<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

MSc. Trương Phú Chí Hiếu

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

MSc. Trương Phú Chí Hiếu

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

Mục tiêu

• Hiểu được cơ sở lý thuyết sắc ký, cấu tạo cơ bản của hệ thống và các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao.

• Trình bày các ứng dụng của sắc ký lỏng hiệunăng cao trong phân tích thuốc.

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØHPLC = High - Performance Liquid Chromatography High - Pressure Liquid Chromatography

ØQuá trình phân tách dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá trình:

- Những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động.

- Sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất phân tích theo từng lớp qua chất nhồi cột, từ đầu đến cuối cột tách.

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØCác chất phân tích di chuyển theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào ái lực khác nhau với pha tĩnh và pha động:

- Chất phân tích có ái lực nhiều với pha tĩnh thì bị lưu giữ lại lâu hơn trên cột.

- Chất phân tích có ái lực nhiều với pha động thì có tốc độ di chuyển nhanh, ít bị lưu giữ.

=> Xảy ra quá trình tách các chất trên cột sắc ký.

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

<small>Detector ở cuối cột ghi lại </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØSắc ký phân bố:

- Được ứng dụng nhiều nhất vì phân tích được những chất có khoảng phân cực rộng (từ không phân cực đến rất phân cực) hoặc hợp chất ion. - Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động:

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØSắc ký phân bố:

- Độ phân cực của các nhóm chức hữu cơ:

<small>Hydrocarbon mạch thẳng < olefin < hydrocarbon thơm < dẫn chất halogen < sulfid < ether < dẫn chất nitro < ester ≈ andehyd ≈ ceton < alcol ≈ amin < sulfo < sulfoxid < acid carboxylic < nước.</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØPha tĩnh:

- Thường dùng silica SiO₂ được xử lý bề mặt bằng cách đun nóng với acid (thủy phân) để tạo nhóm –OH

- Tiếp tục cho phản ứng với dẫn chất hữu cơ của chlorosilan tạo ra các dẫn chất siloxan có độ phân cực phụ thuộc vào nhóm thế R

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

- Phân tử lượng lớn hơn 2000: sắc ký loại trừ kích thước. Pha động là nước hay dung môi hữu cơ tùy thuộc vào tính tan của chất phân tích. - Phân tử lượng từ 2000 trở xuống: xem xét tính tan của chất phân tích: + Mẫu tan hoặc ít tan trong nước: sắc ký trao đổi ion hoặc sắc ký phân bố pha đảo.

+ Độ tan tăng thêm khi dùng acid hoặc kiềm: sắc ký trao đổi ion.

+ Độ tan không bị ảnh hưởng bởi acid hoặc kiềm; dung dịch nước của chất phân tích trung tính: sắc ký phân bố pha đảo.

+ Mẫu không tan trong nước: sắc ký phân bố pha thuận hoặc sắc ký hấp phụ

+ Tách các đồng phân: sắc ký hấp phụ. + Tách các đồng đẳng: sắc ký phân bố.

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

<small>5. Detecter6. Máy tính7. Bình thải</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØPha động (bình dung mơi):

Dung mơi được dẫn từ bình đến bơm nhờ hoạt động của bơm.

Cung cấp dung mơi cho q trình sắc ký, đưa chất phân tích di chuyển qua cột.

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØPha động (bình dung mơi):

- Lựa chọn dung môi dựa vào độ phân cực của chất phân tích, pha tĩnh và

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØPha động (bình dung môi): - Yêu cầu kỹ thuật với dung môi:

Không chứa bụi

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØPha động (bình dung mơi): - Chương trình trộn dung mơi:

+ Chương trình trộn dung mơi ở áp suất thấp

<small>Bình dung mơi 1</small>

<small>Bình dung mơi 2</small>

<small>Bình dung mơi 3</small>

<small>Ưu điểm: chỉ dùng một bơm, chi phí khơng cao.Nhược điểm: hệ thống ba van để lấy ba dung môi, ảnh hướng đến độ chính xác.</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØPha động (bình dung mơi): - Chương trình trộn dung mơi:

+ Chương trình trộn dung môi ở áp suất cao <small>lại cao hơn.</small>

<small>Nhược điểm: tốn kém hơn, hệ thống cồng kềnh hơn.</small>

<small>Bơm 1</small>

<small>Bơm 3</small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØHệ thống bơm:

- Các loại bơm thông dụng:

Bơm đẩy liên tục: dung môi được bơm đầy một lần, được đẩy

đến khi hết thì dừng.

Bơm đẩy hút luân phiên: việc đẩy và bơm dung môi xảy ra

đồng thời.

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØHệ thống tiêm mẫu:

- Vai trị: nạp một lượng chính xác mẫu các chất phân tích vào trong vịng chứa mẫu (sample loop) có dung tích nhất định (5 – 500 𝛍l), sau đó

được đưa vào cột sắc ký. - Chế độ tiêm:

+ Tiêm thủ công bằng xy lanh. + Tiêm tự động.

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØCột sắc ký:

- Vai trò: tách các mẫu phân tích ra khỏi nhau.

- Cấu tạo: được làm bằng vật liệu không rỉ (thép Cr – Ni – Mo) với mặt trong của cột được làm nhẵn, hoặc làm bằng thủy tinh.

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØCột sắc ký: - Cột bảo vệ:

+ Được đặt trước cột sắt ký để loại các chất bẩn có mặt trong pha động và trong mẫu phân tích.

+ Có kích thước ngắn hơn cột sắc ký và được nhồi cùng loại hạt nhưng có kích thước nhỏ hơn.

+ Trải qua một số lần tiêm mẫu nhất định, khi hình dáng pic trên sắc ký đồ thay đổi, hoặc độ phân giải giảm là những dấu hiệu cho thấy cần thay cột bảo vệ.

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØCột sắc ký:

- Hệ thống điều nhiệt:

+ HPLC thường được thực hiện ở nhiệt độ phòng.

+ Sự thay đổi nhiệt độ (dù nhỏ) cũng gây ảnh hưởng đến chất lượng của sắc ký đồ.

=> Các thiết bị HPLC hiện đại được trang bị thêm bộ phận điều nhiệt, có thể giữ ổn định nhiệt độ lên tới 150<small>0</small>C với sai số không quá 0,05<small>0</small>C.

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

- Vai trị: chuyển các tín hiệu thành dạng điện. - Yêu cầu kỹ thuật với detecter:

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

- Phân loại:

Detecter hấp thụ UV-VIS Detecter huỳnh quang

Detecter chỉ số khúc xạ Detecter tán xạ bay hơi Detecter đo dòng

Detecter độ dẫn

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

- Detecter hấp thụ UV-VIS: gồm ba cấu hình

Detecter đo ở bước

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

- Detecter huỳnh quang:

+ Có thể sử dụng thiết bị huỳnh quang kính lọc hoặc quang phổ huỳnh quang cho detecter huỳnh quang.

+ Có độ chọn lọc và độ nhạy lớn hơn (có thể gấp 1000 lần) so với detecter UV-VIS: dùng trong phân tích vết trong kiểm sốt mơi trường, giám định pháp y …

+ Phù hợp với phân tích các chất phát huỳnh quang: hợp chất thơm đa vòng, dẫn chất quinoline, steroid, alkaloid.

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØHệ số phân bố K:

- Đặc trưng cho tốc độ di chuyển của một chất phân tích qua pha tĩnh. K = ^!<small>!</small>

Trong đó: C_S là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh. C_M là nồng độ chất phân tích trong pha động.

- Hệ số phân bố K phụ thuộc vào bản chất của chất phân tích, pha tĩnh và pha động.

=> Các chất phân tích có K càng khác nhau thì càng dễ tách.

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØThời gian lưu t_R: t_R’ = t_R – t₀

Trong đó: t_R là thời gian lưu của một chất phân tích từ khi vào đến khi ra khỏi cột.

t₀ là thời gian để pha động đi qua cột (thời gian chết).

t_R’ là thời gian lưu thật của một chất phân tích

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØHệ số dung lượng k’: - Ngoài ra: k’ = ^#<small>#$ #</small>_$

Þt_R ~ t₀ thì k’ ~ 0: chất phân tích gần như khơng tương tác với pha tĩnh (cột khơng có khả năng giữ chất phân tích).

Þt_R⟫ t₀ thì k’ càng lớn: chất phân tích ở trong cột lâu, đỉnh pic tù. - Giá trị k’ trong khoảng 2 – 5 là lý tưởng.

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØSố đĩa lý thuyết N:

N = 16 x (^#<small>#</small>

<small>%</small>)<small>2 </small>hoặc N = 5,54 x ( t_R W_1/2⁾² Trong đó: W là chiều rộng pic sắc ký tính ở đáy pic.

W_1/2 là chiều rộng pic sắc ký ở vị trí ½ chiều cao của pic.

- Số đĩa lý thuyết (hiệu năng) của cột đặc trưng cho khả năng tách sắc ký của các chất phân tích trên cột.

ÞN càng lớn, khả năng tách càng cao W = 1,7 x W_1/2

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØĐộ chọn lọc 𝛂:

- Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột, giá trị luôn lớn hơn 1 𝛂 = ^K<small>2</small>

K₁ ⁼^kk²₁^’’

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

*Bài tập 1: Thực hiện tách ba chất phân tích bằng kỹ thuật HPLC với cột sắc ký có chiều dài L = 40 cm được bảng số liệu sau đây:

a. Tính số đĩa lý thuyết trung bình của cột. b. Tính chiều cao của đĩa.

c. Tính độ phân giải cho từng cặp chất.

</div><span class="text_page_counter">Trang 41</span><div class="page_container" data-page="41">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Lời giải a. Số đĩa lý thuyết: N = 5,54 x ( t_R

W_1/2⁾² - Đối với chất phân tích A: N_A = 959. - Đối với chất phân tích B: N_B = 979. - Đối với chất phân tích C: N_C = 885.

ÞSố đĩa lý thuyết trung bình: N = (N_A + N_B + N_C) : 3 = 941. b. Chiều cao của đĩa: H = _'^& = _*(+⁽⁾ = 0,0425 cm = 0,425 mm.

</div><span class="text_page_counter">Trang 42</span><div class="page_container" data-page="42">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

- Độ phân giải cho B và A: R_BA = 0,67. - Độ phân giải cho C và B: R_CB = 1,56. - Độ phân giải cho C và A: R_CA = 2,2

</div><span class="text_page_counter">Trang 43</span><div class="page_container" data-page="43">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

*Bài tập 2: Thực hiện tách hai chất phân tích bằng kỹ thuật HPLC với cột sắc ký có chiều dài L = 30 cm được bảng số liệu sau đây:

a. Tính độ phân giải của cột.

b. Tính số đĩa lý thuyết trung bình của cột và chiều cao của đĩa.

c. Muốn độ phân giải là R’ = 1,5 thì cột phải có số đĩa lý thuyết là bao nhiêu? Biết rằng pha động và pha tĩnh được giữ nguyên.

</div><span class="text_page_counter">Trang 44</span><div class="page_container" data-page="44">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

- Đối với chất phân tích A: N_A = 3493. - Đối với chất phân tích B: N_B= 3397.

ÞSố đĩa lý thuyết trung bình: N = (N_A + N_B) : 2 = 3445. Chiều cao của đĩa: H = _'^& = _,((-^,) = 8,71 x 10<small>-3</small> cm.

</div><span class="text_page_counter">Trang 45</span><div class="page_container" data-page="45">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

c. Số đĩa lý thuyết của cột tương ứng với độ phân giải R’ = 1,5 R’ = t_R2 − t_R1

t_R2 ^x 4^N′ => N’ = 16 x ( R′x t_R2

t_R2 − t_R1⁾²^{= 7396}

</div><span class="text_page_counter">Trang 46</span><div class="page_container" data-page="46">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

*Bài tập 3: Thực hiện tách hai chất phân tích bằng kỹ thuật HPLC với cột sắc ký có chiều dài L = 40 cm được bảng số liệu sau đây:

Biết thể tích pha tĩnh và pha động lần lượt là: V_S = 19,6 ml và V_M = 62,6 ml.

a. Tính hệ số dung lượng cho mỗi chất phân tích. b. Tính hệ số phân bố cho mỗi chất phân tích.

</div><span class="text_page_counter">Trang 47</span><div class="page_container" data-page="47">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Lời giải a. Hệ số dung lượng: k’ = ^#<small>#$ #</small>_$

- Hệ số dung lượng cho chất phân tích A: k’_A = 4,26. - Hệ số dung lượng cho chất phân tích B: k’_B = 4,74. b. Ta có: k’ = K x ^"<small>!</small>

ÞK = k’ x ^"<small>"</small>

- Hệ số phân bố cho chất phân tích A: K_A = 13,61. - Hệ số phân bố cho chất phân tích B: K_B = 15,14. c. Độ chọn lọc: 𝛂 = ^k<small>2</small>’

k₁’ = 1,11.

</div><span class="text_page_counter">Trang 48</span><div class="page_container" data-page="48">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

</div><span class="text_page_counter">Trang 49</span><div class="page_container" data-page="49">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØPhân tích định lượng: - Dựa vào chiều cao hoặc

diện tích của pic sắc ký để từ đó tính ra nồng độ của chất phân tích.

</div><span class="text_page_counter">Trang 50</span><div class="page_container" data-page="50">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØPhân tích định lượng:

- Phương pháp ngoại chuẩn:

+ Tiến hành sắc ký cả hai mẫu chuẩn (đã biết nồng độ) và mẫu thử trong cùng điều kiện.

+ So sánh diện tích hoặc chiều cao pic sắc ký của mẫu chuẩn và mẫu thử. ÞTính được nồng độ của mẫu thử: C_X = C_S x ^.<small>%</small>

Trong đó: C_X và C_S lần lượt là nồng độ mẫu thử và mẫu chuẩn.

S_X và S_S lần lượt là diện tích (hoặc chiều cao) pic sắc ký của mẫu thử và mẫu chuẩn.

</div><span class="text_page_counter">Trang 51</span><div class="page_container" data-page="51">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

*Bài tập 4: Tiến hành định lượng viên nén Captopril 25 mg bằng phương pháp HPLC thu được pic sắc ký có diện tích 17,661. Hỏi chế phẩm này có đạt yêu cầu về hàm lượng Captopril (phải nằm trong khoảng 98,0% đến 101,5%). Biết khi định lượng nguyên liệu chuẩn Captopril 25 mg trong cùng điều kiện thu được pic sắc ký có diện tích 17,768.

</div><span class="text_page_counter">Trang 52</span><div class="page_container" data-page="52">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

ØPhân tích định lượng:

- Phương pháp ngoại chuẩn:

+ Có thể tiến hành sắc ký với một dãy mẫu chuẩn có nồng độ tăng dần. + Tính tốn các diện tích (hoặc chiều cao) pic sắc ký của các mẫu chuẩn này

=> Lập phương trình hồi quy tuyến tính biểu diễn quan hệ giữa nồng độ và diện tích (hoặc chiều cao) pic sắc ký, từ đó tính tốn được nồng độ của mẫu thử dựa vào diện tích (hoặc chiều cao) pic sắc ký của mẫu thử.

</div><span class="text_page_counter">Trang 53</span><div class="page_container" data-page="53">

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

*Bài tập 5: Tiến hành định lượng nguyên liệu Loratadin bằng phương pháp HPLC. Cân khoảng 20 mg nguyên liệu cho mỗi lần thử, tiến hành 6 lần thử thu được các pic sắc ký có diện tích được ghi lại theo bảng số liệu sau:

Hỏi diện tích pic sắc ký là bao nhiêu khi cân chính xác 20,00 mg nguyên liệu Loratadin và tiến hành thử trong cùng điều kiện như trên.

</div><span class="text_page_counter">Trang 54</span><div class="page_container" data-page="54">

vTài liệu tham khảo

Xuất Bản Y Học.

</div><span class="text_page_counter">Trang 55</span><div class="page_container" data-page="55">

Thank you for your attention!

</div>