<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>LỜI CAM ĐOAN </b>

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng bảo vệ để lấy bất kỳ học vị nào.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cảm ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

<i>Hà Nội, ngày tháng năm 2023 </i>

Nghiên cứu sinh

<b>Phạm Ngọc Khánh </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>LỜI CẢM ƠN </b>

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận án, tơi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hồn thành luận án, cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS.TS Ninh Thị Phíp và PGS.TS Phạm Thanh Huyền đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Cây công nghiệp và Cây thuốc - Khoa Nông học, Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, đã tận tình giúp đỡ tơi trong q trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Dược liệu, Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Sa Pa, Trung tâm Tài nguyên dược liệu, Khoa Hóa phân tích Tiêu chuẩn đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận án./.

<i> Hà Nội, ngày tháng năm 2023 </i>

Tác giả

<b> Phạm Ngọc Khánh </b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

2.1. <i>Giới thiệu về chi Dysosma Woodson và các loài bát giác liên </i> 5

2.1.1. <i><b>Vị trí phân loại, nguồn gốc và phân bố chi Dysosma WoodsonError! Bookmark not defined. </b></i>

2.2. Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của dược liệu các loài trong chi

2.2.2. <i>Tác dụng sinh học và sử dụng chi Dysosma Woodson trong y học </i> 11 2.3. Một số kết quả nghiên cứu về đa dạng di truyền và đặc điểm sinh sản

2.3.2. Các nghiên cứu về sinh thái và đặc điểm sinh sản của các loài thuộc chi

2.4. Một số kết quả nghiên cứu nhân giống cây dược liệu và các loài thuộc chi

2.5. Một số kết quả nghiên cứu trồng cây dược liệu và các loài thuộc chi

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

2.5.1. Khái quát về tình hình trồng trọt dược liệu trên thế giới và trong nước 25 2.5.2. Một số kết quả nghiên cứu về biện pháp kỹ thuật trồng cây dược liệu 26 2.5.3. Nghiên cứu về trồng trọt các loài Bát giác liên 32

3.2.1. Nội dung 1: Đánh giá đặc điểm nông sinh học các mẫu giống Bát giác liên 40 3.2.2. Nội dung 2: Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cây Bát

3.2.3. Nội dung 3: Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật trồng cây Bát giác liên 40

3.3.2. Phương pháp tiến hành theo dõi và các chỉ tiêu theo dõi 50

4.1. Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống Bát giác liên 54

4.1.2. Đánh giá đặc điểm hình thái của các mẫu giống Bát giác liên 57 4.1.3. Đánh giá đa dạng di truyền các mẫu giống Bát giác liên bằng chỉ thị phân tử 75 4.1.4. Đánh giá đặc điểm sinh trưởng, năng suất và chất lượng dược liệu các

4.2. Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống cây Bát giác liên 90 4.2.1. Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nâng cao tỷ lệ đậu quả và nhân

4.2.2. Nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật nhân giống vơ tính cây Bát giác liên 101 4.2.3. Ảnh hưởng của phương thức nhân giống đến khả năng sinh trưởng và

4.3. Bước đầu nghiên cứu một số biện pháp kỹ thuật trồng cây Bát giác liên 120 4.3.1. Ảnh hưởng của thời vụ trồng đến sinh trưởng và năng suấ dược liệu Bát

4.3.2. Ảnh hưởng của mật độ khoảng cách trồng đến sinh trưởng và năng suất

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

dược liệu Bát giác liên 124 4.3.3. Ảnh hưởng của liều lượng phân bón đến sinh trưởng và năng suất dược

4.3.4. Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến sinh trưởng, năng suất và chất lượng

Danh mục các cơng trình khoa học đã cơng bố liên quan đến luận án 142

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<b>DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT </b>

AFLP Đa hình độ dài đoạn nhân bản chọn lọc (Amplified Fragment Length Polymorphism)

GA3 Gibberellic acid

HPLC Sắc ký lỏng hệu năng cao (High performance Liquid Chromatography) IBA Indol butyric acid

ISSR Chuỗi lặp lại đơn giản giữa (Inter Simple Sequence Repeat) ITS

Gen nhân (Nuclear ribosomal internal transcribed spacer)

IUCN Liên minh bảo tồn thiên nhiên Quốc tế

(International Union for Conservation of Nature) LSD0.05 Sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa với mức ý nghĩa 0,05

(Least Significant Difference)

MS Môi trường dinh dưỡng tổng hợp để nuôi cấy mô tế bào thực vật được phát minh bởi Murashige và Skoog

PCA Phân tích thành phần chính (Principal components analysis PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) RAPD Đa hình DNA nhân bản ngẫu nhiên

(Random Amplified Polymorphism DNA) RFLP Đa hình độ dài đoạn cắt hạn chế

(Restriction Fragment Length Polymorphism) RP Chỉ số sai khác của các cặp mồi (Resolving power)

Tm Nhiệt độ gắn mồi

<i>α - NAA </i> Axit α - naphtyl axetic

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>DANH MỤC BẢNG </b>

2.2. <i>Hình thái đặc trưng của chi Dysosma Woodson và Podophyllum L </i> 6

3.1. Thông tin các mẫu giống Bát giác liên sử dụng trong nghiên cứu 37 3.2. Thông tin về các mồi sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền 38 4.1. Một số đặc điểm về sinh thái nơi thu thập các mẫu Bát giác liên 55 4.2. Đặc điểm hình thái và vi phẫu rễ các mẫu giống Bát giác liên 57 4.3. Đặc điểm hình thái và giải phẫu thân ngầm của các mẫu giống Bát giác liên 59 4.4a. Đặc điểm hình thái và vi phẫu gân lá các mẫu giống Bát giác liên 62 4.4b. Độ dày các lớp tế bào phiến lá của các mẫu giống Bát giác liên (µm) 63 4.5. Đặc điểm hình thái hoa của các mẫu giống Bát giác liên 66 4.6a. Đánh giá độ hữu dục của hạt phấn và tỷ lệ đậu quả của các mẫu giống

4.6b. Ảnh hưởng của các biện pháp thụ phấn bổ sung đến sự đậu quả của mẫu

4.7. Đặc điểm hình thái quả và hạt của các mẫu giống Bát giác liên 71

4.10. Đa hình của 20 mẫu giống Bát giác liên dựa trên chỉ thị ISSR 76 4.11. Hệ số tương đồng di truyền của 20 mẫu giống Bát giác liên được đánh

giá bằng chỉ thị ISSR (phía trên) và RAPD (hàng dưới) 77 4.12. Đa hình của 20 mẫu giống Bát giác liên dựa trên chỉ thị RAPD 80 4.13. Thời giai đoạn sinh trưởng và phát triển trong 1 năm của các mẫu giống

4.14. Đặc điểm sinh trưởng của các mẫu giống Bát giác liên 87 4.15. Năng suất và hàm lượng podophyllotoxin của các mẫu giống Bát giác liên 89 4.16. Ảnh hưởng của chế độ phân bón và tỉa định quả đến tỷ lệ đậu quả và kích

4.17. Ảnh hưởng của chế độ phân bón và tỉa định quả đến hạt giống Bát giác liên 96

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

4.18. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến thời gian, tỷ lệ nảy mầm và xuất

4.19. Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến đặc điểm sinh trưởng của cây con

4.20. Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom thân ngầm đến thời gian và khả năng

4.21. Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom thân ngầm đến đặc điểm sinh trưởng

4.22. Ảnh hưởng của vị trí cắt hom thân ngầm đến thời gian và khả năng nhân

4.23. Ảnh hưởng của vị trí cắt hom thân ngầm đến đặc điểm sinh trưởng của

4.24. Ảnh hưởng của số đốt hom thân ngầm đến thời gian và khả năng nhân

4.25. Ảnh hưởng của số đốt hom thân ngầm đến đặc điểm sinh trưởng cây

4.26. Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom rễ đến thời gian và khả năng nhân

4.27. Ảnh hưởng của thời vụ giâm hom rễ đến đặc điểm sinh trưởng của cây

4.28. Ảnh hưởng của vị trí cắt hom rễ đến thời gian giâm hom và khả năng

4.29. Ảnh hưởng của vị trí cắt hom rễ đến đặc điểm sinh trưởng của cây giống

4.30. Ảnh hưởng của độ dài hom rễ đến thời gian giâm hom và khả năng nhân

4.31. Ảnh hưởng của độ dài hom rễ đến đặc điểm sinh trưởng của cây giống

4.32. Ảnh hưởng của xử lý BA và GA3 đến khả năng nhân giống hom rễ Bát

4.33. Ảnh hưởng của phương thức nhân giống đến khả năng sinh trưởng của

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

4.34. Ảnh hưởng của phương thức nhân giống đến năng suất và hàm lượng

4.35. Ảnh hưởng của thời vụ trồng đến khả năng sinh trưởng của cây Bát giác liên 121 4.36. Ảnh hưởng của thời vụ trồng đến năng suất dược liệu Bát giác liên 123 4.37. Ảnh hưởng của mật độ khoảng cách trồng đến khả năng sinh trưởng của

4.38. Ảnh hưởng của mật độ khoảng cách trồng đến năng suất dược liệu Bát

4.39. Ảnh hưởng của liều lượng phân bón đến khả năng sinh trưởng của cây

4.40. Ảnh hưởng của liều lượng phân bón đến năng suất và chất lượng dược

4.41. Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến khả năng sinh trưởng của cây Bát

4.42. Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến đặc điểm hình thái lá cây Bát giác liên 135 4.43. Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến đặc điểm vi phẫu lá Bát giác liên 136 4.44. Ảnh hưởng của chế độ che sáng đến năng suất và hàm lượng

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>DANH MỤC HÌNH </b>

2.9. <i>Một số hợp chất phân lập từ thân ngầm loài D.pleiantha </i> 11

4.4. <i>Mẫu giống Bát giác liên tại Chiêm Hóa - Tuyên Quang </i> 56

4.6. Đặc điểm hình thái và giải phẫu rễ mẫu giống Bát giác liên M11 58 4.7. Đặc điểm hình thái và giải phẫu thân ngầm Bát giác liên 60

4.9. <i>Lá dị hình trên cành sinh sản của các loài thuộc chi Dysosma và Podophyllum </i> 61 4.10. Các giai đoạn phát triển của hoa ở mẫu giống Bát giác liên M13 64 4.11. Đặc điểm hình thái và giải phẫu hoa của các mẫu giống Bát giác liên 65

4.13. Các giai đoạn nảy mầm của hạt mẫu Bát giác liên M11 72

4.15. Sơ đồ cây quan hệ di truyền dựa trên trình tự vùng gen ITS được thiết lập thông qua phân tích gen của lồi Bát giác liên ở Việt Nam và các loài

4.16. Sơ đồ cây quan hệ di truyền trong số 20 mẫu giống Bát giác liên được

4.17. Sơ đồ cây quan hệ di truyền trong số 20 mẫu giống Bát giác liên được

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

4.20. Sơ đồ phân tích PCA của 20 mẫu giống Bát giác liên 83 4.21. Vi phẫu rễ mẫu Bát giác liên M11 tại vị trí chồi bất định 109 4.22. Đặc điểm hình thái thân rễ (c), thân (a) và lá (b, d) Bát giác liên ở các chế

4.23. Vi phẫu gân lá và phiến lá Bát giác liên khi trồng trong điều kiện không

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<b>TRÍCH YẾU LUẬN ÁN </b>

<b>Tên tác giả: Phạm Ngọc Khánh </b>

<b>Tên Luận án: “Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, biện pháp kỹ thuật nhân giống và </b>

<i>trồng cây Bát giác liên (Dysosma tonkinense (Gagnep.) M. Hiroe) tại Sa Pa, Lào Cai” </i>

<b>Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu </b>

Nghiên cứu góp phần xác định được 1-2 mẫu giống Bát giác liên có năng suất, chất lượng dược liệu cao và đề xuất biện pháp kỹ thuật nhân giống, trồng trọt cây Bát giác liên phù hợp tại Sa Pa, Lào Cai.

<b>Phương pháp nghiên cứu </b>

Sử dụng 20 mẫu giống Bát giác liên thu thập từ các địa phương ở Việt Nam được ký hiệu từ M1 đến M20 và trồng đánh giá tại Trung tâm nghiên cứu dược liệu Sa Pa. Thực hiện nghiên cứu các thí nghiệm đánh giá đặc điểm nông sinh học; các thí nghiệm đánh giá đặc điểm tự bất hợp và biện pháp tác động nâng cao khả năng đậu quả; thí nghiệm nhân giống hữu tính; các thí nghiệm nhân giống vơ tính bằng thân ngầm (thời vụ giâm hom, vị trí cắt lấy hom thân ngầm, số đốt của hom thân ngầm) và bằng rễ (thời vụ giâm hom, vị trí cắt lấy hom rễ, độ dài hom rễ, chất kích thích sinh trưởng); thí nghiệm trồng trọt (thời vụ trồng, khoảng cách trồng, lượng phân bón và chế độ che sáng). Các thí nghiệm 1 nhân tố hoặc 2 nhân tố được bố trí thí nghiệm theo phương pháp khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD) 3 lần nhắc lại;

Phân tích giám định tên khoa học bằng phương pháp so sánh hình thái (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2009) tại Trung tâm Tài nguyên dược liệu (Viện Dược liệu) kết hợp với phân tích trình tự vùng gen ITS tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Nghiên cứu hệ gen; Giải phẫu tại Trung tâm Nghiên cứu dược liệu Sa Pa, Trung tâm Tài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu; Bộ môn Cây công nhiệp và cây thuốc, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam;

Đánh giá đa dạng di truyền của các mẫu giống Bát giác liên bằng chỉ thị ISSR và RAPD. Kỹ thuật PCR đánh giá đa dạng di truyền sử dụng 24 chỉ thị ISSR và 11 chỉ thị RAPD được thực hiện bằng máy PCR (Eppendorf ) tại Bộ môn Công nghệ sinh học

<i>thực vật - Học viện Nông nghiệp Việt Nam </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

Phân tích chất lượng dược liệu Bát giác liên bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được thực hiện theo Dược điển Việt Nam V (2017) và Zhang & cs. (2014) tại khoa Hóa phân tích Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

<i> Thời gian thực hiện từ năm 2017 - 2022. </i>

<b>Kết quả chính và kết luận </b>

Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học 20 mẫu giống Bát giác liên thu thập được đã

<i>xác định các mẫu giống đều thuộc cùng một lồi có tên khoa học Dysosma tonkinense </i>

(Gagnep.) M.Hiroe; Giữa các mẫu giống Bát giác liên có sự đa dạng di truyền cao, với hệ số tương đồng di truyền trung bình từ 0,69 khi đánh giá bằng chỉ thị ISSR, đến 0,79 khi đánh giá bằng chỉ thị RAPD. Trên cơ sở đánh giá đặc điểm nông sinh học đã tuyển chọn được mẫu giống M11 thu tại Hà Giang có đặc điểm sinh trưởng phát triển tốt, năng suất thực thu 11,75 tạ/ha và hàm lượng podophyllotoxin 3,51% phù hợp để sản xuất dược liệu tại Sa Pa, Lào Cai;

Xác định được một số biện pháp kỹ thuật nhân giống Bát giác liên: hạt giống được tách lớp áo hạt, đãi sạch, để ráo và gieo ngay cho tỷ lệ mọc mầm cao. Nhân giống vơ tính bằng hom thân ngầm gồm 3 đốt được cắt tại vị trí đầu thân ngầm vào thời vụ tháng 5 cho tỷ lệ hom bật mầm cao nhất. Xác định chồi bất định phát sinh từ rễ sau khi cắt rời khỏi thân ngầm và sử dụng rễ làm vật liệu nhân giống vơ tính, với thời vụ giâm hom tháng 5, hom có độ dài 15 cm được cắt tại vị trí cuối rễ; ngâm hom trong dung dịch BA 10 ppm trong 2 giờ, vớt ra để ráo trong 1 giờ sau đó ngâm trong dung dịch GA3 175 ppm trong 2 giờ cho kết quả nhân giống tốt nhất;

Xác định được một số biện pháp kỹ thuật trồng Bát giác liên, thời vụ trồng tốt nhất vào tháng tháng 11, mật độ trồng 62.000 cây/ha, lượng phân bón thích hợp gồm 20 tấn phân hữu cơ hoai mục + 70 kg N + 140 kg P<small>2</small>O<small>5</small> + 70 kg K<small>2</small>O và chế độ che sáng phù hợp cho cây là 60%.

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b>THESIS ABSTRACT </b>

<b>PhD candidate: Pham Ngoc Khanh </b>

<b>Thesis title: "Research on agro-biological characteristics, techniques for propagation </b>

<i>and cultivation of Dysosma tonkinense (Gagnep.) M. Hiroe in Sa Pa, Lao Cai". </i>

<b>Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA) Research Objectives </b>

<i>The research aims to determine 1-2 accessions of D. tonkinense with high </i>

productivity and quality of medicinal material and propose techniques for propagation

<i>and cultivation of D. tonkinense in Sa Pa, Lao Cai. </i>

<b>Research Methods </b>

<i>The study utilized 20 accessions of D. tonkinense collected from various </i>

provinces in Vietnam. The accessions were marked as M1 to M20 and planted at Sa Pa Research Centre of Medicinal Materials for evaluation purposes. The research encompassed experiments to evaluate biological and agronomical traits, assess self-incompatibility traits, improve fruiting ratio, sexual and asexual propagation by rhizo me and root cutting, and cultivation practices (planting seasonals, distances, fertilizer amounts, and shading canopy). One-factor or two-factor experiments were conducted following the Randomized Complete Block Design with three replications.

To identify scientific names, morphological comparison (Nguyen Nghia Thin, 2009) was conducted at the Center of Medicinal Resources, National Institute of Medicinal Materials, along with nrDNA-ITS (ITS region) sequence analysis at Vietnam National Museum of Nature and Institute of Genome Research. Anatomical assessments were conducted at Sa Pa Research Center of Medicinal Materials, Center of Medicinal Resources, and Faculty of Analysis and Standard Chemical, National Institute of Medicinal Materials.

<i>The genetic diversity of 20 accessions of D. tonkinense was evaluated using </i>

ISSR and RAPD markers. PCR technique was employed to assess genetic diversity using 24 ISSR markers and 11 RAPD markers, performed by a PCR machine (Eppendorf) at the Department of Plant Biotechnology, Vietnam National University of Agriculture.

The quality of D. tonkinense medicinal materials was analyzed using High-performance Liquid Chromatography (HPLC) according to Vietnam Pharmacopoeia V

</div>