khảo sát thành phần hóa học phân đoạn sdm2 7 7 cao methanol cây cam thảo nam scoparia dulcis l

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.33 MB, 73 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>HỒ</b>

<b> NGỌCTRINH</b>

<b>SDM2.7.7 CAO METHANOL CÂY CAM THẢO NAM </b>

<b>KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>SDM2.7.7 CAO METHANOL CÂY CAM THẢO NAM </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>GIẤY XÁC NHẬN </b>

Tôi tên là: Hồ Ngọc Trinh

Ngày sinh: 10-02-1997 Nơi sinh: Tp.HCM

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã sinh viên: 1653010347

Tơi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh sẽ kết nối tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thơng tin khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ký tên

Hồ Ngọc Trinh

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>Giảng viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Minh Hoàng </b>

<b>Học viên thực hiện: Hồ Ngọc Trinh Lớp: DH16YD01 </b>

<b>Ngày sinh: 10/02/1997 Nơi sinh: Tp. Hồ Chí Minh Tên đề tài: KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC PHÂN ĐOẠN SDM2.7.7 CAO </b>

<i><b>METHANOL CÂY CAM THẢO NAM (SCOPARIA DULCIS L.) </b></i>

<b>Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên được bảo vệ khóa luận trước </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<b>LỜI CẢM ƠN</b>

Đầu tiên em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô Khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã hết lòng truyền đạt cho em nhữngkiến thức quý báu trong những năm tháng trên giảng đường đại học. Chính nhữngkiến thức mà Thầy Cô giảng dạy là nền tảng cho em trong quá trình thực hiện đề tàithực tập tốt nghiệp.

-Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc của em đến thầy Nguyễn Minh Hoàng, ngườithầy đã tận tâm hướng dẫn, dạy bảo và truyền đạt những kiến thức cũng như kinhnghiệm quý báu đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho em hoàn thành đề tàithực tập tốt nghiệp này.

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Lê Tiến Dũng và anh chị tạiphịng Hố Sinh Dược - Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa họcvà Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn, tạo điều kiện làm việc tốt nhất và dành choem sự quan tâm, giúp đỡ to lớn trong thời gian em thực hiện đề tài tại đây.

Ngoài ra khơng thể thiếu sự giúp đỡ nhiệt tình của toàn thể các bạn sinh viênđang thực tập và học việc trong phịng thí nghiệm Hố Sinh Dược. Mọi người đãln động viên, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình học tập cũng như trongthời gian thực hiện thực tập tốt nghiệp.

Quan trọng nhất trong cuộc đời con, con kính gửi đến bố mẹ tình cảm sâu sắctận đáy lịng con. Nhờ có sự dạy dỗ, động viên, dìu dắt và tạo mọi điều kiện cho concó thể phát huy được những khả năng tiếp tục thực hiện niềm u thích của mình.Con sẽ cố gắng và nỗ lực bước đi hết con đường tốt đẹp mà Bố Mẹ đã dành cho con.

Gửi lời chúc sức khoẻ đến tất cả mọi người và chúc các bạn của tôi hồnthành tốt thực tập tốt nghiệp của mình cũng như thành cơng trong cuộc sống.

Trân trọng cảm ơn!

TP.Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2020Sinh viên

HỒ NGỌC TRINH

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN...IMỤC LỤC... IIDANH MỤC HÌNH... IVDANH MỤC SƠ ĐỒ...VDANH MỤC BẢNG...VIDANH MỤC VIẾT TẮT...VII

ĐẶT VẤN ĐỀ...1

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CAM THẢO NAM... 3

1.1. Danh pháp và phân loại...3

1.2. Đặc điểm hình thái... 4

1.3. Thành phần hoá học... 4

1.4. Tác dụng dược lý...4

1.5. Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước...5

1.5.1. Nghiên cứu trong nước...5

1.5.2. Nghiên cứu ngồi nước...5

1.6. Một số thành phần hóa học đã được công bố ... 6

1.7.4. Các kỹ thuật giải ly chất ra khỏi cột... 14

1.7.5. Kỹ thuật tăng dần tính phân cực cho dung mơi giải ly...14

1.7.6. Phương pháp ngâm dầm...14

1.7.7. Phương pháp kết tinh phân đoạn... 14

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

1.7.8. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập được...15

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...16

2.3.2. Điều chế cao methanol...17

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU...19

3.1. Phân lập và tinh chế các hợp chất có trong cam thảo nam...19

3.1.1. Khảo sát phân đoạn cao chiết MeOH... 19

3.1.2. Khảo sát phân đoạn SDM2... 20

3.1.3. Khảo sát phân đoạn SDM2.7... 21

3.1.4. Khảo sát phân đoạn SDM2.7.7... 22

3.1.5. Khảo sát phân đoạn SDM2.7.7.7...26

3.1.6. Khảo sát phân đoạn SDM2.7.7.2.2 (kí hiệu B)... 27

3.1.7. Khảo sát phân đoạn B1... 28

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<b>DANH MỤC HÌNH</b>

Hình 1.1. Cam thảo nam...3

Hình 3.1. Sắc ký cột nhanh khơ cao MeOH của Cam thảo nam...19

Hình 3.2. Kết quả TLC gom phân đoạn của cao SDM 2.1 đến 2.8...21

Hình 3.3. Kết quả TLC gom phân đoạn của cao SDM 2.7...22

Hình 3.4. Kết quả TLC gom các phân đoạn của cao SDM2.7.7... 23

Hình 3.5. Chấm bản mỏng và giải ly với các hệ Cột saphadex SDM 2.7.7.2...26

Hình 3.6. Kết quả SKCĐ gom phân đoạn của cao B ...28

Hình 3.7. Kết quả TLC gom phân đoạn của cao B1 thu được 3 phân đoạn chínhB1.1,B1.2 và B1.3... 29

Hình 3.8. Các tương quan HMBC... 31

Hình 3.9. Tương quan HMBC của các phân tử đường trong SDMIII... 30

Hình 3.10. Cấu trúc hóa học của hợp chất SDM III...36

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>DANH MỤC SƠ ĐỒ</b>

Sơ đồ 2.1.Phương pháp điều chế các loại cao từ cây Cam thảo nam...18Sơ đồ 3.1. Tách phân đoạn từ cao Methanol của cây Cam thảo... 20Sơ đồ 3.2. Sắc ký cột trên cao SDM2 của cây Cam thảo nam....25Sơ đồ 3.3. Sơ đồ sắc ký cột trên cao phân đoạn SDM2.7.7.2 của cây Cam thảo...27

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>DANH MỤC BẢNG</b>

Bảng 1.1. Chi tiết các hợp chất Benzoxazinoid trong cây Cam thảo nam...6

Bảng 1.2. Chi tiết các hợp chất Flavonoid trong cây Cam thảo nam...7

Bảng 1.3. Chi tiết các hợp chất Diterpenoid trong cây Cam thảo nam...8

Bảng 1.4. Chi tiết các hợp chất Triterpenoid trong cây Cam thảo nam...9

Bảng 3.1. Kết quả sắc ký bản mỏng cao SDM... 20

Bảng 3.2. Kết quả sắc ký bản mỏng phân đoạn SDM2...21

Bảng 3.3. Kết quả sắc ký bản mỏng phân đoạn SDM2.7...22

Bảng 3.4. Kết quả sắc ký bản mỏng phân đoạn SDM2.7.7...24

Bảng 3.5. Kết quả sắc ký bản mỏng phân đoạn SDM2.7.7.2...26

Bảng 3.6. Kết quả sắc ký bảng mỏng phân đoạn B...28

Bảng 3.7. Kết quả sắc ký bản mỏng phân đoạn B1...29

Bảng 3.8. So sánh số liệu phổ của SDM III và Ferruginoside C... 32

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoạiMS Mass Spectrum Phổ khốiNMR

Nuclear Magnetic <sub>Phổ cộng hưởng từ hạt</sub>nhân

DistortionlessEnhancement byPolarization Transfer

Phổ DEPT

HMBC <sup>Heteronuclear Multiple Phổ tương tác dị hạt nhân</sup>Bond Coherence qua nhiều liên kết

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

HSQC <sup>Heteronuclear Single</sup>Quantum Correlation

Phổ tương tác dị hạt nhânqua một liên kếtChemical shift Độ chuyển dịch hóa họcppm Part per million Một phần triệu

<i>J</i> Coupling constant Hằng số ghép spin-spin(M)Hz (Mega) Hertz

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% cá thểMIC <sup>Minimum Inhibitory</sup>

concentration <sup>Nồng độ ức chế tối thiểu</sup>

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

<b>ĐẶT VẤN ĐỀ</b>

Những năm gần đây,nhiều loại bệnh nguy hiểm chưa tìm được thuốc đặctrị như ung thư, HIV, xơ vữa động mạch, tiểu đường, đột quỵ… đang ngày mộtxuất hiện càng nhiều trên thế giới với số lượng bệnh nhân không ngừng giatăng. Chính điều này đã thơi thúc các nhà khoa học phải ln tìm kiếm, tổnghợp những loại thuốc mới có cơng dụng trị liệu tốt hơn. Với những tiến bộ vượtbậc của y học ngày nay các sản phẩm có tác dụng chữa bệnh đã và đang đượctổng hợp để sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, các loại thuốc có nguồn gốc tổng hợpkhơng phải là giải pháp tối ưu ít nhiều đều gây nên tác dụng phụ cho người sửdụng. Do vậy, vào những năm gần đây, xu hướng sử dụng các hợp chất nguồngốc từ tự nhiên có hoạt tính sinh học đã được các nhà khoa học quan tâm hàngđầu nhằm tạo ra các sản phẩm chiết xuất từ thiên nhiên có khả năng đáp ứngđược các nhu cầu đa dạng cho đồng thời không gây tác dụng phụ cho người sửdụng.

<i>Trong số đó cây cam thảo nam (Scoparia dulcis L</i><b>.) là cây thực vật thân</b>

thảo đã được sử dụng trong các loài thuốc nam dân gian ở Việt Nam. Khôngnhững thế Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ,.. cũng dùng để lợi tiểu, chống đáitháo đường, viêm nhiễm. Người Antilles dùng để điều trị rong kinh và bệnh lậu.Nước Đài Loan dùng cây cam thảo để trị bệnh viêm phế quản và loét dạ dày.

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá hoạt tính sinh học của

<i>Scoparia dulcis L. bao gồm gây độc tế bào, ức chế β –glucuronidase, chống</i>

viêm, kháng virut, hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm và lợi tiểu. Hơn 50 hợpchất, bao gồm flavonoid, terpenoids, benzoxazinoids, v.v., đã được phân lập

<i>từ Scoparia dulcis L. trên thế giới nhưng ở Việt Nam thì cịn hạn chế.</i> Do đó,chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài “<b>Khảo sát thành phần hóa học ở phân đoạn</b>

<i><b>2.7.7 cao methanol từ cây cam thảo nam (Scoparia dulcis L.)”. Đây sẽ là một</b></i>

tiền đề cho việcnghiên cứu một số sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiênvới độ tinh sạch, có hoạt tính cao trong việc phòng và chữa bệnh.

Mục tiêu của đề tài:

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

– Khảo sát thành phần cao methanol ở phân đoạn 2.7.7 từ cây cam thảonam.

– Phân lập thành phần cao methanol ở phân đoạn 2.7.7 từ cây cam thảonam.

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

<b>CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CAM THẢONAM</b>

Cam thảo nam cịn có tên là cam thảo đất, dã cam thảo (Trung Quốc),

<i>giả cam thảo, có tên khoa học là Scoparia dulcis L., thuộc họ hoa mõm chó</i>

(Scrophulariaceae) .

Phân loại thực vật (Đỗ Tất Lợi et al, 2004) :

<small>-</small> Giới: Thực vật (Plantae)

<small>-</small> Bộ: Hoa Môi (Lamiales)

<small>-</small> Họ: Mã đề (Plantaginaceae)

<small>-</small> Chi: Scoparia

<i>- Loài: Scoparia dulcis</i>

Phân bố: Chi Scoparia có khoảng 10 lồi trên thế giới, phân bố chủ yếu ởcác vùng nhiệt đới. Việt Nam duy nhất có một lồi là cây cam thảo nam. Hiện naycây mọc hoang dại ở nhiều nơi, nhất là vùng nhiệt đới Đông Nam Á và mọc cả ởmiền Nam Trung Quốc, đặc biệt vùng Quảng Tây, nhân dân cũng dùng cây nàyvới tên dã cam thảo. Tại Ấn Độ, Malaisia, Thái Lan, châu Mỹ đều có .

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

Cam thảo nam là một loài cỏ thẳng đứng, cao 30 - 80cm, thân nhẵn, rễ tohình trụ. Lá đơn, mọc đối hoặc vịng 3 lá một. Phiến lá hình mác hay hình trứngngược, dài 1,5 - 3cm, rộng 8 - 12mm, phía cuống hẹp lại thành cuống ngắn, méplá nửa phía trên răng cưa to, phía dưới nguyên. Mùa hạ ra hoa nhỏ màu trắng ở kẽlá, mọc riêng lẻ hoặc thành đôi. Quả nhỏ hình cầu, trong chứa nhiều hạt nhỏ, nhănnheo (Đỗ Tất Lợi et al, 2004). Mùa hoa quả: tháng 5 - 7 .

<b>1.3. Thành phần hố học</b>

Tồn cây cam thảo nam chứa diterpenoid, flavonoid và acid hữu cơ. Cácchất diterpenoid bao gồm scoparinol, dulanol, scopadulin, acid scoparic A, B, C,acid scopadulcic A, B. Các flavonoid là hymenoxin, apigenin, luteolin, scutelarein,scutelarin methyl ester, linarin, vitexin, isovitexin, vicenin – II. Các acid hữu cơbao gồm acid betulinic, acid dulcisic, acid ifflaionie. Ngoài ra, cịn có friedelin,glutinol, dulcitol amellin, β – sitosterol, tanin, alcaloid (Trung thảo dược học III,1997).

Nhân dân nhiều vùng ở Việt Nam cũng như nhân dân vùng Quảng Tây(Trung Quốc) dùng thay vị Cam thảo bắc để chữa sốt, chữa say sắn độc và giảiđộc cơ thể. Tại Malaysia, Cam thảo nam được dân gian dùng làm thuốc chữa ho.Người dân trên đảo Angti dùng rễ Cam thảo nam làm thuốc để chữa bệnhlậu,rong kinh (Đỗ Tất Lợi et al, 2004).

Amellin là một hợp chất có khả năng làm giảm đường huyết và các triệuchứng của bệnh đái tháo đường, tăng hồng cầu. Cũng giống như insulin, amellinkhơng làm hạ đường huyết dưới mức bình thường, mà sự giảm lượng đườngtrong máu và nước tiểu diễn ra dần dần. Nó làm tăng lượng, kiềm dự trữ bị hạthấp ở người bệnh đái tháo đường và làm giảm hàm lượng sắt trong huyết thanhvà các chất tạo cetone trong máu. Nó ngăn cản sự tiêu hao mơ, tích tụ protein tốthơn trong chế độ ăn, làm giảm mỡ trong mơ mỡ, thúc đẩy q trình làm lành cácvết thương.

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

Theo Đông y, Cam thảo nam vị ngọt, hơi đắng, tính mát; có tác dụngthanh nhiệt, giảm ngứa, cầm tiêu chảy, chữa cảm sốt, ho. Nó thường được dùngchữa một số bệnh như dị ứng mề đay, rôm sảy, eczema, lở ngứa, cảm mạo, hohen. Ngồi ra cam thảo nam cịn có tác dụng bổ tỳ, nhuận phế, thanh nhiệt, giảiđộc và lợi tiểu .

<b>1.5. Một số nghiên cứu trong nước và ngoài nước</b>

1.5.1

.

Nghiên cứu trong nước

Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của lồi Cam thảo nam trongnước vẫn cịn là một đề tài khá mới, chưa được tìm hiểu và nghiên cứu nhiều.Năm 2006, nhóm nhà khoa học Phan Minh Giang và cộng sự đã khảo sátthành phần hóa học và hoạt tính những diterpenoids loại scopadulan từ Cam thảonam ở Việt Nam (Phan Minh Giang et al, 2006).

Các hợp chất methoxyflavonoid và coixol được phân lập từ cây Cam thảo

<i>nam (Scoparia dulcis Linn.) (Tôn Nữ Liên Hương et al, 2006).</i>

Qua các tài liệu, cho thấy trong nước chỉ nghiên cứu về tác dụng và hoạttính sinh học của Cam thảo nam dựa vào các bài thuốc dân gian. Những nghiêncứu về khảo sát thành phần hóa học của cây Cam thảo nam trong nước còn rấthạn chế.

1.5.2. Nghiên cứu ngoài nước

Từ những năm 1966 đến 1969 các hợp chất thơng thường như sitosterol,hexacosanol, D-mannitol,... đã được tìm thấy trong cây,sau đó là các hợp chất đặctrưng của lồi như dulciol, scropanol, dulciolone cũng đã được phân lập (Chen etal, 1976).

Năm 1976, Chen, C.M. và Chen, M.T. đã công bố về hợp chất methoxybenzoxazolinone và một loại triterpene là ifflaionic acid từ rễ cây Cam

<i>6-thảo nam, bài viết được đăng trên tạp chí Phytochemistry số 15 (Chen et al, 1976).</i>

Năm 1988, Kawasaki, M. và cộng sự đã phân lập 11 hợp chất flavonoidnhư apigenin, scutellarein, luteolin, linarin, scutellarin,... và một số dẫn xuất

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

của chúng từ dịch chiết ethanol 70% của cây Cam thảo nam (Kawasaki etal,1988).

Còn nhiều nghiên cứu từ nhiều quốc gia khác về thành phần hóa học củalồi cây này đã được cơng bố ở các nước như Bangladesh, Thái Lan, HànQuốc,... cho thấy tầm quan trọng của việc tìm hiểu thơng tin hóa học về mộtloại cây có nhiều hoạt tính sinh học và dược học như cây Cam thảo nam.

<b>1.6. Một số thành phần hóa học đã được cơng bố .</b>

1.6.1. Các hợp chất Benzoxazinoid

<b>Bảng 1.1. Chi tiết các hợp chất Benzoxazinoid trong cây Cam thảo nam.</b>

1 Benzoxazolinone: R1 = R2 = H C7H5O2N(135.1 amu)2

6-methoxy-benzoxazolin-2(3H)-one: C8H7O3NR1 = H; R2 = OCH3 (165.1 amu)3

3-hydroxy-6-methoxy-2-benzoxazolinone: C8H7O4NR1= OH; R2 = OCH3 (181.1 amu)4

3,6-dimethoxy-benzoxazolin-2(3H)-one:R1 = R2 = OCH3

C9H9O4N(195.1 amu)5

(2R)-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3(2H)-one glucopyranoside:R1 = β-D-Glc; R2 = H

2-O-β-C15H19O9N(357.3 amu)6

(2R)-7-methoxy-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-one galactopyranoside:R1 = β-D-Gal; R2 = H

2-O-β-C15H19O9N(357.3 amu)7 (2R)-7-methoxy-2H-1,4-benzoxazin-3(4H)-one 2-O-β-

galactopyranoside:R1 = β-D-Gal; R2 = H

C16H21O10N(387,3 amu)

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

5-71-4

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

1.6.3. Các hợp chất Diterpenoid.

<b>Bảng 1.3. Chi tiết các hợp chất Diterpenoid trong cây Cam thảo nam.</b>

12 Dulcinol (Scopadulciol) C27H36O4(424.6 amu)

14 Dulcidiol C27H38O4(426.6 amu)

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

<b>1.7. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu.</b>

1.7.1

.

Phương pháp sắc ký- Sắc ký lớp mỏng (TLC):

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là phương pháp sắc ký dựa vào hiện tượng hấp thu,trong đó pha động là dung mơi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển qua pha tĩnh làchất hấp thụ trơ như silica gel, alumina... Pha tĩnh được tráng đều và giữ trên mặtphẳng của tấm thuỷ tinh, plastic hay nhơm. Lớp mỏng pha tĩnh thường có chiều dàykhoảng 0.25 – 0.5 mm (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Đối với chất hấp thu silicagel thì chất nào có tính phân cực kém hơn sẽ di chuyển nhanh hơn so với chất cótính phân cực mạnh.

Mẫu phân tích: thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khácnhau. Sử dụng khoảng 1μl dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, dùng ốngvi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh ở vị trí cao hơn một chút so vớimặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình giải ly.

Pha động: Là dung mơi hoặc hỗn hợp dung môi, di chuyển chậm dọc theo tấmbảnmỏng và lơi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung mơi di chuyển lên cao nhờ vào lực maoquản.

Ưu điểm:

Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích.

Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điềukiện phân tích.

Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc kýlớp mỏng.

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng silica gel 60 F254 trêntấm nhôm 20x 20 cm, Merck. Để biết được vị trí của vết trên bản mỏng có thể ápdụng các phương pháp sau: soi bản với đèn UV ở bước sóng 365 - 254 nm (ưuđiểm của phương pháp này là nhanh, tiện lợi, nhìn được vết mà khơng bị hao hụtmẫu chất. Nhược điểm là vết có thể ở vị trí x trên bản, nhưng mắt lại nhìn thấy vết

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

ở vị trí khác), hoặc nhúng bản vào dung dịch H<small>2</small>SO<small>4</small> 5 - 10% trong ethanol, sấy khôrồi nướng trên bếp điện đến khi hiện màu.

- Sắc ký cột thường:

Sắc ký cột thường được tiến hành tại điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnhlà loại hạt có kích thước tương đối lớn (50 ÷ 150 μm) được nạp trong cột thủy tinh.Có 2 loại là silica gel pha thường và silica gel pha đảo. Silica gel pha thường có cỡhạt là 0,040 ÷ 0,063 mm (240 ÷ 430 mesh), silica gel pha đảo có cỡ hạt từ 30 ÷ 50μm. Mẫu chất cần phân tích được nạp ở đầu cột, trên pha tĩnh. Sau đó dung mơigiải ly sẽ ra khỏi cột ở bên dưới cột và được hứng vào hủ bi hoặc ống nghiệm. Đốivới loại cột thường, hợp chất ít phân cực hơn được giải ly ra khỏi cột trước, hợpchất phân cực hơn sẽ bị pha tĩnh giữ lại và ra khỏi cột chậm hơn, còn cột đảo thìhợp chất phân cực hơn ra khỏi cột trước và cơ chế bị giữ lại cũng tương tự cộtthường.

- Sắc ký cột Sephadex:

 Nguyên tắc: Những phân tử có kích thước lớn khơng thể chui vào lỗrỗng của mạng gel, nhanh chóng ra khỏi cột, trong khi phân tử nhỏ ra khỏi cột lâuhơn vì bị giữ trong lỗ rỗng của gel lâu hơn. Như vậy, hỗn hợp mẫu khi đi qua cộtsắc ký lọc gel sẽ ra khỏi cột lần lượt theo trình tự trọng lượng phân tử lớn ra khỏicột trước, trọng lượng phân tử nhỏ ra khỏi cột sau.

Quy trình tiến hành:

 Nhồi gel vào cột: cho các hạt gel đã trương nở ở dạng huyền phù vàocột. Cân bằng cột bằng cách cho dung môi giải ly chảy qua cột vài lần. Đặt mẫu lên đầu cột gel: Dung dịch mẫu đặt lên đầu cột giống như sắc ký

 Triển khai sắc ký gel: sử dụng kỹ thuật dung môi đơn nồng độ (nghĩa làsử dụng một loại dung môi hay hỗn hợp dung mơi, khi bắt đầu cho tớikhi kết thúc q trình giải ly chỉ sử dụng một loại dung mơi đó). Các chấttan sẽ ra khỏi cột theo thứ tự trọng lượng phân tử giảm dần.

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

1.7.2. Các bước thực hiện quá trình sắc ký

<i>. Lựa chọn dung môi tiến hành sắc ký</i>

Trước khi triển khai sắc ký cột cần dùng sắc ký bản mỏng để dò hệ giải lyphù hợp theo các bước sau:

<small>-</small> Bước 1: Hòa tan mẫu trong dung môi phù hợp (dung dịch A).

<small>-</small> Bước 2: Chuẩn bị những tấm bản mỏng có kích thước 4x10cm. Chấm lênnhững bản này dung dịch A với nồng độ dung dịch khoảng 2 - 5%.

<small>-</small> Bước 3: Giải ly bản mỏng với những hệ dung môi khác nhau.

- Bước 4: Hiện hình các vết trên bản bằng đèn UV hoặc thuốc thử. Từ đónhận định hệ dung mơi phù hợp cho q trình giải ly cột sắc ký dựa vàogiá trị R<small>f</small>.

Với:

<i>R</i>

=

- Trong đó:

a: là khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm của vết mẫu thử (đơn vị: cm).

b: là khoảng cách từ vạch xuất phát đến vạch dung môi trên cùng đường đi củavết (đơn vị: cm).

R<small>f</small> chỉ có giá trị từ 0 đến l (vào khoảng 0.2 ÷ 0.3 là được). Đối với mẫu cao thôban đầu, dung môi giải ly đầu tiên là dung mơi đẩy vết ít phân cực nhất lên vị trícó R<small>f</small> = 0,5 và dung mơi chấm dứt sắc ký cột là dung môi đẩy vết phân cực nhấtlên vị trí có R<small>f</small>= 0,2 (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).

Thường sử dụng silicagel pha thường cho phân đoạn cao hay hỗn hợp chấtcần tách có độ phân cực thấp đến trung bình, silicagel pha đảo thường được dùngkhi cần cơ lập các hợp chất phân cực lớn. Trong silica gel pha thường thì hợp chấtít phân cực được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực hơn được giải ly sau vàngược lại đối với silica gel pha đảo. Thơng thường để tách chất tốt thì trọng lượngchất hấp phụ phải lớn hơn 25 – 50 lần so với trọng lượng của mẫu chất. Chiều caochất hấp thụ và đường kính trong của cột thường là theo tỉ lệ khoảng 10:1.

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

1.7.3. Nạp chất hấp thu vào cột.

Có hai cách nạp chất hấp thu là: nạp dạng lỏng dùng cho các chất hấp phụ cókhả năng trương nở như silica gel, sephadex…và nạp dạng khô dùng cho các chấthấp phụ khơng có khả năng trương nở như Al<small>2</small>O<small>3</small>, CaCO<small>3</small>...

Nạp chất hấp thụ dạng lỏng vào cột:

Giữ cột thẳng đứng, cho bơng gịn vào phần dưới cột để giữ cho chất hấp thukhông bị theo dung môi ra khỏi cột. Ổn định cột bằng cách rót dung môi khởi đầugiải ly vào nhiều lần. Cho silica gel vào cốc chứa dung mơi, khuấy đều và ngâm ítnhất 2 tiếng để silica gel trương nở. Lượng dung môi dùng vừa đủ khơng sệt qkhiến bọt khí bị giữ trong cột và khơng được q lỏng. Sau đó dùng phễu rót từ từsilica gel vào cột và mở khóa để cho dung môi chảy ra. Sau khi nạp xong tiến hànhcho lượng dung mơi đã chảy ra rót vào cột trở lại vài lần để chặt cột, lưu ý mặtthống của silica gel phía đầu cột phải nằm ngang.

Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột:

Dùng kẹp sắt giữ cột thẳng đứng, cho bơng gịn vào phần dưới cột, cho dungmơi khởi đầu giải ly vào cột và khóa cột lại. Sau đó dùng phễu cho hạt silica gelvào cột và gõ nhẹ theo thành cột để loại bọt khí ảnh hưởng đến q trình giải ly củacột. Tiếp đến mở khóa cột cho dung mơi chảy ra và cũng rót dung mơi trở lại để cộtđược chặt.

Nạp mẫu ở dạng khô

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

Tiến hành cho mẫu vào một lượng dung mơi vừa đủ để hịa tan. Sau đó chomột ít silica gel vào và để khơ tơi rồi mới nạp vào cột. Sau khi nạp mẫu vào cộtcho thêm bơng gịn lên phía trên để tránh bị xáo trộn bề mặt khi đổ dung môi vào.

1.7.4. Các kỹ thuật giải ly chất ra khỏi cột.– Nhờ vào trọng lực

Nếu giải ly cột bằng trọng lực thì các hạt silica gel nạp cột kích thước phải >60 µm. Nếu sử dụng silica gel có kích thước nhỏ hơn thì dung mơi sẽ ra khỏi cột rấtchậm và cần nhờ đến một lực mới có thể ra khỏi cột được.

– Sử dụng lực đẩy

Có thể sử dụng một máy bơm để hỗ trợ cho việc giải ly bằng cách chodịng khí nén hoặc hút tác động vào cột sẽ đẩy dung môi ra khỏi cột.

1.7.5. Kỹ thuật tăng dần tính phân cực cho dung mơi giải ly.

Trong sắc ký cột thường, trước tiên dùng dung mơi ít phân cực để giải lychất tương đối ít phân cực ra khỏi cột rồi sau đó tăng độ phân cực của dung môi lêntừ từ để tránh nứt cột do thay đổi hệ đột ngột. Đối với sắc ký cột pha đảo thường sửdụng dung mơi có tính phân cực mạnh trước rồi từ từ giảm hệ để giải ly các chấtphân cực mạnh ra khỏi cột trước.

1.7.6. Phương pháp ngâm dầm.

Ngâm bột cây trong bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép khơng rỉ có nắpđậy. Tiến hành chiết nhiều lần, mỗi lần khoảng 24 giờ là đủ. Dung môi sau khiđược thu hồi bằng máy cô quay áp suất thấp sẽ được làm khan nước bằng Na<small>2</small>SO<small>4</small>và tiếp tục sử dụng để chiết những lần sau.

1.7.7. Phương pháp kết tinh phân đoạn.

Phương pháp kết tinh phân đoạn dùng để làm sạch các hợp chất thu được ởcác phân đoạn sắc kí. Chọn dung mơi thích hợp hồ tan các chất sau đó để yên trongcác lọ có đậy nắp nhằm hạn chế sự bay hơi của dung môi. Khi thấy tinh thể khôngkết tinh nữa, hút lấy hết phần dung dịch cho vào lọ khác rồi tiếp tục cho dung mơinhư sử dụng lúc ban đầu vào hịa tan tinh thể thu được rồi tiếp tục cho kết tinh. Quátrình được lặp lại nhiều lần đến khi thu được chất sạch.

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

1.7.8. Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập được.Phương pháp vật lý: dựa vào nhiệt độ nóng chảy và độ quay cực.Phương pháp hóa lý:

– Phổ hồng ngoại (IR)

– Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (<small>1</small>H-NMR,<small>13</small>C-NMR, DEPT).– Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (HMBC, HSQC).

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

<b>CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU</b>

<b>2.1. Nguyên vật liệu</b>

2.1.1. Nguyên liệu

- Nguyên liệu: Mẫu nguyên liệu là phần trên mặt đất cây Cam thảo .

- Thời gian, địa điểm thực hiện: Đề tài được thực hiện tại PTN Sinh Hoá Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam từ tháng 10/2019 đến tháng 12/2019.

Dược-2.1.2. Hóa chất và dung mơi

<small>-</small> Hố chất

• Hạt silica gel cỡ hạt 40-60 µm dùng cho pha thường và hạt silica gelpha đảo cỡ hạt 30-50 µm, và hạt gel Sephadex LH-20.

• TLC pha thường (Merck).

• TLC pha đảo (Merck).

• Tủ sấy Memmert ALM400, bể ổn nhiệt Memmert WB7.

• Cân kỹ thuật SHINKO GS 3000g, cân phân tích SHIMADZU ATX224.

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

• Đèn UV Vilber Lourmat VL - 6LC.

•

Cột sắc kí: sử dụng cột cổ điển loại có đường kính 2 cm - độ dài60 cm và cột có đường kính 2.5 cm - độ dài 80 cm. Cột dùng chạySephadex có đường kính 2.5 cm - độ dài 80 cm.Cột đảo dùng đểchạy có đường kính là 2 cm- độ dài là 35 cm.

Các thiết bị ghi phổ: phổ<small>1</small>H-NMR, <small>13</small>C-NMR, phổ DEPT- NMR 135 và 90:ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho phổ <small>1</small>H-NMRvà 125 MHz cho phổ<small>13</small>C-NMR.

Tất cả phổ được ghi tại: Phòng Cộng hưởng từ - Viện Hóa học, Học việnKhoa học và Cơng nghệ Việt Nam; địa chỉ: Số 18 Hoàng Quốc Việt, quận CầuGiấy, thành phố Hà Nội.

<b>2.3. Phương pháp nghiên cứu.</b>

2.3.1

.

Thu mẫu

Mua nguyên liệu 22 kg Cam thảo đất (rễ, thân, lá, hoa, quả,...) được thu hái.Sau đó tiến hành rửa sạch, loại bỏ phần hư, đem phơi gió đến khơ.Tiếp theo xaynhuyễn thành bột nguyên liệu với khối lượng bằng 6 kg.

2.3.2. Điều chế cao methanol

Mẫu bột được cho ngâm trong các bình thủy tinh lớn có nắp đậy. Rótmethanol vào bình cho đến xấp xỉ bề mặt của bột.Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 24giờ, để cho dung môi xuyên thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các hợpchất. Sau 24 giờ, dung dịch chiết được lọc qua giấy lọc, cô quay thu hồi dung mơi.Lặp đi lặp lại q trình nhiều lần cho đến khi chiết kiệt hết các chất trong nguyênliệu bột ta thu được cao MeOH dạng sệt khối lượng m<small>1</small> = 750g. Phương pháp điềuchế các loại cao được tóm tắt trong sơ đồ.

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

<b>Sơ đồ 2.1 .Phương pháp điều chế các loại cao từ cây Cam thảo namBột cây (6 kg)</b>

(40,0 gam) <b>Dịch sau chiết</b>

- Chiết kiệt Hexan- Cô đuổi dung môi

Cao EA (70,0 gam) <b>Dịch sau chiết</b>

- Chiết kiệt với EA- Cô đuổi dung môi

- Chiết cao với MeOH- Cô đuổi dung môi

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

<b>CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU</b>

<b>3.1. Phân lập và tinh chế các hợp chất có trong cam thảo nam.</b>

3.1.1. Khảo sát phân đoạn cao chiết MeOH

Phân đoạn cao MeOH được tiến hành hấp phụ với 40 gam silica gel,sấy khơ và nghiền mịn, sau đó tiến hành sắc ký cột với các thông số cột nhưsau:

- Đường kính cột sắc ký: d = 15 cm.- Chiều dài cột sắc ký: l = 80 cm.

- Khối lượng silica gel nhồi cột: 400 gam.- Khối lượng cao MeOH: 60 gam.

<b>Hình 3.1. Săc ký cột nhanh khơ cao MeOH của Cam thảo nam.</b>

Hệ dung môi giải ly EA:Me:H2O (v/v/v) với các tỉ lệ thay đổi theo hướngtăng dần độ phân cực (25:1:1, 20:1:1, 10:1:1, 8:1:1, 5:1:1) và cuối cùng là MeOH100%. Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ thủy tinh và được theo dõi bằngSKLM (TLC), hiện vết bằng thuốc thử H<small>2</small>SO<small>4</small>10% và hơ nóng trên bếp điện. Các lọcho kết quả SKLM giống nhau (về màu sắc vết và Rf) được gom thành một phânđoạn. Kết quả sắc ký cột trên cao MeOH thu được 3 phân đoạn chính (SDM1-SDM3), trong đó các phân đoạn SDM2 cho vết chính rõ, đẹp nên được chọn đểkhảo sát tiếp.

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

<b>Sơ đồ 3.1. Tách phân đoạn từ cao Methanol của cây Cam thảoBảng 3.1. Kết quả sắc ký bản mỏng cao SDM:</b>

3.1.2. Khảo sát phân đoạn SDM2

Phân đoạn SDM2 tiếp tục thực hiện sắc ký cột nhanh với lượng mẫu m =21,905g, hệ dung môi tăng dần độ phân cực từ EA:MeOH (25:1, 10:1), đếnCHCl3:MeOH (30:1, 25:1, 10:1, 8:1) và cuối cùng là MeOH 100%. Dung dịch thuđược chứa trong các lọ thủy tinh và được theo dõi bằng SKLM (TLC), hiện vếtbằng thuốc thử H2SO4 10% và hơ nóng trên bếp điện. Các lọ cho kết quả SKLMgiống nhau (về màu vết và Rf) được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cộttrên phân đoạn SDM2 thu được 8 phân đoạn chính (SDM2.1– SDM2.8).

SDM1 EA:MeOH(20:1) 17,29g Nhiều vết

SDM2 EA:MeOH(8:1) 21,905g Nhiều vết ( bốn vết rõ, đẹp)SDM3 EA:MeOH(5:1) 20,7g Nhiều vết

<b>Crude - SD</b>

SDM 3(99→104)

SDM 1(1 → 12 )

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

<b>Bảng 3.2. Kết quả sắc ký bản mỏng phân đoạn SDM2:</b>

3.1.3. Khảo sát phân đoạn SDM2.7

Phân đoạn SDM2.7 tiếp tục thực hiện sắc ký cột nhanh, hệ dung môi tăngdần độ phân cực CHCl3: MeOH (8:1, 5:1) và cuối cùng là MeOH 100%. Dung dịchthu được chứa trong các lọ thủy tinh và được theo dõi bằng SKLM (TLC), hiện vếtbằng thuốc thử H2SO4 10% và hơ nóng trên bếp điện. Các lọ cho kết quả SKLM

SDM2.1 EA:Me (20:1) Nhiều vếtSDM2.2 EA:Me (10:1) Nhiều vếtSDM2.3 CHCl3:MeOH (25:1) Nhiều vếtSDM2.4 CHCl3:MeOH (20:1) Nhiều vếtSDM2.5 CHCl3:MeOH (8:1) Nhiều vết (vết rõ, đẹp)SDM2.6 CHCl3:MeOH (8:1) Nhiều vết (vết rõ, đẹp)SDM2.7 CHCl3:MeOH (5:1) Nhiều vết (vết rõ, đẹp)SDM2.8 CHCl3:MeOH (5:1) Nhiều vết

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

giống nhau (về màu vết và Rf) được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cộttrên phân đoạn SDM2.7 thu được 7 phân đoạn chính (SDM2.7.1– SDM2.7.7).

3.1.4 . Khảo sát phân đoạn SDM2.7.7

Phân đoạn SDM2.7.7 tiếp tục thực hiện sắc ký cột Sephadex có khối lượngmẫu 892 mg, hệ dung mơi MeOH 100%. Dung dịch thu được chứa trong các lọ thủytinh và được theo dõi bằng SKLM (TLC), hiện vết bằng thuốc thử H<small>2</small>SO<small>4</small> 10% vàhơ nóng trên bếp điện. Các lọ cho kết quả SKLM giống nhau (về màu vết và R<small>f</small>)

SDM2.7.1 CHCl<small>3</small>:MeOH (5:1) 92mg Nhiều vếtSDM2.7.2 CHCl<small>3</small>:MeOH (5:1) 702mg Nhiều vếtSDM2.7.3 CHCl<small>3</small>:MeOH (3:1) 1033mg Nhiều vếtSDM2.7.4 CHCl3:MeOH (3:1) 2071mg Nhiều vết

SDM2.7.5 CHCl<small>3</small>:MeOH (3:1) 3576mg Nhiều vết (vết rõ, đẹp)SDM2.7.6 CHCl<small>3</small>:MeOH (2:1) 3709mg Nhiều vết (vết rõ, đẹp)SDM2.7.7 CHCl<small>3</small>:MeOH (2:1) 892mg Nhiều vết (vết rõ, đẹp)

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

được gom thành một phân đoạn. Kết quả sắc ký cột trên phân đoạn SDM2.7.7 thuđược 5 phân đoạn chính (SDM2.7.7.1- SDM2.7.7.5).

Từ kết quả trên, đã gom các phân đoạn 1 đến 3 (SDM2.7.7.1), 4 đến 6(SDM2.7.7.2), 7 đến 12 (SDM2.7.7.3), 13 đến 16 (SDM2.7.7.4) và 17 đến 21(SDM2.7.7.5).

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

SDM2.7.7.1 20CHCl<small>3</small>:6MeOH:1H<small>2</small>O 15mg Nhiều vếtSDM2.7.7.2 20CHCl<small>3</small>:6MeOH:1H<small>2</small>O 144mg Nhiều vết (vết rõ, đẹp)SDM2.7.7.3 20CHCl<small>3</small>:6MeOH:1H<small>2</small>O 435mg Nhiều vết (vết rõ, đẹp)SDM2.7.7.4 20CHCl<small>3</small>:6MeOH:1H<small>2</small>O 162mg Nhiều vếtSDM2.7.7.5 20CHCl<small>3</small>:6MeOH:1H<small>2</small>O 245mg Nhiều vết

</div>