BÁO CÁO THỰC HÀNH KĨ THUẬT DI TRUYỀN

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (7.15 MB, 34 trang )

<span class="text_page_counter">Trang 1</span><div class="page_container" data-page="1">

<b>TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCMVIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 2</span><div class="page_container" data-page="2">

Bài 1: Phương pháp tách chiết Plasmid từ tế bào vi khuẩn...2 Bài 2 Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn (retriction enzyme)...7 Bài 3:Chuyển gene vào tế bào vi khuẩn bằng phương pháp shock nhiệt...11 Bài 4 Phương Pháp PCR khuẩn lạc xác định dòng tế bào vi khuẩn mang gene mục tiêu ...15

<b>Bài 1: Phương pháp tách chiết Plasmid từ tế bào vi khuẩn</b>

<b>I.Cơ sở lý thuyết1.Giới thiệu về E.coli</b>

Giới thiệu vi khuẩn E.coli Escherichia coli, còn được gọi là E. coli, là vi khuẩn coliform Gram âm, kỵ khí tùy nghi, hình que, thuộc chi Escherichia. Vi khuẩn thường gặp ở đoạn dưới ống tiêu hóa của các sinh vật máu nóng. Hầu hết các chủng E. coli đều vô hại, nhưng một số serotype như EPEC, ETEC, v.v. có thể gây ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng cho vật chủ và đôi khi là nguyên nhân gây ra các sự cố ô nhiễm thực phẩm khiến sản phẩm bị thu hồi. Hầu hết các chủng không gây bệnh cho người và là một phần của hệ vi sinh vật đường ruột bình thường; những chủng như vậy là vơ hại hoặc thậm chí có lợi cho con người.

<b>Cấu tạo của vi khuẩn E.Coli:</b>

Bộ gen của vi khuẩn E.coli Trình tự DNA hồn chỉnh đầu tiên của bộ gen E. coli (chủng K-12 dẫn xuất MG1655 trong phịng thí nghiệm) được cơng bố vào năm 1997. Đó là phân tử DNA dạng vịng dài 4,6 triệu cặp base, chứa 4288 gen mã hóa

2

</div><span class="text_page_counter">Trang 3</span><div class="page_container" data-page="3">

protein (nằm trong 2584 operon), 7 operon RNA ribosome (rRNA) và 86 gen RNA vận chuyển (tRNA). Mặc dù bộ gen E. coli được phân tích di truyền chuyên sâu trong khoảng 40 năm, tuy nhiên nhiều gen trong số này chưa được biết đến. Mật độ mã hóa rất cao, với khoảng cách trung bình giữa các gen chỉ là 118 cặp base. Bộ gen có chứa một số lượng đáng kể gen nhảy, vùng lặp lại, thể tiền thực khuẩn (prophage) và tàn tích của thể thực khuẩn.

<b>2. Các bước tách chiết Plasmid từ sinh khối vi khuẩn sử dụng cột silica spin </b>

<b>II. Tiến hành thí nghiệm</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 4</span><div class="page_container" data-page="4">

- Ly tâm thu sinh khối bỏ dịch nổi: loại bỏ hết môi trường bám lên khuẩn, hạn chế trường hợp các tế bào vi sinh vật vẫn có thể sinh trưởng khi eppendof vẫn chưa đạt đủ nhiệt độ -80℃

- Bổ sung CaCl2: ion Ca<small>2+</small> giúp màng tế bào co giãn, tạo khả năng biến nạp cho tế bào.

- Bảo quản lạnh, giúp giữ giống trong gycerol vì glycerol sẽ khơng tạo các tinh thể băng làm phá hủy tế bào ở nhiệt độ -80℃

<b>3. Tách chiết Plasmid từ sinh khối vi khuẩn </b>

Sử dụng Bộ kit TracePure <small>TM</small> KIT tách chiết DNA plasmid

</div><span class="text_page_counter">Trang 5</span><div class="page_container" data-page="5">

- Chuẩn bị bản gel agarose có nồng độ 1%.

- Tiến hành nạp 5 µl l dung dịch DNA plasmid vào gel. - Điện di DNA plasmid ở 100 voltage trong 30 phút.

- Quan sát xác định band DNA plasmid, xác định chất lượng và kích thước của DNA plasmid.

5

</div><span class="text_page_counter">Trang 6</span><div class="page_container" data-page="6">

<b>-Dựa vào hình ảnh điện di có thể xác định rằng trong tế bào của vi khuẩn BL21 và</b>

DH5

α đều đã được tách chiết thành cơng. Và có thể xác định rằng Plasmidcủa vi khuẩn BL21 có kích thước lớn hơn 10000bp so với thang chuẩn,Plasmid của vi khuẩn

DH5

α có kích thước khoảng 7000bp so với thang chuẩn.

</div><span class="text_page_counter">Trang 7</span><div class="page_container" data-page="7">

<b>Bài 2 Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn (retriction enzyme) </b>

<b>I.Cơ sở lí thuyết</b>

- Emzym cắt giới hạn (restriction enzyme-RE) là emzym cắt DNA tại vị trị nhận biết đặc hiệu để tạo đầu bằng (blunt end) hoặc đầu dính (sticky end)

- Thơng thường, quy trình subcloning u cầu sử dụng 1-2 RE cắt ngay bên ngồi đoạn chèn mà khơng cắt trong chính đoạn chèn. Các RE, có một vị trí nhận biết trong vùng đa điểm tạo dịng (multi cloning sites-MCS), thường được chọn sử dụng khi chúng không cắt vị trí khác trong DNA vector và thường tạo ra hai phân đoạn dễ tách biệt.

- Gene mục tiêu được tạo dòng vào một vector với mục tiêu nâng cao hiệu quả biểu hiện thành protein hoặc giúp sàng lọc gene. Trong những trường hợp này, gene mục tiêu cần phải được gắn chèn vào đúng hướng và nằm trong khung đọc với promoter phiên mã

Hình. Các dạng đầu cắt của emzyme cắt giới hạn

- Plasmid pET -11a

- Sử dụng RE: EcoRI (5675bp) GAATTC

</div><span class="text_page_counter">Trang 8</span><div class="page_container" data-page="8">

<b>Thực hiện phản ứng cắt plasmid DNA với 2 enzyme cắt giới hạnCắt đồng thời với hai enzyme:</b>

Chuẩn bị phản ứng với các thành phần theo bảng sau:

<b>Điện di kiểm tra kết quả cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 9</span><div class="page_container" data-page="9">

Dựa vào hình ảnh chạy điện di gel ta thấy được rằng các đoạn Plasmid đã được cắt bằng Enzyme cắt giới hạn đều chạy chậm hơn so với các đoạn Plasmid không bị cắt bởi các Enzyme cắt giới hạn.

Nguyên nhân là khi các Plasmid có cấu trúc dạng vòng đứt (các DNA bị cắt bởi Enzyme cắt giới hạn) mặc dù có cùng chiều dài và khối lượng với các Plasmid có cấu trúc siêu trúc (các DNA chưa bị cắt bởi Enzyme cắt giới hạn) nhưng lại có hình dạng lớn hơn trong gian ba chiều, điều này dẫn đến việc chúng cần nhiều thời gian hơn để có thể đi qua các lỗ gel.

<b>Bài 3:Chuyển gene vào tế bào vi khuẩn bằng phương pháp shock nhiệt</b>

</div><span class="text_page_counter">Trang 10</span><div class="page_container" data-page="10">

Qúa trình tạo dịng tế bào biến nạp

<small>Vecor trong tế bào vi khuẩn biểu hiện đoạn </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 11</span><div class="page_container" data-page="11">

<b>3.Quy trình chuyển gene vào tế bào vi khuẩn khả nạp bằng phương pháp shock nhiệt:</b> Bổ sung 1 ml dung dịch CaCl2 100

mM lạnh vào eppendorf (chứa sinh

</div><span class="text_page_counter">Trang 13</span><div class="page_container" data-page="13">

Sau 2 ngày cấy Các đĩa mà nhóm thực hiện:

13

</div><span class="text_page_counter">Trang 14</span><div class="page_container" data-page="14">

Từ hình ảnh đĩa control được quan sát ở các mốc thời gian khác nhau ta có thể đưa ra các giả thuyết:

Gỉa thuyết 1: ampicillin có thể đã không được bảo quản đúng cách hoặc không được pha đúng cách dẫn đến các tế bào vi khuẩn trong đĩa control dù không mang gene kháng kháng sinh nhưng vẫn có thể tồn tại và phát triển được trong mơi trường có ampicillin.

Gỉa thuyết 2: dịng tế bào được sử dụng đã có mặt từ rất lâu trong phịng thí nghiệm, nên có thể các tế bào đã được tiếp xúc với 1 lượng ampicillin nhất định hoặc với đoạn gene kháng kháng sinh và sống sót, các tế bào sống sót đó truyền lại gene kháng kháng sinh cho các thế hệ tiếp theo.

14

</div><span class="text_page_counter">Trang 15</span><div class="page_container" data-page="15">

<b>Bài 4 Phương Pháp PCR khuẩn lạc xác định dòng tế bào vi khuẩnmang gene mục tiêu</b>

- Với mỗi ống phản ứng đã chuẩn bị, dùng que cấy thẳng đã khử trùng lấy một lượng nhỏ sinh khối vi khuẩn và hoà đều vào dung dịch phản ứng.

- Vortex và spindown nhanh tất cả các ống phản ứng.

<b>3.2. Quy trình nhiệt của phản ứng colony PCR </b>

- Quy trình nhiệt của phản ứng colony PCR được cài đặt gồm các bước nhiệt với thời gian theo bảng sau:

Các bước nhiệt Thời gian Số lần lặp lại

15

<small>Chọn khuẩn </small>

<small>Hòa tan khuẩn lạc với H2O các loại mồi </small>

<small>Chạy PCR và điện di gel Lưu trữ khuẩn </small>

</div><span class="text_page_counter">Trang 16</span><div class="page_container" data-page="16">

<b>3.3. Điện di kiểm tra kết quả phản ứng colony PCR </b>

- Chuẩn bị bản gel agarose có nồng độ 1.5%.

- Tiến hành nạp 10 µl sản phẩm phản ứng colony PCR vào gel. - Điện di sản phẩm cắt ở 100 voltage trong 30 phút.

- Quan sát xác định band sản phẩm PCR và so sánh với marker để xác định kích thước.

<b>4. Báo cáo thực hành </b>

Kết quả chạy PCR và điện di gel:

16

</div><span class="text_page_counter">Trang 17</span><div class="page_container" data-page="17">

<b>Kết luận:</b>

-Từ kết điện di gel có thể kết luận rằng các tế bào được nuôi cấy trên các đĩa Petri có chứa ampicillin đều khơng chứa đoạn gene mục tiêu vì trên bảng điện di tất cả các giếng có chứa mẫu tương ứng là 1,2,3,4,5,6,7,8,10,11,12 đều khơng cho ra band giống với giếng chứa mẫu control. Và tất cả đều khơng xuất hiện bất kì band nào. Cịn các band nằm ngay miệng giếng chính là các Plasmid của chính vi khuẩn và có kích thước lớn hơn rất nhiều nên không thể di chuyển qua các lỗ gel và bị mắc kẹt lại.

<b>Phần thực hiện trên phần mềm Snap Gene.</b>

Sinh viện thực hiện: Nguyễn Quốc Duy-21137561 Lớp: DHSH17B

Phần 1: Tạo vector tái tổ hợp

Vector được chọn: pRL-null bởi vì có vùng multiple cloning site [1]. Restriction enzyme: NdeI dùng chi mồi xuôi và SpeI dùng cho mồi ngược.

</div><span class="text_page_counter">Trang 18</span><div class="page_container" data-page="18">

Enzyme pRL-null

Trình tự mồi xi:TCACATATGGGCAAGATTGCA Trình tự mồi ngược: CTGACTAGTTCACCACTCCCG

Chú thích: trình tự của enzyme cắt giới hạn các trình tự đánh dấu mồi

Lý do chọn Ndel cho mồi xuôi là vì có trình tự giống với đầu của đoạn gen, vị trí cắt khơng cắt vào các trình tự thuộc đoạn gen  từ đó làm giảm trình tự đoạn mồi xi  giảm nhiệt độ nóng chảy của mồi  rút ngắn chênh lệch nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược.

</div><span class="text_page_counter">Trang 19</span><div class="page_container" data-page="19">

Qúa trình PCR đoạn gen và sau đó chuyển vào vector tạo ra vector tái tổ hợp Phần 2: Phân tích sản phẩm

Giếng 1: vector tái tổ hợp ngun vẹn (DNA mạch vịng đóng dạng siêu xoắn) Giếng 2: vector được cắt bởi enzyme AbsI (DNA mạch vòng đứt)

Giếng 3: vector được cắt bởi enzyme AbsI + BspQI ( DNA mạch thẳng)

19

</div><span class="text_page_counter">Trang 20</span><div class="page_container" data-page="20">

Nồng độ agarose 1%

Nồng độ agarose 1,5%

Nồng độ agarose 2%

Giải thích cho việc có sự khác biệt giữa cúa các giếng trong các nồng độ argarose khác nhau. DNA dạng siêu xoắn trong khơng gian sẽ có diện tích bề mặt nhỏ so với DNA mạch thẳng

20

</div><span class="text_page_counter">Trang 21</span><div class="page_container" data-page="21">

hoặc DNA vịng đứt nhưng đồng thời có độ linh hoạt kém nhất. Khi nồng độ agarose là 1% DNA siêu xoắn nhỏ hơn so với DNA vòng đứt và DNA mạch thẳng(phần lớn) nên sẽ đi nhanh hơn, chậm hơn DNA mạch thẳng( phần nhỏ) có kích thước và khối lượng nhỏ nhất. DNA vịng đứt có khối lượng, kích thước lớn nhất và có độ linh hoạt kém hơn mạch thẳng nên sẽ đi chậm nhất.Khi nồng độ agarose là 1,5% lúc này các lỗ gel đã nhỏ hơn nên DNA siêu xoắn cần nhiều thời gian để đi qua các lỗ gel vì độ linh hoạt kém, kích thước và khối lượng lớn hơn DNA mạch thẳng. Ở nồng độ agarose 2% DNA siêu xoắn di chuyển ngắn nhất vì khối lượng lớn, độ linh hoạt kém và kích thước có thể là chỉ nhỏ hơn lỗ gel 1 chút.

So sánh:

Khối lượng: DNA siêu xoắn = DNA vòng đứt > DNA mạch thẳng.

Độ linh hoạt ( khả năng thay đổi hình dạng): DNA mạch thẳng > DNA vịng đứt > DNA siêu xoắn.

Kích thước trong khơng gian 3 chiều: DNA vòng đứt > DNA mạch thẳng > DNA siêu xoắn. Tài liệu tham khảo:

[1] Ajay Kumar, Vishant Mahendra Boradia, Apurwa Mahajan, S. Kumaran, Manoj Raje, Chaaya Iyengar Raje(2023), “Mycobacterium tuberculosis H37Rv enolase (Rv1023)- expression, characterization and effect of host dependent modifications on protein

<i>functionality”, Biochimie Volume 214, Part B, November 2023, Pages 102-113</i>

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trọng Phúc-21088391 Lớp: DHSH17A

<b>Tạo vector tái tổ hợp:</b>

RE: BAMHI + TspMI Vector: pGEX-4T

Trình tự mồi xi: TAA GCA GGA TCC ATG GGC AAG ATT GCA

21

</div><span class="text_page_counter">Trang 22</span><div class="page_container" data-page="22">

Trình tự mồi ngược: TAA GCA CCC GGG TCA CCA CTC CCG AAT

Q trình PCR đoạn gene và sau đó chuyển vào Vector tạo ra vector tái tổ hợp + Giếng số 1: sản phẩm không cắt

+ Giếng số 2: sản phẩm cắt bởi enzyme BamHI

+ Giếng số 3: sản phẩm được cắt bởi enzyme BamHI và TspMI Gel từ 0,5-1%

Ở nồng độ này thì giếng số 2 chạy nhanh nhất tiếp theo là giếng số 3 và cuối cùng là giếng số 1 chạy chậm nhất.

22

</div><span class="text_page_counter">Trang 24</span><div class="page_container" data-page="24">

 Giếng số 1 chạy nhanh nhất dần dần tới giếng 2 và 1 Gel có nồng độ từ 3,5-4%

<b>KẾT LUẬN: </b>

Ở giếng đầu DNA ở dạng vòng chạy nhanh hơn so với giếng 2. Giữa DNA có dạng mạch vịng và DNA mạch thẳng có sự khác biệt khi di chuyển là do DNA plasmid dạng thẳng thường di chuyển nhanh hơn dạng vòng. Ta nhận biết dạng thẳng trên gel agarose bằng cách so sánh plasmid chưa cắt với plasmid dạng thẳng đã cắt bởi enzyme giới hạn. Khi đã gắn 1 trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn thì vector đã thay đổi hình dạng từ vịng sang thẳng.

24

</div><span class="text_page_counter">Trang 25</span><div class="page_container" data-page="25">

Sinh viên thực hiện: Đặng Thị Huyền Ngân_21094021

- Ezyme cắt giới hạn : EcoRI + TspMI

<b>b) Tạo mồi - Trình tự nhân biết Enzyme cắt giới hạn:</b>

- Mồi xi - Trình tự EcoRI:

- Mồi ngược - Trình tự TspMI:

25

</div><span class="text_page_counter">Trang 26</span><div class="page_container" data-page="26">

</div><span class="text_page_counter">Trang 27</span><div class="page_container" data-page="27">

<i>Tiến hành Cloning</i>

27

</div><span class="text_page_counter">Trang 28</span><div class="page_container" data-page="28">

<i>Sản phẩm Cloned</i>

<b>1. Điện di vector tái tổ hợp (PAG-S1) trên gel agarose 1%</b>

- giếng 1: ko cắt bởi R/E

- giếng 2: cắt bởi 1 enzyme EcoRI

- giếng 3: cắt bởi 2 enzyme EcoRI + TspMI

28

</div><span class="text_page_counter">Trang 29</span><div class="page_container" data-page="29">

Kết luận:

- Giếng 1 không bị cắt bởi Enz nào nên giữ được cấu trúc nguyên vẹn của đoạn DNA tái tổ hợp => Tạo cấu trúc siêu xoắn

- Giếng 2 bị cắt bởi 1 enzyme nên cấu trúc trở nên tháo xoắn => Tạo cấu trúc dạng vịng, cấu trúc này có xu hướng di chuyến chậm nhất trên gel so với dạng siêu xoắn.

- Giếng 3 bị cắt bởi 2 enzyme nên hình thành 2 sợi plasmid +plasmid dạng thẳng: (3143bp)

+plasmid dạng sợi đơn: (1153bp)

=> Sợi có kích thước nhỏ hơn sẽ đi nhanh hơn trên gel

29

</div><span class="text_page_counter">Trang 30</span><div class="page_container" data-page="30">

<i>Nồng độ agarose 0.5%Nồng độ agarose 2%</i>

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Minh Đức-21111641 Lớp: DHSH17B

30

</div><span class="text_page_counter">Trang 31</span><div class="page_container" data-page="31">

NGUOC (enzyme BssHII) TAAGCAGCATGCTCACCACTCCCGAATCTCC 31-mer 55% GC 9345.1 Da Binds at: 1128 <- 1146

Xuoi (enzyme SphI) TAAGCAGCGCGCATGGGCAAGATTGCAT28-mer 54% GC 8662.7 Da Binds at: 1 -> 16

31

</div><span class="text_page_counter">Trang 32</span><div class="page_container" data-page="32">

Sinh viên thực hiện: Trần Tiểu My-21087211 Lớp: DHSH17A

Trình tự mồi xi: TAAGCACCCWGGGATGGGCAAGATTGCATC Trình tự mồi ngược: TAAGCAGGATCCTCACCACTCCCGAATCT

32

</div><span class="text_page_counter">Trang 33</span><div class="page_container" data-page="33">

Qúa trình PCR đoạn gen và chuyển vào vector => tạo ra vector tái tổ hợp

Giếng 1 chứa vector chưa chỉnh sửa. Giếng 2 chứa vector cắt bởi enzyme Ecori

Giếng 3 chứa vector cắt bởi 2 enzyme Ecori và BamHI

33

</div><span class="text_page_counter">Trang 34</span><div class="page_container" data-page="34">

Giếng 1: không bị cắt bởi Enzyme => giữ cấu trúc nguyên vẹn đoạn DNA tái tổ hợp và tạo cấu trúc siêu xoắn

Giếng 2: cắt bởi enzyme nên cấu trúc trở nên tháo xoắn và trở thành cấu trúc dạng sợi mạch đôi => di chuyến chậm nhất trên gel so với dạng siêu xoắn.

Giếng 3: cắt bởi 2 enzyme tạo thành 2 chuỗi => kích thước sợi nhỏ hơn, di nhanh trên gel

34

</div>