lOMoARcPSD|38146348

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ HỐ HỌC VÀ THỰC PHẨM

KHOÁ HỌC CHUYÊN ĐỀ
TIỂU LUẬN

Giảng viên:T.s Nguyễn Minh Xuân Hồng
Bộ mơn hố sinh và dinh dưỡng con người

Sinh viên thực hiện: Nhóm 1

Họ và tên Mã số sinh viên
Nguyễn Khánh Dư 20125360
Võ Công Luận 20125503
Nguyễn Trần Đăng Khoa 20125455

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2023.

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên với tình cảm sâu sắc và chân thành nhất, cho phép em được bày tỏ lòng biết
ơn đến nhà trường đã tạo điều kiện giảng dạy cho em môn học tuyệt vời này.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi đến cô Nguyễn Minh Xuân Hồng đã truyền đạt
vốn kiến thức quý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập. Nhờ có những
hướng dẫn của Cơ mà nền tảng của chúng em mới có thể hồn thiện tốt hơn. Đây chắc

chắn sẽ là những kiến thức có giá trị sâu sắc giúp em rất nhiều cho công việc sau này
Em xin chân thành cảm ơn Cô!

2

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

MỤC LỤC

Contents

MỤC LỤC.....................................................................................................................3
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU............................................................................................4
CHƯƠNG II: NỘI DUNG CHÍNH...............................................................................6

2.1: Tổng quan về q trình Multiplex PCR:.............................................................6
2.2: Các loại Multiplex PCR......................................................................................8

2.2.1: Phản ứng PCR mẫu đơn...............................................................................8
2.2.2: Phản ứng PCR nhiều mẫu............................................................................8
2.3: Thiết kế mồi cho Multiplex PCR........................................................................9
2.3.1: Chiều dài mồi...............................................................................................9
2.3.2: Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm)...............................................................9
2.3.3: Độ đặc hiệu..................................................................................................9
2.3.4: Tránh hình thành dimer primer.....................................................................9
2.3.5: Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR bằng phần mền PrimerPlex......9
2.4: Ưu điểm của multiplex PCR.............................................................................10
2.4.1. Kiểm soát nội bộ........................................................................................10

2.4.2. Hiệu quả.....................................................................................................10
2.4.3. Chỉ định về Chất lượng Tiêu bản...............................................................10
2.4.4. Chỉ định Số lượng Tiêu bản.......................................................................10
2.5: Nhược điểm của multiplex PCR.......................................................................10
2.6: Tối ưu hoá các thành phần cho phản ứng multiplex PCR.................................11
2.6.1: Nồng độ mồi..............................................................................................11
2.6.2 Nồng độ dNTP và MgCl2............................................................................11
2.6.3: Sự cân bằng dNTP/ MgCl2.........................................................................12
2.6.4: Nồng độ dung dịch đệm (buffer)................................................................12
2.6.5: Lượng ADN khuôn và Taq ADN polymerase............................................12
2.6.6: Sử dụng các chất điều chỉnh: DMSO, Glycerol, BSA................................13
2.7: Ứng dụng của Multiplex PCR...........................................................................13
2.7.1: Các mục đích phản ứng multiplex PCR.....................................................14
2.7.2: Multiplex PCR trong thực phẩm................................................................14
CHƯƠNG III: KẾT LUẬN.........................................................................................16
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................17

3

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU

Multiplex PCR( PCR đa mồi) là một biến thể của PCR cho phép khuếch đại đồng thời
nhiều mục tiêu quan tâm trong một phản ứng bằng cách sử dụng nhiều cặp mồi.
Multiplex PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử phổ biến.

Trong thử nghiệm ghép kênh, có thể khuếch đại nhiều hơn một trình tự đích bằng cách

sử dụng nhiều cặp mồi trong hỗn hợp phản ứng. Là một phần mở rộng cho việc sử
dụng PCR trong thực tế.

4

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

Kỹ thuật này có thể tiết kiệm đáng kể thời gian và công sức bằng cách khuếch đại
đồng thời nhiều trình tự trong một phản ứng đơn lẻ, một quá trình được gọi là phản
ứng chuỗi polymerase đa nhân (PCR). Multiplex PCR yêu cầu các đoạn mồi dẫn đến
sự khuếch đại các vùng DNA duy nhất, cả trong các cặp riêng lẻ và sự kết hợp của
nhiều đoạn mồi, trong một tập hợp các điều kiện phản ứng.
Ngồi ra, phải có sẵn các phương pháp để phân tích từng sản phẩm khuếch đại riêng lẻ
từ hỗn hợp tất cả các sản phẩm. Multiplex PCR đang trở thành một xét nghiệm sàng
lọc nhanh chóng và thuận tiện trong cả phịng thí nghiệm lâm sàng và nghiên cứu. Sự
phát triển của một multiplex PCR hiệu quả thường yêu cầu lập kế hoạch chiến lược và
nhiều nỗ lực để tối ưu hóa các điều kiện phản ứng.
Đối với xét nghiệm PCR ghép thành công, nồng độ tương đối của mồi, nồng độ của
dung dịch đệm PCR, sự cân bằng giữa nồng độ magie clorua và deoxynucleotide, nhiệt
độ chu trình, lượng DNA mẫu và Taq DNA polymerase là rất quan trọng. Một sự kết
hợp tối ưu giữa nhiệt độ ủ và nồng độ dung dịch đệm là điều cần thiết trong PCR ghép
để thu được các sản phẩm khuếch đại có tính đặc hiệu cao. Nồng độ magie clorua chỉ
cần tỷ lệ thuận với lượng dNTP, đồng thời việc điều chỉnh nồng độ mồi cho từng trình
tự đích cũng rất cần thiết. Danh sách các yếu tố khác nhau có thể ảnh hưởng đến phản
ứng khơng có nghĩa là đầy đủ. Việc tối ưu hóa các tham số được thảo luận trong tổng
quan hiện tại sẽ cung cấp một cách tiếp cận thực tế để giải quyết các vấn đề phổ biến
gặp phải trong PCR ghép kênh (chẳng hạn như các sản phẩm khuếch đại giả, khuếch
đại không đồng đều hoặc khơng khuếch đại một số trình tự đích, và khó khăn trong

việc tái tạo một số kết quả). Việc đánh giá và xác nhận kỹ lưỡng các quy trình PCR
ghép kênh mới là điều cần thiết. Độ nhạy và độ đặc hiệu phải được đánh giá kỹ lưỡng
bằng cách sử dụng axit nucleic tinh khiết đã chuẩn hóa. Nếu có thể, nên sử dụng đầy
đủ các biện pháp kiểm sốt chất lượng bên ngồi và bên trong, những biện pháp này
phải được áp dụng nghiêm ngặt. Khi số lượng tác nhân vi sinh vật có thể phát hiện
bằng PCR tăng lên, nó sẽ trở nên rất mong muốn cho các mục đích thực tế để đạt được
sự phát hiện đồng thời nhiều tác nhân gây ra các hội chứng lâm sàng tương tự hoặc
giống hệt nhau và/hoặc chia sẻ các đặc điểm dịch tễ học tương tự.

5

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

CHƯƠNG II: NỘI DUNG CHÍNH

2.1: Tổng quan về q trình Multiplex PCR:
Phản ứng chuỗi Multiplex polymerase (PCR Multiplex) là một sửa đổi của phản ứng
chuỗi polymerase nhằm phát hiện nhanh chóng các đoạn xóa hoặc sao chép trong một
gen lớn. Quá trình này khuếch đại các mẫu DNA bộ gen bằng cách sử dụng nhiều đoạn
mồi và DNA polymerase làm trung gian nhiệt độ trong một máy quay vòng nhiệt.
Multiplex-PCR lần đầu tiên được mô tả vào năm 1988 như là một phương pháp để
phát hiện sự mất đoạn của gen dystrophin.Nó cũng đã được sử dụng với gen sulfatase
steroid. Năm 2008, multiplex-PCR được sử dụng để phân tích microsatellites và SNPs.
Multiplex-PCR bao gồm nhiều bộ mồi trong một hỗn hợp PCR đơn lẻ để tạo ra các bộ
khuếch đại có kích thước khác nhau dành riêng cho các trình tự DNA khác nhau. Bằng
cách nhắm mục tiêu nhiều gen cùng một lúc, thông tin bổ sung có thể thu được từ một
lần chạy thử nghiệm mà nếu không sẽ cần nhiều lần thuốc thử và nhiều thời gian hơn
để thực hiện. Nhiệt độ ủ cho từng bộ mồi phải được tối ưu hóa để hoạt động chính xác

trong một phản ứng duy nhất và kích thước bộ khuếch đại, tức là chiều dài cặp cơ sở
của chúng, phải đủ khác nhau để tạo thành các dải riêng biệt khi hiển thị bằng điện di
trên gel. Bộ dụng cụ ghép kênh thương mại dành cho PCR hiện có sẵn và được nhiều
phịng thí nghiệm pháp y sử dụng để khuếch đại các mẫu DNA đã phân hủy.
Quy trình thực hiện:

6

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

Đầu tiên cần thu thập mẫu DNA từ nhiều nguồn sau đó đảo ngược đoạn mồi đặc hiệu
cho Gen với các trình tự phổ biến và chuyển đoạn mồi đặc hiệu cho Gen với các trình
tự phổ biến. Cho DNTP, Taq polymeraza, Taq buffer (containing MgCl2) vào trong
ống nghiệm tiến hành ủ và đem đi phân tích điện di.

2.2: Các loại Multiplex PCR.
Các phản ứng ghép kênh có thể được chia thành hai loại:
2.2.1: Phản ứng PCR mẫu đơn
Kỹ thuật này sử dụng một mẫu duy nhất có thể là DNA bộ gen cùng với một số cặp
mồi xuôi và ngược để khuếch đại các vùng cụ thể trong một mẫu.

7

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

2.2.2: Phản ứng PCR nhiều mẫu.

Nó sử dụng nhiều mẫu và một số bộ mồi trong cùng một ống phản ứng.
Sự hiện diện của nhiều đoạn mồi có thể dẫn đến lai chéo với nhau và khả năng bắt
nhầm với các mẫu khác.
Tuy nhiên phản ứng PCR cũng có nhược điểm đó là: sự xuất hiện của nhiều đoạn mồi
có thể dẫn đến sự lai chéo với nhau. Vì nhiều đoạn mồi nên sẽ có nhiều DNA nên
chúng có thể có sự lai chéo và điều đó sẽ khiến cho việc ghép nối sai với các mẫu khác
2.3: Thiết kế mồi cho Multiplex PCR.
Thiết kế các bộ mồi cụ thể là điều cần thiết cho phản ứng ghép kênh thành công. Các
cân nhắc thiết kế mồi quan trọng được mô tả dưới đây là chìa khóa để khuếch đại cụ
thể với năng suất cao.
2.3.1: Chiều dài mồi.
Xét nghiệm PCR Multiplex Chiều dài mồi liên quan đến việc thiết kế một số lượng lớn
mồi, do đó mồi được thiết kế phải có độ dài phù hợp. Thơng thường, mồi có độ dài
ngắn, trong khoảng 18-22 base (nucleotide) được sử dụng.
2.3.2: Nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm).
Các mồi có Tm tương tự, tốt nhất là trong khoảng 55°C-60°C được sử dụng.
Đối với các trình tự có hàm lượng GC cao, mồi có Tm cao hơn (tốt nhất là 75°C-80°C)
được khuyến nghị. Vì hàm lượng GC cao sẽ có nhiều liên kết hydro hơn làm cho nhiệt
độ nóng sẽ cao hơn.
Độ dao động về Tm giữa các mồi nên nằm trong khoảng 3°- 5°C.
2.3.3: Độ đặc hiệu.
Điều quan trọng là phải xem xét tính đặc hiệu của mồi được thiết kế đối với trình tự
mục tiêu, trong khi chuẩn bị xét nghiệm ghép kênh, đặc biệt là khi có sự cạnh tranh khi
nhiều trình tự mục tiêu ở trong một bình phản ứng.

8

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348


2.3.4: Tránh hình thành dimer primer.
Các mồi được thiết kế nên được kiểm tra để phát hiện sự hình thành primer dimer, với
tất cả các primer có trong hỗn hợp phản ứng (hiện tượng mồi bắt cặp với nhau). Giảm
kích thước dẫn đến khuếch đại không đặc hiệu. Tất cả các chỉ số cần lưu ý khi thiết kế
mồi gần giống với thiết kế mồi cho 1 phản ứng PCR thông thường. Thông thường, khi
tỷ lệ Mồi/Khn q cao cũng có thể dẫn đến việc hình thành primer dimer, do đó phải
chú ý chỉ số của các thành phần trong phản ứng.
2.3.5: Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR bằng phần mền PrimerPlex.
PrimerPlex là 1 cơng cụ hữu ích cho q trình thiết kế mồi đối với phản ứng multiplex
PCR. Chương trình này giúp kiểm tra các oligo xem chúng có phản ứng chéo với nhau
hay khơng, đồng thời tăng sự thích ứng giữa các mồi. Q trình này phân tích hàng
triệu cặp mồi khả dĩ chỉ trong vài giây, sau đó chương trình đưa ra danh sách các mồi
để người thiết kế lựa chọn.
2.4: Ưu điểm của multiplex PCR.
2.4.1. Kiểm soát nội bộ
Các vấn đề tiềm ẩn trong PCR đơn giản bao gồm âm tính giả do phản ứng khơng thành
cơng hoặc dương tính giả do nhiễm bẩn. Âm tính giả thường được tiết lộ trong các thử
nghiệm ghép kênh vì mỗi bộ khuếch đại cung cấp một biện pháp kiểm soát bên trong
cho các đoạn được khuếch đại khác.
2.4.2. Hiệu quả.
Chi phí thuốc thử và thời gian chuẩn bị trong PCR đa thành phần ít hơn so với trong
các hệ thống sử dụng nhiều ống PCR đơn thành phần. Một phản ứng ghép kênh là lý
tưởng để bảo tồn polymerase đắt tiền và các khuôn mẫu đang thiếu hụt.
2.4.3. Chỉ định về Chất lượng Tiêu bản.
Chất lượng của tiêu bản có thể được xác định trong multiplex hiệu quả hơn so với
phản ứng PCR đơn giản.

9


Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

2.4.4. Chỉ định Số lượng Tiêu bản.
Khuếch đại hàm mũ và các tiêu chuẩn nội bộ của PCR ghép kênh có thể được sử dụng
để đánh giá số lượng của một tiêu bản cụ thể trong một mẫu. Để định lượng chính xác
các mẫu bằng PCR ghép kênh, số lượng mẫu tham chiếu, số chu kỳ phản ứng và sự ức
chế tối thiểu của việc nhân đôi sản phẩm theo lý thuyết cho mỗi chu kỳ phải được tính
đến.
2.5: Nhược điểm của multiplex PCR.
Mặc dù multiplex PCR có nhiều ưu điểm nhưng nó cũng có một số nhược điểm khơng
thể bỏ qua:
Thứ nhất, có thể xảy ra hiện tượng tự ức chế giữa các nhóm mồi khác nhau. Primer
dimer là một sản phẩm phụ tiềm năng của PCR, bao gồm hai phân tử primer lai với
nhau vì chúng có chung một chuỗi bazơ bổ sung. Sau đó, DNA polymerase sẽ khuếch
đại dimer mồi, cạnh tranh các thuốc thử PCR và có khả năng ức chế q trình khuếch
đại của trình tự DNA đích. Do đó, dimer mồi gây ra nhược điểm thứ hai, đó là hiệu
suất khuếch đại thấp. Nói chung, điều này làm cho PCR ghép kênh trở nên khó thiết kế
và có nghĩa là kỹ thuật này không thể dễ dàng nhân rộng đến các mục tiêu rất lớn.
Thứ hai, việc chia nhỏ các mẫu thường được yêu cầu để giảm bớt những thách thức
đối với cỡ mẫu lớn. Tuy nhiên, điều này lại làm giảm độ nhạy của thử nghiệm đối với
các biến thể hiếm. Sử dụng các giọt nhỏ hoặc mồi liên kết để tăng tính đặc hiệu là các
giải pháp thay thế đã được sử dụng để vượt qua một số trở ngại này và giảm sự hình
thành dimer của mồi.
Một vấn đề phức tạp khác là chỉ có thể đặt một bộ điều kiện khuếch đại duy nhất cho
mỗi sản phẩm PCR. Do đó, thiết kế mồi cho một số mục tiêu đa kênh có thể khó khăn.
Có nguy cơ ưu tiên một số sản phẩm hơn những sản phẩm khác. Một tùy chọn là xem
xét một số yếu tố trong quá trình thiết kế mồi, chẳng hạn như trình tự axit nucleic đích,
độ dài và hàm lượng GC. Điều này làm cho nhiều khả năng tập hợp các điều kiện

khuếch đại sẽ là tối ưu cho tất cả các sản phẩm được nhắm mục tiêu bởi PCR ghép
kênh. Hầu hết các nhà nghiên cứu hiện nay sử dụng các cơng cụ thiết kế silico , trên
máy tính, để đơn giản hóa các tác vụ này.

10

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

2.6: Tối ưu hoá các thành phần cho phản ứng multiplex PCR.
2.6.1: Nồng độ mồi.
Nồng độ mồi ban đầu cho phản ứng có nồng độ từ 0.1 µM đến 0.5 µM. Có thể điều
chỉnh chỉ số này tùy thuộc vào từng điều kiện phản ứng, ví dụ, người ta có thể tăng
hàm lượng mồi đối với các locus “yếu” và giảm nồng độ mồi với các locus “mạnh”.
Nồng độ cuối cùng của mỗi mồi trong phản ứng nên nằm trong khoảng từ 0.04 µM
đến 0.5 µM.
Với số lượng bản sao thấp hay ADN phức tạp, nồng độ mồi nên nằm trong khoảng 0.3
µM đến 0.5 µM. Ngược lại nếu số lượng bản sao lớn hay ADN khn ít phức tạp thì
nồng độ mồi nên nằm trong khoảng 0.04 µM đến 0.4 µM.
2.6.2 Nồng độ dNTP và MgCl2.
Nồng độ MgCl2 nên giữ cố định ở mức 2 mM. Nồng độ dNTP có thể dao động từ 0.5
mM đến 1.6 mM. Nồng độ thích hợp nhất của từng loại dNTP là từ 0.2 mM đến 0.4
mM. Quá ngưỡng này sẽ làm giảm tốc độ phản ứng.
Nồng độ mỗi loại dNTP thấp hơn 0.1 mM sẽ vẫn giữ được tốc độ phản ứng nhưng lại
làm giảm số lượng sản phẩm. dNTP gốc (stock) nhạy cảm với quá trình rã đơng, do đó
làm hiệu quả phản ứng multiplex PCR có thể giảm.
Để khắc phục nhược điểm này, dNTP nên được chia thành từng lượng nhỏ trước khi
bảo quản ở -20ºC.
Do MgCl2 ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả hoạt động của enzyme Taq ADN

polymerase nên nồng độ Mg2+ phải được kiểm tra chặt chẽ. Enzyme Taq polymerase,
khuôn, dNTP và các mồi đều liên kết với MgCl2 nên nồng độ MgCl2 phụ thuộc vào
nồng độ các thành phần này. Hơn nữa, nếu khn hoặc mồi có chứa EDTA hay EGTA
thì nồng độ MgCl2 cũng sẽ được điều chỉnh. Mg2+ giúp ổn định cấu trúc sợi đôi, bảo vệ
ADN khỏi bị biến tính. Nồng độ Mg2+ cao có thể dẫn đến việc làm tăng lượng sản
phẩm không đặc hiệu do nó tác động đến q trình gắn mồi lên sợi khuôn. Tuy nhiên
nếu hàm lượng Mg2+ không đủ cũng sẽ làm giảm lượng sản phẩm cần thiết.

11

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

2.6.3: Sự cân bằng dNTP/ MgCl2.
Để làm việc hiệu quả, Taq ADN polymerase cần Mg tự do (bên cạnh Mg liên kết với
dNTP và ADN). Đây là lí do tại sao khi tăng nồng độ dNTP thì tốc độ phản ứng PCR
lại giảm trong khi đó tăng nồng độ Mg lại cho kết quả ngược lại. 0.2 mM dNTP kết
hợp với 1.5 đến 2 mM MgCl2 là hợp lí.
2.6.4: Nồng độ dung dịch đệm (buffer).
Dùng đệm nồng độ 2X sẽ cải thiện hiệu quả của phản ứng multiplex PCR. Nó hiệu quả
hơn bất kỳ chất điều chỉnh nào (như DMSO, glycerol, BSA). Các cặp mồi dùng để
nhân các đoạn ADN có chiều dài lớn sẽ hoạt động tốt hơn ở nồng độ muối thấp trong
khi các cặp mồi dùng để nhân các đoạn ADN ngắn hơn yêu cầu nồng độ muối cao hơn.
2.6.5: Lượng ADN khuôn và Taq ADN polymerase.
Khi lượng khuôn ADN thấp, hiệu quả khuếch đại và độ đặc hiệu của phản ứng có thể
tăng lên nếu hạ thấp nhiệt độ gắn mồi. Người ta tiến hành thử nghiệm ở các nồng độ
Taq ADN polymerase khác nhau, sau đó đưa ra được nồng độ tối ưu đối với enzyme
này 2.5U/ 50µl dịch phản ứng.
Nếu quá nhiều enzyme, nồng độ glycerol dùng để bảo quản enzyme có thể làm mất

cân bằng q trính khuếch đại làm tăng sự nhiễu. Tỷ lệ mồi đặc hiệu và hỗn hợp phụ
thuộc vào hoạt tính của enzyme, các thành phần thiết yếu trong phản ứng như MgCl2,
dNTPs và bản chất của ADN đích. Vì vậy, một loạt các cải tiến được thực hiện nhằm
cải thiện quá trình PCR chủ yếu định hướng trực tiếp vào các yếu tố tác động đến việc
gắn mồi và kéo dài chuỗi.
2.6.6: Sử dụng các chất điều chỉnh: DMSO, Glycerol, BSA.
Hầu hết các phản ứng multiplex PCR khó thực hiện đều phải được hỗ trợ bởi các chất
phụ gia như DMSO, glycerol, formamide và betaine. Những phụ gia này giúp làm lỏng
chuỗi ADN, do đó ADN dễ dàng bị biến tính bằng nhiệt nhanh hơn.
Tuy nhiên, trong các phản ứng multiplex PCR, DMSO và glycerol lại gây ra sự cạnh
tranh. Vì vậy, nồng độ của các chất này cũng nên được xem xét kiểm tra chặt chẽ.

12

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

Nồng độ BSA đạt tới 0.8 µg/µl sẽ làm tăng hiệu quả phản ứng hơn nhiều so với việc
bổ sung DMSO và glycerol.
2.7: Ứng dụng của Multiplex PCR.
Multiplex PCR có nhiều ứng dụng rộng rãi, có thế xác định sự có mặt cùng lúc nhiều
tác nhân khác nhau như virus, vi khuẩn và các tác nhân xâm nhiễm khác. Đồng thời,
phản ứng multiplex PCR cũng được dùng để xác định các thành phần có trong một hỗn
hợp mẫu hoặc cũng có thể dùng để xác định sự có mặt của nhiều gen đơn lẻ trong hệ
gen.

2.7.1: Các mục đích phản ứng multiplex PCR.

1. Xác định tác nhân gây bệnh 5. Định lượng mẫu

2. Hiệu suất SNP genotyping cao 6. Phân tích các liên kết
3. Phát hiện đột biến 7. Phát hiện ARN
4. Phát hiện đột biến mất trong gen 8. Nghiên cứu pháp y

13

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

2.7.2: Multiplex PCR trong thực phẩm.
2.7.2.1: Xác định giống sản phẩm nông sản biến đổi gen bằng multiplex PCR.
Multiplex PCR để phát hiện GMO. Trong nghiên cứu này, một Fourplex PCR đã được
thiết kế và thử nghiệm để phát hiện hiệu quả đậu tương GM. Bốn cặp mồi đã được xác
định dựa trên các dấu hiệu DNA đã phát triển cùng với khuếch đại đặc trưng cho đậu
tương để phân biệt đậu nành thông thường GM và không GM. Ba cặp mồi cụ thể của
GMO như P35Sfor/P35Srev (141 bp), TNOSfor/TNOSrev (224 bp) và EPSPSfor/
EPSPSrev (256 bp) đã được sử dụng để xác định các vùng chuyển gen của RRS. Cặp
mồi LECTfor/LECTrev (101 bp) đã được áp dụng cho phát hiện gen lectin nội sinh để
kiểm tra khả năng khuếch đại của DNA đậu tương. Việc phân tích bộ bột đậu nành GM
chứa 0, 0,1, 0,5 và 10% Roundup Ready cho phép kiểm tra độ nhạy và độ tin cậy của
phương pháp PCR. Sản phẩm PCR 101 bp tồn tại trong tất cả các mẫu đậu tương bao
gồm cả mẫu trắng (0% RRS), như mong đợi. Các sản phẩm khuếch đại dự kiến là 141,
224 và 256 bp có mặt trong tất cả các mẫu chuyển gen, ngoại trừ dải DNA 224 bp
tương ứng với đầu cuối NOS trong mẫu RRS 0,1%. Mẫu 0,1% GMO tạo ra các dải
yếu, trong khi các mẫu chứa 0,5 và 10% RRS tạo ra các dải rõ ràng. Hơn nữa, cường
độ của các dải DNA tăng tương ứng với lượng vật liệu chuyển gen tăng lên trong các
mẫu. Không quan sát thấy sản phẩm PCR nào trong mẫu âm tính (khơng phải DNA).
Kết quả thu được cho thấy phương pháp multiplex PCR đã phát triển cho phép phát
hiện GMO với độ đặc hiệu cao và độ nhạy ít nhất (0,1% GMO). Ngồi ra, quy trình

này có thể được sử dụng để sàng lọc nhiều loại GMO, bao gồm cả các giống không
được phê duyệt nếu chúng chứa một trong các bộ khuếch đại được xác định bằng
phương pháp này.
Các quy trình phân tích được mơ tả ở đây cho phép sàng lọc nhanh chóng, hiệu quả và
đáng tin cậy các GMO, cụ thể là cây trồng Roundup Ready và Bt cũng như các cây
chuyển gen khác có chứa các yếu tố đặc trưng của GMO như: promoter 35S, NOS
terminator, epspsgen. Tương ứng, các phương pháp PCR ghép kênh đã phát triển có
thể được triển khai dễ dàng để kiểm soát việc phân phối và sử dụng thực phẩm biến
đổi gen.

14

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

2.7.2.2: Xác định loài bằng Multiplex PCR.
Cách tiếp cận này đặc hiệu trong việc phát hiện các tổ hợp khác nhau của các loài thịt
mục tiêu mà khơng có phản ứng chéo với thịt lừa, cá, tôm, thịt chuột và gà. Kết quả là
Multiplex PCR được sử dụng để cải thiện điều kiện khuếch đại. Mồi đặc hiệu đã được
thử nghiệm cho năm loại thịt: thịt lừa, cá, tôm, thịt chuột và thịt gà. Người ta đã thử
nghiệm rằng các mồi dành riêng cho thịt không cho thấy phản ứng chéo với bất kỳ loại
thịt khơng phải mục tiêu nào. Tính đặc hiệu của xét nghiệm tăng gấp bốn lần được
thiết lập bằng cách thực hiện PCR.

Khuếch đại 100 ng DNA thịt pha loãng từ 100 đến 0,001 bốn lồi dương tính rõ ràng
và 0,1 bốn loài giới hạn phát hiện thấp hơn. Những kết quả này chứng minh rằng xét
nghiệm nhạy cảm với thịt lợn, thịt bò, vịt và thịt cừu đã được thử nghiệm.

15


Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348

CHƯƠNG III: KẾT LUẬN

Multiplex PCR (PCR đa nhân) là một phương pháp PCR mà cho phép phát hiện đồng
thời nhiều gen hoặc một loạt các biến đổi genetic tạo nên một bộ gen trong một mẫu
DNA. Điều này tiết kiệm thời gian và chi phí so với việc thực hiện nhiều phản ứng
PCR độc lập để kiểm tra từng gen.
Multiplex PCR sử dụng nhiều cặp bản sao oligonucleotide primers được thiết kế để
nhận dạng các đoạn DNA khác nhau cùng một lúc. Quá trình này cho phép nhân đôi
các đoạn DNA một cách đồng thời và đo lường số lượng sản phẩm amplification bằng
cách sử dụng các dấu hiệu quang học hoặc các phương pháp phân tích khác.
Tuy nhiên, Multiplex PCR cũng có một số hạn chế. Các hạn chế bao gồm khả năng
xuất hiện sai sót do độ dài khác nhau của các đoạn PCR, sự cạnh tranh giữa các cặp
bản sao oligonucleotide primers và một số vấn đề khác có thể gây ra kết quả sai. Ngoài
ra, sự tăng cường đồng thời các gen khác nhau trong cùng một mẫu cũng có thể dẫn
đến sự bất thường hoặc mất mát của một số sản phẩm PCR.
Tóm lại, Multiplex PCR là một cơng cụ hữu ích trong việc phát hiện và phân tích đồng
thời nhiều gen trong một mẫu DNA. Tuy nhiên, các hạn chế cũng cần được xem xét
khi sử dụng phương pháp này.

16

Downloaded by van Nguyen ()

lOMoARcPSD|38146348


TÀI LIỆU THAM KHẢO

/>
/>
/> /> /> /> />

/> /> /> />
17

Downloaded by van Nguyen ()