<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO </b>

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI </b>

<b>LÊ THIÊN MINH </b>

<b>NGHIÊN CỨU TÍNH ĐỐI KHÁNG CỦA ASPERGILLUS </b>

<i><b>FLAVUS KHƠNG SINH ĐỘC TỐ ĐỂ PHỊNG CHỐNG </b></i>

<b>AFLATOXIN TRÊN NGƠ VÀ LẠC </b>

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 62420201

<b>TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC </b>

Hà Nội – 2014

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

Cơng trình này được hoàn thành tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

1. GS. TS. NGUYỄN THÙY CHÂU

2. PGS. TS. NGUYỄN THN XUÂN SÂM

Phản biện 1: PGS. TS. LÊ LƯƠNG TỀ

Phản biện 2: PGS. TS. NGUYỄN THN HOÀI TRÂM Phản biện 3: GS. TS. NGUYỄN VĂN TUẤT

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Vào hồi …. giờ…. ngày….. tháng…… năm………..

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1. Thư viện Tạ Quang Bửu – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội 2. Thư Viện Quốc gia

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

<b>NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN </b>

<b>ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN </b>

1. <i>Lê Thiên Minh, Nguyễn Tiến Nam, Nguyễn Thùy Châu. (2010). Hiệu quả của chế </i>

<i>ph m Aspergillus flavus (AF) không sinh aflatoxin để phòng chống afltoxin trên lạc. Tạp chí Nơng nghiệp và Phát Triển Nơng thơn, (5/2010). pp (81-85). </i>

2. <i>Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu. (2010). Tác dụng của chủng A.flavus DA2 </i>

<i>không sinh và phịng chống aflatoxin trên ngơ ở giai đoạn ngồi đồng và trong q trình bảo quản. Tạp Chí Nơng nghiệp và Phát triển Nông thôn, (6/2010). pp </i>

(30-34)

3. Lê Thiên Minh, Nguyễn Hồng Hà, Nguyễn Thị Xuân Sâm, Nguyễn Thùy Châu.

<i>(2011). Nghiên cứu sản xuất chế ph m Aspergillus flavus khơng sinh aflatoxin để </i>

<i>phịng chống aflatoxin. Hội nghị Khoa học Toàn quốc về Cơ điện Nông nghiệp và </i>

Bảo quản Chế biến Nông sản, Thực phNm. NXB Khoa học và Kỹ thuật. (1/2011). pp.213-219.

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

<b>MỞ ĐẦU </b>

Aflatoxin là những chất chuyển hóa có độc tính cao, được sinh tổng hợp

<i>chủ yếu bới các loài nấm mốc Aspergillus. Các độc tố này tồn tại trong nông </i>

sản thực phNm, không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của thực phNm mà còn là một trong những nguyên nhân gây nên những căn bệnh nguy hiểm cho người và động vật như viêm gan cấp tính, ung thư gan, suy dinh dưỡng ở trẻ em.

Việc kiểm soát hàm lượng aflatoxin có mặt trong nơng sản thực phNm đã

được nghiên cứu từ rất lâu với nhiều biện pháp khác nhau, mỗi biện pháp đều

có những ưu nhược điểm nhất định nhưng chưa có biện pháp nào đạt được hiệu quả như mong đợi. Những năm gần đây, xu hướng sử dụng chính những chủng

<i>nấm đối kháng Aspergillus flavus khơng sinh độc tố có tính cạnh tranh cao làm </i>

tác nhân kiểm soát đang được phát triển và tỏ ra khá hiệu quả. Chế phNm nấm

<i>Aspergillus flavus đối kháng đã được nghiên cứu, ứng dụng và cấp bằng sáng </i>

chế, được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp ở một số quốc gia như Mỹ, Ấn

Độ, Trung Quốc...

Việt Nam nằm trong miền khí hậu nhiệt đới nóng, Nm là điều kiện rất thuận lợi cho các loài nấm mốc phát triển, xâm nhiễm vào cây trồng ngay từ giai đoạn canh tác, trong suốt quá trình bảo quản và chế biến nếu khơng có biện pháp

<i>kiểm soát nghiêm ngặt. Do đó, việc tạo lập một chế phNm nấm A. flavus đối </i>

kháng từ những chủng phân lập được trên các nguồn tự nhiên bản địa chắc chắn sẽ mang lại hiệu quả giảm thiểu sự nhiễm aflatoxin.

<b>Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu </b>

<i><b>tính đối kháng của Aspergillus flavus không sinh độc tố để phòng chống aflatoxin trên ngơ và lạc”, với các mục đích và nội dung nghiên cứu chính sau </b></i>

đây:

<b>Mục đích nghiên cứu </b>

<i>Kiểm soát sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc bằng chế phNm Aspergillus </i>

<i>flavus không sinh aflatoxin. </i>

<b>Nội dung nghiên cứu </b>

<i>1. Phân lập, tuyển chọn các chủng Aspergillus flavus khơng sinh aflatoxin có khả năng cạnh tranh cao và ổn định với các chủng A. flavus sinh aflatoxin. </i>

<i>2. Nghiên cứu quy trình ni cấy và tạo chế phNm bào tử từ chủng Aspergillus </i>

<i>flavus không sinh aflatoxin. </i>

<i>3. Nghiên cứu ứng dụng chế phNm Aspergillus flavus không sinh aflatoxin </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

nhằm giảm thiểu sự nhiễm aflatoxin trên ngô, lạc ở quy mơ phịng thí nghiệm và trên đồng ruộng.

<b>Những đóng góp mới của luận án </b>

1. Là cơng trình nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam sử dụng cơ chế cạnh tranh

<i>sinh học bằng chủng A. flavus không sinh aflatoxin trong kiểm sốt aflatoxin </i>

nhiễm trên ngơ và lạc.

2. Luận án nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để làm sáng tỏ bản chất

<i>sinh học phân tử của chủng A. flavus DA2 không sinh aflatoxin phân lập từ ngô (Việt Nam). Chủng A. flavus DA2 không mang 3 gen (ver, aflR và nor) trong </i>

cụm gen sinh tổng hợp aflatoxin.

3. Luận án đã nghiên cứu tạo được công nghệ nuôi cấy bề mặt cho sản xuất chế

<i>phNm bào tử chủng A. flavus DA2 đạt sản lượng cao (10</i>⁹CFU/g) với công nghệ

đơn giản, giá thành rẻ. Chế phNm có tác dụng giảm sự nhiễm nấm mốc và

aflatoxin trên ngô, lạc ở giai đoạn đồng ruộng và trong quá trình bảo quản từ 86,55% đến 97%, đảm bảo tính khả thi cao khi đưa ra ứng dụng ở quy mô lớn.<small> </small>

<b>Bố cục luận án </b>

Luận án gồm 124 trang, 35 bảng và 26 hình; Mục lục 3 trang; Mở đầu: 2 trang; Chương 1. Tổng quan tài liệu: 27 trang; Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 11 trang; chương 3. Kết quả và thảo luận: 51 trang; Kết luận và kiến nghị: 1 trang; Tài liệu tham khảo: 12 trang ( Bao gồm 11 tài liệu tiếng Việt, 129 tài liệu tiếng Anh); Phụ lục: 15 trang.

<b>CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ AFLATOXIN </b>

Aflatoxin là nhóm các hợp chất có nhân difuranocumarin, là sản phNm trao

<i>đổi chất chủ yếu của hai loài nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. </i>

Aflatoxin là các chất có khả năng gây ung thư, gây đột biến gen, là tác nhân làm giảm khả năng miễn dịch. Người có thể bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc bị nhiễm hoặc ăn thịt các động vật được nuôi bằng ngũ cốc bị nhiễm aflatoxin. Các nghiên cứu ở những vùng có tỷ lệ ung thư cao trên thế giới đều cho thấy nhiễm độc aflatoxin là nguy cơ chính gây ung thư gan.

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>1.2 PHÒNG CHỐNG SỰ NHIỄM AFLATOXIN </b>

Trên thực tế, đã có một số biện pháp kiểm soát aflatoxin được ứng dụng như: biện pháp canh tác nông nghiệp, biện pháp sau thu hoạch, phương pháp sinh học, sử dụng vi sinh vật đối kháng…

Việc sử dụng các chủng vi sinh vật đối kháng khơng có hại cho con người và thực phNm mà lại có khả năng giảm sự tạo độc tố hoặc ức chế hoàn toàn việc tạo độc tố là biện pháp lý tưởng. Các nghiên cứu của Dorner cho thấy, lạc đã bị

<i>nhiễm Aspergillus flavus và aflatoxin từ giai đoạn trước thu hoạch. Vì vậy, </i>

nhiều Quốc gia như Mỹ, Ấn Độ, Thái Lan, Nigeria đã có chiến lược phòng chống nhằm giảm tổn thất do aflatoxin gây nên trên lạc ở giai đoạn trước và sau

<i>thu hoạch. Việc sử dụng chủng A. flavus không sinh độc tố để ức chế các chủng </i>

<i>A. flavus sinh độc tố nhiễm trong đất trồng lạc theo cơ chế loại trừ cạnh tranh đã </i>

được thực hiện ở các nước này. Cơ quan bảo vệ môi trường của Mỹ đã cho

<i>phép đưa vào danh mục chủng Aspergillus flavus AF36 như là tác nhân sinh </i>

học an tồn để phịng chống aflatoxin trên ngô, lạc và bông. Chế phNm AF36

<i>sản xuất từ chủng A. flavus AF36 được công nhận là thuốc bảo vệ thực vật tích </i>

cực để giảm các aflatoxin trên ngơ, lạc và bông bằng việc cạnh tranh và thay thế

<i>chủng A. flavus sinh aflatoxin vốn nhiễm tự nhiên trên đất trồng ngô, lạc và bông. Chủng A. flavus AF36 chứa các gen mã hoá cho sự tạo aflatoxin bị đột </i>

biến và không thể hiện sự trao đổi vật chất di truyền với các chủng sinh aflatoxin.

<i>Sử dụng chủng nấm A.flavus không sinh độc tố phân lập được để kiểm soát </i>

aflatoxin là dự án quan trọng của Bộ Nông nghiệp Mỹ. Cách tiếp cận này đã

được chấp nhận ở Châu Phi và trở thành một hợp phần của dự án “đánh giá

mức độ nhiễm aflatoxin và can thiệp bằng cách sử dụng các biện pháp kiểm soát sinh học” được tài trợ bởi cơ quan phát triển Đức (BMZ).

<b>CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU </b>

- 55 mẫu ngô, 45 mẫu lạc và 140 mẫu đất được thu thập tại các tỉnh Nghệ An,

Đắc Nông, Vĩnh Phúc và Hà Nội

- Chuột nhắt trắng giống Swiss do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp - Mẫu ngô sạch của Viện Nghiên cứu ngô đã được kiểm tra không bị nhiễm độc tố aflatoxin.

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<b>2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU </b>

<i> Phân lập phân loại A.flavus không sinh độc tố theo Rapper Fennel; Sàng lọc và xác định khả năng cạnh tranh các chủng A.flavus không sinh aflatoxin </i>

theo phương pháp của Tanaka và công sự; Xác định sự có mặt của một số gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp aflatoxin theo phương pháp của Criseo và cộng sự; Xác định hàm lượng aflatoxin bằng TLC theo phương pháp của OAOC, phương pháp sắc ký lỏng cao áp theo tiêu chuNn Việt Nam TCVN 6953:2001.

<b>CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN </b>

<b>3.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CHỦ</b><i><b>NG A.FLAVUS KHÔNG SINH </b></i>

<b>AFLATOXIN LÀM CHỦNG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AF </b>

<b>3.1.1 Phân lập các chủ</b><i><b>ng Aspergillus flavus trên ngô, l</b></i><b>ạc </b>

Từ 100 mẫu ngô, lạc lấy ở một số địa điểm khác nhau, chúng tôi đã phân

<i>lập được 85 chủng nấm mốc có hình thái giống lồi A. flavus. Trong đó, ở Yên </i>

Thành, Nghệ An số chủng nấm mốc phân lập được trên số mẫu là 27/30, chiếm

<i>90%. Ở Cư’Mgar, Đắc Nông số lượng chủng nấm mốc A. flavus phân lập được </i>

trên số mẫu là 24/30, chiếm 80% và ở Yên Lạc, Vĩnh Phúc số lượng chủng nấm

<i>mốc A. flavus phân lập được trên số mẫu là 21/25, chiếm 84%. Tỷ lệ nhiễm mốc ở 15 mẫu ngô Đông Anh, Hà Nội là 86% và tỷ lệ nấm mốc A. flavus phân </i>

lập /tổng số mẫu trung bình là 85%. Kết quả trên cho thấy, các mẫu ngô, lạc ở

<i>các tỉnh được khảo sát đã bị nhiễm A. flavus với tần suất cao (80-90%) và khơng có sự chênh lệch đáng kể giữa các vùng. Như vậy, có thể nói rằng A. </i>

<i>flavus là lồi nấm mốc nhiễm chính trên ngơ và lạc ở Việt Nam. </i>

<b>3.1.2 Sàng lọc các chủ</b><i><b>ng Aspergillus flavus</b></i><b>không sinh aflatoxin </b>

<i>Theo một số tài liệu đã công bố không phải tất cả các chủng A. flavus đều </i>

sinh aflatoxin. Do vậy, để sàng lọc các chủng không sinh aflatoxin, từ 85 chủng

<i>A. flavus phân lập được ở trên tiến hành nuôi cấy trên môi trường ngô theo </i>

phương pháp của Tanaka và cộng sự. Sau 7 ngày nuôi cấy, mẫu được tách chiết và xác định hàm lượng aflatoxin B1 tạo thành bằng kỹ thuật sắc ký bản mỏng (TLC)

<i>Từ 85 chủng A. flavus phân lập đã sàng lọc được 21 chủng A. flavus không </i>

sinh aflatoxin sử dụng cho các thí nghiệm tiếp sau. Kết quả phân tích cũng chỉ

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

ra rằng 70,5% số chủng phân lập được có khả năng tạo aflatoxin dao động từ 80-600 ppb.

Dựa trên khả năng sinh aflatoxin và mức độ phát triển của các chủng

<i>A.flavus phân lập, 05 chủng A. flavus (DA1, DA2, AL21, AL22 và AL23) </i>

<i>không sinh aflatoxin và 01 chủng A. flavus AF14 sinh aflatoxin đã được chọn </i>

sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

<b>3.1.3 Khả năng cạnh tranh các chủ</b><i><b>ng A.flavus không sinh aflatoxin </b></i>

<i>Theo kết quả thu được ở trên, 05 chủng A. flavus (DA1, DA2, AL21, AL22 </i>

và AL23) sau khi được phân loại, sàng lọc bằng các khóa phân loại và xác định

<i>khơng sinh aflatoxin được đánh giá khả năng cạnh tranh với chủng A. flavus </i>

AF14 sinh aflatoxin thông qua sự giảm hàm lượng aflatoxin trên môi trường

<i>ngô. Chủng A. flavus AF14 sinh aflatoxin được nuôi hỗn hợp với từng chủng A. </i>

<i>flavus không sinh aflatoxin đã tuyển chọn theo tỉ lệ 1:1 (số bào tử của mỗi </i>

chủng là 1,5 x 10⁵CFU/g) trên cơ chất ngơ sạch khơng có aflatoxin ở nhiệt độ 28^oC, độ Nm 25% trong thời gian 7 ngày. Sau đó chiết xuất và phân tích hàm lượng aflatoxin được tạo thành.

<i><b>Hình 3.1 Sắc ký đồ thể hiện hàm lượng aflatoxin B1 của hỗn hợp các chủng A. </b></i>

<i>flavus nuôi cấy trên mơi trường ngơ </i>

<i>Hình 3.1 chỉ ra rằng, khi nuôi riêng chủng A. flavus AF14, sau 7 ngày nuôi </i>

cấy hàm lượng aflatoxin B1 là 600 ppb. Kết quả phân tích cũng cho thấy, các

<i>chủng A. flavus khơng sinh aflatoxin khảo sát đều thể hiện khả năng canh tranh </i>

làm giảm hàm lượng aflatoxin B1 của chủng AF14 với mức độ khác nhau, dao

<i>động từ 42-85%. Hiệu quả giảm khác nhau là do các chủng A. flavus DA2, A. flavus DA1, A. flavus AL21, A. flavus AL22, A. flavus AL23 có khả năng cạnh </i>

<i>tranh khác nhau đối với chủng A. flavus A14. Khi nuôi hỗn hợp chủng A. flavus </i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

<i>A14 và chủng A. flavus DA2 hàm lượng aflatoxin trong môi trường ngô giảm </i>

nhiều nhất, chỉ còn 90 ppb, hiệu quả giảm aflatoxin B1 là 85%.

<b>3.1.4 Sự có mặt một số gen thuộc cụm gen mã hóa cho các enzym tham gia vào quá trình sinh tổng hợp aflatoxin của chủ</b><i><b>ng A.flavus </b></i>

<b>DA2 </b>

<i>Chủng A. flavus DA2 được xác định là không sinh aflatoxin dựa trên các </i>

phương pháp ni cấy, phân tích bằng TLC, sắc ký lỏng cao áp HPLC và có

<i>khả năng cạnh tranh cao với chủng A. flavus AF14 sinh độc tố. Theo nhiều tài liệu nghiên cứu, các chủng A. flavus khơng sinh aflatoxin có thể do thiếu một số </i>

gen mã hóa cho các enzym trong q trình sinh tổng hợp aflatoxin hoặc vẫn có

đầy đủ các gen mã hóa cho q trình sinh tổng hợp aflatoxin nhưng không sinh độc tố do chúng bị đột biến gen. Để hiểu bản chất không sinh aflatoxin của

<i>chủng A. flavus DA2 phân lập được ở mức độ gen, kỹ thuật multiplex PCR đã </i>

được sử dụng để xác định sự thiếu hụt của 4 gen trong cụm gen sinh tổng hợp

<i>aflatoxin, đó là: aflR, nor, omt và ver. </i>

<i>Kết quả hình 3.2 cho thấy, trong khi chủng sinh độc tố A. flavus AF14 có </i>

<i>đầy đủ cả 4 gen cần thiết cho sự tạo aflatoxin thì chủng A. flavus DA2 chỉ có </i>

<i>gen omt. Ba gen mục tiêu aflR, ver và nor là các gen quan trọng mã hóa cho quá </i>

trình hình thành các sản phNm trung gian trong con đường sinh tổng hợp

<i>aflatoxin hoàn toàn khơng có. Trong đó, gen aflR là gen điều khiển và là nhân </i>

tố phiên mã quan trọng cho hầu hết các gen cấu trúc, kiểm sốt q trình sinh

<b>tổng hợp aflatoxin. Theo Criseo chủng này khơng có khả năng tạo aflatoxin vì </b>

<i>khơng có đầy đủ 4 gen aflR, nor, omt và ver là cụm gen đã được chứng minh là </i>

các gen chìa khóa cho sự tạo aflatoxin.

<i><b>Hình 3.2 Sản ph m multiplex PCR của chủng A. flavus DA2 và AF14 Chú thích: Line 1: A. flavus DA2; Line 2: A. flavus AF14; Line 3: Marker </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>3.1.5 Tính ổn định liên quan đến khả năng không sinh aflatoxin của chủ</b><i><b>ng A.flavus DA2 </b></i>

<i>Chủng A.flavus DA2 được nuôi trên môi trường ngô qua 15 thế hệ, sau mỗi </i>

5 thế hệ khả năng sinh aflatoxin đã được phân tích bằng TLC. Bên cạnh đó, sau

<i>mỗi 5 thế hệ, chủng A. flavus DA2 được chiết tách ADN và sử dụng kỹ thuật multiplex PCR để kiểm tra sự có mặt của các gen aflR, ver, omt và nor thuộc </i>

cụm gen mã hóa cho các enzym liên quan đến quá trình sinh tổng hợp aflatoxin. Sau 15 thế hệ khơng hề có vết của aflatoxin trên bản sắc ký. Kết quả PCR (hình 3.4) cũng chỉ ra rằng, sau khi cấy chuyền qua 15 thế hệ 3 gen mục tiêu

<i>aflR, verb và nor là các gen quan trọng mã hóa cho quá trình hình thành các sản </i>

phNm trung gian trong con đường sinh tổng hợp aflatoxin vẫn vắng mặt. Vì vậy,

<i>có thể khẳng định rằng chủng A. flavus DA2 ổn định về mặt di truyền. </i>

<i><b>Hình 3.3 Sắc ký đồ thể hiện khả năng sinh aflatoxin của chủng A.flavus DA2 </b></i>

<i>sau 5, 10 và 15 thế hệ </i>

<i><b><small>Chú thích: Chu n B1: Aflatoxin B1 chuNn; Mẫu 1: A.flavus DA2 thế hệ thứ 5; Mẫu 2: A.flavus DA2 thế hệ thứ 10; Mẫu 3: A.flavus DA2 thế hệ thứ 15. </small></b></i>

<i><b>Hình 3.4 Sự tồn tại của các gen aflR, ver, omt và nor của chủng A. flavus DA2 </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 12</span><div class="page_container" data-page="12">

<i><b><small>Chú thích: Line 1: Marker; Line 2: chủng A. flavus DA2 gốc; Line 3: Chủng A. flavus DA2 </small></b></i>

<i><b><small>sau cấy chuyền 5 thế hệ; Line 4: Chủng A. flavus DA2 sau cấy chuyền 10 thế hệ; Line 5: Chủng A. </small></b></i>

<i><small>flavus DA2 sau cấy chuyền 15 thế hệ. </small></i>

<b>3.1.6 Tính an tồn của chủ</b><i><b>ng A.flavus DA2 th</b></i><b>ử nghiệm trên động vật </b>

<i>Chủng A.flavus DA2 được thử độc tính trên chuột Swiss trắng có kết quả </i>

như sau: cho chuột uống hỗn dịch bột thuốc pha trong hồ tinh bột, với mức liều từ 10,0g – 30,0g mẫu thử/kg/ngày khơng nhận thấy biểu hiện gì khác thường, không nhận thấy biểu hiện ngộ độc trên chuột thí nghiệm trong thời gian theo dõi. Tất cả chuột đều ăn uống, hoạt động bình thường. Không xác đinh được liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD₅₀) vì khơng tìm được liều gây chết chuột. Chuột ở nhóm chứng và nhóm thử tăng trọng lượng cơ thể đều như nhau trong thời gian theo dõi.

<b>3.2 SẢN XUẤT CHẾ PHẨ</b><i><b>M A.FLAVUS DA2 </b></i>

<b>3.2.1 Xác định đường cong sinh trưởng </b>

<i>Thời gian nhân ni thích hợp cho thu hồi sinh khối chủng A. flavus DA2 </i>

là 48h, vì khi tiếp tục kéo dài thời gian nhân nuôi sẽ xảy ra hiện tượng thiếu dinh dưỡng và có bào tử trên thành bình ni cấy, sinh khối nấm mốc giảm.

<b>3.2.2 Sản xuất bào tử chủ</b><i><b>ng A.flavus DA2 b</b></i><b>ằng công nghệ nuôi cấy bề mặt </b>

<i>3.2.2.1 Lựa chọn môi trường thích hợp </i>

<i>Mơi trường thích hợp cho sự phát triển và sự tạo bào tử của chủng A. </i>

<i>flavus DA2 là môi trường MT1 (môi trường cám trấu). Ở môi trường này mật </i>

độ bào tử đạt 7,1x10<small>7</small>

CFU/g. Book và cộng sự đã nghiên cứu công nghệ sản

<i>xuất bào tử chủng Aspergillus flavus không sinh độc tố trên mơi trường hạt lúa </i>

mì, sau 7 ngày ni cấy ở nhiệt độ 31⁰C sản lượng bào tử đạt 4,9x10⁹CFU/g. Như vậy môi trường cám trấu cho mật độ bào tử thấp hơn mơi trường hạt lúa mì nhưng mơi trường cám trấu có giá thành rẻ hơn nhiều so với mơi trường hạt lúa mì và là nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt nam. Tận dụng được nguồn phế phụ

<i>phNm nông nghiệp khi ứng dụng sản xuất bào tử chủng A. flavus DA2 ở quy mơ </i>

pilot. Vì vậy, mơi trường này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

<i>3.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy </i>

<i>Chủng A. flavus DA2 có khả năng tạo bào tử cao nhất là 7,1</i>x10⁷CFU/g tại 30⁰C sau 7 ngày nuôi cấy. Theo Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, nhiệt độ thích

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

hợp với đa số nấm mốc là 30-32^oC. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của <i>Book và Cotty khi nuôi cấy A.flavus AF36 ở</i> nhiệt độ 31⁰C mật độ bào tử

đạt 4,9x10⁹CFU/g sau 7 ngày ni cấy. Kết quả thí nghiệm cho thấy, nhiệt độ

<i>thích hợp để ni cấy chủng A.flavus DA2 cho sự tạo bào tử là 30</i>⁰C.

<i>3.2.2.3 Ảnh hưởng của độẩm của môi trường. </i>

Khi tăng độ Nm môi trường nuôi từ 55% đến 65%, khả năng tạo bào tử của

<i>chủng A. flavus DA2 tăng dần và đạt giá trị cực đại là 7,1</i>x10⁷CFU/g khi độ Nm môi trường cám trấu là 65%. Ở các giá trị độ Nm môi trường cám trấu cao hơn,

<i>khả năng tạo bào tử của chủng A.flavus DA2 giảm dần. Kết quả này phù hợp </i>

với đặc điểm sinh lý chung của nấm mốc thường sinh trưởng và có hoạt tính sinh học tốt trên mơi trường rắn có độ Nm từ 60 – 65%.

<i>3.2.2.4 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy. </i>

<i>Mật độ bào tử chủng A.flavus DA2 nuôi cấy trên môi trường cám trấu tăng </i>

nhanh trong khoảng thời gian từ 4-8 ngày. Ngày thứ 9 mật độ bào tử đạt 2,0x10⁹CFU/g và đạt cao nhất ở ngày thứ 10, là 2,2x10⁹ CFU/g. Như vậy, thời

<i>gian nuôi cấy phù hợp cho sự tạo bào tử chủng A.flavus DA2 là 9 ngày. Nếu </i>

kéo dài thời gian nuôi cấy đến ngày thứ 10 thì sẽ làm tăng chi phí trong sản

<i>xuất, trong khi sản lượng bào tử A.flavus DA2 tăng lên không nhiều. </i>

<b>3.2.2 Sản xuất bào tử chủ</b><i><b>ng A.flavus DA2 </b></i><b>ở quy mô pilot </b>

<i>3.2.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến sản lượng bào tử chủng A. flavus DA2 </i>

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nấm mốc/nguyên liệu càng cao thì lượng bào tử tạo thành nhiều hơn ở giai đoạn sớm của q trình ni. Với tỷ lệ mốc ban đầu là 10% thì thu được lượng bào tử khi kết thúc q trình ni đạt 2,1x10⁹CFU/g. Tỷ lệ giống ban đầu là 5% mật độ bào tử thu được thấp hơn, chỉ

đạt 7,5x10⁸<i> CFU/g. Do vậy, tỷ lệ tiếp giống khi nuôi cấy bề mặt chủng A.flavus </i>

DA2 cho sản lượng bào tử cao là 10%.

<i>3.2.2.2 Ảnh hưởng của độ dày khối ủđến sản lượng bào tử của chủng A. flavus DA2 </i>

Kết quả nghiên cứu cho thấy, khối ủ có độ dày 6,0 cm cho mật độ bào tử lớn nhất đạt 2,1x10⁹cfu/g, các mẫu có độ dày khối ủ là 8 cm và10 cm có hệ sợi phát triển yếu hơn hẳn, chủ yếu chỉ mọc trên bề mặt khối mơi trường. Do đó, độ

<i><b>dày khối ủ khi nuôi cấy bề mặt chủng A. flavus DA2 là 6 cm. </b></i>

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

<b>3.2.3 Hoàn thiện chế phẩm AF từ chủ</b><i><b>ng A.flavus DA2 </b></i>

<i>3.2.3.1 Nghiên cứu lựa chọn chất mang </i>

<i>Mật độ bào tử của chủng A. flavus DA2 hầu như không giảm sau 6 tháng </i>

bảo quản và chỉ giảm nhẹ đối với các chất bảo quản là canxi alginate và than bùn, từ 1x10⁹CFU/g xuống còn 7x10⁸CFU/g và từ 1x10⁹CFU/g xuống còn 8x10⁸CFU/g, theo thứ tự sau 12 tháng bảo quản. Mật độ bào tử giảm mạnh ở chất mang là cám gạo, từ 1x10⁹CFU/g, xuống còn 1x10⁷CFU/g sau 6 tháng bảo quản và còn 1x 10⁵CFU/g sau 12 tháng bảo quản. Do giá thành chất mang canxi alginat đắt hơn than bùn nên chúng tôi chọn than bùn để làm chất bảo quản bào tử chủng A. flavus DA2.

<i>3.2.3.2 Quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm A.flavus DA2 quy mô pilot </i>

Từ các kết quả nghiên cứu thu nhận được, quy trình cơng nghệ nhân ni,

<i>thu hồi và tạo chế phNm A.flavus DA2 được đưa ra như sau: </i>

</div>