<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>Bộ CÔNG THƯƠNG</b>

<b>ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH</b>

<b>BÁO CÁO TỔNG KỂT ĐỀ TÀI KHOA HỌC</b>

<b>Tên đề tài: </b>Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của hành tím đen (Allium ascalonicum L.)

<b>Mã số đềtài: 21.2.</b> SHTPSV03

<b>Chủ nhiệm đề tài:</b> Bùi Thị Trang

<b>Đơn vị thực hiện: Viện</b> Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

<b>LỜICÁM ƠN</b>

Sau thời gian hai năm học tập và nghiên cứu tại Viện công nghệ Sinh học và Thực phẩm với sự hướng dẫn nhiệt tình cùng những bài học quý báu của q thầy cơ ở Viện, tơi đã hồn thành đề tài của mình. Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến:

Đầu tiên, tơi xin bày tỏ lồng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Trần Đình Thắng và TS. Đỗ Hữu Nghị đã tận tình trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tơi hồn thành đề tài này.

Tiếp đến, tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô của Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm đã truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trong thời gian tôi học tập và nghiên cứu tại trường. Tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô phịng thí nghiệm đã tạo điều kiện giúp đỡ, cung cấp các cơ sở vật chất cần thiết trong suốt thời gian tôi thực hiện nghiên cứu này.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo nhà trường đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành được đề tài này.

Một lần nữa xin trân trọng cảm ơn!

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>PHẢN L THÔNG TIN CHƯNGI. Thơng tíntổngqt</b>

<b>1.1. Tên đề tài:</b> Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của hành tím đen (Allium ascalonicum L.)

<b>1.2.Mã số: 21.2. </b>SHTPSV03

<b>1.3.Danh sách chủ trì,thành viêntham gia thựchiện đề tài</b>

(học hàm, học vị) <b>^Đơn^vị^cơng^tác^{Vai trị}^thực^{hiện đề}^tài1.5.Thịi gian thựchiện:</b>

1.5.1. Theo hợp đồng: từ tháng 03 năm 2022 đến tháng 03 năm 2023 1.5.2. Gia hạn (nếu có): đến tháng...năm...

1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 03 năm 2023 đến tháng 9 năm 2023

<b>1.6. Những thay đổiso với thuyết minh ban đầu</b> (nếu có):

<i>tyề mụctiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chứcthực hiện;Nguyên nhân; Ý kiến củaCơ quan quảnlý)</i>

<b>1.7. Tổng kinhphí đượcphê duyệt của đề tài:50 triệu đồng.II.Kết quả nghiên cứu</b>

<b>1. Đặt vấn đề</b>

Từ lâu hành tím được xem là một loại gia vị, thực phẩm trên thế giói. Chúng đã được sử dụng như một vị thuốc y học cổ truyền với các lợi ích về sức khỏe. Các thành phần hóa học được tìm thấy trong hành tím <i>(Aỉỉium ascaỉonicum L.)</i> chủ yếu là flavonoid glycoside, các hợp chất chứa lưu huỳnh và saponin. Flavonol glucoside bao gồm quercetin và isorhamnetin mono- và di-glucosides được tìm thấy trong hành tím của Pháp và Ý [1]. Các nghiên cứu trước đây cho thấy nhiều cây thuộc họ

<i>Aỉỉium</i> (trừ <i>A. sativum</i> và <i>A. cepà)</i> đóng vai trị quan trọng trong thành phần của các chất tạo hưong, chất chống oxy hóa, hương thơm và trị liệu [2]. Củ của các loài

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

<i>Aỉỉium được </i>sử dụng rộng rãi làm hương liệu thực phẩm và được đánh giá cao trong những năm qua khơng chỉ vì hương vị và mùi đặc trưng mà còn là nguồn cung cấp đáng kể các hợp chất có hoạt tính sinh học như allicin và các dẫn xuất của chúng [3, 4, 5] hoặc flavonoid glycoside [6, 7, 8].

Hoạt tính chống oxy hóa của các lồi <i>Aỉỉium </i>có nguồn gốc từ các hợp chất chứa lưu huỳnh và tiền chất của chúng, bên cạnh đó, các hợp chất khác như polyphenol, chất xơ và nguyên tố vi lượng cũng được cơng bố góp phần thể hiện các hoạt tính tương tự [9]. Polyphenol là hợp chất được phân bố rộng rãi trong các sản phẩm tự nhiên. Chúng đã được cơng bố là có nhiều đặc tính sinh học, chẳng hạn như các hoạt tính chống oxy hóa, kháng biểu mơ, kháng khuẩn, kháng vi rút và chống viêm [10, 11]. Các cây thuốc giàu polyphenol có thể làm chậm q trình oxy hóa phân hủy lipid và cải thiện chất lượng cũng như giá trị dinh dưỡng của thực phẩm [12]. Ngoài việc là nguồn cung cấp chất chống oxy hóa cao, hành tím cịn có những lợi ích quan trọng như cải thiện sức khỏe tim mạch, ngăn ngừa ung thư, tiểu đường, chống viêm, kháng khuẩn, có thể giúp chống béo phì và giúp ngăn ngừa hoặc điều trị dị ứng [13].

Hành tím chứa những chất chuyển hóa thứ cấp như ílavonoid, đặc biệt là flavonols, anthocyanin, sterol thực vật và saponin [13]. Các sterol thực vật phổ biến nhất trong các sản phẩm tự nhiên là p-sitosterol, stigmasterol và campesterol. Sterol có thể làm giảm nguy cơ xơ vữa động mạch và bảo vệ chống lại các bệnh tim mạch [14]. Chúng cịn có khả năng làm giảm nguy cơ ung thư vú, tuyến tiền liệt và ruột kết [15, 16], Hơn nữa, sterol thực vật có đặc tính kháng viêm và điều hòa miễn dịch [17]. Tất cả sterol thực vật trong cơ thể con người được cung cấp từ chế độ ăn, vì chúng khơng thể được tổng hợp bởi con người. Hơn 95% tổng lượng sterol thực vật trong khẩu phần ăn được đại diện bởi p-sitosterol, stigmasterol và campesterol [14]. Chi <i>Aỉỉium</i> bao gồm hơn 500 loài phổ biến trên khắp thế giới. Đặc tính kháng khuẩn và kháng nấm của Aỉỉium đã được chứng minh từ các loài <i>A. sativum, A.Porrum</i> [18], A <i>cepa [19], A ascaỉonicum \2ữ\, A. fistulosum</i> [21].

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

Hành tím <i>(AHium ascalonicum L.) mang</i> lại nhiều lợi ích về sức khỏe nhưng vẫn bị hạn chế bởi mùi hăng và vị cay của chúng. Tuy nhiên, mùi và vị khó chịu của hành tím có thể bị loại bỏ thơng qua q trình xử lý nhiệt do các hợp chất kém bền và có mùi khó chịu sẽ được chuyển hóa thành hợp chất bền và không mùi [22]. Dựa trên cơ sở này, tiến hành xử lý và tạo sản phẩm hành tím đen nhờ vào q trình lão hóa được kiểm sốt trong mơi trường nhiệt độ và độ ẩm thích hợp nhằm cải thiện mùi vị và chất lượng của hành tím. Ngồi ra, nghiên cứu của Yang và Park [22] thì thành phẩm hành tây đen từ hành tây - một nguyên liệu cùng chi của hành tím sẽ có vị ngọt, chua, thay thế cho các mùi khó chịu và vị hăng nồng ở hành tươi. Đặc biệt có thể tạo ra sản phẩm với nhiều đặc tính chức năng mới.

Thành phần hóa học của hành tím đen <i>(AỉỉiumAscaỉonicum) ở</i> Việt Nam chưa được nghiên cứu nhiều, mục đích của nghiên cứu này là mang lại dữ liệu mới về các hợp chất hóa học và hoạt tính sinh học có trong sản phẩm hành tím đen, đồng thời xây dựng quy trình sản xuất cao chiết hành đen giàu hoạt tính sinh học.

- Xác định thành phần hóa học của hành tím đen

- Xác định tổng hàm lượng flavonoid có trong hành tím đen - Xác định tổng hàm lượng Phenolic có trong hành tím đen - Xác định hoạt tính chống oxy hóa của hành tím đen - Xác định hoạt tính kháng viêm của hành tím đen - Xác định hoạt tính kháng ung của hành tím đen

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

- Phân lập các hợp chất có trong dịch chiết hành tím đen và thử các hoạt tính sinh học của chúng (hoạt tính chống oxi hóa, kháng viêm, kháng ung)

<b>3. Phưong pháp nghiên cứu</b>

3. 1 Nội dung 1: Tổng quan về hành tím tươi và hành tím đen trong và ngồi nước - Cách tiếp cận: Tìm kiếm và thu thập tài liệu tham khảo trong và ngoài nước.

- Phương pháp: Đọc và tổng hợp lại tài liệu đã công bố trong và ngoài nước, phát hiện ra vấn đề cần nghiên cứu, đưa ra tên đề tài và xây dựng nội dung nghiên cứu. - Kết quả: Tập hợp được tư liệu dạng văn bản phằn tích tổng quan về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hành tím tươi và hành tím đen.

- Tính mới: Sau khi đọc tài liệu đã nghiên cứu trong và ngồi nước nhận thấy chưa có cơng trình nào xác định đầy đủ về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học hành tím đen.

3. 2 Nội dung 2: Thu mẫu

- Cách tiếp cận: Tìm kiếm và thu thập trực tiếp từ Vinh Châu. - Phương pháp: thu mua hành tím Vĩnh Châu

- Kết quả: Thu thập được mẫu hành tím Vinh Châu tươi với kích thước đồng đều. 3. 3 Nội dung 3: Tạo sản phẩm hành tím đen

- Cách tiếp cận: Tiến hành xử lý sơ bộ và áp dụng quá trình lão hóa được kiểm sốt trong mơi trường nhiệt độ và độ ẩm thích hợp để tạo sản phẩm

- Kết quả: Tạo được sản phẩm hành tím đen 4. 4 Nội dung 4: Tạo cao hành tím đen

- Cách tiếp cận: Tìm kiếm phương pháp phù hợp và tiến hành thực nghiệm - Phương pháp phân tích: Chiết theo phương pháp ngâm chiết

- Kết quả: Tạo được cao hành tím đen 3. 5 Nội dung 5: Phân lập chất

- Cách tiếp cận: Tiến hành phân lập và tách chiết các hợp chất - Phương pháp phân tích: Sử dụng phương pháp sắc ký cột, TLC,... - Kết quả: Tinh sạch và xác định cấu trúc của các hợp chất

3. 6 Nội dung 6: Xác định thành phần hóa học của hành tím đen

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

- Cách tiếp cận: Tiến hành phân tích mẫu, lấy số liệu về thành phần hóa học. - Phương pháp phân tích: Sử dụng phương pháp LC-MS để phân tích thành phần - Kết quả: Xác định được thành phần hóa học của hành tím đen, từ đó có thể so sánh với thành phần hóa học của hành tím tươi.

3. 7 Nội dung 7: Xác định hàm lượng tổng flavonoid có trong hành tím đen - Cách tiếp cận: Tiến hành phân tích mẫu, lấy số liệu tổng hàm lượng flavonoid - Kết quả: Xác định được tổng hàm lượng flavonoid

3. 8 Nội dung 8: Xác định hàm lượng tổng phenolic có trong hành tím đen - Cách tiếp cận: Tiến hành phân tích mẫu, lấy số liệu tổng hàm lượng phenolic - Kết quả: Xác định được tổng hàm lượng phenolic

3. 9 Nội dung 9: Thử hoạt tính chống oxy hóa của hành tím đen - Cách tiếp cận: thử hoạt tính chống oxi hóa của hành tím đen - Kết quả: Có số liệu về khả năng chống oxy hóa của hành tím đen 3.10 Nội dung 10: Thử hoạt tính kháng viêm của hành tím đen - Cách tiếp cận: thử hoạt tính viêm của hành tím đen

- Kết quả: Có số liệu về khả năng kháng viêm của hành tím đen 3.11 Nội dung 11: Thử hoạt tính kháng ung của hành tím đen - Cách tiếp cận: thử hoạt tính ung của hành tím đen

- Kết quả: Có số liệu về khả năng kháng ung của hành tím đen 3.12 Nội dung 12: Báo cáo tổng kết và viết báo

- Phương pháp: Tổng hợp các số liệu về thành phần hóa học, các chất được phân lập, tổng hàm lượng flavonoid và phenolic, hoạt tính sinh học để viết báo cáo tổng kết đề tài và viết báo.

- Kết quả: 1 bài báo gửi scopus, 1 báo cáo tổng hợp

<b>4. Tổng kết vềkết quả nghiên cứu</b>

Trong nghiên cứu này, các điều kiện tối ưu của q trình chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (UAE) và hoạt động chống oxy hóa từ hành tím đen đã được nghiên cứu. Các điều kiện tối ưu UAE thu được dựa trên phương pháp luận bề mặt đáp ứng với thiết kế Box-Behnken. Điều kiện chiết xuất tối ưu là nhiệt độ chiết 53°c, thời

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

gian chiết 72 phút, nồng độ ethanol 48% v/v và mức công suất siêu âm 84% (504W), các giá trị thực nghiệm của TPC, TFC và DPPH là 17,28 ± 0,12 mgGAE/g; 5,42 ± 0,08 mgQE/g và 75,35 ±0,15 %.

Tỏi tươi qua quá trình lên men ở độ ẩm và nhiệt độ cao sẽ trải qua quá trình biến đổi các thành phần lý hóa của tỏi làm tỏi có màu đen, mềm, vị ngọt, khơng cịn mùi hăng cay. Khả năng chống oxy hóa của tỏi đen tăng gấp 5 lần, hàm lượng flavonoid tăng 8 lần, hàm lượng đường tổng tăng 2,8 lần và đường khử tăng 11 lần so với tỏi tươi nên tỏi đen được xem là có giá trị dược tính cao hơn so với tỏi tươi

Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp với các phương pháp phân tích phổ hiện đại (MS, NMR), từ phân đoạn dịch chiết ethylacetat của lá cây dâu đã phân lập, xác định cấu trúc phân tử 2 hợp chất nhóm flavonoid là kaempferol 3- O-p-D- glucopyranoside (1) và quercetin 3-O-a- L-rhamnopyranosid (2). Các kết quả trên cũng mở ra những hướng nghiên cứu sâu hơn nhằm hướng tới mục tiêu tìm ra hoạt chất chính có khả năng ứng dụng làm chất chuẩn trong kiểm nghiệm. Đồng thời cần tiếp tục thực hiện các nghiên cứu bổ sung về hàm lượng và tác dụng sinh học của các hợp chất phân lập được, nhằm minh chứng cho công dụng và góp phần định hướng sử dụng hiệu quả hơn

<b>5. Đánh giá cáckếtquả đã đạt được và kếtluận</b>

- Nghiên cứu cung cấp thông tin về các thành phần hóa học có trong hành tím đen.

- Đe tài bước đầu cung cấp những thông tin về hoạt tính sinh học của hành tím đen: khả năng chống oxi hóa, khả năng kháng ung từ đó biết được tác dụng đối với sức khỏe con người.

- Cung cấp thơng số về quy trình sản xuất cao chiết hành tím đen giàu hoạt tính sinh học.

- Là tiền đề để phát triển sản phẩm hành tím đen nâng cao giá trị kinh tế.

<b>6. Tóm tắtkết quả</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

Trong nghiên cứu này, các điều kiện tối ưu của quá trình chiết xuất có sự hỗ trợ của sóng siêu âm (ƯAE) và hoạt động chống oxy hóa từ hành tím đen đã được nghiên cứu. Các điều kiện tối ưu UAE thu được dựa trên phưong pháp luận bề mặt đáp ứng với thiết kế Box-Behnken. Điều kiện chiết xuất tối ưu là nhiệt độ chiết 53°c, thời gian chiết 72 phút, nồng độ ethanol 48% v/v và mức công suất siêu âm 84% (504W), các giá trị thực nghiệm của TPC, TFC và DPPH là 17,28 ± 0,12 mgGAE/g; 5,42 ± 0,08 mgQE/g và 75,35 ± 0,15 %.

Tỏi tưoi qua quá trình lên men ở độ ẩm và nhiệt độ cao sẽ trải qua q trình biến đổi các thành phần lý hóa của tỏi làm tỏi có màu đen, mềm, vị ngọt, khơng cịn mùi hăng cay. Khả năng chống oxy hóa của tỏi đen tăng gấp 5 lần, hàm lượng flavonoid tăng 8 lần, hàm lượng đường tổng tăng 2,8 lần và đường khử tăng 11 lần so với tỏi tươi nên tỏi đen được xem là có giá trị dược tính cao hơn so với tỏi tươi

Bằng các phương pháp sắc ký kết hợp với các phương pháp phân tích phổ hiện đại (MS, NMR), từ phân đoạn dịch chiết ethylacetat của lá cây dâu đã phân lập, xác định cấu trúc phân tử 2 hợp chất nhóm flavonoid là kaempferol 3- O-p-D- glucopyranoside (1) và quercetin 3-O-a- L-rhamnopyranosid (2). Các kết quả trên cũng mở ra những hướng nghiên cứu sâu hơn nhằm hướng tới mục tiêu tìm ra hoạt chất chính có khả năng ứng dụng làm chất chuẩn trong kiểm nghiệm. Đồng thời cần tiếp tục thực hiện các nghiên cứu bổ sung về hàm lượng và tác dụng sinh học của các hợp chất phân lập được, nhằm minh chứng cho cơng dụng và góp phần định hướng sử dụng hiệu quả hơn

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<b>III. Sảnphẩmđề tài, công bố và kếtquả đào tạo3.1. Kết quả nghiên cứu (sảnphẩm dạng1,2,3)</b>

<b>4</b> Báo cáo phân tích và số liệu hoạt tính sinh học

<b>5</b> Chemical Composition analysis of Ethanol Extract Of Black Shallot

<i>(Allium Ascalonicum)</i> and Their Bioactive

<i><b>Ghi chú:</b></i>

Các ấn phẩm khoa học (bài báo, báo cáo KH, sách chuyên khảo...) chỉ dược chấp nhân nếu có ghi nhận địa chỉ và cảm on trường ĐH Công Nghiệp Tp. HCM đã cấp kính phí thực hiện nghiên cứu theo đúng quy định.

Các ấn phẩm (bản photo) đính kèm trong phần phụ lục minh chứng ở cuối báo cáo. (đối với ấn phẩm là sách, giáo trình cần có bản photo trang bìa, trang chính và trang cuối kèm thơng tin quyết định và số hiệu xuất bản)

<b>3.2. Kết quả đào tạo</b>

<i><b>Ghi chú:</b></i>

<i>- Kèm bản phototrang bỉa chuyên đề nghiên cứu sinh/ đềtài/khóa luận vàbằng/giẩy chứng nhận nghiên cứu sinh/thạc sỹ nếu học viên đãbảovệ thành</i>

<b>TTHọ và tên</b>

<b>Thòi gianthựchiện đề tài</b>

<b>Tên đề tài</b>

<i>Tên chuyên đềnếuỉà NCS Tên đề tài nểuỉàCao học</i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

2 Nguyên, nhiên vật liệu, cây con..

<b>V.Kiên</b><i><b>nghị ( </b>vê phát triên các kêt quảnghiên cứu của đê tài)</i>

<b>VI. Phụlụcsản phẩm (hệt kê</b><i> minh chứng các sảnphẩm nêuởPhần III)- Bài báo scopusQ3</i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<b>PHẢN II. BẤO CẢOCHI TIẾT ĐẺTÀINGHIÊN cứu KHOAHỌC</b>

<i>(báo cáo tong kết sau khi nghiệm thu, đã baogồmnộidung góp ý củahội đồng nghiệmthu)</i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN...<b>Error! Bookmark not defined.</b>

TÓM TẮT...<b>Error! Bookmark not defined.</b>

ABSTRACT...<b>Error! Bookmark not defined.</b>

LỜI CAM ĐOAN...<b>Error! Bookmark not defined.</b>

MỤC LỤC...xii

DANH MỤC HÌNH ẢNH...<b><small>XV</small></b> DANH MỤC BẢNG BIỂU...xvi

DANH MỤC TỪ VIẾT TẤT... xvii

MỞ ĐẦU...1

1. Đặt vấn đề...<b>Error! Bookmark not defined.</b> 2. Mục tiêu nghiên cứu...<b>Error! Bookmark not defined.</b> 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu...<b>Error! Bookmark not defined.</b> 4. Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu...<b>Error! Bookmark not defined.</b> 5. Y nghĩa thực tiễn của đề tài...1

1.2 Tổng quan q trình lão hóa...8

1.2.1 Cơ chế của q trình lão hóa bằng phương pháp xử lý nhiệt...8

1.2.2 Các biến đổi nhờ quá trình lão hóa...11

1.3 Tổng quan về hành tím đen...14

1.4 Định hướng ứng dụng...14

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu...16

2.1 Vật liệu nghiên cứu...16

2.2 Phương pháp khảo sát điều kiện tạo hành tím đen...17

2.2.1 Sơ đồ quy trình sản xuất hành tím đen từ hành tím tươi...17

2.2.2 Thuyết minh quy trình...17

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

2.2.10 Hoạt tính chống oxi hóa...23

2.3 Phưong pháp nghiên cứu thành phần hóa học của hành tím đen...24

2.3.1 Xác định tổng hàm lượng phenolic...24

2.3.2 Xác định tổng hàm lượng flavonoid...24

2.3.3 Phưong pháp nghiên cứu các hợp chất bay hơi...24

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu các hợp chất không bay hơi...24

2.4 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học...28

2.4.1 Thử hoạt tính chống oxi hóa...28

2.4.2 Thử hoạt tính kháng ung thư...28

2.5 Phương pháp tối ưu hóa cao chiết giàu TPC, TFC và chống oxi hóa...29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN cứu... 31

3.1 Khảo sát điều kiện tạo hành tím đen...31

3.1.1 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến độ ẩm...31

3.1.2 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến pH...32

3.1.3 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến axit...33

3.1.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến độ màu...34

3.1.5 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến hàm lượng đường khử...36

3.1.6 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến hàm lượng phenolic...38

3.1.7 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến hàm lượng flavonoid...39

3.1.8 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến khả năng bắt gốc tự do DPPH...41

3.2 Khảo sát thành phần hóa học của hành tím đen...43

3.2.1 Tổng hàm lượng phenolic...43

3.2.2 Tổng hàm lượng flavonoid...44

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

3.2.3 Thành phần các hợp chất bay hơi của hành tím đen...44

3.2.4 Thành phần các hợp chất khơng bay hơi của hành tím đen...46

3.3 Khảo sát hoạt tính sinh học...49

3.3.1 Khả năng chống oxi hóa...49

3.3.2 Khả năng kháng ung thư... 50

3.4 Tối ưu hóa cao chiết giàu TPC, TFC và chống oxi hóa... 51

3.4.1 Sự phù hợp của các mơ hình...51

3.4.2 Phân tích bề mặt đáp ứng...55

3.4.3 Tối ưu hóa và xác minh mơ hình...58

3.5 Quy trình sản xuất cao chiết giàu hợp chat phenolic và flavonoid có hoạt tính chống oxi hóa từ hành tím đen...58

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...61

DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA HỌC VIÊN...62

TÀI LIỆU THAM KHẢO...63

PHỤ LỤC...73 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG CỦA HỌC VIÊN <b>.Error! Bookmark not defined.</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

Hình 1.5 So đồ chuyển hóa alliin thành allicin...12

Hình 1.6 Hình thành các hợp chất chứa lưu huỳnh trong quá trình trao đổi chất của tỏi đã qua chế biến...13

Hình 2.1 Quy trình tạo sản phẩm hành tím đen...16

Hình 2.2 Quy trình nghiên cứu sản xuất hành đen từ hành tím tươi...17

Hình 2.3 Phân lập các hợp chất từ hành tím đen...27

Hình 3.1 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến yếu tố độ ẩm của hành tím đen...31

Hình 3.2 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến yếu tố pH của hành tím đen...33

Hình 3.3 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến yếu tố axit của hành tím đen...34

Hình 3.4 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến yếu tố màu của hành tím đen...36

Hình 3.6 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến yếu tố đường khử của hành tím đen...38

Hình 3.7 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến hàm lượng phenolic của hành tím đen...39

Hình 3.8 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến hàm lượng ílavonoid của hành tím đen....40

Hình 3.9 Ảnh hưởng của chế độ ủ đến giá trị DPPH của hành tím đen...42

Hình 3.10 Cấu trúc Quercetin...47

Hình 3.11 Cấu trúc Quercitrin...48

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

<b>DANH MỤC BẢNG BIỂU</b>

Bảng 2.1 Chương trình pha động trên cột C18...24

Bảng 3.1 Độ ẩm của hành tím đen ở chế độ nhiệt 60°C, 70°C và 80°C...31

Bảng 3.2 pH hành tím đen ở các chế độ nhiệt 60°C, 70°C và 80°C...32

Bảng 3.3 Axit tổng của hành tím đen ở các chế độ nhiệt 60°C; 70°C; 80°C...33

Bảng 3.4 Độ màu của hành đen ở chế độ nhiệt 60°C, 70°C và 80°C...34

Bảng 3.5 Giá trị đường khử của hành tím đen ở chế độ nhiệt 60°C, 70°C và 80°C.37 Bảng 3.6 Giá trị polyphenol của hành đen ở chế độ nhiệt 60°C, 70°C và 80°C...39

Bảng 3.7 Giá trị flavonoid của hành tím đen ở chế độ nhiệt 60°C, 70°C và 80°C. ..40

Bảng 3.8 Giá trị DPPH của hành đen ở chế độ nhiệt 60°C, 70°C và 80°C...41

Bảng 3.9 Giá trị DPPH ngày thứ 18 của hành tím đen ở chế độ nhiệt 60°C, 70°C và 80°C...42

Bảng 3.10 Thành phần các hợp chất bay hơi của hành tím đen...44

Bảng 3.11 Thành phần các hợp chất không bay hơi của hành tím đen...46

Bảng 3.12 Tác dụng chống ung thư của chiết xuất hành tím đen...51

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

Electron spray ionization mass spectra Gas Chromatography-Mass spectrometry

High Performance Liquid Chromatography

Liquid Chromatography-Mass spectrometry

3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 2,5-Diphenyltetrazolium bromide Nuclear magnetic resonance

Response Surface Methodology

Solid Phase Micro Extraction

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

<b>MỞ ĐẦU</b>

<b>5. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài</b>

- Nghiên cứu cung cấp thông tin về các thành phần hóa học có trong hành tím đen.

- Đe tài bước đầu cung cấp những thơng tin về hoạt tính sinh học của hành tím đen: khả năng chống oxi hóa, khả năng kháng ung từ đó biết được tác dụng đối với sức khỏe con người.

- Cung cấp thông số về quy trình sản xuất cao chiết hành tím đen giàu hoạt tính sinh học.

- Là tiền đề để phát triển sản phẩm hành tím đen nằng cao giá trị kinh tế.

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

<b>TỎNG QUAN</b>

<b>Tổng quan về hành tím</b>

<i><b>Giói thiệu</b></i>

Hành tím có tên khoa học là <i>Aỉỉium ascalonicum, </i>một loại cây thân thảo, mọc ỏ nhiều noi trên thế giới. Tuy nhiên, nguồn gốc của chúng có lẽ là ở châu Ả. Vào thời điểm hiện tại, chi <i>Aỉỉium </i>có hon 500 lồi, mỗi lồi khác nhau về hình dáng, màu sắc và mùi vị, nhưng giống nhau về đặc điểm sinh hóa, hóa thực vật và dược thực phẩm. <i>Aỉỉium được </i>biết đến là có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm, đồng thời chứa lưu huỳnh và nhiều hợp chat phenolic khác, điều này thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học [23, 24]. Hành tím lần đầu tiên được giói thiệu đến người châu Âu vào thế kỷ 12. Những người lính thập tự chinh đã mang chúng về nhà như một "kho báu quý giá" từ thành phố cổ Ascalon của người Palestine. Tên Aỉỉium được biết đến bắt nguồn từ từ “all” (hăng) của người Celt, trong khi tên

<i>ascaỉonicum</i> có thể bắt nguồn từ địa điểm trồng trọt [25].

Hành tím cao từ 15 - 50cm, củ hành to từ 2 - 3cm, có cạnh, vảy mỏng như giấy và có màu đỏ. Lá có hình trụ nhọn, rỗng, tròn và màu xanh mốc. Cụm hoa dạng tán ở đầu một cán cao từ 20 - 50cm, rộng, tán hoa hình cầu được bao chung hình bẹ màu trắng, hoa có 6 phiến hoa rời, cuống hoa từ 1 - l,5cm [26].

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

Hành tím được coi là thành viên của họ hành, nhưng nhỏ hơn hành tây và trông giống tỏi hơn (Hình 1.1). Hành tím có mùi hăng, vị hơi cay được sử dụng rộng rãi cùng với các <i>Allium</i> khác để tạo hương vị cho thực phẫm đặc biệt là thịt và nước sốt. Hành tím được con người sử dụng làm gia vị hàng ngày, nguyên liệu cơng nghiệp thực phẫm mà cịn được dùng như một cây thuốc [27, 28]. Loại hành này khác VỚI giống thông thường (Allium <i>cepa</i> L.) ở đặc điểm củ nhỏ hơn, có hình dạng giống như những nhánh tỏi lớn, và có hương vị nhẹ hơn. Người Pháp sử dụng loài này làm nguyên liệu nấu ăn hoặc chế biến nước sốt bằng cách băm nhỏ củ đun sôi trong rượu trắng [29]. ở các nước Đơng Nam Ả, hành tím được sử dụng phẫ biến và quan trọng hơn hành tây và được trồng nhiều nhất là loại có củ màu đỏ [30]. Mặc dù được tiêu thụ rộng rãi nhưng các cơng bố liên quan đến tác dụng sinh học của

Hình 1.1 Đặc điểm hình thái cây hành tím.

A. Củ hành tím; B. Cây hành tím; c. Hoa hành tím. hành tím rất ít so với các lồi <i>Allium</i> khác như tỏi và hành tây.

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

<i><b>Thànhphần hóa học</b></i>

Các nhà khoa học đã phân tích trong thành phần hóa học của A. <i>ascaỉonicum </i>có sự hiện diện của thành phần hữu ích như lectin liên kết với mannose [31]. Ngoài việc được sử dụng như thuốc thử trong các lĩnh vực nghiên cứu, lectin cịn có tiềm năng trong các liệu pháp chữa bệnh ung thư và kháng virus nhờ tính đặc hiệu khi liên kết với các cấu trúc carbohydrate khác nhau trên lớp vỏ vi khuẩn, virus hay trên bề mặt tế bào ung thư [32].

Hành tím là một nguồn quan trọng cung cap carbohydrate, vitamin A, B và c. Hợp chat phenolic trong hành tím bao gồm axit gallic, apigenin, eriodictyol, quercetin, isoquercetin, rutin, kaempferol, catechin và axit tannic [33]. Ngồi ra, hai saponin furostanol mói (ascalonicoside A1/A2 và B) cũng được phằn lập từ củ hành tím [7]. Các loài <i>Aỉỉium</i> là nguồn giàu flavonol. A. ascalonicum (hành tím) là một nguồn dồi dào của các hợp chất lưu huỳnh, flavonoid và phenolic. Sự hiện diện của các hợp chất này có vai trị trong việc loại bỏ gốc tự do và đặc tính chống oxy hóa [9, 34, 35]. Có báo cáo cho thấy chiết xuất hành tím có chứa một so polyphenol như apigenin, axit gallic, catechin, quercetin, kaempferol và axit tannic là những hợp chất nổi bật có hoạt tính kháng nấm [36]. Trong đó, hợp chất quercetin được biết đến với khả năng chống oxy hóa và loại bỏ gốc tự do cũng như khả năng bảo vệ chống lại bệnh tim mạch, chúng còn có tác dụng rõ rệt trong điều trị dị ứng, hen suyễn, viêm khớp, ung thư, biến chứng tiểu đường, rối loạn thối hóa thần kinh và bệnh lỗng xưong [37, 38, 39, 40].

Phân tích GC-MS của tinh dầu hành tím đã xác định được 42 hợp chất chiếm hon 70,29% tổng số tinh dầu. Các thành phần chính là dipropyl disulfide (15,17%), dipropyl trisulfide (11,14%), methyl propyl trisulflde (9,20%), 1-propenyl propyl disulfide (4,57%) và methyl propyl disulfide (3,26%) [41].

Các hợp chat hữu cơ de bay hơi của hành tây và hành tím được xác định thơng qua HS-SPME-GC-MS. Các thành phần chính là dipropyldisulphide và allylpropyldisulphide. Thiopropanal S-oxit chỉ được phát hiện trong chất bay hơi

</div><span class="text_page_counter">Trang 23</span><div class="page_container" data-page="23">

của hành tây. Điều thú vị là trong hành tím có sự hiện diện của 2-metyl-2-pentenal, một hợp chất có mùi thơm trái cây, có thể đây là đặc trưng cho mùi thơm khác nhau giữa hành tây và hành tím. Phân tích SPME-GC-MS của hành tím sau khi hấp thụ trên sợi SPME ở 50°C cho thấy sự hiện diện của các hợp chất mới [42].

Chiết xuất của hành tây <i>(Aỉỉium cepa\ tỏi</i> tây <i>(Aỉỉium porrum</i> L.), hành lá (Allium

<i>fistulosum</i> L.), hành tím <i>(Allium ascaỉonicum</i> auct.), củ nén <i>(Allium schoenoprasum </i>

L.) và hẹ Trung Quốc (Allium <i>tuberosum</i> L.) được phân tích bởi GC-MS bằng cách sử dụng cột mao quản có đường kính (0,53mm) với tiêm chất làm lạnh (0°C) trên cột và điều kiện nhiệt độ cột ban đầu, tốc độ gia nhiệt (2-5°C / phút) và nhiệt độ GC-MS từ 80-100°C. Các mẫu của các thành phần nghi ngờ được sử dụng để định danh và định lượng, rượu benzyl làm chất chuẩn nội. Trong các điều kiện này, thiosulfmat MeS(O)SMe, PrS(O)SPr, MESS(O)Pr, MeS(O)SPr, (Z)- và (E)- MeS(O)SCH=CHMe, (E)-MeSS(O)CH=CHMe và (Z)- và (E)-PrS(O)SCH=CHMe và 2,3-dimethyl-5,6 dithiabicyclo [2.1.1] hexane 5-oxit (cis- và trans zwiebelanes) đều được xác định trong hành tây, tỏi tây, hành lá, hành tím và củ nén trong khi MeS(O)SMe và (E, Z)-MeS(O)SCH=CHMe được xác định trong lá hẹ Trung Quốc. Mặt khác, nghiên cứu không thể thu được các pic cho các đồng phân MeCH=CHS(O)SPr hoặc bất kỳ thiosulfinat nào có chứa nhóm 2-propenyl (allyl), được xác định bởi HPLC [43].

Selen và lưu huỳnh đồng thời được xác định có trong hành tím <i>(Allium ascalonicum)</i> thực hiện bằng kỹ thuật ghép nối, HPLC được kết hợp với quang phổ nguồn plasma cảm ứng cao tần, kết nối khối phổ (HPLC - ICP-MS) được trang bị hệ thống phản ứng octopole (ORS). Hợp chất seleno phổ biến được xác định trong hành tím là Ỵ-glutamylmethylselenocysteine được ion hóa bằng phương pháp phun mù electron, ghép nối khối phổ (ESI-MS / MS). Hơn nữa, hành tím cịn cho thấy tác dụng ngăn ngừa chống lại các tế bào bệnh bạch cầu ở người [44].

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

<i><b>Hoạt tính sinh học</b></i>

Hành tím có nhiều hợp chất hoạt tính sinh học. Một số nghiên cứu cho thấy hành tím có các đặc tính kháng khuẩn, kháng nấm [45], chống oxi hóa, kháng biểu mơ, kháng khuẩn, kháng vi rút và chống viêm [10, 11, 46], chẳng những thế chúng cịn có tiềm năng điều trị chống lại vi khuẩn Hp <i>(Helicobacterpylori) có</i> trong dạ dày [47]. Có báo cáo chỉ ra rằng hành tím là nguyên liệu sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ sức khỏe với hàm lượng Selen và chất chống oxy hóa cao [48]. Năm 2011, Chen cùng cộng sự đã cho thấy tiềm năng của hành tím sử dụng trong điều trị các hoạt động lây nhiễm của vi-rút adeno [49]. Khả năng chống oxy hóa của hành tím cao hon khi so sánh với các chất chiết xuất từ tỏi, đối với dịch chiết hexane của hành tím có thể bảo vệ q trình tán huyết hồng cầu khỏi các gốc như hydrogen peroxide. Nghiên cứu cũng đã chứng minh dịch chiết từ củ hành tím có tác dụng bảo vệ đối với q trình peroxy hóa lipid từ AAPH và giữ cho glutathione trong hồng cầu khơng bị oxi hóa [50]. Thêm vào đó, hành tím cịn được xem như một loại thảo mộc hữu ích vói tiềm năng điều trị hoặc phòng ngừa chống lại các rối loạn liên quan đến mạch máu [51]. Đồng thời, chất chiết xuất từ hành tím có thể được sử dụng như chất bảo quản tự nhiên để kéo dài thời hạn sử dụng của các sản phẩm cá cũng đã được chứng minh [52].

Kết quả nghiên cứu cho thấy hành tím có hoạt tính chống oxi hóa mạnh hon tỏi tây, tỏi, hẹ Trung Quốc, hành tây. Qua đó, hành tím có thể có tiềm năng mang lại giá trị trong ngành công nghiệp thực phẩm như những chất thay thế chất chống oxy hóa tổng hợp. Đặc tính kháng khuẩn của tinh dầu hành tím cũng được thử nghiệm và đánh giá trên năm mầm bệnh truyền qua thực phẩm: Gram (+) <i>Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes</i> và ba vi khuẩn Gram (-) Salmonella Typhimurium,

<i>Escherichia coli</i> và Campylobacter<i> jejuni</i> [41].

Năm 2019, Asemani và cơng sự đã phát hiện phân tích hóa thực vật của các loài thuộc chi <i>Aỉỉium</i> khác nhau cho thấy 16 lồi đã chứng minh được đặc tính chống ung thư tiềm năng do sự tích tụ của các hợp chất hữu co và lưu huỳnh khác nhau

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

nhiều năm đã chỉ ra rằng tác dụng chống ung thư của <i>Aỉỉium là do</i> các hợp chất có nguồn gốc từ lưu huỳnh (OSCs), được giải phóng ra khi chế biến (băm, nhai, cắt...). Các y-glutamyl-S-alk (en) yl-L-cysteine là các hợp chất lưu huỳnh chính trong

<i>Allium</i> nguyên vẹn, được thủy phân và oxy hóa để tạo ra S-alkyl (en) yl-L-cysteine sulfoxide (alliin). Alliin tích tụ tự nhiên trong q trình bảo quản <i>Aỉỉium và </i>là tiền chất không mùi của OSCs. Các OSCs được tạo ra khi chuyển đổi alliin thành allicin và các alkyl alkane-thiosulfinat khác thông qua alliinase, được giải phóng từ khơng bào khi cắt, nghiền hoặc nhai <i>Allium.</i> Allicin và các thiosulfinat thường không ổn định và bị phằn hủy ngay lập tức để tạo ra các hợp chất lưu huỳnh khác nhau bao gồm các OSCs hòa tan trong dầu như diallyl sulfide (DAS), diallyl disulfide (DADS), diallyl trisulfide (DATS), dithin và ajoene (4,5,9-trithiadodeca-l,6,l 1- triene-9-oxit). Đồng thời, Ỵ-glutamyl cysteine cũng được chuyển đổi thành các OSCs hòa tan trong nước bao gồm S-allyl cysteine (SAC) và S-allyl mercaptocysteine (SAMC) [54, 55]. Kết quả của một nghiên cứu cho thấy SAC và OSCs ỞA. <i>ascaỉonicum </i>có khả năng chống ung thư và kháng sinh [56]. Chúng cũng được chứng minh là có hoạt tính chống ung thư và gây độc tế bào vói dịng HepG2 (ung thư gan) [57]. Ngoài ra, chiết xuất trong nước của A. ascaỉonicum có hoạt tính chống tăng trưởng trên các dòng tế bào ung thư; Jurkat (ung thư bạch cầu cấp tế bào T ỏ người) và K562 (ung thư bạch cầu nguyên bào), Wehil64 (tế bào fibrosarcoma - ung thư mô mềm của chuột). Chiết xuất cũng cho thấy độc tính tế bào ít hon nhiều so với dịng tế bào bình thường (HUVEC) và hoạt động chống viêm đáng kể trên co thể sống [56]. Do đó, có thể kết luận rằng hành tím là một lựa chọn chống ung thư mạnh để điều trị ung thư [57].

Nhìn chung, hành tím có nhiều chất chống oxy hóa, khống chất và vitamin hon hành tây. Chúng là một nguồn giàu chất chống oxy hóa flavonoid như quercetin, kaempferol,... Hành tím chứa các hợp chất chống oxy hóa lưu huỳnh như diallyl disulfide, diallyl trisulfide và allyl propyl disulfide, chuyển đổi thành allicin thông qua tác động của enzyme sau khi bề mặt tế bào bị phá vỡ trong khi nghiền nát và cắt

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

nhỏ. Allicin làm giảm sản xuất cholesterol bằng cách ức chế enzyme HMG-CoA reductase trong tế bào gan [13].

<b>Tổng quan qtrình lãohóa</b>

<i><b>Cơche củaq trình lão hóabằng phương pháp xửlý nhiệt</b></i>

Xử lý nhiệt là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi để loại bỏ mùi khó chịu ở loài Aỉỉium. Bất kể ỏ nhiệt độ nào, màu của mẫu sẽ tăng dần theo thời gian từ vàng nhạt đến nâu sẫm. Nhiệt độ càng cao khả năng hóa nâu sẽ càng nhanh, nếu nhiệt độ chậm khả năng hóa nằu sẽ chậm hon. Khả năng hóa nâu của thực phẩm xử lý nhiệt (như tỏi đen) liên quan đến phản ứng Maillard, phản ứng hóa nâu khơng enzyme, xảy ra giữa các amin thường là axit amin và các hợp chat carbonyl thường là đường khử [58].

Trong 150 năm qua, xử lý nhiệt đã trỏ thành một thực tế phổ biến trong ngành công nghiệp thực phẩm. Các phương pháp xử lý như khử trùng hoặc nướng cải thiện các đặc tính cảm quan và sức khỏe của thực phẩm đã qua xử lý nhiệt. Nhiều phản ứng hóa học khác nhau diễn ra trong quá trình nhiệt và bảo quản thực phẩm, tạo các hợp chất mới ảnh hưởng đến các đặc tính cuối cùng của thực phẩm và khả năng chấp nhận của người tiêu dùng. Một số biến đổi này bao gồm một loạt các phản ứng phức tạp được gọi là phản ứng hóa nâu khơng do enzyme, dẫn đến sự hình thành màu nâu mà khơng có sự can thiệp của enzyme. Trong số đó, phản ứng Maillard là phổ biến nhất do khả năng phát triển trong một phạm vi nhiệt độ lớn, hoạt động của nước, có hoặc khơng có oxy,... Do đó, sự hình thành phản ứng maillard là điều mong muốn trong thực phẩm như cà phê hoặc bánh mì..., trong đó màu sắc và mùi thơm đặc trưng được hình thành. Ngược lại, trong thực phẩm như sữa hoặc nước trái cây, phản ứng maillard bị tránh do hình thành màu sắc và mùi thơm lạ cũng như giảm dinh dưỡng.

Năm 1953, Hodge lần đầu mô tả các bước liên quan đến quá trình hình thành các sản phẩm trong phản ứng Maillard. Tồn bộ q trình hình thành phản ứng Maillard

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

có thể được chia thành ba giai đoạn chính tùy thuộc vào sự hình thành màu sắc. ở giai đoạn đầu, đường và axit am in ngưng tụ, và sau khi ngưng tụ, sự sắp xếp lại Amadori và tạo thành l-amino-ldeoxy-2 ketose. Trong giai đoạn thứ hai, sự mất nước và phân mảnh xảy ra trong các phân tử đưòng. Các axit amin cũng bị phân huỷ trong giai đoạn này. Các sản phẩm phân hạch hydroxymethylfurfural (HMF) nhu pyruvaldehyde và diacetyl được hình thành. Giai đoạn này có thể có màu vàng nhẹ hoặc khơng màu. Trong giai đoạn cuối cùng, sự ngưng tụ aldol xảy ra và cuối cùng hình thành các họp chất nitơ dị vịng, melanoidin, có màu đậm [59].

Giai đoạn đầu: sản phẩm khỗng màu và khổng hấp thụ tia cực tím.

- Phản ứng khử nuớc của đng.

- Phản ứng phân hủy đường và các họp chất am in.

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

Hình 1.3 Quá trình khử nước và khử amin để tạo ra dicarbonỵl. Giai đoạn cuối: sản phẩm màu sẫm, có mùi thom.

<i><small>aldehit axetic</small>^{afdehft axetic}</i>

- Phản ứng ngưng tụ aldol tạo thành các polỵme màu nâu khơng chứa nitơ. - Phản ứng trùng họp hóa aldehitamin tạo thành các họp chất nitơ dị vòng.

Cường độ hóa nâu của thực phẩm cũng phụ thuộc vào bản chất của amino axit có trong thực phẩm. Do đó, người ta đã thiết lập được sự phân loại các amino axit theo mức độ hóa nâu mà chúng tạo ra:

- Các amino axit tạo ra màu nâu ở mức cao: lysine, glycine, tryptophan và tyrosine.

- Các amino axit tạo ra màu nâu ở mức độ trung bình: proline, leucine, isoleucine, alanin, hydroxyproline, phenylalanin, methionine, valine, axit glutamic và asparagin.

- Các amino axit tạo ra một mức độ hóa nâu thấp: histidine, threonine, axit aspartic, arginine, axit glutamic và cysteine.

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

Phản ứng Maillard có tác động lớn khơng chỉ đến các đặc tính cảm quan của thực phẩm mà còn đến thành phần cuối cùng của chúng, do làm giảm các chất dinh dưỡng có liên quan (chẳng hạn như các axit amin thiết yếu), ức chế các enzyme cần thiết khác nhau cho quá trình tiêu hóa thức ăn, và phát triển các hợp chất mới có cả đặc tính có lợi (hoạt động chống oxy hóa) và có hại (acrylamide, amin dị vịng,...) [60].

<i><b>Các biến đẳì nhờ q trình lão hóa</b></i>

Một ví dụ điển hình cho sản phẩm được tạo ra nhờ q trình ủ lão hóa của lồi

<i>Allium</i> là tỏi đen. Tỏi đen chỉ đơn giản là tỏi tươi <i>(Allium sativum</i> L.) đã được xử lý ủ lão hóa trong mơi trường với nhiệt độ (khoảng 70-80°C) và độ ẩm (khoảng 400- 500 g/kg) được kiểm soát [61, 62]. Quá trình này sẽ làm cho tép tỏi có màu sẫm, tạo cho chúng có vị ngọt và thay đổi độ đặc thành dai. Tỏi đen không cịn mùi vị khó chịu như tỏi tươi do hàm lượng allicin giảm và chuyển đổi thành các hợp chất chống oxi hóa S-allyl cysteine (SAC), các alkaloid (các dẫn suất Tetrahydro-/T carboline) có hoạt tính sinh học và các hợp chat flavonoid trong quá trình lão hóa [63, 64]. Điều này cũng làm cho tỏi đen có nhiều SAC hơn tỏi tươi. Trong nghiên cứu của Emiko Sato và cộng sự [65] đã báo cáo rằng chiết xuất tỏi đen có hoạt tính chống lại superoxide và hydrogen peroxide và hàm lượng polyphenol trong chiết xuất tỏi đen đã tăng lên so với tỏi đối chứng. Những thay đổi về đặc tính hóa lý là ngun nhân chính làm tăng hoạt tính sinh học của tỏi đen so với tỏi tươi. Một số nghiên cứu đã báo cáo dịch chiết của tỏi đen thể hiện một số chức năng như chống oxy hóa, chống dị ứng, chống tiểu đường, chống viêm và có tác dụng chống ung thư [66, 67, 68, 69, 70]. Trong quá trình nhiệt, một số hợp chất hóa học từ tỏi tươi được chuyển hóa thành hợp chất Amadori / Heyns, là những hợp chất trung gian chủ chốt của phản ứng Maillard [71]. Bên cạnh đó, tỏi đen cịn chứa một thành phần có hoạt tính chống oxy hóa quan trọng là 5- hydroxymethyl furfural (5-HMF), cũng là một sản phẩm được tạo ra bởi phản ứng Maillard [61].

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

Hình 1.5 Sơ đồ chuyển hóaalliin thành allicin.

Hàm lượng các họp chất hóa học có trong tỏi đen phụ thuộc vào điều kiện trong quá trình xử lý nhiệt. Một số nhà nghiên cứu báo cáo rằng trong tỏi đen có nhiều thành phần có giá trị đặc biệt như polyphenol, flavonoid và một số chất trung gian của phản ứng Maillard được biết đến như là chất chống oxy hóa [58, 72]. Hoạt tính sinh học của tỏi đen cao hon đáng kể so vói tỏi tươi, chẳng hạn như đặc tính chống oxy hóa [65].

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

Hình 1.6 Hình thành các hợp chất chứa lưu huỳnh trong quá trình trao đồi chất của tỏi đã qua chế biến.

Hàm lượng các axit amin phân nhánh (leucine và isoleucine) trong tỏi đen cao hơn so với trong tỏi sống. Hàm lượng axit amin có tính axit của tyrosine và axit aspartic, hàm lượng axit amin cơ bản của axit glutamic, arginine và lysine giảm khi quá trình lão hóa tiếp tục. Tương tự như vậy, hàm lượng của các axit amin phân cực như threonine và serine, và các axit amin không phân cực như glycine và alanin giảm so với tỏi sống. Do đó, việc giảm các axit amin này, đặc biệt là cysteine và tyrosine, trong q trình lão hóa có thể liên quan đến phản úng Maillard, xảy ra giữa các amin thường là axit amin và các hợp chất carbonyl thường là đường khử. Nhóm tác giả đã nhận thấy rằng hàm lượng cysteine chứa lưu huỳnh giảm đáng kể trong q trình lão hóa, điều này minh chứng cho việc mùi vị của tỏi đen cũng giảm theo. Bên cạnh đó, hàm lượng axit amin thơm như phenylalanine lại tăng lên so với tỏi tươi

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

[58]. Ngoài ra, theo nghiên cứu của Rojas và cộng sự [73] về hành đen được xử lý bằng nhiệt, các chất như quercetin tự do được tìm thấy vói số lượng cao hơn đáng kể trong hành tây đen so với hành tươi.

<b>Tổng quan về hành tímđen</b>

Trên thế giới, việc nghiên cứu về ngun liệu hành tím đen cịn hạn chế, chưa được nghiên cứu nhiều vì là sản phẩm mới, chỉ có một nghiên cứu “Thành phần hóa học và tác dụng chống oxi hóa, kháng viêm và kháng ung của chiết xuất etanol hành tím đen” được thực hiện bởi Trần Gia Bửu và cộng sự [74]. Hành tím đen là sản phẩm mới của cây hành tím

<i>(Allium ascaỉonicum), một</i> trong những loại gia vị và bài thuốc nổi tiếng được sử dụng trong ẩm thực Việt Nam và trong y học dân gian, qua quá trình ủ già trong mơi trường nhiệt độ và độ ẩm được kiểm sốt. Tuy nhiên, các hoạt tính sinh học của chiết xuất ethanol từ hành tím đen vẫn chưa được nghiên cứu. Mục đích của nghiên cứu này là xác định thành phần hóa học và tác dụng chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm của chiết xuất hành tím đen. Các thành phần hóa học của chiết xuất hành tím đen được xác định thơng qua phân tích ESIMS / MS và hoạt tính chống oxy hóa của chiết xuất được đánh giá bằng xét nghiệm thu dọn gốc l,l-diphenyl-2picrylhydrazil (DPPH). Hoạt tính chống ung thư của hành tím đen chống lại ung thư biểu mô cổ tử cung ở người (Hela) và các dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan (HepG2) ở người đã được kiểm tra thông qua xét nghiệm MTT. Tác dụng chống viêm của chiết xuất được đo thông qua định lượng sản xuất oxit nitrit bằng phản ứng Griess. Đã xác định được sự hiện diện của 7 hợp chất hoạt tính sinh học trong chiết xuất hành tím đen, bao gồm quercetin 3,4’-diglucoside, isorhamnetin 3,4’ diglucoside, quercetin 3-glucoside, quercetin 4’-glucoside, isorhamnetin 4’-glucoside, quercetin aglycone, isrohamnetin. Hon nữa, chiết xuất hành tím đen thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh hơn chiết xuất hành tím tươi (25,67 ± 0,65% so với 18,21 ± 0,35%, tương ứng). Tác dụng chống ung thư và chống viêm của hành tím đen cũng cao hơn hành tím tươi. Các dữ liệu cho thấy hành tím đen là một trong những thực phẩm chức năng đầy hứa hẹn để điều trị các bệnh liên quan đến viêm và ung thư.

<b>Định hướng ứng dụng</b>

Hành tím đen là sản phẩm được tạo từ hành tím tươi qua quá trình xử lý nhiệt thời gian dài trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm được kiểm soát chặt chẽ. Các nghiên cứu

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

đã chỉ ra rằng so với nguyên liệu ban đầu thì sản phẩm sau q trình xử lý nhiệt có nhiều đặc tính sinh học vượt trội hơn như khả năng kháng oxi hóa, kháng viêm, kháng ung, chống dị ứng, chống tiểu đường [5 8, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 72, 73, 74]. Dựa vào các dữ liệu đã được nghiên cứu cho thấy hành tím đen là sản phẩm đầy hứa hẹn để hỗ trợ điều trị ngăn ngừa ung thư, các bệnh liên quan đến viêm, điều chỉnh lượng đường trong máu, tăng cường sức đề kháng và hệ miễn dịch. Đồng thời, hành tím đen với khả năng chống oxi hóa mạnh mẽ cũng là một nguồn thực phẩm hữu hiệu hỗ trợ điều trị các bệnh lý liên quan đến việc sản sinh các gốc tự do.

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

<b>VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu</b>

<b>Vật liệu nghiên cứu</b>

Đối tượng nghiên cứu:

Hành tím tươi được thu mua từ thị xã Vinh Châu, tỉnh Sóc Trăng. Sau khi thu mua, tiến hành phân loại và chọn lựa các củ hành ngun vẹn, trịn chắc, khơng sâu mọt, khơng hư hỏng vật lý. Ngoài ra, các củ hành được lựa chọn có màu sắc và kích thước đồng đều (đường kính khoảng 20 - 30mm). Nguyên liệu sau khi lựa chọn được rửa sạch đất cát, cắt bỏ phần cuống và rễ, bóc vỏ khơ bên ngồi. Sau khi xử lý sơ bộ, hành tím được bọc trong giấy bạc (có các lỗ nhỏ đường kính 1.5 - 2mm để thoát hơi nước) và đem ủ ở điều kiện có thể điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm (70°C, 70% RH) trong 18 ngày. Sản phẩm của quy trình xử lý nhiệt có màu nâu đen, khơ,

Hình 2.1 Quy trình tạo sản phẩm hành tím đen.

Hành tím đen được ngâm với dung dịch ethanol thực phẩm tỉ lệ 1:5 (nguyên liệu:dung môi) trong 1 tuần và lặp lại 2 lần để thu được hàm lượng tối đa. Tiếp theo, dịch chiết hành tím đen được lọc và cơ đặc bằng máy cơ quay chân không ở 60°C

</div><span class="text_page_counter">Trang 35</span><div class="page_container" data-page="35">

thu được cao chiết. Sau đó, cao chiết tiếp tục được loại bỏ nước bằng phương pháp sấy thăng hoa, mẫu cao hành tím đen sau cùng được bảo quản ở 4°c cho đến khi sử dụng tiếp.

<b>Phuongpháp khảo sát điều kiện tạo hành tímđen</b>

<i><b>Sơ đoquy trình sảnxuất hành tím đen từ hànhtím tươi</b></i> + Thời gian: 21 ngày

Lấy mẫu và kiểm tra ở thời điểm ngày thứ: 0; 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21

Hình 2.2 Quy trình nghiên cứu sịn xuât hành đen từ hành tím tươi.

<i><b>Thuyết minh quy trình</b></i>

Ngun liệu hành tím tươi: thu nhận từ thị xã Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng. Yêu cầu củ hành cịn ngun vẹn, khơng dập nát, sâu mọt, kích thước đạt đồng đều.

<b>HÀNH TÍMTƯƠI</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 36</span><div class="page_container" data-page="36">

Xử lý sơ bộ: hành tím được xử lý làm sạch đất cát bên ngoài, cắt bỏ phần rễ, cuống và bóc vỏ khơ bên ngồi.

Khảo sát các chế độ lên men bằng nhiệt: sau khi tiến hành xử lý làm sạch, hành tím được bọc trong giấy bạc và thực hiện quá trình lên men bằng nhiệt với thiết bị buồng ủ lão hóa. Hành tím đen được tạo thành khi được ủ hành tím tươi ở 03 chế độ được ký hiệu CĐ60, CĐ70 và CĐ80 tương ứng với nhiệt độ lần lượt là: 60°C; 70°C; 80°C vói độ ẩm 70%, thời gian ủ 21 ngày. Thực hiện lấy mẫu kiểm tra với tần suất 01 mẫu/03 ngày tại một giờ nhất định (lúc 10 giờ sáng) và khảo sát các thơng số hóa lý:

- Khảo sát sự thay đỗi pH, độ màu, độ ẩm, acid tổng, đường khử. - Khảo sát tổng hàm lượng phenolic và flavonoid.

- Khảo sát khả năng bắt gốc tự do DPPH.

Do đặc điềm của củ hành có hàm lượng ẩm cao, vì vậy khi gói giấy bạc đem ủ cần tạo một số lỗ nhỏ ở bốn góc giấy bạc nhằm tạo mơi trường thơng thống đễ hơi ầm có thề thốt ra bên ngồi, tránh động nước ỡ trong q trình ủ.

Hành đen: sản phẩm thu được sau quá trình lên men bằng nhiệt ở quy trình được lựa chọn thơng qua việc đánh giá các chỉ tiêu hóa lý như pH, độ ẩm, độ màu, acid tổng, đường khử và các hoạt chất có hoạt tính chống oxi hóa như phenolic, flavonoid.

<i><b>Xác địnhđộẩm</b></i>

Xác định theo 10TCN 842:2006 tiêu chuẩn rau quà - phưong pháp xác định hàm lượng nước và tính hàm lượng chất khơ.

Ngun tắc: Dùng nhiệt đễ làm bay hơi nước có trong mẫu, tính chênh lệch khối lượng mẫu trước và sau khi sấy.

Cơng thức tính hàm lượng độ ẩm W1(%):

Cơng thức tính hàm lượng chất khô W2 (%):

</div><span class="text_page_counter">Trang 37</span><div class="page_container" data-page="37">

w2(%)= 100-W1 (2-2)

Trong đó: m0 là khối lượng hộp cân (g); m là khối lượng hành trước khi sấy (100g); mi là khối lượng hộp cân và hành sau khi sấy (g).

Cách tiến hành:

Sấy và xác định khối lượng của hộp cân (mo). Cat 100g mẫu thử thành nhiều miếng nhỏ trộn đều và cho vào hộp đựng mẫu. sấy hộp cân ở nhiệt độ 70°C trong 1 giờ dưới áp suất thấp. Đậy nắp trước khi lấy hộp cân ra khỏi tủ, làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng và cân với độ chính xác Img, được mi(g). Xác định được hàm lượng độ ẩm W1(%), sau đó hàm lượng chất khơ w2 (%).

<i><b>Xác định pH</b></i>

Xác định pH theo TCVN 7806:2007 (ISO 1842:1991) - Sản phẩm rau, quả - Xác định độ pH. Sử dụng máy đo pH hiệu Hana HI8424 - Mỹ với điện cực thủy tinh, máy có khả năng bù nhiệt.

Nguyên tắc: xác định sự chênh lệch điện giữa hai điện cực được nhúng vào dung dịch thử. pH là phép đo hoạt động của ion H+, xác định bằng cách đo sự khác nhau về điện thế giữa điện cực thủy tinh và điện cực tham chiếu. Máy đo pH được chuẩn hóa bằng cách sử dụng bộ đệm pH tiêu chuẩn (pH = 4; 7 và 10) trước khi tiến hành đo.

Cách tiến hành:

Trộn 50g mẫu thử với 50ml nước cất và nghiền ở máy xay. Nhúng điện cực vào phần mẫu thử và tiến hành đo giá trị pH của mẫu thử với quy trình vận hành của máy. Sau một thời gian, pH đạt được giá trị ổn định, thực hiện đọc giá trị pH trực tiếp từ màn hình đo của thiết bị.

<i><b>Xác định độ axit</b></i>

Nguyên tắc: xác định độ acid theo TCVN 5483:2007 (ISO 750:1998) Sản phẩm rau, quả Xác định độ acid chuẩn độ được. Chuẩn độ với dung dịch thể tích chuẩn natri hydroxit dùng phenolphtalein làm chất chỉ thị màu.

</div><span class="text_page_counter">Trang 38</span><div class="page_container" data-page="38">

Chuẩn bị mẫu thử:

Cắt mẫu thành những mẩu nhỏ, đưa vào máy xay đễ đồng nhất mẫu. Cân 25g mẫu cho vào bình nón, thêm 50ml nước nóng, trộn đều cho đến khi đồng nhất mẫu. Lắp bộ ngưng đối lưu vào bình nón và đun cách thủy bỉnh trong 30 phút. Đề nguội, chuyển tồn bộ lượng chứa trong bình nón vào bình định mức và định mức 100ml bằng nước. Lắc kỹ và lọc.

Cách tiến hành:

Lấy 50ml dung dịch chiết và thêm từ 0,4 ml dung dịch phenolphtalein, chuẩn độ bằng dung dịch natri hydroxit O,1M cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây.

Công thức tổng quát tính hàm lượng acid tổng là:

Độ acid (^) = <Na0H * ^^ * k*1000

Trong đó: VNaOH là thể tích dung dịch NaOH chuẩn độ (ml); CNaOH là nồng độ dung dịch NaOH (O,1M); Vchiá là thễ tích dung dịch chiết hành thu được (100 ml); Vmẫu là thể tích dung dịch mẫu hành mang đi chuẩn độ (50ml); k là hệ số tính theo acid acetic (k=0,06); nimĩu là lượng cân mẫu tính theo hàm lượng chất khô (g); 1000 là hệ số qui đổi đon vị mg/kg.

<i><b>Xácđịnh độmàu</b></i>

Phưong pháp đo màu củ hành bằng máy đo màu Konica Minolta CR-410 (Konica Minolta, Hà Lan) với hệ màu Lab. Giá trị L* cho biết độ sáng khác nhau, từ màu đen (L’= 0) đến màu trắng (L’= 100). Giá trị a‘ cho biết màu đỏ khác nhau, từ xanh lục (a*= - 60) đến màu đỏ (a*= 60) và giá trị b* dao động từ xanh dưong (b*= - 60) đến màu vàng (b'= 60). Dụng cụ được hiệu chuẩn vói tiêu chuẩn chuẩn màu đen và trắng.

Tổng sai số màu AE được tính tốn từ các tham số L*, a* và b* được tính tốn liên quan đến mẫu đối chứng (hành tươi) theo Saricoban và cộng sự [75]:

</div><span class="text_page_counter">Trang 39</span><div class="page_container" data-page="39">

ủE = ^tH^+W^F+W7^ _(2-4)

Trong đó: L*o; a*o; b*0 giá trị độ màu của hành tím tươi (tại ngày 0); L*(t), a*(t), b*(t) giá trị độ màu của hành tím đen (tương úng tại các ngày 3; 6; 9; 12; 15; 18; 21).

Cách tiến hành:

Mau nghiên cứu được đặt trong một dụng cụ chun dụng hình trụ và được đậy kín bằng nắp (bộ dụng cụ chuyên dụng đi kèm với máy Minolta) đề đo chỉ số màu sắc, mỗi mẫu được đo ở 03 vị trí khác nhau xoay quanh trên bề mặt mẫu. Ghi nhận giá trị.

<i><b>Xác định hàmlượngđường khử</b></i>

Hàm lượng đường khử được xác định theo phưong pháp DNS [76].

Nguyên tắc: dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với axit 3,5- dinitrosalicỵlic (DNS), từ màu vàng của axit DNS trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành 3-amino-5 nitrosalicylic có màu đỏ cam. Cường độ màu của hỗn họp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử.

Pha dung dịch thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối Sodium potassium tartrate, đun cách thủy cho tan rồi định mức 100ml.

Pha dung dịch chuẩn: dung dịch glucose mẫu (500 pg/ml) bằng cách cân 0,5g D- glucose pha trong nước cất thành 1 lít.

Chuẩn bị mẫu thử:

Cân 5g mẫu, tiến hành trích ly bằng 50ml ethanol 90% bằng cách cho vào thiết bị đun cách thủy cho sôi khoảng 10 phút. Thực hiện lọc và đưa về pH = 7 bằng NaOH, định mức lên 100ml.

Cách tiến hành:

</div><span class="text_page_counter">Trang 40</span><div class="page_container" data-page="40">

Hút 0,5ml dịch mẫu thử + 1,5ml DNS, đun sôi 5 phút. Sau khi đun sôi, đề nguội, định mức 10ml bằng nước và mang đi đo độ hấp thu tại bước sóng cực đại 575nm. Kết quả được tính theo mg/kg của ngun liệu khơ (mg/kg DW).

Cơng thức tính hàm lượng đường khử:

Trong đó: V1 là tổng thể tích hỗn họp thử (10ml); Cmẫu là nồng độ mẫu đo được từ đường chuẩn (mg/1); Vchiết là thể tích dung dịch chiết hành thu được (100ml); vmâu là thể tích dung dịch mẫu hành thử nghiêm (0,5ml); mmíu là lưọng cân mẫu tính theo hàm lưọng chất khơ (g); 1000: hệ số chuyển đổi sang đon vị g/kg.

<i><b>Xác định hàmlượng phenolic</b></i>

Nguyên tắc: dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu, thuốc thử này chúa chất oxi hóa là axit phospho-vonframic, trong q trình khử, các nhóm hydroxyl phenol dễ bị oxi hóa, chất oxi hóa này sinh ra màu xanh có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 765nm. Phản ứng do sự hình thành màu xanh của vonfarm và molỵpden. Các thuốc thử Folin- Ciocalteu phản ung với nhiều họp chất polyphenol và mặc dù có thể có đáp ứng khác nhau với các họp chất đon lẻ, thì việc lựa chọn axit gallic làm chất chuẩn hiệu chuẩn cũng giúp ích cho việc thu được dữ liệu phenolic tổng số.

Tổng hàm lưọng phenolic được xác định theo Li Fu và cộng sự [77] với một số thay đổi. Tiến hành pha loãng dung dịch vói nồng độ phù họp (dịch thu được ở phần chiết mẫu). Lấy Iml mẫu đã pha loãng thêm vào 5ml thuốc thử Folin- Ciocalteu pha loãng 1:10. Sau phút, 4ml dung dịch natri cacbonat 7,5% (khoảng 75gZL) được thêm vào. ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng và đo độ hấp thụ của hỗn họp ở bước sóng 7ố5nm. Axit gallic được sử dụng như một chất chuẩn đối chiếu và kết quả được biểu thị bằng đưong lưọng miligam axit gallic (mg GAE/g cao chiết). Hàm lượng phenolic tổng được tính theo cơng thức:

Trong đó: p là hàm lưọng phenolic tổng (mg axit gallic /g cao chiết); a là giá trị X từ đường chuẩn với axit gallic (gg/ml); V là thể tích dung dịch cao chiết (ml); m là

</div>