Báo cáo môn công nghệ protein và enzyme đề tài 7 extraction, isolation and purification of bromelain

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (4.2 MB, 34 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>BÁO CÁO</b>

<b>MÔN CÔNG NGHỆ PROTEIN VÀ ENZYMEĐỀ TÀI 7. EXTRACTION, ISOLATION AND</b>

<b>PURIFICATION OF BROMELAIN</b>

<i><b>Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Cẩm ViNgười thực hiện: Nguyễn Phước Hải – 62000978</b></i>

<b>Nguyễn Ngọc Như Linh – 62000424Phan Thiện Như – 62000490Nguyễn Kim Tuyết Như – 62001025THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

1.1 Tổng quan về hệ enzyme protease...1

1.1.1 Các tính chất của hệ enzyme protease...1

1.1.2 Phân loại...2

1.1.3 Ứng dụng của hệ enzynme protease...6

1.2 Tổng quan về enzyme Bromelain...7

1.2.1 Một số tính chất của Bromelain...8

1.2.2 Cơ chế xúc tác...10

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính...10

<b>CHƯƠNG 2 – QUY TRÌNH SẢN XUẤT...13</b>

2.1 Phương pháp thu nhận...13

2.1.1 Thu dịch enzyme thô...14

2.1.2 Thu nhận chế phẩm enzyme thô...14

2.2 Phương pháp tinh sạch enzyme bromelain...22

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

3.2 Thuốc Bromelain...26 3.3 Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm...28

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<b>DANH MỤC HÌNH</b>

<b>Hình 1.1 Hai cách cắt Protein của enzyme protease...2</b>

<b>Hình 1.2 Casein biến đổi thành paracasein nhờ renin...4</b>

<b>Hình 1.4 Cấu trúc phân tử Bromelain thân...8</b>

<b>Hình 1.5 Cấu trúc hố học của Bromelain thân...9</b>

<b>Hình 2.1 Quy trình sản xuất Bromelain...13</b>

<b>Hình 2.3 Phương pháp thẩm tích...23</b>

<b>Hình 3.1 Thuốc Bromelain...27</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<b>DANH MỤC BẢNG</b>

<b>Bảng 2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính đặc hiệu của bromelain qua quá trình sấy...21</b>

<b>DANH MỤC SƠ ĐỒ</b>

<b>Sơ đồ 2.3 Siêu lọc kiểu khơng đổi thể tích...18</b>

<b>Sơ đồ 2.4 Các hướng thu nhận enzyme bromelain...19</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<b>CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN</b>

<b>1.1 Tổng quan về hệ enzyme protease</b>

Protease (proteinase, peptidase, hoặc enzym phân giải protein) là một nhóm phức tạp của các enzym được tìm thấy trong nhiều loại sinh vật, bao gồm cả thực vật, động vật và vi sinh vật. Chúng thực hiện nhiều chức năng thiết yếu trong các quá trình khác nhau, chẳng hạn như tiêu hóa, kiểm sốt sự tăng sinh, sự phát triển và chết của tế bào, điều hòa tổng hợp protein và sự suy thối. Chúng cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc sao chép và lây lan của vi rút, vi khuẩn và ký sinh trùng.

Enzyme phân giải protein thuộc nhóm hydrolase. Chúng thủy phân liên kết peptit của protein ở giữa chuỗi axit amin (endopeptidases) hoặc ở đầu của nó (exopeptidases).

<b>1.1.1 Các tính chất của hệ enzyme proteaseĐiểm đẳng điện</b>

Mỗi emzyme thuộc hệ protease khác nhau có điểm đẳng điện khác nhau như papain 8.75, casein 4.6, bromelain 9.55, …

Độ pH có sự chênh lệch giữa các enzyme trong hệ protease nhưng chúng được chia theo 3 mức

- Protease acid có pH tối ưu từ 2 – 4 - Protease trung tính có pH tối ưu từ 7- 8 - Protease kiềm có pH tối ưu từ 9 – 11

Ezyme protease là enzyme thủy phân các liên kết pectid (-CO-NH-) trong phân tử protein giải phóng các acid amin, pepton hoặc dipepton.

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>Hình 1.1 Hai cách cắt Protein của enzyme protease</b>

- Cách 1: Enzyme sử dụng acid như Aspartate, Glutamate, … để phân cực nước, sau đó tiến hành phá vỡ liên kết peptide trong phân tử protein

- Cách 2: Enzyme hoạt hoá để được coi như là 1 nucleotide tấn công trực tiếp vào liên kết peptide của protein, tạo chất trung gian là nước liên kết cộng hoá trị với nửa đầu N – terminus, sau đó, nước được kích hoạt để phân cắt hồn toàn liên kết peptide

- Endopeptidase

 Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trị đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ chymotripsin và subtilisin. Nhóm Chymotripsin: bao gồm các enzyme động vật như chymotripsin, tripsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn như subtilisin

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.

 Cystein proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein protease bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài proteinase động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cystein proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.  Aspatic proteinase: hầu hết các asportic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm

pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin…. Các asportic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở PH trung tính.

 Metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA. - Exopeptidase

 Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi poly peptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide.

 Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide.

- Phân loại dựa trên độ pH tối ưu

 Protease acid: pepsin, renin, … hoạt động ở vùng pH acid 2-4.

 Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin, … hoạt động ở vùng pH kiềm 9 – 11.  Protease trung tính: như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa, … hoạt

động ở vùng pH trung tính 7-8 - Dựa trên nguồn cung cấp

Có 3 nguồn cung cấp enzyme protease từ thiên nhiên: động vật, thực vật và vi sinh vật (tảo, vi khuẩn)

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

 Trong nội tạng của gia súc có hiện diện nhiều enzym thủy phân protease như: pepsin, tripsin, cathepsin.

 Tạng: là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzyme nhất.  Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm

protease là renin (Chymosin). Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi cazein thành para-casein có khả năng kết tủa trong mơi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là q trình đơng tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất.

 Các loại nội tạng khác: Gan, lá lách, thận, phổi, cơ hoành tim, huyết, các loại bộ phận này đều chứa enzyme chúng tồn tại trong tế bào. Chỉ có một số loại được sản xuất dưới dạng chế phẩm như: gan, tim lợn để tách aspartac-glutamate aminotransferase, huyết tương ( từ huyết ) để tách ra trombia ( Proenzyme chống đơng máu ).

 Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ nhựa của lá, thân quả đu đủ (Carica papaya) còn bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa ( Pineapple plant ).

<b>Hình 1.2 Casein biến đổi thành paracasein nhờ renin</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

 Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật này là công nghệ làm mềm thịt , chế biến sữa,... Ficin thu được từ nhựa cây cọ ( Ficus carica) được sử dụng thủy phân protein tự nhiên.

Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn...gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men.

 Nguồn vi khuẩn: Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai lọai trên. Do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao, chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B.subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B.subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticis, và một số giống chi Clostridium.  Nấm mốc: Nhiều loại nấm có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được

ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A.terricola, A.fumigatus, A.saitoi, Penicillium chysogenum... Các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả 3 loại protease: acid, kiềm và trung tính. Một số nấm mốc như: A.candidatus, P.cameberti, P.roqueforti...cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đơng tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat.  Xạ khuẩn: Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cúư ít hơn

nấm mốc và vi khuẩn. Tuy nhiên ngưịi ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae, Strerimosus... Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase ( Nhật ) được tách chiết từ S.grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Từ S.fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Protease từ S.fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong nghiệp chế biến thịt.

<b>1.1.3 Ứng dụng của hệ enzynme protease</b>

- Trong công nghiệp làm chế biến thịt: Protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt, làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và có vị tốt hơn. Protease được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị thịt. - Trong chế biến thủy sản: Khi sản xuất nước mắm thường thời gian chế biến là

dài nhất, hiệu suất thủy phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Nên hiện nay quy trình sản xuất nước

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện nhờ sử dụng chế phẩm enzyme thực vật ( bromelain và papain ) và vi sinh vật để rút ngắn thời gian làm, cải thiện hương vị của nước mắm.

- Trong công nghiệp sữa: Protease được dùng để sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đơng tụ của chúng. Protease từ một số sinh vật như: A.candidus, P. roqueti, B. mesentericus,...được dùng trong sản xuất phomat. Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy...protease được dùng làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nỡ nhiều hơn.

- Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease có ý nghĩa rất quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A.oryze được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. - Trong công nghiệp da: Protease được sử dụng để làm mềm da nhờ sự thủy phân

một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da bị cứng.

- Trong công nghiệp dệt: Proteinase vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để sợi được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisine đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, đó dó làm giảm lượng hóa chất để tẩy trắng.

<b>1.2 Tổng quan về enzyme Bromelain</b>

Bromelain là một loại enzym phân giải protein sulfhydryl chính được tìm thấy trong cây dứa ( Ananas comosus ) được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỉ 20. † nước ta nghiên cứu về bromelain được bắt đầu từ những năm 1968-1970.

Bromelain là nhóm protease thực vật được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt là từ thân và trái dứa. † mỗi bộ phận khác nhau thì bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau.

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

Bromelain có trong tồn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả. Bromelain là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptide nội phân tử để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ.

<b>Hình 1.4 Cấu trúc phân tử Bromelain thân</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

- Bước sóng hấp thụ cực đại: 280nm - Nhiệt độ phản ứng tối ưuL 55 C<small>0</small>

- Do có thành phần gồm nhiều phân tử enzym nên cơ chất xúc tác của bromelain rất đa dạng. Nó có thể phân hủy protein, peptit, este

- Nhóm cần thiết để bromelain xúc tác là nhóm sulfhydryl trong chuỗi peptit. Ngồi ra, nhóm cacboxyl và nhóm hydroxyl trong cấu trúc phân tử của bromelain cũng độc lập với hoạt tính của enzym.

- Bromelain thân là glycoproteinase gồm phần protein và phần phi protein. Phần phi protein là một glucide, ở mỗi phân tử gồm 3 manose, 1 xylose, 1 fructose và 2 glucosamine. Glucosamine là phần nối trực tiếp với mạch polipeptide của phần protein. Sợi hydrate carbon liên kết hốn vị với polypeptide.

<b>Hình 1.5 Cấu trúc hoá học của Bromelain thân</b>

- Tùy từng phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích, thành phần acid amin ở bromelain thân và quả thay đổi khác nhau. Bromelain thân có thành phần acid amin thay đổi trong khoảng 321-144 acid amin và 283-161 acid amin đối với bromelain quả.

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

- Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của Bromelain thân có acid amin đầu – NH2 là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với Bromelin quả, acid amin đầu –NH2 là alanine.

- Nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất (nơi các liên kết peptide bị cắt).

- Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion của chất nhận khác.

- Cầu nối S-S có vai trị duy trì cấu trúc khơng gian của bromelain. - Casein và hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất.

- Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và amino acid. Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, amino acid và peptide. - † giai đoạn đầu, Zn rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm hoạt<small>2+</small>

động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein nhờ amin, carboxyl…)

Enzyme – SH + Zn Enzyme – S – Zn + H<small>2+</small>

- Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc không gian được bảo vệ ổn định.

<b>1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính</b>

Giống như các cấu trúc xúc tác sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, <b>…</b>

Các yếu tố nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc tác của bromelain không ổn định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc vào các yếu tố khác như:

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

bản chất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, sự có mặt của chất hoạt hóa, thời gian phản ứng.

<b>Ảnh hưởng của nhiệt độ</b>

Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme.

<b>Ảnh hưởng của pH</b>

pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. pH thích hợp nhất đối với bromelain khơng ổn định, mà phụ thuộc vào bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, nhiệt độ và bản chất của dung dịch đệm, sự có mặt của chất tăng hoạt cũng như thời gian phản ứng.

<b>Ảnh hưởng của kim loại và một số chất khác</b>

- Các ion kim loại thường gắn với phân tử protein tại các trung tâm hoạt động, do đó ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme. Vì bromelain thuộc nhóm protease cystein, trung tâm hoạt động có nhóm –SH đều là hoạt chất hoạt hóa cho bromelain. Ví dụ: KCN, thioglycolic acid, cystein, sulfid, cianit… - Bromelain bị ức chế bởi những ion hoạt hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm –

SH, các tác nhân oxi hóa, halogen hóa, ankyl hóa,..như: iodoacetate, bromoacetate, H2O2, methyl bromur…

- Các ion kim loại như: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử bromelain.

- Theo Murachi, thì khi khơng có chất hoạt hóa, bromelain chỉ phát huy được 60-70 % hoạt tính tối đa trên casein và enzyme có hoạt tính tối đa khi có sự hiện diện 0,005 M cystein.

<b>Các chất bảo vệ enzyme</b>

Tác nhân bảo vệ có vai trị quan trọng trong q trình đơng khơ. Một chất bảo vệ tốt phải bảo vệ tế bào ở nhiệt độ thấp trong suốt q trình lạnh đơng, dễ làm khơ và

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

tạo hỗn hợp ổn định, dễ hòa tan lại vào nước. Nhiều nhóm chức đã được kiểm tra về khả năng bảo vệ của chúng: polyol, polysaccharide, disaccharide, amino acid, protein, muối, vitamin, khoáng, acid hữu cơ. Tuy nhiên khả năng bảo vệ của từng nhóm chức thay đổi đối với từng loại phân tử sinh học. Có 4 nhóm ngăn chặn tác hại của q trình đơng khơ đã đ ợc nghiên cứu, kiểm tra:ƣ

- Đường: trehalose, lactose, maltose, sucrose, fructose, glucose bổ sung với tỉ lệ 10 %.

- Acid amin: natri glutamate (2.5%), dịch trích nấm men (4%). - Polyol: sorbitol (5%), mannitol (5%).

- Dung dịch đệm phosphate.

Đường tái sắp xếp cấu trúc của n ớc trong phân tử protein khi hòa tan lại vàoƣ n ớc và ngăn cản sự uốn cong, hợp nhất bằng cầu nối hydro giữa các gốc phân cực củaƣ protein.

Acid amin bảo vệ bằng cách phản ứng với nhóm carboxyl của protein và nhóm amin của tác nhân bảo vệ nhờ đó mà nó ổn định cấu trúc của protein. cystein ngăn cản sự oxi hố nhóm –SH thành cầu nối

-S-S-Polyol làm cho dung dịch chứa chúng nhanh chóng bị kết tinh trong q trình đơng khơ nhờ vậy có thể bảo vệ đ ợc các phân tử sinh họcƣ

</div>