phân lập và tinh chế hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng bacillus sp rd26

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.21 MB, 77 trang )

Trang 1<div class="page_container" data-page="1">

--- ∞0∞---

NGUYỄN CHÂU KHOA

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT CHỦNG

Bacillus sp. RD26

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CƠNG NGHỆ SINH HỌC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

</div>Trang 2<div class="page_container" data-page="2">

--- ∞0∞---

NGUYỄN CHÂU KHOA

PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ CAO CHIẾT CHỦNG

Bacillus sp. RD26

Chuyên ngành: Y DƯỢC Mã số chuyên ngành:

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: ThS. DƯƠNG NHẬT LINH TS. NGUYỄN TẤN PHÁT

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2020

</div>Trang 3<div class="page_container" data-page="3">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

LỜI CẢM ƠN

Trong khoảng thời gian học việc và làm đề tài tại Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh là khoảng thời gian vui vẻ nhất trong 4 năm sinh viên của tôi. Tại nơi này, tôi đã học được rất nhiều kiến thức mới và cũng có nhiều kinh nghiệm quý báo. Cũng ở nơi đây, tôi được quen với nhiều người bạn mới và có nhiều kỷ niệm cùng với nhau. Để hồn thành được đề tài này, tơi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cơ, anh chị, các bạn và gia đình.

Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô Dương Nhật Linh và thầy Nguyễn Tấn Phát. Thầy cơ đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và

chia sẻ cho em những kiến thức chuyên ngành cũng như đời sống hằng ngày. Em xin cảm ơn quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Q thầy cơ đã hết lịng giảng dạy để truyền đạt những kiến thức để làm nền tảng vững chắc để em có thể hồn thành tốt cơng việc của mình.

Em xin cảm ơn chị Trần Thị Á Ni và các anh chị trong phịng thí nghiệm đã

nhiệt tình ủng hộ, ln hết lịng giúp đỡ khi em có những vấn đề vướng mắc và những khó khăn mà em gặp phải trong quá trình thực hiện đề tài.

Em xin cảm ơn các anh chị tại phịng Các hợp chất có hoạt tính sinh học tại Viện cơng nghệ hóa học-số 1, Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Thành phố Hồ Chí Minh và phịng 4.4 Viện Cơng nghệ hóa học TL29, phường Thạnh Lộc, Quận 12, Thành phố Hồ Chí Minh đã hỗ trợ và giúp đỡ em rất nhiều để hồn thành được đề tài này.

Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn các bạn trong phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã ở bên cạnh giúp đỡ tạo điều kiện để tơi hồn thành tốt đề tài.

Cuối cùng, con xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ông bà, cha mẹ, anh chị những người đã sinh thành, nuôi nấng và dạy dỗ con khôn lớn. Cảm ơn gia đình đã ln ở cạnh con, đã dành cho con tình yêu thương và những lời động viên

</div>Trang 4<div class="page_container" data-page="4">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

trong những lúc con gặp khó khăn nhất, gia đình đã ln ủng hộ và tiếp sức để con có thể bước tiếp trên con đường mà con đã chọn.

Kính chúc tất cả quý thầy cô, anh chị, bạn bè, các em, cả gia đinh có thật nhiều sức khỏe, hạnh phúc và gặt hái được nhiều thành công trong cuộc sống.

Xin chân thành cảm ơn!

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2020

NGUYỄN CHÂU KHOA

</div>Trang 5<div class="page_container" data-page="5">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT... viii

PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 4

1.3.2. Đặc tính và vai trị của hợp chất có hoạt tính sinh học ... 14

1.3.3. Tình hình nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học từ chủng Bacillus sp. RD26 ... 14

1.4. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ ... 15

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ... 17

2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ... 18

2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ... 18

2.2.1. Chủng vi sinh vật nghiên cứu ... 18

2.2.2. Mơi trường - hóa chất ... 18

2.2.3. Thiết bị và dụng cụ ... 18

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 19

2.3.1. Bố trí thí nghiệm ... 19

</div>Trang 6<div class="page_container" data-page="6">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

2.3.2. Hoạt hóa chủng Bacillus sp. RD26 ... 20

2.3.3. Thu nhận cao chiết từ dịch ngoại bào bằng dung môi methanol ... 21

2.3.4. Khảo sát các phân đoạn của cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) ... 23

2.3.5. Sắc ký cột cao chiết ... 24

2.3.6. Khảo sát phân đoạn kháng bằng phương pháp tự sinh đồ ... 24

2.3.7. Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất thu nhận được ... 25

2.3.8. Phương pháp thử hoạt tính sinh học ... 26

PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 27

3.1. THU NHẬN CAO CHIẾT CHỦNG Bacillus sp. RD26 ... 28

3.1.3. Xác định nồng độ kháng nấm tối thiểu (MIC) từ cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 ... 31

3.2. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ ... 35

3.2.1. Khảo sát các phân đoạn từ cao BR-M ... 35

3.2.2. Khảo sát phân đoạn kháng bằng phương pháp tự sinh đồ ... 40

3.2.3. Xác định cấu trúc của hợp chất BR03 ... 41

3.3. Khảo sát hoạt tính sinh học ... 43

3.3.1. Thử hoạt tính chống oxy hóa ... 43

3.3.2. Thử hoạt tính gây độc tế bào (MCF-7) ... 45

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ... 47

4.1. KẾT LUẬN ... 48

4.2. ĐỀ NGHỊ ... 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 50

Tài liệu Tiếng Việt ... 50

Tài liệu Tiếng Anh ... 50

PHỤ LỤC ... 58

PHỤ LỤC 1: XỬ LÍ THỐNG KÊ ... 58

PHỤ LỤC 2: HÌNH ẢNH ... 59

</div>Trang 7<div class="page_container" data-page="7">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ... 20

Sơ đồ 3.1 Quy trình điều chế cao ... 28

Sơ đồ 3.2 Quy trình điều chế các cao phân đoạn từ cao BR-M ... 36

Sơ đồ 3.3 Quy trình phân lập chất từ cao BR-M3 ... 40

</div>Trang 8<div class="page_container" data-page="8">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

Hình 3.1. Thiết bị máy cơ quay ... 29

Hình 3.2. Cao BR-M sau khi cô quay ... 29

Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnhtừ cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 ... 31

Hình 3.4. Kết quả MIC của Candida albican ... 33

Hình 3.5. Kết quả MIC của Trichophyton mentagrophytes ... 33

Hình 3.6. Kết quả MIC của Trichophyton rubrum ... 34

Hình 3.7. Kết quả MIC của Microsporum canis ... 34

Hình 3.8. Kết quả MIC của Microsporum gypseum ... 34

Hình 3.15. Cấu trúc hóa học của BR03 ... 42

Hình 3.16. Kết quả gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) ... 45

</div>Trang 9<div class="page_container" data-page="9">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm khả năng kháng nấm gây bệnh từ cao BR-M ... 30

Bảng 3.2. Kết quả MIC của cao chiết từ chủng Bacillus sp. RD26 ... 32

Bảng 3.3. Khối lượng thu được từ các phân đoạn của cao BR-M ... 35

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát cao BR-M3 ... 37

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát cao BR-M3.3 ... 38

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát cao BR-M.3.3.2 ... 38

Bảng 3.7. Dữ liệu phổ của BR03 và 5- hydroxymethylfurfural đo trong (DMSO-d6) ... 41

Bảng 3.8. Kết quả xác định hoạt tính bắt gốc tự do DPPH ... 44

Bảng 3.9. Phần trăm gây độc tế bào của mẫu trên dòng tế bào ung thư vú MCF-7 ... 45

</div>Trang 10<div class="page_container" data-page="10">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

B. cereus Bacillus cereus B. subtilis Bacillus subtilis

13C-NMR 13C-Nuclear Magnetic Resonance

C. albicans Candida albican

C. glabrata Candida glabrata C. krusei Candida krusei C. tropcalis Candida tropcalis

1H-NMR 1H-Nuclear Magnetic Resonance

HSQC Heteronuclear Spectroscopy Quantum Correlation

concentration

M. canis Microsporum canis

M. gypseum Microsporum gypseum

</div>Trang 11<div class="page_container" data-page="11">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

T. rubrum Trichophyton rubrum T. mentagrophytes Trichophyton mentagrophytes

</div>Trang 12<div class="page_container" data-page="12">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay cùng với sự phát triển của xã hội thì nhu cầu về sức khỏe của con người càng được quan tâm nhiều hơn. Có thể kể đến các bệnh do nấm cũng đang là một vấn đề sức khỏe của toàn cầu. Chúng là một mối đe dọa nghiêm trọng đối với những người có hệ thống miễn dịch suy yếu như những người bị ung thư hoặc HIV/ADIS, khi đó có thể bị chúng lây nhiễm một cách dễ dàng do không

hàng rào bảo vệ đã suy yếu. Viêm màng não do Cryptococcus neoformans là một bệnh nhiễm trùng não chết người nhưng hiếm khi gặp ở người khỏe mạnh thường

chỉ gặp ở những người có hệ thống miễn dịch yếu. Ở những quốc gia có tỉ lệ người nhiễm HIV/AIDS cao thì viêm màng não do cryptococcus gây ra nhiều ca tử vong hơn cả bệnh lao. Không chỉ nhiễm nấm trong nội tạng mà nhiễm nấm da hay nấm móng cũng rất khó chữa lành nếu khơng dùng kháng nấm. Để điều trị tốt nhất thì phương pháp là sử dụng thuốc theo toa. Với những trường hợp nhiễm nặng hoặc nhiễm trùng thì có thể mất vài tháng hoặc một năm để loại bỏ nhiễm trùng. Theo các nhà nghiên cứu, nấm cũng giống như vi khuẩn cũng có thể phát triển tính kháng thuốc của mình, khi đó chúng có khả năng chống lại các thuốc điều trị. Với tình hình hiện tại, thuốc chống nấm còn khá hạn chế hơn thuốc kháng sinh, do đó, việc nấm kháng thuốc gây khó khăn trong việc lựa chọn thuốc điều trị. Việc nấm mốc hay vi nấm gây bệnh cho người trong môi trường sống

hiện nay là vấn đề lớn đáng được quan tâm. Nấm Candida auris là một loại nấm

mới đe dọa sức khỏe trên tồn cầu. Nó có khả năng kháng lại hầu hết một số thuốc kháng nấm hiện có. Vì vậy, việc tìm ra nguồn thuốc mới thay thế cho các thuốc đang sử dụng ngày càng trở nên cấp bách (CDC, 2018).

Ngoài ra trong những năm gần đây, stress oxy hóa đang được các nhà khoa học quan tâm. Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa các gốc tự do và chất chống oxy hóa trong cơ thể. Nếu q trình oxy hóa diễn ra bình thường, các gốc tự do giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh nhưng khi các gốc tự do vượt quá mức cân bằng được điều chỉnh bởi chất chống oxy hóa bắt đầu gây hại cho

</div>Trang 13<div class="page_container" data-page="13">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

lipit, protein và DNA trong cơ thể. Protein, lipit và DNA chiếm một phần lớn trong cơ thể, do đó tổn thương lâu dài có thể dẫn đến một số bệnh tật: tiểu đường, xơ vữa động mạch, bệnh tim, huyết áp cao, tình trạng viêm nhiễm, ung thư (Storz và cs., 1999). Các gốc tự do làm đẩy nhanh quá trình oxy hóa, gây tổn thương đến cấu trúc DNA làm cho việc sao mã của DNA khơng chính xác dẫn đến sự hình thành của tế bào ung thư. Ngồi ra, góc tự do cịn gây tổn thương tế bào, thúc đẩy q trình lão hóa, làm suy yếu hệ thống miễn dịch, gây ra các bệnh thối hóa. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra các chất chống oxy hóa càng được quan tâm nhằm hạn chế việc tạo ra các gốc tự do để phòng ngừa hiệu quả những bệnh trên (Devasagayam và cs., 2004).

Bên cạnh đó, các bệnh liên quan đến ung thư cũng là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nên tử vong ngày càng tăng cao. Việc điều trị các bệnh ung thư bằng cách sử dụng các thuốc hóa trị gây đau đớn cho người điều trị cũng như việc kháng thuốc của tế bào gây ra bởi hóa trị. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đang tìm kiếm các hợp chất từ tự nhiên để thay thế cho việc sử dụng các phương pháp hóa trị đưa vào cơ thể người để giảm bớt các nguy cơ tình trạng kháng thuốc của các tế bào ung thư. Do đó việc tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học có nguồn gốc tự nhiên và an toàn cho người sử dụng đang là một đòi hỏi cấp bách và thiết thực hiện nay.

Các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học, đã tạo thành một thư viện các hợp chất với sự đa dạng cấu trúc, cho thấy được một loạt các hoạt động sinh học. Trong khi nguồn thực vật đang được sử dụng cho việc sản xuất thuốc điều trị thì các nguồn vi sinh vật nội sinh cũng đang được nghiên cứu để sản xuất ra các loại thuốc mới có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa (Gouda và cs., 2016). Năm 2017, cơng trình nghiên cứu của Azman và cộng sự đã phân lập và tinh sạch được hợp chất có khả năng kháng khuẩn, chống ung thư từ vi khuẩn Antinobacteria.

Bacillus được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu vì chúng là vi khuẩn

có bào tử và có thể sống được trong điều kiện mơi trường khắc nghiệt như: nhiệt

</div>Trang 14<div class="page_container" data-page="14">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

độ cao, pH thấp, môi trường dinh dưỡng bất lợi. Trong đó, Bacillus nổi bật nhất

là nhờ khả năng sản xuất ra hơn 20 loại kháng sinh dựa vào cấu trúc đa dạng của

nó (Stein và cs., 2005).Ngồi ra, một số lồi thuộc chi Bacillus có thể tạo ra hoạt

chất sinh học có khả năng làm tan rã thành tế bào nấm (Tserkovniak và cs., 2009).

Ở một nghiên cứu khác, vi khuẩn nội sinh được phân lập từ rễ cây nhân sâm

ở Hàn Quốc, Bacillus sp. GS07 có tiềm năng trong việc chống lại các nấm gây

bệnh (Cho và cs., 2007). Năm 2014, Youcef-Ali và cộng sự, đã phân lập được

CWBI-B1567 và CWBI-B1568 từ Bacillus mojavensis và Bacillus subtilis có khả năng chống lại nấm Candida.

Ở Việt Nam, cịn khá ít các cơng trình nghiên cứu về các vi khuẩn nội sinh sản xuất ra các hợp chất sinh học có hoạt tính sinh học. Từ những vấn đề đã nêu

ở trên, chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: “ Phân lập và tinh chế hợp chất có

hoạt tính sinh học từ cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 ”.

Mục tiêu:

Phân lập và tinh chế được hợp chất từ cao chiết chủng Bacillus sp. RD26 có

hoạt tính sinh học.

Nội dung:

- Nuôi cấy chủng Bacillus sp. RD26 trong môi trường lên men tối ưu.

- Thu được cao chiết từ dịch ngoại bào bằng dung môi methanol.

- Xác định hoạt tính kháng nấm của cao MeOH.

- Phân lập và tinh sạch hợp chất từ cao MeOH. - Xác định cấu trúc của hợp chất.

- Đánh giá một số hoạt tính sinh học từ hợp chất: thử khả năng ức chế vi nấm gây bệnh trên người, hoạt tính oxy hóa, hoạt tính gây độc tế bào.

</div>Trang 15<div class="page_container" data-page="15">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

</div>Trang 16<div class="page_container" data-page="16">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

1.1. VI KHUẨN Bacillus

1.1.1. Phân loại

Theo Bergey (1974), Bacillus được phân loại theo như sau:

Giới Bacteria Ngành Firmicutes

Lớp Bacilli Bộ Bacillales

Bacillus là một trong những vi sinh vật được phát hiện và mô tả đầu tiên

trong giai đoạn đầu của sự phát triển hệ vi sinh vật của thế kỷ 19. Đây là một chi lớn với hơn 200 lồi vi khuẩn hiếu khí, có dạng hình que, có khả năng sinh bào

tử để chống lại điều kiện khắc nghiệt từ môi trường sống. Bacillus được phân bố

rộng rãi trong tự nhiên: từ trên cạn đến dưới nước, từ nước ngọt đến nước mặn kể cả trên thực vật và động vật,…

Tế bào sinh dưỡng Bacillus là có dạng hình que, trịn ở hai đầu, vi khuẩn hiếu

khí, bắt màu tớm Gram (+), cú kớch thc 0.5-1,2àm ì2,5-10 m, tn tại ở dạng

đơn lẻ, chuỗi ngắn hoặc dài. Đối với Bacillus có bào tử thì bào tử có dạng hình

trụ, trịn, oval hoặc hình bầu dục. Tùy theo từng lồi, mà bào tử có thể nằm ở giữa tế bào hoặc lệch tâm. Bào tử có thể tồn tại từ vài năm đến vài chục năm.

</div>Trang 17<div class="page_container" data-page="17">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

Hầu hết các loài Bacillus đều di động trừ B. anthracis và B. mycoides, mặc dù có

sự khác biệt rất lớn về khả năng di động của mỗi lồi. Đa số các lồi có catalase dương tính (Nguyễn Đức Quỳnh Như và cs., 2009).

1.1.3. Đặc điểm nuôi cấy

Phần lớn các lồi Bacillus là sinh vật hóa dị dưỡng linh hoạt, có khả năng hơ

hấp trong khi sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ đơn giản (đường, amino acid, acid hữu cơ). Trong một số trường hợp, chúng cịn có thể lên men carbohydrate trong

một phản ứng hỗn hợp tạo ra glycerol và butanediol. Một số ít lồi như B. megaterium khơng địi hỏi tác nhân tăng trưởng hữu cơ, một số khác lại cần có

amino acid, D-vitamin hay cả hai. Phần lớn chúng là ưa nhiệt trung bình, khoảng nhiệt độ tối đa cho sự phát triển của tế bào dinh dưỡng từ 25-75ºC, nhiệt độ tối ưu là 30-45oC, khoảng pH rộng 2-11. Trong phịng thí nghiệm, với điều kiện tối

ưu, thời gian thế hệ của Bacillus vào khoảng 25 phút (Phạm Văn Ty và cs.,

2006).

1.1.4. Ứng dụng

Hiện nay, việc sản xuất chất dẻo sinh học (hydroxyburate) đang được nghiên

cứu từ một số chủng Bacillus như Bacillus laterosporus, Bacillus firmus và Bacillus cereus. Bacillus pasteurii được thêm vào đất ướt tạo ra calcite-một chất

xi măng liên kết đất, chuyển hóa đất thành đá làm vững nền móng các tịa nhà và giúp chúng chịu được động đất.

Trong chế phẩm sinh học, Bacillus thuringiensis được dùng làm thuốc trừ sâu vi sinh. Bacillus thuringiensis sp. làm chế phẩm Israelensis serotype H14 diệt

lăng quăng. Do khả năng tạo bào tử chịu nhiệt, sinh các loại enzym ngoại bào và

khả năng đối kháng với các vi sinh gây bệnh như Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Candida albicans, E. coli, S. aureus, Shigella, Vibrio spp.,… nên Bacillus spp. được sử dụng làm probiotic trong chăn nuôi và thủy sản, Bacillus subtilis dùng làm chế phẩm phòng và điều trị viêm tai mũi họng ở người

(Berkeley và cs., 2002).

</div>Trang 18<div class="page_container" data-page="18">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

1.2. TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NẤM GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI

Candida albicans là một loại nấm men thường gây nhiễm trùng da. Nhiễm Candida albicans thường xảy ra ở da hoặc màng nhầy, đặc biệt là ở trong khoang miệng và âm đạo. Candida albicans là một loại nấm cơ hội vì nó thường chỉ gây ra bệnh ở những người bị suy giảm miễn dịch. Có khoảng trên 200 lồi Candida,

mỗi lồi có độc lực khác nhau nên khả năng gây bệnh và độ nhạy cảm thuốc với

kháng nấm là khác nhau. Chủng nấm gây bệnh chủ yếu là Candida albicans

</div>Trang 19<div class="page_container" data-page="19">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

chiếm 85-90%. Các chủng nấm khác ít gặp hơn như: C. glabrata, C. krusei và C. tropcalis (Mahmoudi Rad và cs., 2012, Garber, 2001).

Ở trạng thái hoại sinh, vi nấm giữ một thế cân bằng với các vi khuẩn cùng

sống với nó. Trong một số điều kiện nhất định, vi nấm Candida sp. chuyển từ

trạng thái hoại sinh sang ký sinh (gây bệnh). Đặc trưng của trạng thái ký sinh là số lượng vi nấm tăng lên rất nhiều, có sự thành lập những sợi tơ nấm giả cho phép vi nấm len lỏi giữa những tế bào ký chủ và xâm nhập sâu hơn.

1.2.1.2. Bệnh do nấm Candida gây ra

Candida albicans là một mầm bệnh nấm đa kháng thuốc mới nổi trên thế

giới. Loại nấm này thường được tìm thấy ở các vị trí giải phẫu khác nhau của người khỏe mạnh, có thể gây ra nhiễm trùng hệ thống và nhiễm trùng bề ngoài

trong điều kiện môi trường tối ưu. Nấm Candida xâm lấn (IC) là một bệnh nhiễm

trùng bệnh viện quan trọng với tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao ở trẻ nhập viện.

Chẩn đốn lâm sàng bệnh nấm Candida có thể khó khăn vì thiếu các triệu chứng

cụ thể và các dấu hiệu lâm sàng (Dadar và cs., 2018).

Bệnh vi nấm Candida có thể xảy ra ở bất kỳ cơ quan nào trong cơ thể nhưng

phổ biến nhất vẫn là niêm mạc và da. Khi vi nấm kí sinh và gây bệnh ở mô sâu, sợi nấm giả thường chiếm đa số. Trường hợp gây tổn thương ngồi da thì số lượng tế bào nấm men nảy chồi chiếm ưu thế hơn sợi tơ nấm giả. Bình thường có

thể tìm thấy Candida ký sinh trong họng, đường tiêu hoá, âm đạo, da mà không

gây bệnh, chúng sống cộng sinh và cân bằng trong vi hệ bình thường.

1.2.2. Dermatophytes

Dermatophytes là một nhóm nấm ngồi da ký sinh ở những mơ keratin hóa của người và thú, các vi nấm này dùng men keratinase phân giải keratin để lấy nguồn thức ăn. Các vi nấm ngoài da là vi nấm sợi tơ nên gồm các sợi tơ có vách ngăn, phần lớn sinh bào tử đính nhỏ và bào tử đính lớn. Nhóm này có khoảng 40

lồi, gồm 3 chi Epidermophyton, Trichophyton và Microsporum.

Một số vi nấm ngồi da có sự sinh sản hữu tính, đưa đến sự thành lập thể quả

kín, khi ấy nấm sẽ thuộc lớp Nấm Túi (Ascomycetes) và có tên là Arthroderma sp.

</div>Trang 20<div class="page_container" data-page="20">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

(khi giai đoạn sinh sản là vơ tính là Trichophyton sp.) hoặc Nannizzian sp. (khi giai đoạn sinh sản vơ tính là Microsporum sp.).

Bệnh nấm da rất phổ biến, có ít nhất 10% dân số thế giới bị nhiễm nấm da. Bệnh lây nhiễm chủ yếu qua tiếp xúc trực tiếp với người bệnh, thú bệnh hay đất, hoặc gián tiếp qua thảm, sàn nhà, kệ tủ đựng quần áo, hồ tắm, giày dép mang vảy da hay tóc bệnh. Ở mơi trường thích hợp, vi nấm có thể ống ngồi cơ thể ký chủ ít nhất một năm. Do vi nấm có ở khắp nơi, rất khó xác định được nguồn lây

nhiễm, nhất là ở các vi nấm ưa người như T. rubrum và T. mentagrophytes. Các

loại nấm gây bệnh cho người thay đổi theo vị trí gây bệnh và theo vùng địa lý, tuy nhiên trên phạm vi toàn thế giới có hai lồi nấm da thường được ly trích từ

bệnh nấm da là T. rubrum và T. mentagrophytes (chiếm 80-90% trong tổng số ca

bệnh nấm da) (Nguyễn Đinh Nga, 2009).

</div>Trang 21<div class="page_container" data-page="21">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

❖ Trichophyton rubrum

Loài nấm thường gây bệnh trên chó, trong giai đoạn này vùng bệnh tích dạng ban đỏ. Trên đỉnh đầu, mũi, xung quanh mắt bị rụng lơng, chân và tay có những đốm trịn khơng đều. Khuẩn lạc bắt đầu mọc sau 5-6 ngày ni cấy, khúm nhuyễn như bột, có sắc tố màu đỏ rượu nho. Nếu xem dưới kính hiển vi thì thấy rất nhiều bào tử đính nhỏ hình quả lê, ít khi thấy bào tử đính lớn.

T. rubrum thường gây tổn thương mũi, đỉnh đầu, xung quanh mắt, chân

tay có những đốm trịn khơng đều, khi bệnh kéo dài vùng da bệnh bị nhiễm nấm phủ một lớp vảy xám (Kidd và cs., 2016).

</div>Trang 22<div class="page_container" data-page="22">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

❖ Trichophyton mentagrophytes

Có hai dạng khuẩn lạc: dạng có hạt và dạng lông tơ. Khúm nhuyễn như bột, có sắc tố màu kem, đôi khi màu đỏ, sẽ chuyển sang màu kem trên thạch khoai đường. Mặt dưới thay đổi từ màu rám da bị đến nâu tối. Dạng có lơng tơ, khuẩn lạc ni cấy lâu ngày có dạng kem, mặt dưới biến đổi từ màu trắng sang vàng đến nâu đỏ. Bào tử có hình điếu thuốc, thành mỏng, 3-7 ơ và kích thước 4-8 µm x 20-50 µm. Bào tử đính nhỏ, trịn, thường có nhiều, thành đám, sợi tơ xoắn, bào tử đính ít, vách nhẵn.

Thường gây bệnh ở lồi gặm nhấm, chó, ngựa, thỉnh thoảng cịn gặp trên

những thú khác và người T. mentagrophytes thường gây những tổn thương ở

vùng mỏm, mặt và bốn chân. Trong giai đoạn đầu, bệnh tích là những nốt sần sùi, mụn nước, mụn mủ, sau đó phát triển thành vảy cứng màu vàng, trường hợp nặng vết thương đỏ, sưng tấy (Kidd và cs., 2016).

</div>Trang 23<div class="page_container" data-page="23">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

Hình 1.4. Vi thể vi nấm Microsporum spp.

(

Chi Microsporum bao gồm 16 loài. Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch của các loài Microsporum là hoặc mịn hoặc phấn với sắc tố trắng đến nâu. Microsporum spp. bào tử đính lớn là những vách ngăn dầy do có nhiều điểm nhỏ,

gai nhỏ, hoặc nhiều mụn cơm. Ban đầu, bào tử đính lớn được mơ tả bởi Chester Emmons (1934), chúng như hình con quay hoặc hình thoi, nhưng khi phát hiện ra lồi mới đã giúp mở rộng phạm vi hình dạng của chúng từ hình trứng ở

Microsporum nanum cho đến hình trụ nhọn 2 đầu ở Microsporum vanbreuseghemii. Bào tử đính lớn có thể có vách mỏng, hơi dày cho đến dày, có

từ 1 đến15 vách ngăn và kích thước nằm trong khoảng chiều dài 6-160 µm, chiều rộng 6-25 µm. Bào tử đính nhỏ khơng có cuống hoặc có cuống và có dạng hình chùm, thường được bố trí đơn lẻ dọc theo sợi nấm hoặc có dạng chùm như ở

Microsporum racemosum, một tác nhân gây bệnh hiếm có (WeitzmanI và cs.,

1995, Lakshmipathy và cs., 2010).

❖ Microsporum canis

Microsporum canis là một phần của một họ nấm được gọi là

dermatophytes. Có các bào tử đa bào được gọi là macroconidia với thành dày thơ. Macroconidia là trục chính đặc trưng hình 5-15 tế bào. Trên môi trường nuôi cấy, khúm mượt như nhung, sắc tố cam. Bào tử đính lớn được sinh nhiều, hình con

</div>Trang 24<div class="page_container" data-page="24">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

thoi, vách dầy, bề mặt có gai, bào tử đính nhỏ hình quả lê ít gặp hơn. Được tìm thấy trong nhiều mơi trường khác nhau và tồn tại đến 15 tháng.

Microsporum canis ăn keratin trên các lớp ngồi của da, tóc và móng. Nơi sinh sống của Microsporum canis là ở mèo và chó. Có thể truyền sang người

thông qua tiếp xúc trực tiếp và gián tiếp với động vật và các đồ vật như lược, bàn chải, mũ, đồ nội thất, khăn trải, v.v ... Yếu tố lớn nhất để nhiễm trùng là tiếp xúc

với các tế bào bị hư hại da, tóc và móng. Microsporum canis có thể lây nhiễm tất

cả các động vật có vú (Kidd và cs., 2016).

❖ Microsporum gypseum

M. gypseum có sợi nấm vách ngăn dọc theo đó có thể tìm thấy bào tử đính

nhỏ khơng cuống hoặc dạng chùm (3-8 µm x 2-3 µm). Các hình trục chính (8-15 µm x 22-60 µm) có thành tương đối mỏng, với bề mặt gập ghềnh và chứa khoảng 3-6 tế bào bên trong. Trên môi trường nuôi cấy, khúm nhuyễn như bột hoặc nổi

hạt lắn tăn, sắc tố vàng nâu nhạt. M. gypseum có rất nhiều bào tử đính lớn hình con thoi, vách mỏng, có gai. Điều này phân biệt bào tử đính lớn của M. gypseum, với bào tử đính lớn M. canis có đầu khá nhọn và bào tử đính lớn khá hiếm và bị bóp méo do M. audounii tạo ra.

Microsporum gypseum phát triển tương đối nhanh và trưởng thành trong 6

đến 10 ngày. Hình dạng khuẩn lạc là dạng bột đến dạng hạt và màu từ màu be

đến màu nâu quế. Hoặc có màu vàng đến đỏ nâu. Phức hợp Microsporum gypseum là một nhóm các tế bào da liễu có phân bố trên toàn thế giới và là một

nguyên nhân hiếm gặp của dermatomycoses ở người. Nhiễm trùng thường gặp nhất là bệnh nấm da, với một số biến thể về địa lý và nghề nghiệp. Nhiễm trùng mặt và da đầu thường được quan sát thấy ở trẻ em (Kidd và cs., 2016).

1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH

HỌC TỪ CHỦNG Bacillus sp.

1.3.1. Khái niệm

Hợp chất có hoạt tính sinh học là hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên và có những hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, chống ung thư, kháng virus, hoạt tính

</div>Trang 25<div class="page_container" data-page="25">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

dược lý (Barzkar và cs., 2019), là nhữg hợp chất thiết yếu và không cần thiết (như vitamin hoặc polyphenol) có trong tự nhiên, là một phần trong thức ăn và được chứng minh có ảnh hưởng đến sức khỏe của con người (Biesalski và cs., 2009).

1.3.2. Đặc tính và vai trị của hợp chất có hoạt tính sinh học

Các nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra rằng hợp chất có hoạt tính sinh học tác động có lợi đến sức khỏe của con người phù thuộc vào liều lượng trong điều trị các bệnh mãn tính (Martirosyan, 2011). Bên cạnh đó, hợp chất tự nhiên có một loạt các tính chất, trong đó các đặc tính chống oxy hóa là quan trọng nhất trong việc phòng ngừa bệnh tim mạch, tiểu đường, béo phì, tăng huyết áp và kích thích phản ứng miễn dịch (Giacometti và cs., 2018).

1.3.3. Tình hình nghiên cứu hợp chất có hoạt tính sinh học từ chủng

Bacillus sp. RD26

Bacillus là một trong những loài được sử dụng nhiều nhất trong quá trình

kiểm soát sinh học.Năm 2005, Wu và cộng sự đã tinh chế được hai peptide

Subpeptin JM4-A và Subpeptin JM4-B sản xuất từ vi khuẩn Bacillus subtilis JM4

đã được phân lập từ đất, cho thấy có khả năng kháng cả vi khuẩn Gram âm và

Gram dương như: Bacillus cereus, Leuconostoc mesenteroides, Staphylococcus aureus, Salmonella và Shigella flaxineri.Trong năm 2008, Kumar và cộng sự của mình đã tìm ra vi khuẩn Bacillus subtilis MTCC-8114 phân lập từ đất có khả

năng sinh ra hợp chất peptide có hoạt tính kháng các vi nấm gây bệnh trên người:

Trichophyton, Epidermophyton, Microsporum.Các hợp chất này thường là enzym

thủy phân hay là các peptid có hoạt tính sinh học hoặc các hợp chất polyketide (Zhang T. và cs., 2008; Kumar A. và cộng sự., 2009).

Năm 2010, Tabbene và cs đã tinh chế được hợp chất S07-2 từ Bacillus subtilis B38 có khả năng chống lại P. aeruginosa, năm 2011 tinh chế bacillomycin từ chủng vi khuẩn trên có khả năng chống nấm Candida. Năm 2013, Roy và cộng sự đã tiến hành phân lập được fengycin từ B. thuringiensis SM1 được phân lập từ đất có khả năng kháng lại C. albicans. Cũng trong năm 2013,

</div>Trang 26<div class="page_container" data-page="26">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

một nghiên cứu của Trịnh Thành Trung và cộng sự đã phân lập được vi khuẩn

Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum sp 1901 từ mẫu đất ở Rừng Quốc

gia Hoàng Liên và nghiên cứu các đặc tính sinh học tiềm năng của chúng như: sinh ra nhiều các loại enzyme amylase, cellulose, xylanase, lipase, protease và

phytase, sinh chất kháng sinh kháng lại Shigella sp., E. coli, S. aureus hoặc nấm gây bệnh trên cây là F. oxysporum.

Trong nghiên cứu của Senol và cộng sự (2014), đã tinh chế được enzyme

Chitinase từ vi khuẩn Bacillus subtilis TV-125 có khả năng chống lại Fusaarium Culmorum - một loại nấm gây bệnh trên thực vật.

Balouiri và cộng sự (2015), đã phân lập được chủng Bacillus spp. có khả năng kháng lại nấm C. albicans. Trong một nghiên cứu của Boottanun và cộng sự (2017), tìm thấy được chất chuyển hóa thứ cấp từ Bacillus amyloliquefaciens phân lập từ đất có thể ức chế được vi khuẩn gây bệnh như: Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Acinetobacter baumannii. Bacillus mang lại nhiều lợi

ích cho việc chống lại những nguồn bệnh do vi khuẩn và vi nấm gây ra bởi khả

năng hình thành nội bào tử của chúng và hoạt tính kháng sinh phổ rộng. Bacillus

sản xuất ra 167 hợp chất sinh học chống lại vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh

và virus. Bacillus có khả năng sản xuất nhiều loại enzym phân hủy thành tế bào

nấm như chitinase, protease, glucanase,… các enzym này phá hủy thành tế bào, nhất là chitinase.

1.4. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ

Basiliskamide sinh ra từ Bacillus laterosporus có khả năng ức chế nấm C. albicans và A. fumigatus, giá trị MIC lần lượt là 1,0-3,1 µg/mL và 2,5-5,0 µg/mL

(Barsby và cs., 2002).

Trong năm 2010, Gao và cộng sự của mình đã phân lập được chất

Macrolactin có khả năng kháng khuẩn E. coli và S. areus có giá trị MIC lần lượt

là 0,3 và 0,1 µg/mL.

Trong một nghiên cứu khác của Wang và cộng sự (2015), Chlorotetaine được

tìm thấy từ Bacillus amyloliquefaciens có khả năng ức chế được các chủng nấm

</div>Trang 27<div class="page_container" data-page="27">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida krusei và Polymorphic candida với giá trị MIC là 0,81 µg/mL và 1,63 µg/mL đối với nấm mốc Aspergillus niger.

</div>Trang 28<div class="page_container" data-page="28">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

</div>Trang 29<div class="page_container" data-page="29">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Thời gian: Từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 7 năm 2020 - Địa điểm:

＋ PTN Công nghệ Vi Sinh-cơ sở 3, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 68 Lê Thị Trung, Thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương.

＋ Phịng 19, Phịng các hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Cơng nghệ Hóa học, số 01 Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, TP. Hồ Chí Minh.

＋ Phòng 4.4, Phòng các hợp chất có hoạt tính sinh học, Viện Cơng nghệ Hóa học, TL29, phường Thạnh Lộc, Quận 12, TP. HCM.

2.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.2.1. Chủng vi sinh vật nghiên cứu

Chủng vi khuẩn nội sinh Bacillus sp. RD26 phân lập từ cây Diệp Hạ Châu Đắng (Phyllanthus amarus schum. et thonn) được cung cấp bởi phịng thí nghiệm

Cơng nghệ Vi sinh, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh.

Chủng nấm Candida albicans, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Microsporum gypseum được cung cấp bởi

Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.

2.2.2. Mơi trường - hóa chất

- Nutrient broth (NB), Nutrient agar (NA), Sabouraud Dextrose Agar (SDA).

- Cồn 96o, 70o, NaCl, HCl, NaOH, H2SO4. - Nguồn dinh dưỡng: glucose, pepton. - Các muối khống: CaCO3, MgSO4.

- Các dung mơi: ethyl acetat, methanol, chloroform và nước. - Nước muối sinh lý 0.85%, nước cất.

2.2.3. Thiết bị và dụng cụ

- Thiết bị: cân kỹ thuật, nồi hấp, tủ lạnh, tủ mát, tủ cấy, máy ly tâm, máy đo OD, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, máy vortex, lị vi sóng,…

</div>Trang 30<div class="page_container" data-page="30">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

- Dụng cụ: ống nghiệm, đèn cồn, đĩa petri, giá ống nghiệm, pipette, micropipette, bơng gịn, bình scotte, erlen, que cấy vòng, que cấy trang, đũa khuấy, kéo, kẹp sắt,…

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Bố trí thí nghiệm

</div>Trang 31<div class="page_container" data-page="31">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

2.3.2. Hoạt hóa chủng Bacillus sp. RD26

Kế thừa từ nghiên cứu “Tối ưu hóa mơi trường ni cấy chủng Bacillus sp.

RD26 để nâng cao hoạt tính kháng vi khuẩn MRSA bằng phương pháp quy

Chủng Bacillus sp. RD26

Nuôi cấy

Lên men và thu dịch

Cô quay dịch thu được với dung môi

Thu được cao chiết từ

Đánh giá một số hoạt tính thu được từ hợp

chất Khảo sát khả năng kháng

nấm gây bệnh từ cao BR-M

Xác định nồng độ kháng nấm tối thiểu (MIC) từ

cao chiết BR-M

Sắc ký cột

Khảo sát phân đoạn kháng bằng phương pháp tự sinh đồ

</div>Trang 32<div class="page_container" data-page="32">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

hoạch thực nghiệm” (Dương Nhật Linh và cs., 2018) trước đó đã xác định cơng

thức mơi trường tối ưu hóa để lên men chủng Bacillus sp. RD26 (pepton: 7,36

g/L, glucose: 15 g/L, CaCO3: 0,72 g/L, MgSO4: 0.6 g/L).

Hoạt hóa: Chủng vi khuẩn Bacillus sp. được hoạt hóa bằng cách lấy một ít

sinh khối từ ống thạch nghiêng NA vào 20 mL môi trường NB chứa trong bình erlen. Sau đó, đem ni ở 37oC/36h, với tốc độ lắc 200 vòng/phút.

Nhân giống: Bổ sung 10% dịch vi khuẩn Bacillus sp. đã được hoạt hóa vào

100 mL môi trường canh vô trùng (Pepton 7.36 g, Glucose 15 g, CaCO3 0.72 g, MgSO4 0.6 g, nước cất 1000 mL, pH 7±0.1). Nuôi lắc ở 37oC/36h, tốc độ lắc 200 vòng/phút (Grahovac và cs., 2015).

Lên men: Bổ sung 10% dịch khuẩn nhân giống cấp 2 vào 1L mơi trường tối ưu hóa đã được hấp vơ trùng. Nuôi ở 37oC/ 36h (Bisht và cs., 2011).

2.3.3. Thu nhận cao chiết từ dịch ngoại bào bằng dung môi methanol

2.3.3.1. Thu nhận cao

Hoạt hóa chủng như mục 3.3.2.

Sau thời gian lên men đem ly tâm 10.000 vòng/ phút trong vòng 10 phút ở 4oC rồi thu dịch nổi. Tiến hành thu cao chiết chủng Bacillus bằng cách cho dịch

thu được và dung mơi methanol vào bình cơ quay. Sau đó, đem cô quay đuổi bỏ dung môi để thu được cao chiết.

Nhiệt độ cô quay phụ thuộc vào nhiệt độ sôi của dung môi (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

2.3.3.2. Khảo sát hoạt tính kháng nấm của cao chiết chủng Bacillus sp.

</div>Trang 33<div class="page_container" data-page="33">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

- Đo OD 530 nm điều chỉnh sao cho đạt trong khoảng từ 0,08-0,1tương ứngvới McFarland 0.5 sau đó pha lỗng dịch nấm để đạt mật độ tế bào đạt 106 CFU/mL.

- Nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút

❖ Vi nấm T. rubrum, T. mentagrophytes, M. canis, M. gypseum:

- Nấm được cấy trên môi trường thạch SDA có bổ sung kháng sinh cloramphenicol, ủ ở 30oC/72h.

- Dùng que cấy cạo nhẹ bề mặt khóm nấm để lấy bào tử cho vào ống nước muối 0.85%.

- Đo OD 530 nm điều chỉnh sao cho đạt trong khoảng từ 0,08-0,12 tương đương với mật độ tế bào là 1x108 CFU/mL, sau đó pha lỗng dịch nấm để đạt được nồng độ 106 CFU/mL.

- Dịch nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút. ● Các bước tiến hành:

- Dùng tăm bông vô trùng phết vi nấm gây bệnh đã được pha loãng trải đều lên môi trường thạch đã được chuẩn bị, trải đến khi cho mặt thạch ráo. Mỗi lần xoay đĩa 60o.

- Dùng dụng cụ đục lỗ, đục 4 lỗ trên đĩa, mỗi lỗ khoảng 6mm.

- Dùng pipet hút 70 μL dịch lọc cho vào giếng. Một giếng bơm nước cất làm giếng đối chứng.

- Để yên trong vòng 15 phút cho cao chiết khuếch tán đều vào lớp thạch. - Sau đó, đem ni ở 28oC trong vịng 4-5 ngày đối với vi nấm. Sau 4-5

ngày, đọc kết quả vịng kháng. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.

● Kết quả: Cao chiết được cho là có khả năng kháng nấm khi xung quanh giếng

khơng có vi nấm mọc.

2.3.3.3. Xác định nồng độ kháng nấm tối thiểu (MIC) từ cao chiết chủng Bacillus sp. RD26

Nhằm xác định nồng độ ức chế tối thiểu mà tại đó, cao chiết chủng

Bacillus sp. có khả năng ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh

</div>Trang 34<div class="page_container" data-page="34">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

● Chuẩn bị:

- Môi trường SDA đã được hấp vô trùng ở 121oC/ 20 phút.

- Chuẩn bị một dãy ống nghiệm (10 ống) có chứa nước cất đã được hấp vơ trùng.

● Các bước tiến hành:

- Pha loãng cao chiết với nước cất, từ dung dịch gốc có nồng độ 1000 µg/mL, cao chiết thử nghiệm được pha loãng theo cấp số nhân thành các nồng độ liên tiếp 1/2, 1/4, 1/8, 1/16.

- Cho cao chiết vào dãy ống nghiệm với độ pha loãng khác nhau và trộn đều

cao chiết với nước cất.

- Đổ cao chiết từ các ống nghiệm ra đĩa rồi cho môi trường SDA vào và trộn

đều. Sau đó, để cho mơi trường được khơ hoàn toàn. - Chuẩn bị dịch treo vi nấm gây bệnh tương tự mục 3.3.3.1.

- Dùng tăm bông vô trùng lấy dịch vi nấm đã chuẩn bị chấm lên đĩa mơi trường có chứa cao chiết. Trong đó, có một đĩa chỉ chứa mơi trường được làm đĩa đối chứng.

</div>Trang 35<div class="page_container" data-page="35">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

- Sử dụng ống vi quản, chấm các cao đã được pha loãng vào tấm TLC cách mép đáy 1.5 cm và cách bề mặt dung môi từ 0.8-1 cm. Các vết ở 2 bên bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1 cm để tránh hiệu ứng bờ. - Đặt các tấm TLC đã được chấm vào ly thủy tinh có chứa dung mơi và

được đậy kín để tránh dung mơi bay hơi.

- Dung môi chạy đến khoảng 80% tấm TLC thì lấy ra để nhiệt độ phịng để các bản mỏng được khơ hồn tồn.

2.3.6. Khảo sát phân đoạn kháng bằng phương pháp tự sinh đồ

● Chuẩn bị dịch treo vi nấm gây bệnh:

</div>Trang 36<div class="page_container" data-page="36">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

- Nấm được cấy trên môi trường thạch SDA có bổ sung kháng sinh cloramphenicol, ủ ở 30oC/72h.

- Dùng que cấy cạo nhẹ bề mặt khóm nấm để lấy bào tử cho vào ống nước muối 0.85%.

- Đo OD 530 nm điều chỉnh sao cho đạt trong khoảng từ 0,08-0,12 tương đương với mật độ tế bào là 1x108 CFU/mL, sau đó pha loãng dịch nấm để đạt được nồng độ 106 CFU/mL.

- Dịch nấm đã chuẩn bị cần được sử dụng trong vòng 15 phút. ● Các bước tiến hành:

- Các tấm TLC sau khi được chạy sắc ký sẽ được làm khơ hồn tồn để loại bỏ dung mơi trước khi thử hoạt tính kháng.

- Các tấm TLC sau đó được cho vào đĩa petri vô trùng, cho dịch vi nấm vào.

- Các đĩa được ủ 37oC trong vòng 24-48h. Sau 24-48h đọc kết quả vết kháng.

● Kết quả: Phân đoạn được cho là có khả năng kháng khi có vết trắng xuất hiện trên nền tím.

2.3.7. Tinh sạch và xác định cấu trúc hợp chất thu nhận được

- Sử dụng sắc ký cột pha thường để phân lập, tinh chế hợp chất từ cao chiết.

- Để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được, sử dụng kết hợp các phương pháp vật lý và các phương pháp phổ hiện đại, đồng thời kết hợp tra cứu tài liệu tham khảo.

- Phương pháp phổ cộng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR (sử dụng TMS làm chất nội chuẩn) tại Viện Cơng nghệ Hóa học.

</div>Trang 37<div class="page_container" data-page="37">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA

2.3.8. Phương pháp thử hoạt tính sinh học

Thử hoạt tính oxy hóa và gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7)

Hợp chất BR03 được gửi thử hoạt tính chống oxy hóa (DPPH) và gây độc tế

bào ung thư vú (MCF-7) tại phòng SHPT – BM Di truyền trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.

</div>Trang 38<div class="page_container" data-page="38">

SVTH: NGUYỄN CHÂU KHOA