分类号： 密级：
UDC ： 编号：2016130002

博士学位论文

象-猪异种克隆胚胎鉴定及体内外发育的研究

In vitro and in vivo development and identification of
elephant-Pig interspcecies reconstructed embryoes

博 士 研 究 生 ：NGUYEN TIEN DAT

指 导 教 师 ：魏红江教授

申 请 学 位 类 别 ：农学博士

专 业 ：动物遗传育种与繁殖

研 究 方 向 ：遗传标记与动物育种

培 养 学 院 ：动物科学技术学院

二 O 二二年五月

TCLC: Secrecy:
UDC : No.:2016130002

Yunnan Agricultural University
Ph.D. Dissertation

In vitro and in vivo development and identification of

elephant-Pig interspcecies reconstructed embryos

Ph.D. Candidate ：Nguyen Tien Dat
Advisor ：Prof. Wei Hongjiang
Major ：Animal Genetics, Breeding and
Reproduction
Specialty ：Genetic markers and animal
breeding

Yunnan Agricultural University
May 2022


目 录

目 录 ............................................................ I

摘要............................................................ IV

ABSTRACT ........................................................ VI

表题一览 ........................................................ IX

图题一览 ......................................................... X

英文缩略表 ...................................................... XI

第一章文献综述 ................................................... 1

1.1 异种体细胞核移植 ............................................ 1

1.1.1 体细胞核移植 (SCNT) ..................................... 1
1.1.2 异种体细胞核移植（iSCNT） ............................... 2

1.2 近年来 ISCNT 胚胎发育研究的成就 .............................. 4
1.3 影响 ISCNT 克隆效果的因素 .................................... 9

1.3.1 核重编程 ................................................ 9
1.3.1.1 受体卵质核移植中的供体核重塑 ....................... 10
1.3.1.2 胚胎基因组激活 ...................................... 11
1.3.1.3 组蛋白甲基化 ........................................ 11
1.3.1.4 组蛋白乙酰化 ........................................ 13
1.3.1.5 DNA 甲基化 .......................................... 15

1.3.2 线粒体/基因组 DNA 不相容 ............................... 16
1.3.3 供体核转录的沉默 ....................................... 18
1.3.4 母系遗传的 mRNA 破坏 ................................... 18
1.3.5 RNA 聚合酶 II 活性 ...................................... 19
1.3.6 多能性基因的表达 ....................................... 19
1.4. 克隆猛犸象 ................................................ 20
1.4.1 猛犸象 ................................................. 20
1.4.2. 猛犸象的复活—伟大的梦想 .............................. 22
1.5 猪卵母细胞的选择 ........................................... 24
1.6 胚胎的体外生产 ............................................. 26
1.6.1 卵母细胞的体外成熟 ..................................... 27
1.6.2 体细胞核移植技术 ....................................... 28

I

1.6.3 体外培养 ............................................... 30


第二章亚洲象成纤维细胞系的建立及卵母细胞的体外成熟培养 .......... 32

2.1 实验材料 ................................................... 34
2.1.1 实验仪器及耗材 ......................................... 34
2.1.2 主要实验材料和试剂 ..................................... 35
2.1.3 常用溶液配制 ........................................... 35
2.1.4 软件 ................................................... 38

2.2 实验方法 ................................................... 39
2.2.1 象耳和脐带组织的采集 ................................... 39
2.2.2 象耳和脐带组织的成纤维细胞原代培养 ..................... 39
2.2.3 象耳和脐带组织的成纤维细胞传代培养 ..................... 39
2.2.4 象耳和脐带组织的成纤维细胞冻存 ......................... 40
2.2.5 象耳和脐带组织的成纤维细胞复苏 ......................... 40
2.2.6 象耳成纤维细胞生长曲线的绘制 ........................... 40
2.2.7 成纤维细胞周期检测 ..................................... 40
2.2.8 亚洲象孤雌胚胎体外培养发育 ............................. 41
2.2.8.1 亚洲象卵巢收集 ..................................... 41
2.2.8.2 亚洲象卵母细胞体外培养 ............................. 41
2.2.8.3 亚洲象成熟卵母细胞孤雌激活与培养 ................... 41

2.3 结果分析 ................................................... 41
2.3.1 亚洲象成纤维细胞的建立 ................................. 41
2.3.2 象供体细胞培养形态 ..................................... 43
2.3.3 象成纤维细胞周期的检测 ................................. 43
2.3.4 生长曲线 .............................................. 44
2.3.5 象成纤维细胞直径 ....................................... 45
2.3.6 象卵丘-卵母细胞体外培养 ................................ 46
2.3.7 亚洲象孤雌胚胎体外培养 ................................. 47


2.4 讨论 ....................................................... 48

第三章象-猪异种克隆胚胎的鉴定及体外内发育研究 ................... 51

3.1 实验材料 ................................................... 53
3.1.1 主要实验仪器 ........................................... 53
3.1.2 主要实验材料和试剂 ..................................... 53
3.1.3 常用溶液配制 ........................................... 54
3.1.4 引物 ................................................... 55

II

3.1.5 软件 ................................................... 55
3.2 象-猪异种克隆胚胎构建、胚胎移植及胎儿获得 .................. 55

3.2.1 猪卵母细胞体外培养 ..................................... 55
3.2.2 成熟卵母细胞的去核及体细胞核移植 ....................... 56
3.2.3 重构胚融合与激活 ....................................... 57
3.2.4 胚胎移植 ............................................... 57
3.3 象-猪异种克隆体外培养胚胎鉴定 .............................. 58
3.3.1 异种克隆胚胎样品采集级处理 ............................. 58
3.3.2 异种克隆胚胎的分子鉴定 ................................. 58
3.4 象-猪异种克隆胎儿鉴定 ...................................... 59
3.4.1 胎儿采集胎儿形态学观察，测量及处理 ..................... 59
3.4.2 胎儿 DNA 提取及分子鉴定 ................................. 59

3.4.2.1 酚仿法提取胎儿基因组 DNA ............................ 59
3.4.2.2 胎儿分子鉴定 ....................................... 59
3.5 结果分析 ................................................... 60
3.5.1 iSCNT 胚胎的体外发育 ................................... 60

3.5.2 iSCNT 胚胎的分子鉴定 ................................... 61
3.5.3 iSCNT 胎儿的产生和鉴定 ................................. 65
3.6 讨论 ....................................................... 66
第四章 结论与展望 ............................................... 70
4.1 结论 ....................................................... 70
4.2 展望 ....................................................... 70
参考文献 ........................................................ 71
致谢............................................................ 86
攻读学位期间发表学术论文、出版著作、技术专利和获奖情况 .......... 88
学习过程 ....................................................... 88
发表论文 ....................................................... 88

III

摘要

珍稀濒危野生动物遗传资源面临着逐渐灭绝是当今世界面临的重大难题。目前
活体保种是物种遗传资源保存的主要方式，然而其面临着保种成本高、风险大等困
境。通过冷冻体细胞、生殖细胞、DNA 样品等遗传物质是实现物种长久保存的重要
途径。科学家提出了利用辅助生殖技术来帮助保护野生动物物种的遗传资源免于灭
绝，其中体细胞克隆是最有效的关键技术之一。象是世界自然保护联盟列出的濒危
物种之一，也是中国一级野生保护动物，境内现仅存 300 余头。利用活体保种并结
合现代生物学技术实现其遗传资源的长久保存刻不容缓。复活“猛犸象”是国际遗传
学家共同关心的话题，即是如何实现通过冷冻的体细胞、生殖细胞、DNA 样品等遗
传物质，实现“猛犸象”的成功复活。

本研究旨在通过建立亚洲象不同组织的成纤维细胞系和探索大象卵母细胞的体
外成熟培养，并通过体细胞核移植技术开展象-猪异种克隆的研究，以期为濒危珍稀
动物的保护和扩繁提供理论基础。


1. 亚洲象成纤维细胞系的建立及卵母细胞的体外成熟培养

成功建立了成活（6 岁）和死亡（2 岁）亚洲象的耳组织成纤维细胞系及初生
亚洲象脐带组织成纤维细胞系。亚洲象成纤维细胞培养过程中，细胞生长较快，粘
附在培养皿底部，胰蛋白酶消化未出现异常。细胞形态呈明显的梭形，生长状态显
示，继代培养 3 天后原代成纤维细胞达到汇合，成纤维细胞密度持续增加至第 6 天，
培养 6 天后成纤维细胞密度下降，细胞的生长曲线均为典型的“S”形。此外，象成纤
维细胞的直径明显大于猪成纤维细胞（p<0.05）。最后，我们对上述三种来源的细
胞各冻存。另外，我们采集了 2 岁死后 18 小时的亚洲母象的 2 个卵巢，大小分别
为长 5.7cm、宽 4.5cm 和长 5.3cm、宽 4.4cm。通过实验室自行研发的刀切过滤法，
共获得了 250 个卵丘-卵母细胞复合体，对其 48h 的体外成熟培养，然后去除包裹
在卵母细胞外围的卵丘细胞，其中 9 个卵母细胞排出第一极体。因亚洲象的卵母细
胞来之不易，我们去除了死亡明显、细胞质碎裂的 30 个卵母细胞，对剩余 220 个
进行了体细胞克隆和孤雌激活，并放入胚胎培养液中进行了 9 天的体外培养，其中
卵裂的卵母细胞有 3 个。

IV

2. 象-猪异种克隆胚胎的鉴定及体内外发育
以猪卵母细胞受体，开展了象-猪异种克隆胚胎的构建，并评估了重构胚胎的

体外和体内发育。我们先后共构建了 7780 个象-猪异种克隆胚胎，其体外发育时的
卵裂率、4 细胞率、8 细胞率、囊胚率分别为 73.0±1.6%、30.5±1.8%、5.6±0.5%、
4.7±1.0%，其囊胚细胞总数为 38.7±9.8 个，囊胚细胞直径为 252.8±10.8μm。通过
象特异性基因 EDNRB、AGRP 和 TYR 设计 PCR 引物，通过 PCR 技术检测了 235 枚
象-猪异种克隆胚中象的基因。结果表明，在象-猪克隆胚发育的 1 细胞期、2 细胞
期、4 细胞期、8 细胞期、囊胚期，能检测到亚洲象基因组存在的比例分别 53.2%、
60.8%、60.8%、32.3% 和 32.7%，表明亚洲象体细胞能有效参与象-猪异种克隆胚
的发育。此外，我们进一步评估了象-猪异种克隆胚胎的体内发育，并将 2260 个重
建胚胎移植到 2 头代孕母猪体内，2 头均怀孕，分别在妊娠 17 天和 19 天后手术分

别获得了 1 个和 10 个胎儿。经鉴定，获得的 11 个胎儿中没有一个包含象基因组，
这表明象-猪胚胎未能在体内发育。

综上所述，我们首次成功获得了象-猪异种克隆胚，这些胚胎能够发育成囊胚，
为象-猪异种克隆体系的建立及珍稀物种遗传资源的保护提供了重要的技术支撑。

关键词：亚洲象；猪；成纤维细胞；卵母细胞；异种克隆

V

Abstract

The gradual extinction of rare and endangered wildlife genetic resources is the
major problem of the world today. Recently, live seed preservation/in vivo conservation
is the main way to preserve species genetic resources, but high cost of seed preservation
and great risk are the major barriers in conservation. Freezing the genetic material such
as somatic cells, germ cells, and DNA samples is an important way to achieve long-term
preservation of species. Scientists have proposed the use of assisted reproductive
technologies to protect the genetic resources of wild animal species from extinction and
somatic cloning is considered as one of the most effective key technology.Elephant is
categorized as an endangered species by the International Union for Conservation of
Nature and is also a first-class wild protected animal in China, with only about 300
remaining animals in the territory. It was urgent to achieve the long-term preservation of
their genetic resources through the use of live seed preservation in combination with
modern biological techniques. The resurrection of "mammoths" is a topic of common
concern among international geneticists, that is, how to achieve the successful
resurrection of "mammoths" through frozen somatic cells, germ cells, DNA samples and
other genetic material.

This study aimed to establish Asian elephant fibroblast cell lines from different

tissues and the in vitro maturation culture for elephant oocytes, and to construct the
elephant-pig interspecies somatic cell cloning through somatic cell nuclear transfer
technology which can provide a theoretical basis for the protection and propagation of
endangered rare animals.
1. Establishment of Asian elephant fibroblast cell line and in vitro maturation of
oocytes
The ear tissue fibroblast cell lines of live (6 years old) and dead (2 years old) Asian
elephants and the umbilical cord tissue fibroblast cell lines of newborn Asian elephants
were successfully established. During the culture of Asian elephant fibroblasts, the cells
grew rapidly and adhered to the bottom of the petri dish, and no abnormality was
observed upon trypsinization. The cell morphology was obviously spindle-shaped, and
the growth state showed that the primary fibroblasts reached confluence after 3 days of
subculture, and the fibroblast density continued to increase until the 6th day, after 6 days
of culture, the fibroblast density decreased, and the cell growth curves were all for the

VI

typical "S" shape. In addition, the diameter of fibroblasts was significantly larger than
that of porcine fibroblasts (p<0.05). Finally, we cryopreserved elephant fibroblast cells
from the above three sources. Furthermore, we collected both ovaries of an Asian
elephants 18 hours after the her death (2 years old) and observed that both ovaries were
5.7cm long, 4.5cm wide and 5.3cm long and 4.4cm wide, respectively. A total of 250
cumulus-oocyte complexes were obtained by the knife-cut filtration method, which were
matured and cultured in vitro for 48 hours, and then the cumulus cells wrapped around
the oocytes were removed, nine of the oocytes excreted the first polar body. Because
Asian elephant oocytes are hard to extrude, we removed 30 oocytes with obvious death
and fragmented cytoplasm, the remaining 220 were cloned and parthenogenetically
activated, and placed in embryo culture medium for 9 days of in vitro culture, among
which there were 3 cleavage oocytes.
2. Identification and in vitro and in vivo development of elephant-pig interspecies

cloned embryos

Next we constructed of elephant-pig interspecies cloned embryos using porcine
oocyte as a recipient and identified and evaluated of the in vitro and in vivo development
of the reconstructed embryos. A total of 7780 elephant-pig interspecies cloned embryos
were constructed which exhibited successful in vitro development with cleavage rate, 4-
cell rate, 8-cell rate, and blastocyst rate of 73.01±1.59%, 30.48±1.80%, and 5.64±0.52%,
and 4.73±1.01%, respectively. The total number of blastocyst cells was 38.67±9.83, and
the blastocyst cell diameter was 252.75±10.77μm. Next, we designed species-specific
markers targeting EDNRB, AGRP and TYR genes to verify the genome ofreconstructed
embryos with donor nucleus/species. The results indicated that 53.2, 60.8, and60.8% of
reconstructed embryos (n ¼ 235) contained elephant genome at 1-cell, 2-cell and4-cell
stages, respectively. However, the percentages decreased to 32.3 and 32.7% at 8-celland
blastocyst stages, respectively indicating that Asian elephant somatic cells can effectively
participate in the development of elephant-pig interspecies cloned embryos. Additionally,
we further evaluated the in vivo development of elephant-pig interspecies cloned embryos
and transferred 2260 reconstructed embryos into 2 surrogate sows, both of which became
pregnant, and a total of 11 (1 and 10) fetuseswere surgically recovered after 17 and 19 days
of gestation, respectively. Unfortunately, none of these fetuses contained elephant genomes,
which suggested thatelephant embryos failed to develop in vivo. In summary, we
performed the elephant–pig iSCNT for the first time and observed that porcine ooplasm

VII

can successfully reprogram the elephant nucleus to the blastocyst stage. Unfortunately, the
elephant embryos failed to develop in vivo after transferring into surrogate gilts. In
addition, we also developed a method to identify the species origin, and up to 60.8% of
reconstructed embryos contained elephant genome at the 4-cell stage while it decreased to
32.7% at blastocyst stages. Our study laid the foundation for the resurrection of extinct
animals and the protection of endangered animals by iSCNT.

Keywords: Asian elephant; Pig; Fibroblast cell; Oocytes; Interspecies somatic cellnuclear
transfer.

VIII


表题一览

表 1-1 不同纲克隆报告的综合列表 .................................................................................... 5
表 1-2 不同目克隆报告的综合列表 .................................................................................... 5
表 1-3 不同科克隆报告的综合列表 .................................................................................... 7
表 1-4 不同属克隆报告的综合列表 .................................................................................... 7
表 1-5 不同种克隆报告的综合列表 .................................................................................... 8
表 3-1 实验所涉及引物信息 .............................................................................................. 55
表 3-2 亚洲象猪 ISCNT 胚胎的体外发育 ........................................................................ 60
表 3-3 ISCNT 囊胚的形态特征 ......................................................................................... 61
表 3-4 亚洲象猪 ISCNT 胚胎的体内发育 ........................................................................ 65
表 3-5 妊娠第 19 天胎儿冠臀长和宽度 ............................................................................ 65

IX

图题一览

图 1-1 使用体细胞核移植过程克隆多莉羊 ........................................................................ 1
图 1-2 使用 iSCNT 方法建立濒危和灭绝动物模型........................................................... 3
图 1-3 SCNT 的开发和重编程模型..................................................................................... 9
图 1-4 促进染色质压缩或松弛的特定组蛋白修饰 .......................................................... 12
图 1-5 组蛋白乙酰化：一种调节基因表达的机制 .......................................................... 13
图 1-6 DNA 甲基化示意图 ................................................................................................ 14
图 1-7 DNA 甲基化调节转录 ............................................................................................ 15

图 1-8 核 DNA 和线粒体 DNA 在重编程中的作用......................................................... 16
图 1-9 猛犸象的科学分类 .................................................................................................. 21
图 1-10 日本科学家计划复活猛犸象 ................................................................................ 22
图 1-11 用亚洲象创造杂交猛犸象 .................................................................................... 23
图 2-1 亚洲象（AE01，♂）脐带成纤维细胞系的建立 ................................................ 42
图 2-2 亚洲象（AE02，♀）耳组织成纤维细胞系的建立 ............................................ 42
图 2-3 亚洲象成纤维细胞培养的形态 .............................................................................. 43
图 2-4 通过 PI 染色进行细胞周期检测 ............................................................................ 44
图 2- 5 象成纤维细胞的生长............................................................................................. 45
图 2-6 象成纤维细胞和猪成纤维细胞的大小对比.......................................................... 45
图 2-7 亚洲象卵丘-卵母细胞体外培养 ............................................................................ 46
图 2-8 亚洲象孤雌胚胎体外培养 ...................................................................................... 49
图 3-1 猪卵母细胞体外成熟培养...................................................................................... 56
图 3-2 ISCNT 胚胎的收集 ................................................................................................. 58
图 3-3 ISCNT 胚胎的分子鉴定 ......................................................................................... 62
图 3-4 用于基因组鉴定的重建胚胎 .................................................................................. 64
图 3-5 通过 PCR 鉴定 ISCNT 胎儿................................................................................... 66

X

英文缩略表

英文缩写 英文全称 中文对照
iSCNT
SCNT Interspecies somatic cell nuclear tranfer 异种体细胞核移植
ART
EGA Somatic cell nuclear tranfer 体细胞核移植
MET
MPF Assister reproductive technology 辅助生殖技术
PCC

MII Embryonic genome activation 胚胎基因组激活
HDACi
HAT Maternalembryo transition 母体胚胎过渡
HDAC
OXPHOS Maturation-promoting factor 成熟促进因子
ATP
ETC Premature chromatin condensation 染色质过早凝聚
IVF
RNA Pol II Metaphase II 中期 II
IVP
IVM Histone deacetylase inhibitor 组蛋白去乙酰化酶抑制剂
IVC
IVG Histone Acetylation 组蛋白乙酰化
pFF
FCS Histone deacetylation 组蛋白去乙酰化
PBS
ICSI Mitochondrial Oxidative Phosphorylation System 线粒体氧化磷酸化
CRL
mt Adenosine triphosphate 腺苷三磷酸
TSA
NCSU Electron transport chain 电子传递链

In vitro fertilization 体外受精

RNA polymerase II RNA 聚合酶Ⅱ

In vitro embryo production 体外胚胎生产

In vitro maturation 体外成熟


In vitro culture 体外培养

In vitro growth 体外生长

Porcine follicular fluid 猪卵泡液

Fetal bovine serum 胎牛血清

Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲盐水

Intracytoplasmic sperm injection 胞浆内精子注射

Crown Rump Length 冠臀长

Mitochondria 线粒体

Trichostatin A 曲古抑菌素 A

North Carolina State University 北卡罗来纳州立大学

XI

第一章文献综述

第一章文献综述

1.1 异种体细胞核移植

1.1.1 体细胞核移植 (SCNT)
体细胞核移植（Somatic Cell nuclear transfer，SCNT），又称体细胞克隆，是将


供体体细胞的细胞核转移到已去核卵母细胞的细胞质中，使体细胞核在卵母细胞中
发生重编程，并发育为新的胚胎，最终发育为动物个体。早在 1962 年，约翰格登就
通过实验把蝌蚪已分化体细胞的细胞核移植进入卵母细胞质中，并成功培育出―克隆
青蛙‖，首次证明了可以通过 SCNT 技术从完全分化的体细胞获得完整的克隆动物
（Gurdon，1962 ）。1997 年全球首只克隆哺乳动物―多莉‖羊的诞生（图 1-1）
（Wilmut et al, 1997），掀起了全世界高等动物的研究热潮。Dolly 的诞生证明一个
完全分化成熟的体细胞，还能恢复到早期原始细胞状态，还能像胚胎细胞一样保存
全部遗传信息，推翻了生物学界有关―用成年动物细胞无法培育成胚‖的理论，是生
物技术及其理论的革命。随后，有关克隆动物的报道接连不断。目前，已有 20 多种
哺乳动物被成功克隆。

图 1-1 使用体细胞核移植过程克隆多莉羊
Fig. 1-1 Cloning of Dolly the Sheep using the somatic cell nuclear transfer process

1

第一章文献综述

近十年来，体细胞克隆技术的进步与发展，结合分子遗传学和基因组学等生物
技术的进步，使科学家们拥有一件新的非常有效的工具，来深入研究重要的生命科
学问题，包括各种疾病的发病机理、动物生长发育的机制等等，并已在生殖性克隆、
治疗性克隆和基础研究等领域中获得了一些应用（Niemann et al，2012）。同时，克
隆技术在生产基因编辑（转基因）动物的发展也越来越快，目前已在动物育种实际
中发挥着其巨大的应用潜力（Thomson and McWhir，2004 ）。尽管如此，克隆效率
的低下仍然是 SCNT 技术发展应用中面临的极大障碍。目前，各种动物的克隆效率
都很低，小鼠的克隆效率（按产生活体动物数量与移植的胚胎数量的百分比来计算，
下同）在 1% 到 2% 左右，奶牛为 5% 到 20%，在其他物种中则大概为 1% 到 5%。
限制克隆技术广泛应用的另一障碍是胚胎及克隆动物的发育异常（Ogura et al，
2013），例如胎盘异常增大、克隆动物的异常肥大、免疫缺陷、呼吸系统缺陷和早

衰等（Loi et al，2016；Ogura et al，2013），尽管这些表型不会传递给后代（Fulka
et al，2004；Tamashiro et al，2002；Wakayama et al，2013），但上述异常发育的机
制目前仍为阐明。在过去十年中，克隆技术研究人员在提高克隆效率方面付出了巨
大努力（Meissner and Jaenisch，2006 ），然而，由于缺乏对 SCNT 技术介导的重编
程的表观遗传障碍的理解以及克服这些障碍的关键方法的建立，克隆效率依然十分
低下。随着现代生物技术的进步，特别是单细胞测序等技术的出现，已经能够分析
SCNT 重编程过程中的转录组和表观遗传变化。这些分析揭示了一些分子机制，并
为如何克服这些缺陷提供了线索（Liu et al, 2016; Matoba et al, 2014; Matoba et al,
2018）。事实上，最近中国科学家在克隆猴上的成功（Liu et al，2018 ）很大程度上
归功于这种理解和建立克服表观遗传重编程关键障碍的方法（Cibelli and Gurdon，
2018 ）。因此，未来还需要做更多的工作来揭示阻滞克隆胚胎发育的表观遗传障碍，
从而有效提高 SCNT 效率。

1.1.2 异种体细胞核移植（iSCNT）

在过去的几十年中，由于环境变化和人类对自然资源开发的加剧，导致全球生
物多样性显著下降。野生动物如今面临诸多生存上的威胁，包括人类活动导致栖息
地的丧失，狩猎、污染对野生动物生育力和繁殖力的影响，以及外来物种的捕食或
猎物丧失导致的不良饮食（Holt et al, 2004）。如今，许多动物物种被列为濒危物种。

2

第一章文献综述
这意味着这些物种有灭绝或受到威胁的危险，并且很可能在不久的将来成为濒危物
种。体细胞核移植技术作为一种特殊的辅助生殖技术 (ART) 手段，提供了一种可用
于保护濒危物种或具有优良基因型的动物的方法，且已被研究证实可以使一些濒临
灭绝或灭绝的动物复活（Rojas et al，2005 ）。如果由于动物突然死亡，无法完成生
殖繁衍及解冻后精子寿命降低等情况而无法使用其他传统的 ARTs，则可以选择
SCNT 方法。SCNT 的成功需要大量重建胚胎的生产和移植，以保证活体动物的诞生。
因为直接从野生动物个体中获取卵母细胞不太现实且非常困难，iSCNT 已发展成为

野生珍稀及濒危动物 SCNT 的替代方法。iSCNT 涉及将一个物种的细胞核或细胞转
移到另一个物种的去核卵母细胞的细胞质中（Jiang et al, 2011），体外激活培养后，
重构胚可以在体外发育到囊胚。

图 1-2 使用 iSCNT 方法建立濒危和灭绝动物模型(Rola et al, 2021)
Fig. 1-2 Modeling endangered and extinct animals using the iSCNT method

3

第一章文献综述

目前，iSCNT 主要应用于帮助拯救濒临灭绝的物种，甚至恢复灭绝后的物种。
iSCNT 技术涉及通过将来自野生哺乳动物的供体细胞的细胞核与来自不同的种、不
同的属、不同的科、不同的目或不同的纲的动物的去核受体卵母细胞融合来重建胚
胎。然后将所得胚胎移植到合适的代孕动物（通常是卵母细胞的供体）的子宫中，
以发育至足月（Beyhan et al，2007；Moro et al，2015a；Moro et al，2015b）。当供
体细胞和受体卵母细胞来自具有相似生殖生理、妊娠期和胎盘的进化关系密切的物
种时，哺乳动物中的 iSCNT 会更有效。理论上，不存在生殖隔离，能自然杂交的物
种更有可能在 iSCNT 实验中表现良好（Lagutina et al，2013）。当核供体细胞和受
体卵母细胞分别来源于具有较远亲缘关系的动物时，如来自不同的门、不同的目、
不同的科、不同的属，iSCNT 的克隆胚胎仅能发育到早期阶段（桑椹胚和囊胚），
而无法产出活体动物。iSCNT 效率低的原因在于两个方面：1）mtDNA 基因与编码
线粒体蛋白的核基因不相容（ mt/基因组 DNA 不相容），2）供体细胞传递的
mtDNA（mtDNA 异质性）可能导致克隆胚胎发育不良。mtDNA 复制、转录和翻译
所需的因子由核 DNA 编码，因此，协调一致的 mt/基因组 DNA 对于胚胎的正常发
育至关重要（Loi et al，2011）。iSCNT 胚胎内的不相容性显著影响到胚胎基因组激
活 (EGA) 时发生的核质事件 (Sansinena et al, 2011)。在 iSCNT 中，供体核和受体细
胞来自不同物种，胚胎相关基因的核重编程和重编程过程则面临着更大的生物学挑
战（Zuo et al，2017；Loi et al，2011）。为了使 iSCNT 胚胎成功发育到囊胚期及以
后，它需要协调 EGA 的供体和受体成分（Beyhan et al，2007）。iSCNT 胚胎的全

局转录组分析显示部分 EGA、几个多能基因的阶段特异性表达失败以及母体转录物
的降解受损（Wang et al，2009；Wang et al，2011；Zuo et al，2017）可能是导致胚
胎发育阻滞的原因。不充分的的转录激活和表观遗传重编程可能会导致 iSCNT 胚胎
基因组激活的失败并导致胚胎发育阻滞（Zuo et al，2017）。

1.2 近年来 iSCNT 胚胎发育研究的成就

iSCNT 研究几乎是在多莉羊成功克隆后立即进行的。自然杂交的物种更有可能
在 iSCNT 实验中表现良好。这是可以理解的，因为通过自然交配能产生活的杂交后
代表明这两个物种之间存在一定的核质相容性（Mastromonaco et al，2007）。通常，
当供体和受体细胞来自密切相关的物种时，哺乳动物中的 iSCNT 效率更高。iSCNT

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第一章文献综述

实现的两个主要前提是早期发育事件和机制在哺乳动物中的进化上是保守的，并且
在哺乳动物卵母细胞中调节这些事件的分子能够与来自另一个物种的细胞核相互作
用。然而，这些前提的有效性值得严格审查。尽管大多数哺乳动物胚胎遵循非常相
似的个体发育模式，但在进化上不同的分类群之间确实存在该过程的许多方面的显
著差异（Gilbert and Bolker，2001）。发育事件的时间调控因物种而异，例如细胞周
期进程、胚胎基因组激活 (EGA)、囊胚形成、植入和胚胎发育都存在物种之间的差
异性。iSCNT 研究已根据动物进化分类系统进行了总结，不同的纲间见表 1-1、不
同的目间见表 1-2、不同的科间见表 1-3、不同的属间见表 1-4、不同的种间见表 1-5。

表 1-1 不同纲克隆报告的综合列表

Table 1-1 Comprehensive list of interclass cloning experiments reported

donor species Recipient species Stage of References

development

Chicken (G. gallus) Cow (B. taurus) Blastocyst Liu et al, 2004

目前，有研究报道的关于不同纲的 iSCNT 只有一项。由于两个物种之间的进化
关系太远，对 iSCNT 的成功有很大影响（表 1-1）。在鸡-牛 iSCNT 实验中，iSCNT
胚胎发育至囊胚期，但未进行胚胎移植。

表 1-2 不同目克隆报告的综合列表

Table 1-2 Comprehensive list of interorder cloning experiments reported

No. donor species Recipient species Stage of References
development
1 Chicken (G. gallus) Cow (B. taurus) Blastocyst Liu et al, 2004
2 Rhesus Monkey (M. mulatta) Cow (B. taurus) Blastocyst Dominko et al, 1999
3 Rat (R. norvegicus) Cow (B. taurus) 2-cell Dominkoet al, 1999
4 Panda (A. melanoleuca) Rabbit (O. cuniculus) Blastocyst Chenet al, 2002
5 Human (H. sapiens) Cow (B. taurus) Blastocyst Changet al, 2003
6 Mouse (M. musculus) Cow (B. taurus) 8-Cell Arat et al, 2003
7 Human (H. sapiens) Rabbit (O. cuniculus) Blastocyst Chen et aL, 2003
8 Rhesus Monkey (M. mulatta) Rabbit (O. cuniculus) Blastocyst Yang et al, 2003
9 Dog (C. familiaris) Cow (B. taurus) Blastocyst Murakami et al, 2005
10 Ibex (C. ibex) Rabbit (O. cuniculus) Blastocyst Jiang et al, 2005
11 Domestic cat (F. catus) Rabbit (O. cuniculus) Blastocyst Wen et al, 2005

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