HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ THỊ LOAN

ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC, DI TRUYỀN VÀ PHÒNG CHỐNG
SINH HỌC NẤM Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc)
GÂY BỆNH HÉO VÀNG CHUỐI Ở MIỀN BẮC VIỆT NAM

N
Mã số

: Bảo vệ t ực vật
: 9 62 01 12

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2024


Cơng trình hồn thành tại:
HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM
Người hướng dẫn khoa học:

TS. Nguyễn Đức Huy
TS. Vũ Đăng Toàn

Phản biện 1:

PGS.TS. Nguyễn Văn Nam
Trƣờng Đại học Tây Nguyên

Phản biện 2:

PGS.TS. Trần Đăng Khánh
Viện Di truyền Nông nghiệp

Phản biện 3:

TS. Nguyễn Huy Chung
Viện Bảo vệ thực vật

Luận án sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng Đánh giá luận án cấp Học viện
họp tại:
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 2024

Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của ((HVN)


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
Chuối thuộc chi Musa spp., họ Musaceae. FAOSTAT (2019) đã đưa cây chuối thuộc nhóm cây ăn
quả hỗ trợ sinh kế và an ninh lương thực của hàng triệu người trên toàn cầu.
Trên thế giới chuối được trồng ở 150 quốc gia, diện tích khoảng 5,2 triệu ha với sản lượng xấp xỉ
125 triệu tấn (FAOSTAT, 2022). Việt Nam thuộc nhóm 11 nước có diện tích đang cho thu hoạch và sản
lượng chuối lớn nhất thế giới (tương ứng bằng 2,2% và 1,76%), đứng thứ 3 ở Đông Nam Á về diện tích
thu hoạch (sau Philippines, Thái Lan) và sản lượng (sau Philippines, Indonesia) (FAOSTAT, 2022).
Theo Cục trồng trọt (9/2023), diện tích trồng chuối của nước ta trong ba năm qua tăng nhẹ, từ 152,8
nghìn ha năm 2020 lên 154,2 nghìn ha năm 2021 và 157,1 nghìn ha năm 2022. Năng suất và sản lượng

chuối cũng tăng, từ 166,0 tạ/ha năm 2020 lên 169,6 tạ/ha và 175,0 tạ/ha năm 2022 cho sản lượng lần lượt là
2,27 triệu tấn, 2,35 triệu tấn và 2,51 triệu tấn. Một số giống chuối có diện tích lớn như chuối sứ (Xiêm)
chiếm 30,3%, chuối tiêu hồng (14,4%), chuối già hương (11,6%) và một số giống khác như chuối tây, chuối
tiêu….
Trong những năm gần đây, bệnh héo vàng chuối do nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây
ra đã được phát hiện tại các vùng trồng chuối của Việt Nam như Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Lào Cai...
với mức gây hại 25 - 30% tùy giống và tùy vùng. Bệnh nhiễm trên cảc giống chuối tiêu, chuối tây... Triệu
chứng của bệnh: mép lá vàng, lá bị gẫy gập treo trên thân giả, mạch xylem chuyển màu từ vàng nhạt, đỏ sẫm
đến nâu đen. Bệnh xuất hiện và gây hại tập trung tại các vùng chuối trồng từ 2 - 3 năm tuổi trở lên, các vùng
trồng lâu năm thì tỷ lệ cây bị bệnh càng cao. Nấm gây hại trên tất cả các bộ phận và các giai đoạn sinh trưởng
của cây chuối. Cây bị nhiễm bệnh cho buồng và quả nhỏ hoặc không ra buồng (Cục BVTV, 2020).
Nguyễn Văn Khiêm (2000) nghiên cứu 60 mẫu nấm FOC tại 7 tỉnh bao gồm Hà Nội, Hà Tây, Hưng
Yên, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, và Thừa Thiên Huế đã xác định là nấm gây bệnh vàng lá trên chuối ở
nước ta thuộc chủng 1, chưa phát hiện ra bệnh vàng lá trên chuối tiêu.
Kết quả nghiên cứu của tác giả Hùng & cs. (2016) đã xác đinh chủng Foc-TR4 ảnh hưởng đến chuối
tiêu và các loại chuối khác ở vùng nhiệt đới, là bệnh hại quan trọng ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất
lượng chuối, đây là một trong những vấn đề gây trở ngại trong sản xuất chuối của Việt Nam.
Kết quả đánh giá hiện trạng bệnh héo vàng chuối của L.T.Loan và cs., giai đoạn 2018 - 2020 (Hội
thảo KH-HVNN, 2020), cho thấy bệnh xuất hiện ở hầu hết các tỉnh trồng chuối được điều tra như: Lào
Cai, Hưng Yên, Hà Nội, Phú Thọ…, tỷ lệ bệnh gây hại trên chuối tiêu từ 15 - 30% (Vĩnh Phúc, Phú Thọ),
thậm chí lên tới 90% (Khoái Châu, Hưng Yên).
Kết quả các cuộc điều tra, đánh giá bệnh héo vàng chuối cho thấy, bệnh đang có xu hướng lây lan,
phát triển ra nhiều vùng, gây thiệt hại nặng, đặc biệt trên chuối tiêu bệnh có xu hướng gây hại nặng hơn
trên chuối tây. Các nghiên cứu về sự gây hại của nấm Fusarium cho thấy nấm gây bệnh phụ thuộc vào
đặc điểm di truyền của nấm cũng như sự thay đổi các điều kiện trồng trọt, mơi trường. Mỗi lồi nấm có
u cầu khác nhau về ký chủ, về điều kiện phát sinh gây bệnh cũng như các biện pháp phòng chống. Xác
định được chính xác nấm gây bệnh, sự đa dạng sinh học, di truyền của nấm sẽ là cơ sở để xây dựng được
các biện pháp quản lý bệnh tốt hơn nhằm hạn chế sự lây lan, phát tán cũng như giảm thiều thiệt hại cho
nấm bệnh gây ra.
Xuất phát từ những lý do trên, thực hiện đề tài: “Đặc điểm sinh học, di truyền và phòng chống sinh học

nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc Việt Nam” là một điều
cần thiết. Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần xây dựng chiến lược phòng chống, giảm sự gây hại của
nấm trên chuối, tăng hiệu quả kinh tế trong sản xuất chuối và bảo vệ được sự bền vững của môi trường.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Đánh giá được hiện trạng bệnh héo vàng chuối, đánh giá được một số đặc điểm sinh học chủ yếu
của chủng Foc-TR4 và đa dạng loài Fusarium hại chuối ở miền Bắc Việt Nam.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
Điều tra, thu thập, đánh giá được hiện trạng bệnh héo vàng chuối tại miền Bắc Việt Nam. Nghiên

1


cứu đặc điểm hình thái, phân tử chủng Foc-TR4 và đánh giá đa dạng loài Fusarium hại chuối ở các tỉnh
phía Bắc và Thanh Hóa, Nghệ An. Xác định đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của chủng Foc-TR4.
Đánh giá được hiệu lực phòng chống sinh học chủng Foc-TR4 và Foc-R1 trong điều kiện invitro và trong
điều kiện nhà lưới.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) gây bệnh héo vàng chuối.
1.3.2. Địa điểm nghiên cứu
Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Bộ môn Bệnh cây và Miễn
dịch thực vật, Viện Bảo vệ thực vật, Viện Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam; Phịng thí nghiệm hóa sinh
thực vật (Laboratory of Plant Biochemistry), Vườn thực vật Meise, Vương Quốc Bỉ.
1.3.3. Thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu sinh thực hiện nghiên cứu từ tháng 12/2018 đến tháng 12/2023.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
1. Kỹ thuật PCR, giải trình tự các đoạn gene rpb1, rpb2 và tef1α của 19 mẫu bệnh héo vàng chuối
đại diện cho 4 vùng địa lý đã được phân tích kết hợp các VCGs khác nhau trong bộ dữ liệu, đã xác định
được chủng 4 (Foc-TR4) (chiếm 10,5%) được xác định gần VCG 01213 và VCG 01216 gây hại trên cả

chuối tây (ABB) và chuối tiêu (AAA). Như vậy, mẫu bệnh héo vàng chuối được xác định chủng 4 (FocTR4) trên chuối tây (ABB) đã khẳng định thêm thuyết tiến hóa hội tụ của FOCS và quan trọng hơn đó là
gợi ý nguồn gốc chủng Foc-TR4 là ở Việt Nam.
2. Phân tích đặc điểm hình thái - phân tử kết hợp của 19 mẫu bệnh héo vàng chuối, đã xác định được
mức độ đa dạng lồi Fusarium dựa trên giải trình tự 3 đoạn gene chính rpb1, rpb2 và tef1α, cho thấy 18/19
mẫu thuộc 4 nhóm phả hệ thuộc phức hợp lồi FOCS, gồm: F. tardichlamydosporum, F. odoratissimum, F.
duoseptatum và F. cugenangense; 1/19 mẫu thuộc phức hợp loài FFCS và được xác định là loài F. fujikuroi.
Kết quả này khẳng định giả thuyết tiến hóa hội tụ của FOCS (nền di truyền khác nhau) nhưng gây bệnh héo
vàng chuối.
3. Luận án đã xác định được nhóm F. tardichlamydosporum nhiễm trên lồi chuối dại Musa lutea,
cho thấy tầm quan trọng của chuối dại như một vật chủ có thể có đối với nấm Foc.
4. Cung cấp dẫn liệu mới về phòng chống sinh học một số loài vi sinh vật đối kháng (nấm, vi khuẩn
và xạ khuẩn) có thể ứng dụng để quản lý bệnh héo vàng chuối.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu đã chứng minh được chuối ở miền Bắc Việt Nam bị nhiễm bệnh héo vàng được đặc trưng
bởi nhiều nhóm Fusarium khác nhau (F. cugeneeangeneese, F. odoratissimum, F. duoseptatum và F.
tardichlamydosporum) thuộc phức hợp lồi Fusarium oxysporum (FOCS). Trong số này, nhóm F.
odoratissimum xuất hiện và gây hại nghiêm trọng đến giống chuối tiêu, các nhóm khác gây hại ít nghiêm
trọng hơn. Nhóm F. tardichlamydosporum cũng xuất hiện ở điều kiện tự nhiên đối với loài chuối dại Musa
lutea.
Kết quả nghiên cứu của đề tài đã bổ sung dữ liệu mới, có giá trị về phân loại, định danh, phân tích
đa dạng loài nấm Fusarium và mức độ gây bệnh héo vàng chuối bằng phương pháp kết hợp đặc điểm
hình thái và kỹ thuật phân tử đã đóng góp vào hiểu biết chung về các loài Fusarium gây hại trên
chuối ở miền Bắc Việt Nam.
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Hiện nay, bệnh héo vàng chuối là một trong những bệnh quan trọng ảnh hưởng đến sản xuất chuối tại
Việt Nam, đặc biệt gây hại nặng trên chuối tiêu, là giống chuối có giá trị xuất khẩu. Phòng trừ sinh học được
coi là giải pháp chiến lược trong phòng trừ bệnh héo vàng chuối hiệu quả để giảm việc sử dụng thuốc diệt nấm
và giảm thiểu mức độ gây hại của bệnh ngoài sản xuất. Vì vậy kết quả của đề tài cũng có giá trị tham khảo để
xây dựng quy trình phịng trừ nấm Fusarium gây bệnh héo vàng chuối bằng biện pháp sinh học.


2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. NGHIÊN CỨU BỆNH HÉO VÀNG CHUỐI TRÊN THẾ GIỚI
2.1.1. Nguồn gốc của bệnh héo vàng chuối
Báo cáo và mô tả đầu tiên về bệnh héo vàng chuối do nấm Fusarium gây hại trên thế giới là từ
Australia. Năm 1874, Joseph Bancroft phát hiện trên giống chuối Sugar, AAB và Silk subgroup bị bệnh
héo rũ do nấm Fusarium tại Eagle Farm (27°S 431°E) gần Brisbane (Bancroft, 1876). Mô tả của Bancroft
về các triệu chứng cho thấy ông đang đối mặt với bệnh héo Fusarium (Pegg & cs., 1996). Ơng nhận ra
mầm bệnh có thể lây lan dễ dàng bằng cách nhân giống sinh dưỡng và đề xuất việc lựa chọn cẩn thận vật
liệu trồng sạch bệnh. Đây là cuộc điều tra bệnh lý thực vật đầu tiên được ghi nhận ở Queensland. Bệnh
héo vàng chuối do nấm Fusarium một lần nữa được công nhận bởi Tryon (1912), người đã ghi nhận tính
nhạy cảm của giống chuối Sugar và Gros Michel và khả năng kháng lại bệnh này của chuối Cavendish.
2.1.2. Triệu chứng bệnh héo vàng chuối
Các triệu chứng khác nhau của bệnh héo vàng chuối (hay cịn gọi là bệnh Panama) được mơ tả bởi
Ploetz & Pegg (2000), Pérez-Vicente & cs. (2014).
Triệu chứng bên ngoài điển hình của bệnh héo vàng chuối là lá vàng và gẫy gập treo trên thân giả.
Ở giai đoạn đầu là một vệt hoặc mảng màu xanh nhạt đến vàng nhạt ở gốc cuống lá của một trong hai lá
già nhất. Bệnh sau đó có thể tiến triển theo những cách khác nhau. Các lá già hơn có thể chuyển sang màu
vàng, bắt đầu bằng các mảng ở mép lá. Màu vàng tiến triển từ lá già đến lá non cho đến khi chỉ lá ở giữa
mới xòe hoặc xòe một phần lá, phần lá còn lại dựng đứng và có màu xanh. Các triệu chứng khác bao gồm
các mép lá non không đều, nhợt nhạt và lớp lá bị nhăn và biến dạng.
Triệu chứng bên trong của bệnh héo vàng chuối được đặc trưng bởi sự đổi màu của mạch xylem:
bắt đầu với sự ố vàng của rễ và mô mạch, các sợi vàng, đỏ, nâu phát triển liên tục trong thân giả (Moore
& cs., 1995). Giai đoạn đầu của bệnh là sự đổi màu từ một hoặc hai sợi trong bẹ lá già nhất lớp ngoài
cùng của thân giả, dần đến sự đổi màu nặng hơn trên khắp thân giả và cuống quả trong giai đoạn bệnh sau
này. Sự đổi màu thay đổi từ màu vàng nhạt ở giai đoạn đầu sang màu đỏ sẫm, nâu hoặc gần như đen ở
giai đoạn sau. Sự đổi màu rõ rệt nhất ở thân rễ trong khu vực có mạch xylem dày đặc ở vùng củ và thân

giả.
2.1.3. Tác hại của bệnh héo vàng chuối
Bệnh đã lây lan rất rộng ở khắp các vùng trồng chuối tại châu Á, châu Phi, Úc, Nam Mỹ và Trung Mỹ
gây ra những thiệt hại nặng nề cho ngành công nghiệp xuất khẩu chuối, phá hủy khoảng 40.000ha chuối trong
những năm đầu nửa thế kỷ 20 (Stover, 1962). Chủng 4 đã từng phá hủy 23.000ha chuối Cavendish ở Đài Loan
những năm 70 của thế kỷ hai mươi (Su & cs., 1977) và hàng ngàn ha chuối Cavendish của các đồn điền sản
xuất thương mại ở các nước như Philippine. Indonesia, Malaysia, Australia, Nam Phi, Canary Islands đã
không cho thu hoạch do dịch bệnh trầm trọng của chủng Foc-TR4 (VCG 01213) (Nasdir, 2003), gây thiệt hại
hàng trăm triệu đô la trong sản xuất, kể cả các nông hộ nhỏ. Các đồn điền trồng chuối khác ở Kiepersol và
Nam KwaZulu-Natal (KZN) - Nam Phi, thiệt hại 30% diện tích trong những năm 1991 - 2000 (Viljoen, 2002).
2.1.4. Nghiên cứu dịch tễ học và sinh thái học nấm Fusarium
Nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) là một loại nấm tồn tại trong đất, Foc xâm nhập vào
hệ thống rễ, từ đó nó di chuyển vào mơ mạch dẫn đến thối hóa dần. Khi đến thân củ, bệnh héo rũ xảy ra
cuối cùng, dẫn đến cái chết của cây bị nhiễm bệnh (Stover, 1962a). Fusarium có cơ quan sinh trưởng phân
nhánh, dạng sợi. Thể dinh dưỡng của chúng là một tản nấm được tạo thành từ nhiều sợi nấm đơn bào
(khơng có màng ngăn) và đa bào (có màng ngăn) tập hợp lại với nhau. Thể sợi của nấm thường không màu
hoặc chuyển màu nâu khi già. Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ (Iori Inoue &
cs., 2002).
Con đường xâm nhập của nấm bệnh gây héo vàng chuối thông qua các bó mạch xylem bắt đầu từ
rễ (Zhang & cs., 2018). Sự lây nhiễm đi qua các rễ cấp 2 hoặc cấp 3 chứ khơng phải rễ chính (Trujillo,
1963). Ngồi ra, Foc đã được chứng minh là có khả năng lây lan theo nhiều cách khác nhau, thơng qua
cơn trùng chích hút bị nhiễm bệnh là hiệu quả nhất (Stover, 1962). Nấm bệnh gây hại ở tất cả các giai
đoạn sinh trưởng và trên hầu hết các bộ phận của cây chuối (Ploetz, 2015). Cây bị nhiễm bệnh không tạo
ra buồng quả và nếu được thì quả rất nhỏ, khơng phát triển (Pushpavathi & cs., 2016).

3


2.2. NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG LOÀI FUSARIUM GÂY BỆNH HÉO VÀNG CHUỐI
Trong hệ thống Fusarium, Foc thuộc phức hệ loài Fusarium oxysporum (FOCS). Nghiên cứu phân

loại Foc dựa trên phân tích phân tử được nghiên cứu từ những năm 1990. Nghiên cứu trước đây Foc bao
gồm một số dịng vơ tính có thể khác xa về mặt di truyền. Nghiên cứu của O’Donnell & cs. (1998) với
mục tiêu xác định mối quan hệ phát sinh gene giữa các chủng F. oxysporum gây bệnh héo vàng chuối và
xác định xem liệu tập hợp các chủng đặc trưng cho chuối có phải là hậu duệ của một tổ tiên chung duy
nhất hay không. Nghiên cứu đã tập hợp các chủng từ những dòng khác nhau, như được chỉ định bởi dữ
liệu RFLP (Koenig & cs., 1997), đã được chọn để phân tích trình tự DNA trực tiếp cùng với các chủng F.
oxysporum phân lập hoặc là tác nhân gây bệnh trên các vật chủ khác hoặc được cho là không gây bệnh.
Nghiên cứu thực hiện trên 33 mẫu F. oxysporum được thu thập trên chuối. Sử dụng phương pháp phân
tích phân tử bằng cách so sánh trình tự DNA (rDNA) của các gene nhân (mtSSU) và ty thể (tef-1α). Kết
quả nghiên cứu này chỉ ra, các chủng F. oxysporum gây bệnh ở chuối khơng phải là lồi đơn ngành và
dường như có nhiều nguồn gốc tiến hóa độc lập gây ra, mỗi dịng vơ tính có thể được cho là có các đặc
tính gây bệnh độc nhất.
2.3. PHỊNG CHỐNG SINH HỌC NẤM Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4 (Foc-TR4)
TRÊN CHUỐI
Bệnh héo vàng chuối do nấm Fusarium oxysporum f. sp cubense (Foc) là một trong những loại
bệnh gây hại nặng nề đối với chuối, ảnh hưởng lớn tới ngành sản xuất chuối toàn cầu. Đặc biệt, chủng
Foc-TR4 là mối đe dọa lớn nhất đối với ngành sản xuất chuối, có thể lây nhiễm vào hơn 80% các giống
chuối (Ghag & cs., 2015; Zhang & cs., 2019). Bệnh hại đã được tìm thấy ở các vùng sản xuất chuối lớn ở
các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Ghag & cs., 2015).
Việc quản lý hiệu quả và lâu dài đối với bệnh héo vàng chuối vẫn còn là thách thức, phần lớn do
cây ký chủ lâu năm và nấm bệnh tồn tại lâu trong đất (Ploetz & Evans, 2015). Hiện nay phương pháp
kiểm soát sinh học, bao gồm việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng như Trichoderma, Pseudomonas,
Bacillus, Paecilomyces, VAM, v.v., đưa ra một giải pháp thay thế phù hợp và tốt nhất để chống lại bệnh từ
đất như bệnh héo Fusarium trên chuối.
2.4. NGHIÊN CỨU BỆNH HÉO VÀNG CHUỐI Ở VIỆT NAM
Fusarium là một trong những chi nấm gây bệnh thực vật quan trọng nhất ảnh hưởng đến việc canh
tác nhiều loại cây trồng. Tổn thất nông nghiệp do nấm Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) ảnh
hưởng trực tiếp đến thu nhập, sinh kế và dinh dưỡng của nông dân trên toàn thế giới. Đối với Việt Nam,
những dự đoán về tác động của Foc trong tương lai là rất lớn, với ước tính tổn thất trong diện tích sản
xuất chuối là 8% trong vòng 5 năm tới và lên tới 71% trong vòng 25 năm tới (Segura & cs., 2018).

Đã có mộ số kết quả nghiên cứu về bệnh héo vàng chuối của các tác giả Vakili & cs. (1968),
Mai Văn Trị (1997), Bentley & cs. (1998), Vinh & cs. (2001), Zheng & cs. (2018), Mostert & cs.
(2017), Trần Ngọc Hùng & cs. (2018), Khonesavanh & cs. (2022)…

PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1) Điều tra, đánh giá hiện trạng, thu thập và phân lập mẫu bệnh héo vàng chuối ở miền Bắc. 2)
Đánh giá đa dạng loài Fusarium gây bệnh héo vàng chuối ở một số tỉnh miền Bắc và Thanh Hóa, Nghệ
An. 3) Nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của chủng Foc-TR4. 4) Đánh giá hiệu lực ức chế
sinh trưởng tản nấm của một số vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện invitro. 5) Đánh
giá hiệu lực phòng chống của một số vi sinh vật đối kháng đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện nhà lưới.
3.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Phƣơng pháp điều tra, đánh giá hiện trạng, thu thập và phân lập mẫu bệnh héo vàng chuối ở
miền Bắc
Phương pháp điều tra mức độ phổ biến và hiện trạng của bệnh héo vàng chuối thực hiện theo Quy
chuẩn kỹ thuật Quốc gia QCVN 01-38: 2010/BNN & PTNT về phương pháp điều tra phát hiện sinh vật
hại cây trồng (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2010) và theo phương pháp nghiên cứu BVTV (Quyển số 1).
Phương pháp phân lập, xác định đặc điểm hình thái và bảo quản nguồn bệnh theo Moore & cs.,
1995; Abd-Elsalam & cs., 2010
Phương pháp nuôi cấy, phân lập, đánh giá đặc điểm hình thái chủng Foc-TR4 theo (Nirenberg,
1981), (Pérez & cs., 2003).

4


3.2.2. Phƣơng pháp đánh giá đa dạng loài Fusarium bằng giải trình tự đoạn gene rbp1, rbp2 và
tef1α các mẫu bệnh héo vàng chuối
Tách chiết DNA mẫu bệnh héo vàng chuối theo phương pháp của Lin & cs. (2008); Dellaporte & cs.
(1983).
Phản ứng PCR: Khuếch đại vùng gene rpb1, rpb2 được thiết kế bởi O'Donnell K. & cs. (2010),

vùng gene teflα được thiết kế bởi O'Donnell & cs. (1998).
Xác định chủng gây bệnh héo vàng chuối và so sánh các mẫu bệnh héo vàng chuối mới được thu
thập với các VCGs đã biết theo Ordonez & cs. (2015).
Đánh giá đa dạng lồi Fusarium bằng giải trình tự các đoạn gene rbp1, rbp2 và tef1α các mẫu bệnh
héo vàng chuối được tiến hành bởi Công ty Macrogene (Macrogene, Seoul, Hàn Quốc). : Mơ hình lập dữ
liệu nucleotide phù hợp nhất đã được chọn bằng jModelTest 2.1.4. (Posada, 2008). Các phân tích trên ba vùng
dữ liệu riêng lẻ và một ma trận dữ liệu kết hợp được thực hiện với MrBayes v3.2.6 (Ronquist & cs., 2012). Sử
dụng cách tiếp cận mơ hình hỗn hợp để áp dụng các mơ hình tiến hóa khác nhau trên từng vùng DNA của bộ
dữ liệu kết hợp (Ronquist & Huelsenbeck, 2003).
So sánh dựa trên độ phân giải và giá trị hỗ trợ cho từng cấu trúc liên kết gene đơn lẻ bằng cách
tiến hành kiểm tra ILD (Farris & cs., 1995). Được thực hiện bằng phần mềm Swofford 2003.
Mối quan hệ phát sinh lồi được tìm kiếm trong mỗi cấu trúc liên kết được hỗ trợ bởi giá trị hỗ trợ
khả năng tối đa (ML> 70%) (Johnson & Soltis, 1998; Pirie, 2015). Các phân tích ML được thực hiện theo
thuật tốn tìm kiếm RAxML (Stamatakis, 2014).
Sử dụng phương pháp thống kê Bootstrap để đánh giá mức độ tin cậy của cây phát loài.
3.2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học và tính gây bệnh của chủng Fusarium oxysporum
f. sp. cubense tropical race 4 (Foc-TR4)
Nghiên cứu ảnh hưởng của 6 mức nhiệt độ (15oC, 20oC, 25oC, 30oC, 35oC và 40oC), và 9 công thức
pH tương ứng với 9 mức pH (4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,0), được bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu
nhiên (CRD), mỗi cơng thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần 5 đĩa Petri. Chủng nấm Foc-TR4 được nuôi cấy trên
các môi trường PDA trong điều kiện 25oC ±2oC, 12 giờ chiếu sáng/ ngày. Theo dõi tốc độ phát triển tản
nấm và số lượng bào tử hình thành ở các thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày sau cấy.
Xác định tính gây bệnh của chủng Foc-TR4: Các bước lây bệnh được thực hiện theo quy tắc
Koch. Đánh giá khả năng gây độc của nấm Foc-TR4 theo phương pháp Moore & cs. (1995). Chỉ tiêu theo
dõi theo đánh giá của Kristle Grace I. & cs. (2020).
3.2.4. Phƣơng pháp đánh giá hiệu lực ức chế sinh trƣởng tản nấm của một số vi sinh vật đối kháng
đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện invitro
Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số vi khuẩn đối kháng Bacillus velenzesis
đến chủng Foc-TR4: Thí nghiệm gồm 4 cơng thức với 4 lồi vi khuẩn: YB9, ĐTK1, YB4 và YB11. Thí
nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp 5 đĩa.

Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số nguồn nấm đối kháng Trichoderma
asperellum đến chủng Foc-TR4 gồm 3 công thức.
Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của một số chủng nấm Chaetomium globosum đến
chủng Foc-TR4 gồm 4 công thức với các chủng nấm đối kháng (Chae 1, ĐT 13, Chae 15 và C10).
Đánh giá hiệu lực ức chế sinh trưởng tản nấm của Trichoderma harzianum, Bacillus subtilis và
Streptomyces misionensis đến chủng Foc-TR4 và Foc-R1.
Đánh giá giá hiệu lực phòng chống của một số vi sinh vật đối kháng với 4 công thức (Trichoderma
harzianum, Chaetomium ketomium, SH-BV1 (Trichoderma spp.) + Streptomyces spp. + Bacillus subtilis
và vi khuẩn Microtech-1 (NL) (Bacillus subtilis): đến chủng Foc-TR4 trong điều kiện nhà lưới
3.3. PHƢƠNG PHÁP TÍNH TỐN VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU
- Kỹ thuật phân tích số liệu thống kê qua các chương trình phần mềm Geneeious Prime (Biomatters,
New Zealand).
- Sử dụng phương pháp thống kê Bootstrap để đánh giá mức độ tin cậy của cây phát sinh loài
(Zharkikh & Li, 1995).
- Số liệu thí nghiệm được tính tốn, xử lý thống kê theo phương pháp phân tích sai khác giữa các cơng
thức thí nghiệm được xử lý bằng phương pháp so sánh Duncan trong phần mềm IRRISTAT phiên bản 5.0.

5


PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ĐIỀU TRA, ĐÁNH GIÁ HIỆN TRẠNG, THU THẬP VÀ PHÂN LẬP MẪU BỆNH HÉO
VÀNG CHUỐI
4.1.1. Hiện trạng bệnh héo vàng chuối tại các tỉnh miền Bắc
Kết quả điều tra hiện trạng cho thấy, bệnh héo vàng chuối là bệnh phổ biến xuất hiện ở tất cả các
vùng điều tra, hiện đang là bệnh nguy hiểm nhất gây hại trên chuối, bệnh hại trên hầu hết các giống chuối
được điều tra như chuối tây, chuối tiêu, chuối goong, chuối mốc… thậm chí bệnh xuất hiện cả trên chuối
dại.
4.1.2. Mức độ phổ biến của bệnh héo vàng chuối tại một số tỉnh miền Bắc theo vùng địa lý
Mức độ phổ biến của bệnh héo vàng chuối đều ghi nhận ở hầu hết các vùng địa lý. Bệnh xuất hiện

và gây hại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây chuối và được chi nhận, tần xuất bắt gặp bệnh gây
hại là rất phổ biến ở tất cả các tỉnh điều tra (10 - 25%) thậm chí (> 35%).
4.1.3. Mức độ gây hại của bệnh héo vàng chuối tại một số tỉnh theo vùng địa lý
Bệnh hại tăng dần theo các năm duy trì vườn chuối, thường gây hại nặng ở ruộng chuối trồng
năm thứ 2 - 3 trở đi. Phân tích hệ số tương quan (r) để tính chỉ số đo lường mức độ tương quan tuyến
tính giữa hai biến tỷ lệ bệnh (%) và cấp bệnh trung bình. Kết quả phân tích cho thấy hệ số số tương quan
có giá trị trong khoảng từ -1,0 đến 1,0.
Mức độ gây hại ở giai đoạn 2018 - 2019 cho hệ số tương quan r = 0,75, giai đoạn 2020 - 2021 là r =
0,71. Điều này cho thấy mức độ gây hại của bệnh héo vàng Fusarium trên chuối tại một số tỉnh miền Bắc năm
2018 có mối tương quan thuận giữa tỷ lệ bệnh (%) và cấp bệnh trung bình. Cả hai chỉ số di chuyển theo cùng
một hướng. Khi chỉ số tương quan gần +1,0, tương quan chặt, chúng di chuyển song song. Có nghĩa là tỷ lệ
bệnh tăng (%) thì cấp bệnh trung bình cũng tăng.
4.1.4. Kết quả thu thập mẫu bệnh héo vàng chuối tại các tỉnh
Kết quả phân lập các mẫu bệnh cho thấy: trong số 57 mẫu bệnh thu được, thông qua sàng lọc, lấy
đại diện 19 mẫu bệnh (chiếm 33,3%) được thu thập tại 10 tỉnh đại diện cho 4 vùng địa lý khác nhau và
trên các giống chuối khác nhau. Các mẫu bệnh sau khi phân lập đã được làm thuần và bảo quản để phục
vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. Danh sách các mẫu được trình bày tại bảng 4.1.
. Bảng 4.1. Danh sách mẫu bệnh héo vàng Fusarium đƣợc lựa chọn
TT

Ký hiệu
mẫu

1
2
3
4
5
6
7

8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

FOC1
FOC2
FOC4
FOC5
FOC6-1
FOC7
FOC10
FOC11
FOC16
FOC18
FOC21
FOC23-2
FOC24
FOC25-1
FOC25-2
FOC38
FOC56

FOC58
FOC 61

Nơi thu
Yên Bình, Quang Bình, Hà Giang
Yên Thắng, Lục Yên, Yên Bái
Ngòi A, Văn Yên, Yên Bái
Đại Sơn, Văn Yên, Yên Bái
Đại Sơn, Văn Yên, Yên Bái
Lâm Giang, Văn Yên, Yên Bái
Phú Nhuận, Bảo Thắng, Lào Cai
Khánh Yên, Văn Bàn, Lào Cai
Hồng An, Hiệp Hịa, Bắc Giang
Hồng Thanh, Hiệp Hịa, Bắc Giang
Thịnh Long, Hải Hậu, Nam Định
Thành Châu, Phủ Lý, Hà Nam
Hưng Thanh, Tuyên Quang
Lệ Chi, Gia Lâm, Hà Nội
Lệ Chi, Gia Lâm, Hà Nội
Nghĩa Tân, Nghĩa Đàn, Nghệ An
Trâu Quỳ, Gia Lâm, Hà Nội
Minh Tân, Vụ Bản, Nam Định
Hồng Châu, Yên Lạc, Vĩnh Phúc

6

Tên giống

Hệ
gene


Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tây
Musa lutea
Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tây
Chuối Tiêu

ABB
ABB
ABB
M.lutea
ABB
ABB
ABB
ABB
ABB

ABB
ABB
ABB
ABB
ABB
ABB
ABB
ABB
ABB
AAA

Tuổi
vƣờn
chuối
2
2
2
2
2
3
3
2
2
2
3
1
3
3
3
2

2
2

Triệu chứng
Tồn bộ lá vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng
Lá phía dưới vàng


4.1.5. Nghiên cứu đặc điểm hình thái phân tử của nấm Fusarium
4.1.5.1. Nuôi cấy, phân lập các mẫu bệnh héo vàng chuối và phân nhóm dựa vào đặc điểm hình thái
Các đặc điểm hình thái cho đến nay vẫn là tiêu chí được sử dụng phổ biến nhất để xác định các loài
Fusarium. Đặc biệt là sự khác biệt về hình dạng của bào tử lớn, đây là tiêu chí là trọng tâm để nhận dạng
nhiều loài Fusarium (Leslie & Summerell, 2006).

Trong nghiên cứu này, tất cả 19 mẫu bệnh héo vàng thu thập được nuôi cấy và đánh giá trên 4 môi
trường dinh dưỡng khác nhau: PDA, SNA, OMA và CLA, nhiệt độ từ 25 - 28oC. Được mô tả theo
Groenewald & cs. (2006) và so sánh với bảng màu của Rayner (1970).
Trên môi trường CLA, tạo ra các bào tử lớn có kích thước và hình dạng đồng nhất. Trên mơi trường
SNA, hình thái của bào tử lớn đơi khi có kích thước kém đồng đều hơn so với CLA. Môi trường OMA sản
sinh nhiều bào tử nhỏ, kích thước đồng đều, bào tử lớn và bào tử hậu ít, kích thước khơng đồng đều. Trên
mơi trường PDA, đối với tất cả các mẫu phân lập, quan sát thấy bào tử lớn đều có từ 2 - 5 vách ngăn với kích
thước đo được ghi lại ở 38 đến 48 μM × 2 đến 5 μM, phần lớn có 2 - 3 vách ngăn, hình lưỡi liềm, thường
được hình thành muộn hơn bào tử nhỏ, thành mỏng. Bào tử được hình thành 3 - 4 ngày sau ni cấy trên
mơi trường PDA, đồng thời được hình thành đơn lẻ hoặc hình thành cụm bào tử trên hệ sợi nấm. Bào tử nhỏ
có hình bầu dục, hình thận, có 0 - 1 vách ngăn có kích thước từ 5 đến 10 μM × 0 đến 1 μM. Bào tử hậu hình
trịn và có thành dày (bảng 4.2)
Leslie & Summerell (2006) cho biết thêm một số đặc điểm được sử dụng để nhận dạng các loài
Fusarium. Nổi bật nhất trong số các đặc điểm này là sắc tố. Trong nghiên cứu này đã sử dụng bảng màu của
Rayner, (1970) để so sánh các màu có thể so sánh được, để phân biệt màu sắc tản nấm và sợi nấm, sử dụng
các thuật ngữ chung hơn như “đỏ”, “nâu”, “tím”, “cam”, “vàng”, “xám” và “trắng” như các chất chỉ thị màu.
Sự khác biệt đã được quan sát qua hình thái và màu sắc tản nấm. Dựa trên đặc điểm hình thái cho thấy
sự khác biệt. Đã xác định được 4 nhóm hình thái.
4.1.5.2. Phân nhóm mẫu bệnh héo vàng chuối dựa vào đặc điểm hình thái
Dựa vào đặc điểm ni cấy, đặc điểm hình thái và sắc tố tản nấm để phân nhóm hình thái. Đặc điểm
hình thái là đặc điểm quan trọng để khẳng định, các mẫu bệnh héo vàng chuối phân lập được xác định là
loài Fusarium oxysporum. Chỉ duy nhất mẫu FOC58 tản nấm có màu tím nhạt ở giữa và dần trở thành
màu trắng phía bên ngồi với bề mặt tản nấm khơ, quan sát khơng có bào tử hậu, mẫu phân lập khơng
thuộc tổ hợp lồi FOCS mà thuộc phức hợp loài FFSC, loài Fusarium fujikuroi (bảng 4.3).
Bảng 4.3. Kết quả phân nhóm hình thái các mẫu bệnh héo vàng chuối đƣợc thu thập
Hệ gene

Mẫu bệnh héo
vàng chuối


Số lƣợng
mẫu

Nhóm
hình thái

Tỷ lệ
(%)

Chuối Tây
M.lutea

ABB,
M.lutea

FOC1, FOC2,
FOC5, FOC6-1,
FOC7, FOC11,
FOC16, FOC18,
FOC21, FOC23-2,
FOC24, FOC25-1,
FOC25-2, FOC38

14

I

74,0

Yên Bái, Lào Cai


Chuối Tây

ABB

FOC4, FOC10

2

II

10,5

3

Hà Nội, Vĩnh
Phúc

Chuối Tây,
Chuối Tiêu

ABB,
AAA

FOC56, FOC61

2

III


10,5

4

Nam Định

Chuối Tây

ABB

FOC58

1

IV

5,0

TT

Địa điềm

1

Hà Giang, Yên
Bái, Lào Cai,
Bắc Giang, Nam
Định, Hà Nam,
Tuyên Quang,
Hà Nội, Nghệ

An

2

Giống
chuối

7


Bảng 4.2. Đặc điểm hình thái của các mẫu bệnh héo vàng chuối đƣợc thu thập trên môi trƣờng PDA
Số
TT

Bào tử

Tên giống

Nhóm
hình thái

Màu sắc tản
nấm

Bào tử lớn
(μm)

Số vách
ngăn


nhỏ (μm)

Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Musa lutea
Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Chuối Tây/ABB
Chuối Tiêu/AAA
Chuối Tây/ABB

I
I
I
I
I
I
I
I

I
I
I
I
I
I
II
II
III
III
IV

Tím ở giữa
Tím ở giữa
Tím ở giữa
Tím ở giữa
Tím ở giữa
Tím ở giữa
Tím ở giữa
Tím ở giữa
Tím ở giữa
Tím ở giữa
Tím ở giữa
Tím ở giữa
Tím ở giữa
Tím ở giữa
Tím sẫm ở giữa
Tím sẫm ở giữa
Trắng
Trắng

Tím nhạt ở giữa

38-48 × 2-5
40-45 × 2-5
40-46 × 2-5
40-46 × 2-5
39-48 × 2-5
38-47 × 2-5
38-48 × 2-5
38-45 × 2-5
39-45 × 2-5
40-47 × 2-5
39-46 × 2-5
38-46 × 2-5
38-48 × 2-5
38-48 × 2-5
38-43 × 2-5
40-45 × 2-5
39-47 × 2-5
38-47 × 2-5
38-46 × 2-5

2-5
2-5
2-5
2-5
2-5
2-5
2-5
2-5

2-5
2-5
2-5
2-5
2-5
2-5
2-5
2-5
2-5
2-5
2-5

5-10 × 0-1
5-10 × 0-1
5-10 × 0-1
5-8 × 0-1
5-10 × 0-1
5-10 × 0-1
5-8 × 0-1
5-7 × 0-1
6-8 × 0-1
5-10 × 0-1
6-9 × 0-1
5-10 × 0-1
7-8 × 0-1
6-8 × 0-1
6-8 × 0-1
5-7 × 0-1
6-9 × 0-1
5-10× 0-1

5-10 × 0-1

8

8

Bào tử hậu
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Hình trịn, vách dày
Khơng xuất hiện

8

1

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19

Mẫu bệnh
héo vàng
chuối
FOC1
FOC2
FOC5
FOC6-1
FOC7
FOC11
FOC16
FOC18

FOC21
FOC23-2
FOC24
FOC25-1
FOC25-2
FOC38
FOC4
FOC10
FOC56
FOC 61
FOC58


Nhóm hình thái I: gồm 14 mẫu (chiếm 74,0%) là FOC1, FOC2, FOC5, FOC6-1, FOC7, FOC11, FOC16,
FOC18, FOC21, FOC23-2, FOC24, FOC25-1, FOC25-2, FOC38 được thu từ 9 tỉnh Hà Giang, Yên Bái,
Lào Cai, Bắc Giang, Nam Định, Hà Nam, Tuyên Quang, Hà Nội, Nghệ An, trên giống Chuối Tây (ABB)
và chuối dại M.lutea. Nhóm này đặc trưng bởi màu tím ở phần trung tâm, màu trắng xám xung quanh.
Nhóm hình thái II: gồm 2 mẫu (chiếm 10,5%) là FOC4 và FOC10 được thu tại hai tỉnh Yên Bái và tỉnh
Lào Cai trên giống Chuối Tây (ABB). Tản nấm có một điểm nhỏ màu tím sẫm ở giữa, chuyển dần sang
màu trắng ở phía ngồi. Nhóm hình thái III: gồm 2 mẫu (chiếm 10,5%) là FOC56 và FOC61 được thu
tại Hà Nội và Vĩnh Phúc trên 2 giống Chuối Tây (ABB) và Chuối Tiêu (AAA). Màu sắc tản nấm được
đặc trưng bởi màu trắng, khơng có sắc tố. Nhóm hình thái IV: gồm 1 mẫu FOC58 (chiếm 5,0%) được thu
tại Nam Định trên giống Chuối Tây (ABB). Nhóm này nằm giữa nhóm thứ nhất và thứ hai, tản nấm màu tím
nhạt ở giữa dần trở thành màu trắng ở phía ngồi.
4.1.6. Kết quả nghiên cứu bệnh héo vàng trên chuối dại
Trong nghiên cứu này, kết quả khi phân lập mẫu FOC5 được thu từ chuối dại M.lutea cho thấy
chủng Foc-Race 1 cũng đã được xác định có mặt. Phân tích hình thái phân tử mẫu FOC5 thuộc nhóm F.
tardichlamydosporum gây ra bên cạnh việc có mặt của lồi này trên giống chuối tây ABB. Như vậy, F.
tardichlamydosporum cũng có nguồn gốc từ mẫu nhiễm bệnh héo vàng trên một loài Musa lutea hoang
dại, cho thấy tầm quan trọng của chuối hoang dại như một vật chủ có thể có đối với Foc.

4.1.7. Nhận dạng chủng Fusarium (Foc) thơng qua nhóm tƣơng thích VCGs
Dựa trên đặc điểm hình thái phân tử, cây phân loại phát sinh loài Maryani & cs. (2019a) và sự
tương thích của các mẫu cùng với sự có mặt trong cùng một nhánh của các VCG’s (bảng 4.11). Các
chủng phân lập trước đó được xác định là Foc-TR4 sử dụng phân tích hình thái-phân tử đã được bắt
cặp với các VCG 01213, 01216 và 01213/16. Kết quả phân tích gene các mẫu nấm héo vàng
Fusarium chuối được dự đoán 1/19 mẫu (FOC61 - Chuối tiêu) thuộc chủng Foc-TR4.
Bảng 4.4. Xác định các chủng Fusarium dựa trên nhóm VCGs
TT

Mẫu bệnh héo
vàng chuối

Hệ
gene

Số
lƣợng
mẫu

Chủng
gây
bệnh

VCGs

Nhóm

Tỷ lệ
(%)


1

FOC56, FOC61

ABB,
AAA

2

Foc-TR4

01213.
01216

F. odoratissimum

10,5

2

FOC1,
FOC2,
FOC5,
FOC6–1,
FOC7,
FOC11,
ABB,
FOC16,
FOC18,
M. lutea

FOC21, FOC23–2,
FOC24, FOC25–1,
FOC25–2

13

FocRace1

0125

F. tardichlamydosporum

68,4

3

FOC38

ABB

1

01223. 1217

F. duoseptatum

5,3

4


FOC4, FOC10

ABB

2

01221

F. cugeneangenese

10,5

5

FOC58

ABB

1
19

F. fujikuroi

5,3
100

Tổng

FocRace1
FocRace2


Nghiên cứu đã xác định chủng Foc-TR4 chiếm 10,5%, tuy nhiên đây là chủng nguy hiểm nhất gây
hại trên chuối tiêu - giống chuối có giá trị xuất khẩu. Vì vậy, nghiên cứu đã sử dụng chủng Foc-TR4 (đại
diện là mẫu FOC61) cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.1.8. Sự phát triển của chủng Foc-TR4 trên các môi trƣờng ni cấy
Để nghiên cứu hình thái, đặc điểm sợi nấm, đặc điểm bào tử của chủng Fusarium oxysporum f. sp. cubense
tropical race 4 (Foc-TR4). Chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự phát triển của chủng nấm trên 4 môi trường dinh
dưỡng riêng biệt PDA, SNA, CLA và OMA. Kết quả được thể hiện ở bảng 4.5.

9


Bảng 4.5. Ảnh hƣởng của các môi trƣờng tới sự phát triển của nấm Foc-TR4
Đƣờng kính tản nấm (mm) sau khi cấy

Màu sắc tản nấm

Môi
trƣờng

2 ngày

4 ngày

6 ngày

8 ngày

10 ngày


PDA

26,00ab

45,83a

63,83a

77,83a

90,00a

SNA

21,83c

41,50b

51,83b

62,33b

72,33b

CLA

20,83c

39,67b


48,5c

59,33c

69,67d

OMA

26,83a

41,67b

49,50c

60,00bc

70,83c

LSD0,05

1,38

2,64

1,66

2,66

0,92


Tản nấm màu tím nhạt, sợi nấm
bơng, xốp.
Màu trắng, sợi nấm bông, mọc dày
đặc trên giấy thấm.
Màu trắng, sợi nấm bông, mọc dày
đặc trên lá cẩm chướng.
Tản nấm màu tím nhạt, sợi nấm
bông, xốp

Ghi chú: a,b,c,d là chỉ số dùng để so sánh sự sai khác có ý nghĩa giữa các công thức sau các ngày nuôi cấy.
Nghiên cứu đã chứng minh rằng việc sản sinh bản tử lớn và bảo tử nhỏ của nấm Fusarium được
kích thích bởi sự hiện diện của các hợp chất cellulose như trong môi trường CLA, giấy lọc và các mảnh lá
cẩm chướng (Fisher & cs., 1983; Leslie & Summerell, 2006; Tiedt & Jooste, 1988). Việc sử dụng
carboxymethyl cellulose trong môi trường nuôi cấy cũng có thể có ý nghĩa trong q trình tạo bào tử vì
các hợp chất xenlulo có thể kích thích q trình tạo bào tử ở các lồi Fusarium (Mansour & cs., 2012;
Ohara & cs., 2004). Quan sát các đặc điểm hình thái như màu sắc tản nấm, số lượng bào tử vơ tính (bào
tử lớn, bào tử nhỏ và bào tử hậu) cho kết quả phù hợp với nghiên cứu của (Leslie & Summerell, 2006).
Kết quả nghiên cứu được mô tả trong bảng 4.6.
Bảng 4.6. Ảnh hƣởng của các môi trƣờng đến sự sản sinh bào tử của chủng Foc-TR4
Nhóm hình thái

I

II

III

IV

MT ni cấy

PDA
SNA
CLA
OMA
PDA
SNA
CLA
OMA
PDA
SNA
CLA
OMA
PDA
SNA
CLA
OMA

Bào tử nhỏ
2 x 106
2 x 106
1 x 106
2 x 106
2 x 106
2 x 106
1 x 106
1 x 106
2 x 106
2 x 106
1 x 106
1 x 106

1 x 106
1 x 106
1 x 106
1 x 106

Số lƣợng bào tử
Bào tử lớn
1 x 106
1 x 106
2 x 106
1 x 106
1 x 106
1 x 106
2 x 106
2 x 106
2 x 106
1 x 106
2 x 106
2 x 106
2 x 106
2 x 106

Bào tử hậu
1 x 106
1 x 106
1 x 106
2 x 106
1 x 106
1 - 2 x 106
1 - 2 x 106

1 x 106
1 x 106
1 - 2 x 106
1 - 2 x 106
1 - 2 x 106
-

Chú thích: -: khơng hình thành bào tử , +: Số lượng bào tử ít (<1 x 106 bào tử/ ml), ++: Số lượng bào tử
trung bình (1 - 2 x 106 bào tử/ ml), +++: Số lượng bào tử nhiều (> 2 x 106 bào tử/ ml)
4.2. ĐA DẠNG LOÀI FUSARIUM HẠI CHUỐI TẠI CÁC TỈNH MIỀN BẮC VÀ MỘT SỐ TỈNH
4.2.1. Khuếch đại vùng gene rbp1, rbp2 và tef1α của 19 mẫu bệnh héo vàng chuối
Xác định chủng bằng cách sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu cho các gene rbp1, rbp2 và teflα xác
định chủng đã được thực hiện. Bộ khuếch đại PCR từ sự khuếch đại các đoạn gene rbp1, rbp2 và tef1α có
kích thước gene lần lượt là 1.607bp, 1.700-1.742bp và 639-683bp (hình 4.1), trình tự chất lượng sẽ được
sử dụng để phân tích phát sinh lồi.
Phản ứng PCR đã được thực hiện trên 19 mẫu bệnh héo vàng chuối được thu thập tại 10 tỉnh thuộc 4
vùng địa lý Đông Bắc, Tây Bắc, Đồng bằng Sông Hồng và Bắc Trung Bộ. Sau khi tách chiết DNA tinh sạch từ

10


các mẫu nấm Fusarium. Các mẫu nấm được thực hiện phản ứng PCR trên 3 đoạn gene rbp1, rbp2 và tef1α bằng
các cặp mồi tương ứng Fa/G2F, 5f2/7cr và EF-1/EF-2. Hình ảnh các sản phẩm PCR được thể hiện tại hình 4.1.

Hình 4.1. Điện di sản phẩm PCR 3 vùng gene rbp1 (a), rbp2 (b) và tef1α (c) của 19 mẫu bệnh héo
vàng chuối trên agarose 1,5%
4.2.2. Giải trình tự gene các mẫu bệnh héo vàng chuối
Giải trình tự đoạn gene rpb1, rpb2 và teflα của 19 mẫu bệnh héo Fusarium được so sánh với trình
tự tồn bộ hệ gene với dữ liệu trình tự NCBI. Trình tự các đoạn gene lần lượt là 1,578, 917 và 797
nucleotid của 19 mẫu bệnh héo Fusarium trên chuối ở miền Bắc và một số tỉnh của Việt Nam. Trình tự

này đã được phân tích để tìm khung phân loại phát sinh lồi.
4.2.3. Đa dạng lồi Fusarium dựa trên phân tích phân tử
Mối quan hệ phát sinh loài phân tử được suy ra bằng cách giải trình tự từng phần các gene rpb1,
rpb2 và tef1a. Nghiên cứu này áp dụng khái niệm tổ hợp loài FOCS của Maryani & cs. (2019a) nhằm
phân định kỹ hơn các mẫu bệnh nhiễm Foc được thu thập. Phân tích phát sinh lồi của 19 mẫu bệnh héo
vàng phân lập được thu thập trên các giống chuối ở 4 vùng địa lý cho thấy mặc dù đặc điểm hình thái
tổng thể chỉ hướng đến F. oxysporum f. sp. cubense, nhưng rõ ràng chúng có nguồn gốc tiến hóa khác
nhau, kết quả cho thấy tất cả các mẫu phân tích đều thuộc dạng chun hóa (f. sp) là cubense. Kết quả
thể hiện trong bảng 4.8.
Đa dạng loài Fusarium tại Viêt Nam là khá đa dạng. Trong số các mẫu được thu thập tại các vùng địa
lý, Đồng bằng Sông Hồng là nơi có sự đa dạng nhất khi có sự xuất hiện của nhóm F. tardichlamydosporum,
F. odoratissimum thuộc phức hợp lồi FOCS và nhóm F. fujikuroi thuộc phức hợp FFCS. Vùng Tây Bắc
cũng ghi nhận sự xuất hiện của 2 nhóm F. tardichlamydosporum và F. cugeneangenese. Vùng Đơng Bắc
ghi nhận 100% mẫu thu được thuộc nhóm F. tardichlamydosporum và nhóm F. douseptatum chỉ được ghi
nhận ở vùng Bắc Trung Bộ. Trong số 2 nhóm lồi được ghi nhận ở 4 vùng địa lý thì nhóm F.
tardichlamydosporum xuất hiện ở ba vùng Đông Bắc, Tây Bắc và Đồng bằng Sông Hồng.
4.2.4. So sánh độ tƣơng đồng giữa các gene tef1α và rpb2 của các mẫu phân lập
Độ tương đồng của các mẫu nghiên cứu đều được đối chiếu với các trình tự trên Genebank nhằm
tìm lồi tương đồng, đồng thời đảm bảo rằng đoạn gene nhân lên đúng vùng trình tự quan tâm.
4.2.4.1. So sánh trình tự gene tef1α
Phân tích độ tương đồng trình tự của 19 mẫu cho thấy: bao gồm 5 nhóm với mức đồng nhất trình tự
100% trong mỗi nhóm. Kết quả thể hiện trong bảng 4.8. Nhóm I gồm 13 mẫu: FOC6, FOC7, FOC23-2,
FOC24, FOC25-1, FOC25-2, FOC5, FOC21, FOC2, FOC18, FOC16, FOC11 và FOC1 có mức đồng nhất
trình tự cao nhất 100%. Nhóm II gồm 2 mẫu: FOC10 và FOC4 có mức đồng nhất trình tự từ 98,7% đến
100%. Nhóm III gồm 1 mẫu: FOC 38 cho thấy mức đồng nhất trình tự 99% Nhóm IV gồm 2 mẫu: FOC56
và FOC61 có mức đồng nhất trình tự lần lượt là 97,7% và 100%. Nhóm V gồm 1 mẫu: FOC58 có mức
đồng nhất trình tự rất thấp là 91,5% - 91,9%.
4.2.4.2. So sánh trình tự gene rpb2
Phân tích mức đồng nhất trình tự của 19 mẫu cho thấy: bao gồm 6 nhóm với mức đồng nhất trình tự
trong mỗi nhóm từ 93,3-100%. Kết quả thể hiện trong bảng 4.9. Nhóm I gồm 12 mẫu: FOC6, FOC7,

FOC23-2, FOC24, FOC25-1, FOC25-2, FOC5, FOC21, FOC18, FOC16, FOC11 và FOC1 có mức đồng
nhất trình tự cao nhất 100%. Nhóm II gồm 2 mẫu: FOC10 và FOC4 có mức đồng nhất trình tự từ 99,3 99,6%. Nhóm III gồm 1 mẫu: FOC 38 cho thấy mức đồng nhất trình tự từ 99,6 - 99,7%. Nhóm IV gồm 2
mẫu: FOC56 và FOC61 cho thấy mức đồng nhất trình tự từ 99,2 - 99,5% Nhóm V gồm 1 mẫu: FOC58 có
mức đồng nhất trình tự thấp nhất từ 93,3 - 93,8% . Nhóm VI gồm 1 mẫu: FOC2 có mức đồng nhất trình
tự là 98,8%.

11


Nhóm

Mẫu
FOC6
FOC7
FOC23-2
FOC24
FOC25-1
FOC25-2

I

FOC5
FOC21
FOC2
FOC18
FOC16
FOC11
FOC1

II


FOC10
FOC4

III

FOC38

IV

FOC56

FOC6

FOC7

FOC23-2

FOC24

FOC25-1

FOC25-2

FOC5

FOC21

FOC2


FOC18

FOC16

FOC11

FOC1

FOC10

FOC4

FOC38

FOC56

FOC61

FOC58

ID

100

100

100

100


100

100

100

100

100

100

100

100

98,7

98,7

99,0

97,7

97,7

91,9

ID


100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

98,7

98,7

99,0

97,7


97,7

91,9

ID

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

98,7

98,7


99,0

97,7

97,7

91,9

ID

100

100

100

100

100

100

100

100

100

98,7


98,7

99,0

97,7

97,7

91,9

ID

100

100

100

100

100

100

100

100

98,7


98,7

99,0

97,7

97,7

91,9

ID

100

100

100

100

100

100

100

98,7

98,7


99,0

97,7

97,7

91,9

ID

100

100

100

100

100

100

98,7

98,7

99,0

97,7


97,7

91,9

ID

100

100

100

100

100

98,7

98,7

99,0

97,7

97,7

91,9

ID


100

100

100

100

98,7

98,7

99,0

97,7

97,7

91,9

ID

100

100

100

98,7


98,7

99,0

97,7

97,7

91,9

ID

100

100

98,7

98,7

99,0

97,7

97,7

91,9

ID


100

98,7

98,7

99,0

97,7

97,7

91,9

ID

98,7

98,7

99,0

97,7

97,7

91,9

ID


100

99,0

97,7

97,7

91,5

ID

99,0

97,7

97,7

91,5

ID

97,7

97,7

91,8

ID


100

91,6

ID

91,6

FOCc61
V

ID

FOC58

Chú thích: Các trình tự được căn trình tự đa chuỗi bằng Clustal X. ID: identical (đồng nhất: mẫu so với chính nó)

12

Bảng 4.8. Ma trận đồng nhất trình tự gene tef1α của 19 mẫu bệnh héo vàng chuối phân lập đƣợc


Bảng 4.9. Ma trận đồng nhất trình tự gene rbp2 của 19 mẫu bệnh héo vàng chuối phân lập đƣợc
Nhóm
I

Mẫu
FOC23-2
FOC24
FOC21

FOC16
FOC18
FOC6
FOC7
FOC5

13

FOC25-2
FOC25-1
FOC11
FOC1
II

FOC2

III

FOC38

IV

FOC10

FOC23-2

FOC24

FOC21


FOC16

FOC18

FOC6

FOC7

FOC5

FOC25-2

FOC25-1

FOC11

FOC1

FOC2

FOC38

FOC10

FOC4

FOC56

FOC61


FOC58

ID

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

100

99,8

99,7


99,4

99,4

99,3

99,3

93,4

ID

100

100

100

100

100

100

100

100

100


100

99,8

99,7

99,4

99,4

99,3

99,3

93,4

ID

100

100

100

100

100

100


100

100

100

99,8

99,7

99,4

99,4

99,3

99,3

93,4

ID

100

100

100

100


100

100

100

100

99,8

99,7

99,4

99,4

99,3

99,3

93,4

ID

100

100

100


100

100

100

100

99,8

99,7

99,4

99,4

99,3

99,3

93,4

ID

100

100

100


100

100

100

99,8

99,7

99,4

99,4

99,3

99,3

93,4

ID

100

100

100

100


100

99,8

99,7

99,4

99,4

99,3

99,3

93,4

ID

100

100

100

100

99,8

99,7


99,4

99,4

99,3

99,3

93,4

ID

100

100

100

99,8

99,7

99,4

99,4

99,3

99,3


93,4

ID

100

100

99,8

99,7

99,4

99,4

99,3

99,3

93,4

ID

100

99,8

99,7


99,4

99,4

99,3

99,3

93,4

ID

99,8

99,7

99,4

99,4

99,3

99,3

93,4

ID

99,6


99,3

99,3

99,2

99,2

93,3

ID

99,6

99,6

99,5

99,5

93,6

ID

100

99,2

99,2


93,4

ID

99,3

99,3

93,4

ID

100

93,8

ID

93,8

FOC4
V

FOC56
FOC61

VI

ID


FOC58

Chú thích: Các trình tự được căn trình tự đa chuỗi bằng Clustal X. ID: identical (đồng nhất: mẫu so với chính nó)


4.2.5. Tìm kiếm Blast và sơ sở dữ liệu Fusarium-ID.Ver 3.0
Sử dụng phần mềm tìm kiếm trực tuyến BLAST và phần mềm tìm kiếm FUSARIUM-ID.Ver3.0
(Torres-Cruz & cs., 2022), các trình tự đại diện cho các nhóm được xác định.
4.2.5.1. Tìm kiếm Blast gene tef1α
Kết quả tìm kiếm mẫu gần gũi bằng tìm kiếm BLAST và cơ sở dữ liệu FUSARIUM_ID. Ver.3.0
đối với gene tef1α. Các mẫu thuộc phức hợp loài FOCS gồm nhóm I, II, III và IV cho thấy danh tính các
mẫu bệnh héo vàng chuối rất đa dạng. Cụ thể:
Nhóm I gồm 12 mẫu (FOC7, FOC23-2, FOC24, FOC25-1, FOC25-2, FOC5, FOC21, FOC2,
FOC18, FOC16, FOC11 và FOC1). Kết quả tìm kiếm mẫu gần gũi bằng tìm kiếm BLAST đều thuộc
loài F. oxysporum f. sp. cubense. Mức đồng nhất từ 99,1 đến 100%. Phần trăm đoạn so sánh từ 96,3 98,8%. Nhóm II: Hai mẫu FOC4 và FOC10 thuộc nhóm F. oxysporum f. sp. cepae và F. oxysporum. Phần
trăm đoạn so sánh là 100% và mức đồng nhất trình tự 99,9 - 100%. Nhóm III: Mẫu FOC38 là nhóm F.
oxysporum và F. duoseptatum. Phần trăm đoạn so sánh là 100% và mức đồng nhất trình tự 99,9 - 100%.
Nhóm IV: Hai mẫu FOC56 và FOC61 thuộc nhóm F. oxysporum f. sp. sesami và F. oxysporum. Mức
đồng nhất 100%. Phần trăm đoạn so sánh 100%. Nhóm V: Mẫu FOC58 thuộc phức hợp loài FFCS là
loài F. fujikuroi. Phần trăm đoạn so sánh là 98,8% và mức đồng nhất trình tự 97,8 - 99,7%.
4.2.5.2. Tìm kiếm Blast gene rpb2
Kết quả tìm kiếm mẫu gần gũi bằng tìm kiếm BLAST và cơ sở dữ liệu FUSARIUM_ID. Ver.3.0
đối với gene rpb2 (Bảng 4.12). Các mẫu thuộc phức hợp lồi FOCS gồm nhóm I, II, III, IV và VI. Cụ thể:
Nhóm I gồm 12 mẫu (FOC6, FOC7, FOC23-2, FOC24, FOC25-1, FOC25-2, FOC5, FOC21,
FOC18, FOC16, FOC11 và FOC1). Mức đồng nhất từ 99,8 đến 100%. Phần trăm đoạn so sánh 100%.
Nhóm II: Hai mẫu FOC4 và FOC10 thuộc nhóm F. oxysporum. Phần trăm đoạn so sánh là 100% và mức
đồng nhất trình tự 99,9%. Nhóm III: Mẫu FOC38 là nhóm F. oxysporum. Phần trăm đoạn so sánh là 100%
và mức đồng nhất trình tự 100%. Nhóm IV: Hai mẫu FOC56 và FOC61 thuộc nhóm F. oxysporum. Phần
trăm đoạn so sánh là 100% và mức đồng nhất trình tự 100%. Nhóm VI: Mẫu FOC2 thuộc phức hợp loài
FOCS là loài F. oxysporum. Phần trăm đoạn so sánh là 100% và mức đồng nhất trình tự 99,7 - 99,9%.

Nhóm V: Mẫu FOC58 thuộc phức hợp lồi FFCS là loài F. fujikuroi. Phần trăm đoạn so sánh là
100% và mức đồng nhất trình tự 99,9 - 100%.
4.2.6. Phân tích phả hệ
Sử dụng phương pháp Maximum Likelihood để xây dựng cây phát sinh lồi cùng với các trình tự
mới được tạo ra cho 19 mẫu bệnh héo vàng chuối. Kết quả phân tích trình tự dựa trên gene tef1α và cơ sở
dữ liệu FUSARIUM_ID_Ver.3.0 của gene này cho thấy các mẫu nấm Foc chỉ thuộc 2 loài là F.
oxysporum và F. fujkuroi. Để đánh giá mức độ đa dạng của chúng và xác định chính xác danh tính của
chúng, chúng tơi đã phân tích phả hệ sử dụng các trình tự của các mẫu GeneBank đại diện cho 2 phức hợp
lồi FFCS và FOCS. Việc xác định và cơng nhận các lồi trong FOCS có vai trị then chốt trong các lĩnh
vực sinh học như dịch tễ học (Lombard L. & cs., 2019).
Kết quả phân tích trình tự dựa trên trình tự gene tef1α, rpb2, rpb1 và tef1α + rpb2 + rpb1 (hình
4.2; 4.3; 4.4 và 4.5). Tỷ lệ phần trăm của các cây sao chép trong đó các đơn vị phân loại liên kết với nhau
trong thử nghiệm bootstrap (1000 lần lặp lại) được hiển thị bên cạnh các nhánh. Khoảng cách các nhánh
được tính tốn bằng khả năng tổng hợp tối đa và được tính theo đơn vị số lượng thay thế cơ sở trên mỗi vị
trí. Các vị trí được phân thành 5 nhánh thuộc 2 nhóm lồi FOCS và FFCS (hình 4.3). Dựa trên trình tự
gene rpb2 của 19 mẫu bệnh héo vàng chuối (hình 4.4), nhóm phức hợp lồi FOCS được phân làm 4 nhóm
(gồm 18/19 mẫu )và một loài thuộc phức hợp loài FFCS (gồm 1/19 mẫu). Dựa trên trình tự gene rpb1, với
các giá trị có ý nghĩa thống kê được in đậm (≥ 85%/SH-aLRT và ≥ 95%/UFBoot). Các mẫu bệnh héo
vàng chuối Việt Nam được đánh dấu bằng chấm đen Chỉ có 2 mẫu FOC24, FOC 56 và FOC58 cho kết
quả dựa trên giải trình tự gene rpb1 (hình 4.4). Phức hợp lồi FOCS gồm: Mẫu FOC24 nhóm F.
tardichlamydosporum chứa Foc-Race 1, nhóm có chỉ số boostrap cao 92/94%, độ tin cậy cao. Mẫu
FOC56 nhánh 1 F. odoratissimum có chỉ số boostrap cao 90/91%, độ tin cậy cao (species 1). Mẫu FOC58
thuộc phức hợp loài FFCS, là loài F. furikuroi

14

14


15


Hình 4.2. Cây phả hệ của các mẫu nấm FOCs dựa trên trình tự gene teflα đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp Maximum Likelihood

15

15


16

Hình 4.3. Cây phả hệ của các mẫu nấm FOCs dựa trên trình tự gene rbp2 đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp Maximum Likelihood

16

16


17

Hình 4.4. Cây phả hệ của các mẫu nấm FOCs dựa trên trình tự gene rbp1 đƣợc xây dựng bằng phƣơng pháp Maximum Likelihood

17


18

Hình 4.5. Cây phả hệ của các mẫu nấm FOCs dựa trên trình tự kết hợp 3 gene tef1α + rbp2 + rbp1 đƣợc xây dựng bằng phƣơng
pháp Maximum Likelihood

18