

12

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

Tiền tế bào hủy DC-STAMP/OC-STAMP

đP Hoạt hóa cy

Tế bao hủy xương

Tế bào hủy xương

đạng hoạt động

Hình 1.5. Sự điều hịa biệt hóa và chức năng của tế bào hủy xương bởi tế

bào tạo xương [149]

Bên cạnh đó, tham gia điều hịa biệt hóa tế bào hủy xương cịn có vai trị củaOPG (osteoprotegerin) cũng do tế bào tạo xương sản xuất. OPG cũng là một thụ théthuộc họ thụ thể yếu tố hoại tử khối u nhưng tồn tại ở dạng tự do và không gắnmàng. OPG gắn với RANKL, ức chế liên kết RANKL-RANK, qua đó ức chế vàlàm giảm sự hình thành tế bào và hoạt động hủy xương [144]. OPG do vậy còn

được gọi là yếu tố bảo vệ xương hay yếu té ức chế hủy xương (osteoclasts inhibitor

factor (OCIF)). Tỉ lệ RANKL/OPG quyết định lượng tế bào hủy xương được hình

thành và lượng xương bị hủy; khi RANKL tăng làm tỉ lệ này tăng sẽ gây tăng hủy

xương dẫn đến mat xương và lỗng xương [82] (Hình 1.5).

Về con đường truyền tín hiệu RANKL/RANK để biệt hóa tế bào hủy xương từ

tiền tế bào hủy xương, RANKL gắn với RANK làm cho RANK được hoạt hóa, thu

hút và gan với protein adaptor là TRAF6 (tumor necrosis factor receptor- associated

factor 6) (Hinh 1.6).

13

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

Dung hợp tế bào

DC-STAMPMàng nhân

Hình 1.6. Con đường tín hiệu RANKL/RANK kích thích biệt hóa va

hoạt động của tế bào hủy xương [48]

Tiếp theo, TRAF6 kích hoạt con đường tín hiệu MAPK (mitogen-activatedprotein kinase) hay NF-Kb dẫn đến việc hoạt hóa yếu tố phiên mã c-Fos [118, 186].

Ở bước cuối của con đường tín hiệu RANKL/RANK, c-Fos kích hoạt yếu tố phiênmã NFATc1 (nuclear factor of activated T-cell cytoplasmic 1) làm yếu tố này dichchuyén vao trong nhan dé kích thích biểu hiện các gen đặc hiệu của tế bào hủyxương như gen DC-STAMP giúp các tế bào đơn nhân dung hợp thành dạng đa nhân

trưởng thành hay các gen cathepsin K, MMP-9, OSCAR (osteoclast-associated

receptor) có vai trị trong sự biệt hóa và hoạt động chức năng của tế bào hủy xương(Hình 1.6) [33].

Như vậy, có thé thay TRAF6, c-Fos và NFATcl là các yếu tố quan trong trong

con đường RANKL/RANK cho sự biệt hóa và hoạt động của tế bào hủy xương.Thêm vào đó, một số nghiên cứu gần đây cho thấy, tham gia vào con đường tín hiệunày cịn có vai trị của các gốc tự do (reactive oxygen species — ROS) [6, 153].

14

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

RANKL gan với RANK kích hoạt phan ứng tạo các ROS; ROS được tao ra kích

hoạt các con đường tín hiệu RANKL/RANK, bao gồm cả c-Fos và NFATc1 [6].

Ngồi tác dụng kích thích hủy xương, các gốc tự do cịn cho thay có thé ức chế hìnhthành và biệt hóa của tế bào tạo xương [153]. Đây là cơ sở gợi ý tiềm năng chốngchống loãng xương theo hướng ức chế hủy xương và kích thích tạo xương của mộtsố chất có tính chống oxy hóa cao, như đã được chứng minh ở một số nghiên cứu

[40, 55, 123].

1.3. Con đường RANKL/RANK và bệnh lỗng xương

Có nhiều ngun nhân có thé dẫn đến lỗng xương, phố biến nhất là lỗng

xương do lão hóa ở phụ nữ sau mãn kinh do suy giảm hormon estrogen và ở nam

giới cao tuổi. Ngồi ra, có nhiều yếu tố nguy cơ gây lỗng xương khác như lối sốngít vận động, uống rượu, hút thuốc lá nhiều, bệnh lý nền (bệnh thận, gan, viêm khớpdạng thấp) hay sử dụng thuốc (glucocorticoid). Do vậy, loãng xương được chia làm

hai dạng là loãng xương ngun phát do lão hóa và lỗng xương thứ phát do cácnguyên nhân khác [166].

Đáng chú ý là cả hai loại bệnh loãng xương đều liên quan đến sự mắt cân bằngtrong chuyền hóa mơ xương, làm tăng RANKL, giảm OPG dẫn đến tăng hủy xươngvà mat xương [20, 126]. Loãng xương nguyên phát liên quan đến sự suy giảm vathiếu hụt hormon giới tính (estrogen ở nữ và testosteron ở nam) khi lão hóa; trongđó sự suy giảm estrogen diễn ra nhanh chóng ở phụ nữ ở thời kì tiền và sau mãnkinh [30, 65]. Estrogen kích thích sự biệt hóa tế bào sốc trung mơ thành tế bào tạoxương trưởng thành đề tăng tiết OPG và giảm tiết RANKL; đồng thời nó có thể ức

chế tế bào miễn dich sản xuất yếu tố hoại tử khối u TNF-a kích thích biệt hóa tế bào

hủy xương. Do đó, suy giảm estrogen làm giảm OPG và tăng RANKL cũng như

TNF-a, gây tăng hủy xương dẫn đến lỗng xương (Hình 1.7) [30].

15

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

Suy giảm estrogen

Ỳ RANK | Tăng phân hủy

Tếbàotạo | @|—_—_——— ,| “$ RANKL † , - \ —> Xương

cũng như giảm sự chết theo chu trình của tế bào hủy xương dẫn đến tăng nguy cơ

loãng xương (Hình 1.8) [32, 58].

16

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

Điều trị glucocorticoid kéo dai

\

4 Sex

JOP@ | ¬

Tế bào tạo T RANKL Te bao

xương hủy xương

Giảm biét héa va ting — Tầng hoạt dong phân hủy

chết theo chu trình xương, tang sức song và

giảm chet theo chu trình

Giảm tạo xương

Tăng hủy xương

Hình 1.8. Điều tri glucocorticoid kéo dài dẫn đến tăng RANKL, tăng

hủy xương và giảm tạo xương [53].

Như vậy có thể thấy, tăng RANKL là cơ chế chính gây ra tăng hủy xương ở

các loại bệnh loãng xương và rối loạn thiếu xương khác nhau.

1.4. Các liệu pháp điều trị loãng xương

1.4.1. Tổng quan về các liệu pháp điều trị loãng xương

Các thuốc và liệu pháp để phòng chống và điều trị loãng xương đều hướng đếnmục tiêu tăng tạo xương hoặc/và giảm hủy xương. Điều trị lỗng xương có thể dùng

liệu pháp không dùng thuốc kết hợp với liệu pháp dùng thuốc. Liệu pháp khôngdùng thuốc tập trung vào cải thiện lỗi sống như tập luyện, hạn chế hút thuốc, uốngrượu và tập kỹ năng vận động dé giảm ngã cùng với việc bổ sung canxi, vitamin D

Thuốc chống loãng xương có tác dụng theo một hay cả hai hướng: chống hủy

xương (anti-resorptive agents) hoặc/và tăng tạo xương (anabolic agents). Các thuốcchống hủy xương thơng dụng bao gồm thuốc nhóm bisphosphonate tác dụng theohướng ức chế hay giết tế bào hủy xương và denosumab là kháng thé đơn dongkháng yếu t6 kích thích hủy xương RANKL. Một số hormon như PTH và dẫn xuất

được dùng như thuốc kích thích tạo xương [26]. Với loãng xương ở phụ nữ mãn

kinh, liệu pháp thay thế hormone (HRT) dùng bé sung estrogen được cho thấy có

17

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

hiệu quả làm giảm mất xương, chống suy giảm cấu trúc xương cũng như giảm nguy

cơ gãy xương ở tất cả các vị trí. Liệu pháp này hiện đang được đề xuất là lựa chọn

đầu tiên dé chống loãng xương cho phụ nữ mãn kinh sau một thời gian bị giảm chỉđịnh do khuyến cáo dựa trên phân tích chưa đầy đủ về tác dụng và nguy cơ gây ra

do việc bé sung estrogen [49].

Mới đây, một loại thuốc tăng tạo xương mới đã được sử dụng là romosozumab,là một kháng thé đơn dòng ức chế hoạt động cua sclerostin do đó làm kích hoạt conđường tín hiệu Wtn dẫn đến kích thích quá trình tạo xương.Thêm vào đó, nó cũng cóthé ức chế hủy xương [81]. Tuy nhiên, giá thành thuốc còn rất cao và cũng như nhữngthuốc chống lỗng xương khác, nó cịn có những tác dụng phụ khơng mong muốn

1.4.2. Thuốc chỗng lỗng xương nhóm bisphosphonate, tác dụng và hiệu quả

Bisphophonate là nhóm thuốc chống lỗng xương thơng dụng nhất có tác dụngtheo hướng chống hủy xương, và thường được chỉ định như thuốc đầu tay cho bệnhnhân loãng xương do mãn kinh và cả bệnh nhân nam [101, 180]. Các chất thuộcnhóm bisphosphonates là dẫn xuất của pyrophosphate chứa hai nhóm phosphate (Hình

1.9) có ái lực cao với canxi có trong hydroxyapatite là thành phần vơ cơ chính trong

xương. Do vậy, các chất này có thể được gắn kết vào xương, đặc biệt là tại những nơiđang có hoạt động hủy xương mạnh, qua đó ảnh hưởng đến chức năng và sự tồn tại

của tế bào hủy xương (Hình 1.9) [71].

PO3H2 PO3H2

Etidronate Alendronate

Hình 1.9. Cơng thức cau tạo của các thuốc nhóm bisphosphonate [93]

18

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

Có hai nhóm bisphosphonate (BPs), nhóm thuốc thế hệ đầu chứa khơng chứa nitơ

(non-N-BPs) (như etidronate, clodronate và tiludronate) và nhóm thuốc thế hệ sau có

chứa nito (N-BPs) (như alendronate, ibandronate, zoledronate va risedronate). Hai

loại BPs này có tác dụng khác nhau trên tế bào hủy xương, trong đó non-N-BPs gâychết tế bào hủy xương, cịn N-BPs có tác dụng chủ yếu thơng qua việc ức chế hoạtđộng của tế bào hủy xương (Hình 1.10) [93]. Nhóm thuốc chứa nito có kha năng ức

chế hủy xương cao hơn thuốc etidronate không chứa nitơ từ 100 - 10.000 lần [72] do

vậy hiện nay các thuốc nhóm N-BPs được sử dụng nhiều hơn.

Tế bào lót Tế bào hủy Tế bào hủy Kye yo

, KK gs wk Tê bao hủy

(có nguồn goctr xương hoạt xương bị bat “ương hết

tế bào tao xương) động hoạt Š

Hình 1.10. Cơ chế tác dụng của thuốc bisphosphonates chứa nito (N-BPs) ([134])

Bisphosphonate (BPs) gắn đặc hiệu với chat nên khống hóa của xương tạinơi có các tế bào hủy xương đang hoạt động. BPs được các tế bào hủy xương lấyvào trong tế bào, ức chế enzym (farnesyl diphosphate synthase) tham gia vào quá

trình tổ chức bộ máy khung xương tế bào và vận chuyển nội bào, làm mang ruffledborder không duoc hình thành, tế bào bị mat chức năng hoặc chết khi tiếp xúc với

BPs kéo dài [134].

Khác với các N-BPs, các non-N-BPs lại gây ra sự tự chết của tế bào hủyxương nhờ được chuyển hóa thành các phân tử tương tự ATP (ATP analogues) gâyđộc và chết tế bào [135].

Hiệu quả bảo vệ xương của các thuốc bisphosphonates được thấy rất rõ qua khả

năng làm giảm sự mat xương và tăng mật độ xương ở xương tay, xương hơng, xương

đùi ở bệnh nhân lỗng xương. Quan trọng hơn, thuốc này làm giảm gãy xương hông,

19

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

đặc biệt là xương cột song từ 30-70% [93]. Tuy nhiên, tác dung phụ khơng mong muốncủa nhóm thuốc này cũng là van đề rất được quan tâm [72]. Các tác dụng phụ được ghi

nhận, nhất là khi sử dụng lâu dài cho thấy có mối liên quan giữa việc dùng các BPs vớiđau xương, cơ, nguy cơ ung thư thực quản, hoại tử xương hàm, ức chế quá trình tu sửa

và tái tạo xương gây gãy xương [52, 72].

Nhiều nghiên cứu về lỗng xương trên các mơ hình động vật khác nhau cho thayBPs có tác dụng như trên người [94], do vậy các chất này cũng thường được dùng đểlàm đối chứng dương cho các nghiên cứu đánh giá tác dụng chống loãng xương và bảoVỆ xương của các chất [123, 161].

1.5. Nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên và tổng hợp có tiềm năng chống lỗng

Nghiên cứu phát triển các chất tiềm năng để phát triển thuốc chống lỗng

xương mới có hiệu quả và an tồn hơn luôn được các nhà nghiên cứu và hãng dược

phẩm quan tâm. Hai nguồn hoạt chất chính cho các nghiên cứu này là các chất tự

xương, làm tăng mật độ xương được thực hiện ở các mức độ, in vitro, in vivo trêncác mơ hình động vật [68].

Trong các chất tự nhiên được nghiên cứu, polyphenols là nhóm hợp chất phổ

biến có ở nhiều thực vật, rau và hoa quả, trong đó có nhiều chất có hoạt tính bảo vệxương cùng với nhiều hoạt tính sinh học khác như chống oxy hóa, chống viêm,

chống ung thư, bảo vệ tim mạch và thối hóa thần kinh [116]. Vì các sốc tự do cóvai trị kép đến chun hóa xương, có thé làm ức chế hình thành tế bao tạo xươngnhưng lại tham gia vào con đường tín hiệu kích thích biệt hóa và hình thành tế bàohủy xương, làm tăng hủy xương [116] nên các chất có khả năng chống oxy hóa cao

20

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

thường là chất có khả năng bảo vệ xương [105]. Các nghiên cứu cũng đã cho thấy

tác dụng bảo vệ xương của các hợp chất polyphenol có được thơng qua khả năng

chống oxi hóa ức chế hủy xương và làm tăng tạo xương, làm giảm mất xương dokhả năng chống viêm, làm tăng tạo xương và ức chế hủy xương của chúng [107].Có thé ké đến hai chất dién hình trong nhóm hợp chat này có tác dụng bảo vệ xươngđã được nghiên cứu khá nhiều và có tiềm năng rat lớn phát triển thành thuốc chống

lỗng xương đó là icarriin va resveratrol.

Icariin được tách từ các thực vật thuộc chi Epimedium họ Berberidaceae. Chấtnày đã được chứng tỏ có thé ức chế sự hình thành và biệt hóa của tế bào hủy xương,kích thích biệt hóa của tế bào tạo xương ở rất nhiều nghiên cứu in vitro cũng như

giảm được sự mất xương ở mơ hình chuột gây lỗng xương bằng cách cắt buồng

trứng. Tác dụng này có được là nhờ việc kích thích tạo xương, ức chế làm giảmhoạt động của tế bào và hoạt động hủy xương [178]. Hơn nữa, đã có nghiên cứu thử

nghiệm trong 24 tháng trên người cho thấy icariin có hiệu quả trong chống lỗng

xương ở phụ nữ sau mãn kinh [178]. Mới đây, chúng tôi cũng chứng minh được

icariin làm giảm tốn thương xương gây bởi Rankl trên cá ranki:HSE:CFP mơ hình

bệnh lỗng xương [123].

Đối với nguồn chất tổng hợp, các nghiên cứu thường tập trung vào việc cảitiến và biến đổi những chất/thuốc chống loãng xương tong hợp đã có sẵn hay tonghợp các chất dựa trên cấu trúc của những hoạt chất tự nhiên có khả năng bảo vệxương [189]. Các chất tong hợp có hoạt tính chống oxy hóa mạnh cũng là nhữngchất có hoạt tính bảo vệ xương tiềm năng. Mới đây nhóm chất NecroX được tạo ra

mặc dù chưa được nghiên cứu nhiều về tác dụng trên xương nhưng đã chứng tỏ có

hoạt tính chống oxy hóa cao, bảo vệ cơ tim và hệ tim mach, bảo vệ tế bào thần kinh

[158]. Do vậy nghiên cứu này chọn đánh giá tác dụng bảo vệ xương trên cá Rankl

của hai chất có tính chống oxy hóa cao, một chất tự nhiên đã được nghiên cứu khánhiều và đã chứng tỏ là một chất chống lỗng xương tiềm năng là resveratrol, một

chất tơng hơp thuộc nhóm chất NecroX là NecroX-5.

1.5.1 Tiềm năng chống loãng xương của resveratrol

21

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

Resveratrol là một hợp chat polyphenol tự nhiên (Hình 1.11) có nhiều trong hat

và vỏ của quả nho và các loại quả mọng nước, đặc biệt có nhiêu trong rượu vang đỏ

Resveratrol được biết đến là có tính chất chống oxi hóa rất mạnh, nó đã được

sản xuất thương mại và được tin dùng như thực phẩm hỗ trợ điều trị nhiều loại bệnhbao gồm chống oxy hóa, chống ung thư, bảo vệ hệ tim mach, bảo vệ xương [41,88]. Đã có nhiều nghiên cứu về cơ chế tác dụng của chất này ở các mức độ in vitro

[104] in vivo [14] cho đến thử nghiệm lâm sang trên người [183].

Một số nghiên cứu đã cho thấy resveratrol làm tăng sự biệt hóa và hoạt động chức

năng của tế bào tạo xương MC3T3-EI của chuột [59, 103]. Ornstrup và cộng sự cũng

đã chỉ ra rằng resveratrol làm tăng sự biệt hóa tế bào tạo xương từ tế bào gốc trung môcủa người và làm tăng biểu hiện OPG nhưng tác dụng này độc lập với tác dụng chốngviêm [112]. Trên người, đã có nghiên cứu lâm sàng cho thấy, resveratrol làm tăng

enzym alkaline phosphatase đặc trưng cho xương (BAP) và tăng mật độ xương thông

qua tăng chỉ số BMD ở bệnh nhân nam bị béo phì [111].

Đối với hủy xương, resveratrol ức chế sự biệt hóa của tế bào hủy xương

được kích hoạt bởi RANKL cả in vitro [18, 104, 140] và in vivo [18]. Trên mơ

hình chuột cơng được gây kiểu hình loãng xương bằng phương pháp cắt buồngtrứng, resveratrol làm giảm tình trạng lỗng xương sau 12 tuần điều trị [48].

Ngồi ra, chuột nhắt được bổ sung resveratrol lâu dài trong chế độ ăn giảm đáng

ké tinh trạng loãng xương theo tuổi [122]. Trên người, đã có một chương trình

thử nghiệm đánh giá tác dụng của RES làm giảm loãng xương theo tuổi

22

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

(RESHAW) thực hiện trên phụ nữ sau mãn kinh. B6 sung 75 mg RES hai lần

mỗi ngày trong 12 tháng đã có tác động tích cực, làm tăng mật độ xương ở cột

sống thắt lưng và cổ xương đùi [183].

Resveratrol có tiềm năng rất lớn để phát triển thành thuốc chống loãng xương[141, 164]. Nghiên cứu này lần đầu tiên đánh giá tác dụng bảo vệ xương của

resveratrol trên mơ hình cá Rank.

1.5.2. Các chất NecroX và tiềm năng chong loãng xương của NecroX-5

NecroX (Cyclopentylamino carboxymethylthiazolylindole) là một họ chất hóahọc là dẫn xuất của acid amin tryptophan.

Các chất của họ NecroX đã được biết đến bao gom NecroX-1, NecroX-2,

NecroX-5, NecroX-7, NecroX-18 được tổng hợp ở công ty Khoa học Đời sống LG

OOO otb x& OCLC

NecroX-5 NecroX-18 NecroX-7

Hình 1.12. Cau trúc hóa hoc của NecroX-1, NecroX-2, NecroX-5, NecroX-7,

NecroX-18 [61, 73].

Các chất NecroX có khả năng thấm qua mang và chống oxi hóa bảo vệ tế baonhờ việc “don dep” các gốc tự do [61]. Các gốc tự do chứa oxy (Reactive oxygenspecies - ROS) như superoxide, H,O,, hay hydroxyl và gốc tự do chứa Nito

(reactive nitrogen species-RNS) như peroxynitrite (ONOO’), NO, NO;, HNO, và

NO: có thé gây hại cho cơ thé khi được tạo ra nhiều gây mat cân bang oxi hóa [131,170]. ROS và RNS làm thay đổi cấu trúc của chuỗi hô hấp, dẫn đến chết tế bàokhơng theo chu trình, hay hoại tử tế bào [8§, 113]. Điều này có thể là nguyên nhân

23

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

dẫn đến nhiều rối loạn và bệnh lý bao gồm bệnh tim mạch, ung thư, béo phì, mất trínhớ, thiểu máu, bệnh xương khớp và lão hóa [131].

Theo nghiên cứu của Kim và cộng sự năm 2010, NecroX đã được xác định là

có khả năng bảo vệ tế bào gan và tế bào beta của đảo tụy trước ảnh hưởng của cácchất gây stress và tôn thương tế bào như doxorubicin, tertiary-butylhydroperoxide

(t-BHP), CCI4 ở chuột thí nghiệm [73].

Khả năng này có được là do NecroX có thể “don dep” các gốc tự do và ức chếtế bào chết theo con đường chết không theo chu trình gây ra bởi các stress oxy hóa

Trong các NecroX, hai loại NecroX-5 (C¿sH:¡N:OS.2CH¿OaS) với trọng

lượng phân tử là 453,611g [88] và NecroX-7 (C25H32N40,S2) với trọng lượng phân

tử 516,67g [74] được nghiên cứu nhiều nhất về hoạt tính bảo vệ tế bào khỏi các

stress oxi hóa.

NecroX-5 (NecX-5) có kha nang ức ché su hoai tir té bao in vitro thông quaviệc ức chế gốc tự do peroxynitrite (ONOO’) trong trang thái mất cân bang oxi hóa,thiếu oxy, tổn thương gan cấp tính gây ra do carbon tetrachloride (CCl¿) và xơ ganmãn tính ở chuột thí nghiệm [73]. Thêm vào đó, nhiều nghiên cứu cịn cho thấyNecroX-5 và NecroX-7 có khả năng bảo vệ tế bào tim, tế bào thần kinh chống lại

stress oxi hóa. Vũ Thị Thu va cộng sự (2012) đã chứng minh NecroX5 có tác dụng

cải thiện tình trạng ton thuong tim va tế bao cơ tim chuột mơ hình thiếu máu/táitưới máu (Hypoxia/Reoxygenation -HR) nhờ khả năng ức chế sự mat cân bang oxi

hóa, làm giảm sự quá tải vận chuyên Ca”” ở ti thé [157]. Chất này cũng có thé

chống viêm và chống xơ hóa cơ tim chuột bị nhồi máu thông qua ức chế con đường

TNE//Dcn/TGFB1/Smad2 [158].

NecroX-7 được báo cáo có tác dụng bảo vệ cơ tim thông qua khả năng ức chếcác enzym NADPH oxidase (NOXs) tham gia vào các phản ứng tạo gốc tự do ở tỉthể [119].

Đối với tế bào thần kinh, Song và cộng sự (2013) cho thấy NecroX-5 có thé

chống lại sự tổn thương gây ra do neomycin của tế bào lông thụ cảm ở cơ quan

24

</div>Trang 39<div class="page_container" data-page="39">

đường bên của cá ngựa văn [145]. Neomycin là thuốc kháng sinh chống vi khuẩn

Gram âm có thê làm hỏng thính giác và tiền đình vĩnh viễn do làm tăng các phảnứng oxi hóa tạo gốc tự do dẫn đến chết các tế bào lơng ở tai trong [54].

Chưa có nhiều nghiên cứu về tác dụng bảo vệ xương của các chất NecroX.Tuy nhiên đã có nhiều dữ liệu về vai trò của các gốc tự do đối với sự biệt hóa của tếbào hủy xương [24, 139]. Các gốc tự do như superoxide và H;O; được cho biết cóvai trị quan trọng trong biệt hóa và hoạt động của tế bào hủy xương [6]. Hơn nữa,các nghiên cứu còn cho thấy các gốc tự do được sinh ra khi thụ thê RANK gắn vàoRANKL tham gia vào con đường truyền tín hiệu RANKL để biệt hóa và kích hoạttế bào hủy xương [77]. Các chất chống oxy hóa do vậy có khả năng ức chế, làmgiảm sự hình thành tế bào và hoạt động hủy xương và là mục tiêu tiềm năng dé phát

triển thuốc chống loãng xương [40].

Với khả năng chống oxy hóa cao như đã được chứng minh, các chất NecroXrất có khả năng bảo vệ xương theo hướng ức chế hủy xương. Cụ thể, nghiên cứucủa Kim H.J và cộng sự (2012) về NecroX7 đã chứng minh điều này. NecroX-7 chothay có khả năng ức chế sự biệt hóa của tế bào hủy xương in vitro thông qua ức chếhoạt động của yêu tố NF-kB được kích hoạt bởi RANKL. Biểu hiện của các yêu tốphiên mã C-fos, NFATc1 và các gen chức năng đặc trưng của tế bào hủy xương như

TRAP, cathepsin K, MMP9 (xem Hình 6) được kích hoạt bởi RANKL cũng giảm

dưới tác dung của NecroX7 [74]. Hơn nữa, NecroX-7 cũng cho thấy có thé làmgiảm sự mat xương in vivo ở chuột nhắt gây ra do lipopolysaccharide (LPS) [74].

Day là những dir liệu cơ sở gợi ý việc đánh giá tác dụng bảo vệ xương cua

NecroX-5 trong đề tài này.

1.5.3. Dung môi DMSO (Dimethyl sulfoxit ) và khả năng ảnh hưởng đến xương

DMSO là một hợp chất hữu cơ chứa lưu huỳnh có cơng thức (CH3)2SO được

sử dụng như dung mơi trong cơng nghiệp và phịng Dung mơi DMSO và khả năng

ảnh hưởng đến xương thí nghiệm vì nó là chất lưỡng cực, có khả năng hịa tan rất

tốt cả chất phân cực và không phân cực [138]. Dung môi này do vậy được dùng rat

rộng rãi trong các nghiên cứu y sinh, đặc biệt là để hòa tan các chất không tan trong

25

</div>Trang 40<div class="page_container" data-page="40">

nước. Tuy nhiên, việc sử dụng DMSO làm dung môi cho các nghiên cứu ln cần

được lưu ý vì nó được biết có nhiều hoạt tính sinh học có thể gây ảnh hưởng đến kết

quả nghiên cứu như khả năng xuyên màng tế bào, chống viêm, chống oxi hóa vàchống sốc tự do [138]. Hơn nữa, nó cịn được dùng làm chất dẫn thuốc và trị liệumột số bệnh như viêm bàng quang kẽ (interstitial cystitis), bệnh ngồi da, tiết niệu,

hơ hấp, tiêu hóa, cơ xương, tâm thần phân liệt hay làm thuốc giảm dau tai chỗ; độc

tính và một số tác dụng phụ của DMSO cũng được báo cáo [83].

Đặc biệt, về tác dụng trên xương, đã có một SỐ nghiên cứu cho thấy DMSO cóảnh hưởng đến chuyên hóa xương [31, 151, 184]. Cheung và cộng sự đã ghi nhận

tác dụng của DMSO với sự tăng sinh (proliferation) và biệt hóa (differentiation) của

tế bào tạo xương theo liều. Ở nồng độ thấp (dưới 0,5% (v/v)), DMSO khơng có ảnhhưởng đến sự tăng sinh của tiền tế bào tạo xương MC3T3-E1 nhưng nồng độ cao

(1%(v/v)) có thé làm giảm sự tăng sinh; nồng độ 0,5 và 1% (v/v) làm tăng sự biệthóa của các tế bào này thành tế bào tạo xương thông qua việc làm tăng biểu hiện

của các gen runx2 và osterix cũng như làm tăng hoạt động khống hóa của chúng

[31]. Đối với hủy xương, DMSO (ở nồng độ 1%(v/v)) có khả năng ức chế in vitrosự hình thành, hoạt động chức năng của tế bào hủy xương biệt hóa từ tế bào RAW

264.7 khi được kích hoạt bởi RANKL [184]. Hơn nữa, nghiên cứu của A.

Tamjidipoor và cộng sự trên chuột cống cịn cho thấy DMSO có khả năng làm giảmsự mất xương và số lượng tế bào hủy xương, làm tăng mật độ và thể tích xương invivo ở chuột được gây mơ hình lỗng xương bang cách cắt buồng trứng, tác dụngnày cũng thể hiện theo liều [151]. Do vậy, nghiên cứu thực nghiệm đánh giá hoạt

tính bảo vệ xương của các chất có dùng DMSO làm dung mơi cần xem xét ảnh

hưởng của nó đến xương dé tìm ra nồng độ DMSO thích hợp với đối tượng và mụcđích nghiên cứu, đảm bảo loại trừ được ảnh hưởng của DMSO đến kết quả nghiên

1.6. Mơ hình động vật dùng cho nghiên cứu về lỗng xương

1.6.1. Mơ hình động vật có vú cho nghiên cứu lỗng xương

26

</div>