<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>LỜI CAM ĐOAN </b>

Tôi xin cam đoan:

Đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Đoàn Lan Phương và GS.TS Phạm Quốc Long.

Các số liệu và kết quả thu được trong luận án là hoàn tồn trung thực và chưa được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

<b> Tác giả luận án </b>

<b> Nguyễn Thị Thủy </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>LỜI CẢM ƠN </b>

Luận án này được hồn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện và giúp đỡ tơi hồn thành luận án.

Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS Đoàn Lan Phương và GS.TS Phạm Quốc Long là những người thầy đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án.

Tơi xin cảm ơn tập thể phịng Hóa sinh hữu cơ, phịng phân tích hóa học - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã tạo điều kiện cơ sở vật chất giúp tơi hồn thành nghiên cứu.

Tôi cũng cám ơn đề tài nghị định thư Việt Nam - Liên Bang Đức số 44/2014/HĐ-NĐT giữa Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên và Bộ Khoa học và Cơng nghệ do PGS.TS Đồn Lan Phương làm chủ nhiệm đã tài trợ cho các nghiên cứu trong luận án này.

Đồng thời, tôi gửi lời cảm ơn tới ban lãnh đạo trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, khoa Khoa học cơ bản, bộ môn Khoa học tự nhiên và anh, chị, em đồng nghiệp đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu.

Cuối cùng, tôi xin gửi lịng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến gia đình tơi, những người đã tạo mọi điều kiện về vật chất và tinh thần cho tôi trong quá trình

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

1.1. Phân loại, đặc điểm thực vật, phân bố của một số loài thực vật thuộc họ Đậu ... 4

1.1.1. Phân loại họ Đậu... 4

1.1.2. Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng của quả, hạt thực vật của 11 loài thực vật thuộc họ Đậu ở Việt Nam ... 4

1.2. Tình hình nghiên cứu về thành phần lipid và hoạt tính chống oxi hóa các hạt thực vật thuộc họ Đậu trên thế giới và trong nước ... 9

1.2.1. Tổng quan về thành phần lipid hạt thực vật ... 9

1.2.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ... 24

1.2.3. Tình hình nghiên cứu trong nước. ... 37

1.3. Tổng quan về hóa tính tốn ... 39

1.3.1. Phương trình Schrưdinger ... 39

1.3.2. Các phương pháp bán thực nghiệm (semi-empirical methods) ... 39

1.3.3. Các phương pháp ab initio (Ab inito methods) ... 40

1.3.4. Các phương pháp phiếm hàm mật độ (density functional theory, DFT):... 41

1.3.5. Tình hình ứng dụng hóa học tính tốn trong nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của acid phenolic ... 42

<b>Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 44 </b>

2.1. Đối tượng nghiên cứu ... 44

2.2. Phương pháp nghiên cứu ... 46

2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng ... 46

2.2.2. Phương pháp phân tích thành phần lipid trong các mẫu hạt họ Đậu... 46

2.2.3. Phương pháp phân lập và nhận dạng các phospholipid. ... 48

2.2.4. Các phương pháp khảo sát hoạt tính chống oxi hóa ... 50

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>Chương 3. THỰC NGHIỆM ... 53 </b>

3.1. Chiết tách và xác định hàm lượng lipid tổng các mẫu hạt họ Đậu ... 53

3.2. Xác định thành phần lipid trong các mẫu hạt họ Đậu ... 54

3.2.1. Xác định thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid trong các mẫu hạt họ Đậu ... 54

3.2.2. Xác định thành phần và hàm lượng acid béo trong các mẫu hạt họ Đậu ... 54

3.3.2. Xác định các dạng phân tử các phospholipid của lipid hạt Sưa ... 56

3.4. Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa ... 57

3.4.1. Xác định hoạt tính chống oxi hóa theo DPPH ... 57

3.4.2. Khảo sát tiềm năng chống oxi hóa bằng phiếm hàm mật độ (DFT) hiệu năng cao ... 58

<b>Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 59 </b>

4.1. Hàm lượng lipid tổng và các lớp chất lipid của 11 mẫu hạt họ Đậu nghiên cứu ... 59

4.2. Thành phần và hàm lượng phospholipid của 11 mẫu hạt họ Đậu ... 86

4.2.1. Thành phần và hàm lượng các phospholipid trong 11 mẫu hạt họ Đậu nghiên cứu ... 86

<i>4.2.2. Xác định các dạng phân tử phospholipid của mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ... 88 </i>

4.3. Kết quả thử hoạt tính chống oxi hóa ... 107

4.3.1. Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxi hóa của 11 mẫu lipid hạt họ Đậu nghiên cứu bằng phương pháp DPPH ... 107

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

4.3.2. Kết quả khảo sát tiềm năng chống oxi hóa của một số acid phenolic bằng

phiếm hàm mật độ (DFT) hiệu năng cao ... 111

<b>KẾT LUẬN ... 124 </b>

1. Kết quả về hóa học ... 124

2. Kết quả khảo sát tác dụng sinh học ... 125

<b>KIẾN NGHỊ ... 126 </b>

<b>NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ... 128 </b>

<b>TÀI LIỆU THAM KHẢO ... 129 </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<b>DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT </b>

spectrometry

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

STT Ký hiệu Diễn giải Tiếng anh

spectrometry

hỗ trợ bởi chất nền

Matrix assisted laser desorption ionization

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

STT Ký hiệu Diễn giải Tiếng anh

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

<b>DANH MỤC CÁC BẢNG </b>

Bảng 1.1. Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng của 11 loài thực vật được nghiên cứu thuộc họ Đậu ở Việt Nam ... 5 Bảng 1.2. Hàm lượng trung bình tocopherol tổng và tocotrienol tổng trong các

phân họ Đậu nghiên cứu ... 29 Bảng 2.1. Danh sách 11 mẫu hạt họ Đậu nghiên cứu ... 44 Bảng 4.1. Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid chính trong hạt 11 lồi

thuộc họ Đậu nghiên cứu ... 63 Bảng 4.2. Thành phần và hàm lượng các acid béo trong lipid ha ̣t của 11 loài họ

Đậu nghiên cứu (% so với tổng acid béo) ... 66 Bảng 4.3. Thành phần và hàm lượng các tocopherol trong lipid ha ̣t của 11 loài

họ Đậu nghiên cứu ... 71 Bảng 4.4. So sánh tương quan giữa hàm lượng γ-tocopherol với acid α-linolenic

(18:3(n-3)) và α-tocopherol với acid linoleic (18:2(n-6)) ... 74 Bảng 4.5. Thành phần và hàm lượng các phytosterol trong lipid ha ̣t của một số

loài họ Đậu nghiên cứu (mg/kg) ... 77 Bảng 4.6. Thành phần và hàm lượng các triglyceride trong lipid ha ̣t một số loài

họ Đậu nghiên cứu (% so với tổng TG) ... 82 Bảng 4.7. Thành phần và hàm lượng các hợp chất phenolic trong lipid ha ̣t 11

loài họ Đậu nghiên cứu (mg/kg) ... 84 Bảng 4.8. Thành phần và hàm lượng các phospholipid trong lipid tổng của 11

mẫu hạt họ Đậu nghiên cứu ... 87 Bảng 4.9. Tín hiệu của ion phân tử [M-H]<small>-</small> của các dạng phân tử có mặt trong

<i>lớp chất phosphatidylethanolamine của mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) trên phổ MS</i><small>1</small> ... 90 Bảng 4.10. Dữ liệu phổ MS/MS[E<small>-</small>] của dạng phân tử PE có tín hiệu ion âm [M-H]<small></small>

<i>-tại giá trị m/z 714,5006 (PE 16:0/18:2) ... 91 </i>

Bảng 4.11. Thành phần và hàm lượng các dạng phân tử phosphatidylethalnolamine

<i>trong mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ... 95 </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

Bảng 4.12. Tín hiệu của ion phân tử [M+H]<small>+ </small>của các dạng phân tử có mặt trong

<i>lớp chất phosphatidylcholine của mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis </i>

Prain) trên phổ MS<small>1</small> ... 97 Bảng 4.13. Dữ liệu phổ MS<small>1</small>, MS<small>2</small>, MS<small>3</small> của dạng phân tử PC có tín hiệu ion

dương [M+H]<small>+ </small><i>tại giá trị m/z 758,5691 ... 98 Bảng 4.14. Các dạng phân tử phosphatidylcholine của mẫu hạt Sưa (Dalbergia </i>

<i>tonkinensis Prain) ... 101 </i>

Bảng 4.15. Tín hiệu của ion phân tử [M-H]<small>- </small>của các dạng phân tử có mặt trong

<i>lớp chất phosphatidylinositol của mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis </i>

Prain) trên phổ MS¹ ... 102 Bảng 4.16. Dữ liệu phổ MS<small>2</small> của các dạng phân tử PI ... 103

<i>Bảng 4.17. Các dạng phân tử phospholipid trong mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ... 105 </i>

Bảng 4.18. Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa DPPH của một số hạt Đậu nghiên cứu (dịch chiết methanol) ... 107 Bảng 4.19: Quan hệ giữa hoạt tính chống oxi hóa và hàm lượng tocopherol ... 109 Bảng 4.20: Các thông số phản ứng nội tại bao gồm hiệu chỉnh năng lượng điểm 0

(ZPC) của các acid phenolic. ... 116 Bảng 4.21: Năng lượng tự do Gibbs tiêu chuẩn (<small>r</small>G⁰) ... 119 Bảng 4.22: Năng lượng hoạt hóa tự do Gibbs (ΔG<small>#,1M</small>, tính bằng kcal/mol) ... 121

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>DANH MỤC CÁC HÌNH </b>

Hình 1.1. Một số acid béo no ... 11

Hình 1.2. Một số acid béo khơng no một nối đơi ... 12

Hình 1.3. Một số acid béo khơng no đa nối đơi ... 13

Hình 1.4. Cấu trúc phân tử của triacylglycerol (TAG) ... 15

Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo của glycerophospholipid ... 16

Hình 1.6. Một số glycerophospholipid phổ biến ... 16

Hình 1.7. Cơng thức tổng qt của sphingophospholipid ... 18

Hình 1.8. Một số tocopherol thường gặp trong lipid hạt thực vật họ Đậu ... 20

Hình 1.9. Khung cấu trúc của steroid ... 21

Hình 1.10. Một số phytosterol thường gặp trong lipid hạt thực vật họ Đậu ... 22

Hình 1.11. Cấu trúc cơ bản của acid phenolic ... 24

Hình 2.1. Quá trình đo MS<small>n</small> ... 49

Hình 2.2. Cấu trúc của 8 acid phenolic với các vị trí ngun tử được đánh số ... 51

Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu chung ... 53

Hình 4.1. Hàm lượng % lipid tổng trong 11 mẫu hạt họ Đậu. ... 61

Hình 4.2. Bản mỏng TLC và sắc ký đồ các lớp chất lipid một số loài họ Đậu ... 62

Hình 4.3. Phần trăm acid béo no và không no trong 11 mẫu lipid hạt họ Đậu nghiên cứu ... 67

Hình 4.4. Tương quan giữa hàm lượng γ-tocopherol với acid α-linolenic (18:3(n-3)) và acid linoleic (18:2(n-6)) ... 75

Hình 4.5. Hàm lượng % β-sitosterol (so với phytosterol tổng) ... 80

Hình 4.6. Hàm lượng PC, PE, PI trong lipid tổng của 11 mẫu hạt họ Đậu ... 87

Hình 4.7. Sắc ký đồ HRMS [E<small>-</small>] lớp chất phosphatidylethanolamine mẫu hạt <i>Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) ... 89 </i>

Hình 4.8. Phổ HRMS [E-] của lớp chất phosphatidylethanolamine của mẫu hạt Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) trên phần mềm xử lý v.3.60.361 ... 90

Hình 4.9. Sắc ký đồ phổ MS[E<small>-</small>] và MS[E<small>+</small>] của dạng phân tử PE có tín hiệu ion âm [M-H]<small>- </small><i>tại giá trị m/z 714,5006 ... 90 </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

Hình 4.10. Sự phân mảnh trong phổ MS/MS[E<small>-</small>] của dạng phân tử PE có tín

<i>hiệu ion âm tại m/z 714,5006 (PE 16:0/18:2) ... 91 </i>

Hình 4.11. Sự phân mảnh của ion phân tử PE có tín hiệu ion âm tại m/z 714,5006 ... 92 Hình 4.12. Sắc ký đồ phổ MS[E^-] và MS[E⁺] của dạng phân tử PE có tín hiệu

ion âm [M-H]<small>-</small><i> tại giá trị m/z 716,5344 ... 92 </i>

Hình 4.13. Sự phân mảnh trong phổ MS/MS[E<small>-</small>] của dạng phân tử PE có tín

<i>hiệu ion âm tại m/z 716,5344 (PE 16:0/18:1) [M-H]</i><small>-</small> 738,5053 ... 93 Hình 4.14. Sắc ký đồ phổ MS[E<small>-</small>] và MS[E<small>+</small>] của dạng phân tử PE có tín hiệu

ion âm [M-H]<small>-</small><i> tại giá trị m/z 738,5053 ... 93 </i>

Hình 4.15. Sự phân mảnh trong phổ MS/MS[E^-] của dạng phân tử PE có tín

<i>hiệu ion âm tại m/z 738,5053 (PE 18:2/18:2) ... 93 </i>

Hình 4.16. Sắc ký đồ phổ MS[E<small>-</small>] và MS[E<small>+</small>] của dạng phân tử PE có tín hiệu ion âm [M-H]<small>-</small><i> tại giá trị m/z 740,5298 ... 94 </i>

Hình 4.17. Sự phân mảnh trong phổ MS/MS[E<small>-</small>] của dạng phân tử PE có tín

<i>hiệu ion âm tại m/z 740,5298 (PE 18:1/18:2) ... 94 </i>

Hình 4.18. Sắc ký đồ phổ MS[E<small>-</small>] và MS[E<small>+</small>] của dạng phân tử PE có tín hiệu ion âm [M-H]<small>-</small><i> tại giá trị m/z 742,5452 ... 94 </i>

Hình 4.19. Sự phân mảnh trong phổ MS/MS[E^-] của dạng phân tử PE có tín

<i>hiệu ion âm tại m/z 742,5452 (PE 18:0/18:2) ... 95 </i>

Hình 4.20. Sắc ký đồ HRMS [E<small>+</small>] lớp chất phosphatidylcholine mẫu hạt Sưa

<i>(Dalbergia tonkinensis Prain) ... 96 </i>

Hình 4.21. Sắc ký đồ phổ MS[E<small>-</small>] và MS[E<small>+</small>] của dạng phân tử PC có tín hiệu ion dương [M+H]<small>+ </small><i> tại giá trị m/z 758,5691 ... 97 Hình 4.22. Sự phân mảnh của ion phân tử PC có tín hiệu ion dương tại m/z </i>

758,5691 ... 98 Hình 4.23. Sự phân mảnh trong phổ MS<small>2</small> và MS<small>3</small> [E<small>-</small>] của dạng phân tử PC có

tín hiệu ion âm [M+HCOO]<small>-</small><i> tại m/z 802,5536 ... 99 </i>

Hình 4.24. Sự phân mảnh trong phổ MS2 [E<small>-</small>] của dạng phân tử PC có tín hiệu ion âm [M-CH<small>3</small>]<small>-</small><i> tại m/z 742,5305 (PC 16:0/18:2) ... 99 </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

Hình 4.25. Sắc ký đồ phổ MS[E<small>-</small>] và MS[E<small>+</small>] của dạng phân tử PC có tín hiệu ion dương [M+H]<small>+ </small><i> tại giá trị m/z 782,5676 ... 100 </i>

Hình 4.26. Sự phân mảnh trong phổ MS<small>2</small> và MS<small>3</small> [E<small>-</small>] của dạng phân tử PC có tín hiệu ion âm [M+HCOO]<small>-</small><i> tại m/z 826,5629 ... 100 </i>

Hình 4.27. Sự phân mảnh trong phổ MS² [E^-] của dạng phân tử PC có tín hiệu ion âm [M-CH<small>3</small>]<small>-</small><i> tại m/z 766,5450 ... 101 </i>

Hình 4.28. Sắc ký đồ HRMS [E<small>-</small>] lớp chất phosphatidylinositol mẫu hạt Sưa

<i>(Dalbergia tonkinensis Prain) ... 102 </i>

Hình 4.29. Sự phân mảnh trong phổ MS<small>2 </small>[E<small>-</small>] của dạng phân tử PI có tín hiệu ion âm [M-H]<small>-</small><i> tại m/z 833,5123 ... 103 Hình 4.30. Sự phân mảnh của ion phân tử PI có tín hiệu ion âm tại m/z </i>

833,5123. ... 104 Hình 4.31. Sự phân mảnh trong phổ MS<small>2</small> [E<small>-</small>] của dạng phân tử PI có tín hiệu

ion âm [M-H]<small>-</small><i> tại m/z 861,5467 ... 104 </i>

Hình 4.32. Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa theo DPPH của 11 mẫu hạt họ Đậu nghiên cứu ... 108 Hình 4.33. Cấu trúc tối ưu của các acid phenolic đã nghiên cứu được tính

tốn trong pha khí theo mức lý thuyết LC- PBE/6-311++G(d, p). .... 112 Hình 4.34. Năng lượng các obital biên (E<small>L</small> và E<small>H</small> ) và chênh lệch năng lượng

hai orbital biên (E<small>L-H</small> = E<small>L</small> - E<small>H</small>) của các acid phenolic được nghiên cứu. ... 113 Hình 4.35. Trạng thái chuyển tiếp (TS) của phản ứng HAT giữa GALA,

CAFA, CHLA và FERA với gốc tự do HOO• trong pha khí ... 120

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b>MỞ ĐẦU </b>

Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên phong phú và vô cùng quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Theo ước tính của IUCN (Hiệp hội Quốc tế về Bảo tồn Thiên nhiên) có khoảng trên 380.000 lồi thuộc giới thực vật trên trái đất; trong đó chủ yếu là các loài thuộc ngành thực vật hạt kín (Angiospermae) [1]. Sự đa dạng sinh học của ngành thực vật hạt kín có thể được giải thích bởi sự tương tác giữa chúng và môi trường dẫn đến sự chọn lọc tự nhiên so với các loại cây trồng khác. Tuy nhiên khi xã hội ngày càng phát triển kéo theo đó là các vấn nạn môi trường ngày càng tăng cao như tình trạng ơ nhiễm mơi trường, suy thối môi trường cũng như sự cố môi trường. Những vấn nạn này đã và đang làm cho môi trường sống của sinh giới nói chung, thực vật nói riêng đang bị tàn phá nghiêm trọng, thậm chí một số loài đã và đang bị đe dọa tuyệt chủng ngồi tự nhiên. Tiếc rằng trong đó cịn nhiều lồi có giá trị kinh tế và khoa học cao, nhiều lồi cây có chứa hợp chất lipid và các hợp chất có hoạt tính sinh học cao mới được nghiên cứu rất ít hoặc chưa được nghiên cứu.

Theo số liệu thống kê, hệ thực vật bậc cao Việt Nam có trên 10.000 lồi, trong đó có khoảng 564 lồi là các cây có dầu [2]. Nhiều lồi thực vật có chứa lipid thuộc một số họ như: Bầu bí - Cucurbitaceae; Đậu - Fabaceae; Bồ hòn - Sapindaceae; Hồng xiêm - Sapotaceae; Thầu dầu - Euphorbiaceae; Chè - Theaceae; Thị - Ebenaceae; Cúc - Asteraceae; Măng cụt - Clusiaceae, Thông - Pinaceae; Na - Annonaceae; Hoa hồng - Rosaceae, Long não - Lauraceae; Đào lộn hột - Anacardiaceae;… Trong đó họ Đậu (Fabaceae) là một họ thực vật trong bộ Đậu, đây là một trong ba họ thực vật có hoa lớn trên thế giới.

Lipid họ Đậu cũng bao gồm một số hợp chất của lipid thực vật như: các acid béo, phospholipid, tocopherol, triacyclycerol, sphingolipid và những phytosterol… Các hợp chất này có hoạt tính sinh học cao, đó khơng chỉ là nguồn ngun liệu có giá trị sử dụng làm thực phẩm mà còn là nguồn nguyên liệu cần thiết cho nhiều lĩnh vực khác: nguyên liệu thiết yếu cho công nghiệp chế biến sơn, xà phòng, thực phẩm, mỹ phẩm,… đặc biệt còn được sử dụng trong dân gian như các bài thuốc cổ truyền để điều trị các bệnh viêm nhiễm, chống lão hóa và một số căn bệnh hiểm nghèo [1].

</div>