BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Phan Thị Thanh Hà

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
MỘT SỐ VI RÚT CĨ NGUY CƠ CAO TRONG NHUYỄN THỂ
HAI MẢNH VỎ VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ

Ngành: Cơng nghệ Sinh học
Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Lê Quang Hòa
2. PGS. TS. Trương Tuyết Mai

Hà Nội - 2024


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng
dẫn của TS. Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố.
Hà Nội, ngày
Tập thể hướng dẫn

TS. Lê Quang Hòa

tháng

năm

Nghiên cứu sinh

PGS.TS.Trương Tuyết Mai

Phan Thị Thanh Hà

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
TL. GIÁM ĐỐC
TRƯỞNG BAN ĐÀO TẠO

i


LỜI CẢM ƠN
Từ năm 2005 đến nay, trong những năm học Đại học, làm luận văn Thạc sĩ
và luận án Tiến sĩ tại Đại học Bách khoa Hà Nội thân yêu, tôi đã thu nhận được rất
nhiều kiến thức quý báu về lý thuyết cũng như thực hành nghiên cứu thuộc lĩnh
vực công nghệ Sinh học – công nghệ Thực phẩm. Tôi vô cùng biết ơn các Thầy
Cô giáo, Ban Giám đốc Đại học Bách khoa Hà Nội… đã dạy dỗ, bảo ban giúp đỡ
tơi về mọi mặt.
Hồn thành Luận án Tiến sĩ này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.
Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dành
nhiều thời gian trao đổi, định hướng trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu
cũng như viết Luận án. Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô, các cán bộ của Trung
tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Trường Hóa và
Khoa học sự sống đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong q
trình thực hiện và báo Luận án.

Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Dinh dưỡng, lãnh đạo và
các đồng nghiệp Khoa Vi sinh vật Thực phẩm và Sinh học phân tử đã tạo điều
kiện, giúp đỡ tơi hồn thành cơng việc chun mơn được phân cơng.
Lời cảm ơn sâu sắc xin gửi tới Gia đình, Bạn bè ln chia sẻ khó khăn,
động viên khích lệ tơi vượt qua mọi trở ngại để hồn thành nhiệm vụ nghiên cứu
và học tập!

Hà Nội ngày

tháng

năm 20

Nghiên cứu sinh

Phan Thị Thanh Hà

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................... ix
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT..................................................... xii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài.......................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 2

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài................................................................ 4
5. Tính mới của đề tài ................................................................................................. 4
1. TỔNG QUAN ....................................................................................................... 5
1.1. Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và thách thức về an toàn
thực phẩm ................................................................................................................... 5
1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ............................ 5
1.1.2. Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể
hai mảnh vỏ .......................................................................................................... 6
1.2. Đặc điểm sinh học các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể
hai mảnh vỏ ................................................................................................................ 8
1.2.1. Norovirus ................................................................................................... 8
1.2.2. Hepatitis A virus ...................................................................................... 10
1.2.3. Hepatitis E virus ...................................................................................... 11
1.2.4. Astrovirus ................................................................................................ 12
1.3. Quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ .......... 13
1.3.1. Các phương pháp tách chiết RNA vi rút ................................................. 13
1.3.2. Các phương pháp xác định vi rút ............................................................. 18
1.4. Các quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa
trên kỹ thuật Real-time RT-PCR .............................................................................. 22
1.5. Ứng dụng cơng nghệ MGB và LNA nhằm tăng nhiệt độ nóng chảy của bộ mồi,
mẫu dò trong phản ứng Real-time RT - PCR ............................................................. 27

iii


1.5.1. Công nghệ MGB (Minor Groove Binders) ............................................. 28
1.5.2. Công nghệ LNA (Locked Nucleic Acids) ............................................... 29
1.6. Phương pháp xác định kiểu gen vi rút ............................................................... 30
1.7. Tình hình nghiên cứu sự lưu hành các kiểu gen của NoV, HAV, HEV, HAstV
trên thế giới và tại Việt Nam .................................................................................... 31

1.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .......................................................... 31
1.7.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ......................................................... 35
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 38
2.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................ 38
2.1.1. Vật liệu kiểm soát .................................................................................... 38
2.1.2. Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ .................................................................. 38
2.1.3. Oligonucleotide ....................................................................................... 39
2.1.4. Hóa chất ................................................................................................... 43
2.1.5. Thiết bị ..................................................................................................... 43
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 44
2.2.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của
HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ....................................................... 44
2.2.2. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh
truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ ........................................ 52
2.2.3. Xác định kiểu gen của các chủng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm
phát hiện được trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ ................................................... 56
3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................................... 59
3.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV
và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ...................................................................... 59
3.1.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của
HEV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ............................................................................ 59
3.1.2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của
HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ..................................................................... 83
3.2. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm
trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ .................................................................................. 99
3.2.1. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể
hai mảnh vỏ năm 2016 ....................................................................................... 99

iv



3.2.2. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể
hai mảnh vỏ năm 2022 ..................................................................................... 105
3.2.3. So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 và năm 2022 ............................................. 110
3.3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ ...................................................................... 114
3.3.1. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng NoV phát hiện trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ.................................................................................... 114
3.3.2. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HEV phát hiện trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ.................................................................................... 120
3.3.3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HAstV phát hiện
trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ .......................................................................... 123
4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 127
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ............. 128
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................... 129

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Xuất khẩu NTHMV Việt Nam 2020-2021 ................................................. 6
Hình 1.2 Cấu trúc Norovirus ...................................................................................... 9
Hình 1.3. Cấu trúc Hepatitis A virus ........................................................................ 10
Hình 1.4. Cấu trúc Hepatitis E virus......................................................................... 11
Hình 1.5 Cấu trúc Human Astrovirus ....................................................................... 12
Hình 1.6. Bộ 4 mồi chính của phản ứng LAMP ....................................................... 18
Hình 1.7 Nguyên tắc phản ứng Real-time PCR ....................................................... 20
Hình 1.8. Vị trí gắn của MGB trên mẫu dị và cấu trúc hóa học của MGB ............. 28
Hình 1.9 Cấu trúc của nucleotide thông thường và của nucleotidd LNA ................ 29

Hình 2.1. Quy trình lựa chọn, hiệu chỉnh, thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứng
Real-time RT-PCR xác định HEV và HAstV .......................................................... 44
Hình 2.2. Quy trình tách dịng trình tự gen đại diện của HEV và HAstV................ 45
Hình 2.3. Quy trình phiên mã in vitro tạo chứng dương RNA................................. 47
Hình 2.4. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và
HAstV ....................................................................................................................... 48
Hình 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng
HEV và HAstV ......................................................................................................... 49
Hình 2.6. Tóm tắt quy trình phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm trong NTHMV ................................................................................................ 52
Hình 2.7. Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi
rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo ISO 15216-1:2013 .......... 54
Hình 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR với mồi ngoài khuếch đại RNA
của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV..................................................... 57
Hình 2.9. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với mồi trong để khuếch đại cDNA
của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV..................................................... 57
Hình 3.1 Đặc điểm bộ mồi của Schlosser và của Jothikumar trên trình tự gen HEV
chuẩn của WHO........................................................................................................ 59
Hình 3.2. Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Schlosser và
Jothikumar với các hệ gen HEV công bố trên GenBank.......................................... 61
Hình 3.3. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV-A .................................. 65

vi


Hình 3.4. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích
HEV.A sau biến nạp vào vector pJET1.2 ................................................................. 65
Hình 3.5. Kết quả giải trình tự một dịng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.A .... 66
Hình 3.6. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV.B .................................. 66
Hình 3.7. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích

HEV.B sau biến nạp vào vector pJET1.2 ................................................................. 67
Hình 3.8. Kết quả giải trình tự một dịng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.B67
Hình 3.9. Chu trình nhiệt rút gọn của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV
từ NTHMV ............................................................................................................... 74
Hình 3.10. Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% của phản ứng
Real-time RT-PCR xác định HEV ........................................................................... 76
Hình 3.11. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện và định lượng HEV trong NTHMV .......................................................... 80
Hình 3.12. Các đường chuẩn định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện
và định lượng HEV trong NTHMV ......................................................................... 80
Hình 3.13. Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Cann và cộng
sự............................................................................................................................... 84
Hình 3.14. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HAstV ................................ 87
Hình 3.15. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích
HAstV sau biến nạp vào vector pJET1.2.................................................................. 87
Hình 3.16. Kết quả giải trình tự một dịng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HAstV
.................................................................................................................................. 88
Hình 3.17. Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% của phản ứng
Real-time RT-PCR xác định HAstV ........................................................................ 94
Hình 3.18. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện và định lượng HAstV trong NTHMV....................................................... 97
Hình 3.19. Các đường chuẩn định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện
và định lượng HAstV trong NTHMV ...................................................................... 97
Hình 3.20. Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2016 .............. 103
Hình 3.21. Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2016 ................................................ 104

vii



Hình 3.22. Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo
thời điểm lấy mẫu năm 2016 .................................................................................. 104
Hình 3.23. Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2022 .............. 109
Hình 3.24. Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2022 ................................................ 109
Hình 3.25. Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo
thời điểm lấy mẫu năm 2022 .................................................................................. 110
Hình 3.26. So sánh tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV
năm 2016 và năm 2022 ........................................................................................... 111
Hình 3.27. So sánh sự phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính ............. 111
năm 2016 và năm 2022 ........................................................................................... 111
Hình 3.30. Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại vùng gen ORF1-ORF2
của NoV GI và NoV GII ....................................................................................... 114
Hình 3.31. Cây phát sinh lồi của các mẫu NoV GI phát hiện được trong nghiên cứu
với các trình tự NoV GI tham chiếu từ GenBank................................................... 116
Hình 3.32. Phân bố kiểu gen Norovirus GI của các mẫu phát hiện được trong nghiên
cứu .......................................................................................................................... 117
Hình 3.33. Cây phát sinh lồi của các mẫu NoV GII phát hiện được trong nghiên
cứu với các trình tự NoV GII tham chiếu từ GenBank. ......................................... 118
Hình 3.34. Phân bố kiểu gen Norovirus GII của các mẫu phát hiện được trong
nghiên cứu .............................................................................................................. 119
Hình 3.35. Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại HEV ....................... 121
Hình 3.36. Cây phát sinh lồi của các mẫu HEV phát hiện được trong nghiên cứu
với các trình tự HEV tham chiếu từ GenBank ....................................................... 122
Hình 3.37. Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại HAstV .................... 123
Hình 3.38. Cây phát sinh loài của bốn chủng HAstV phát hiện được trong nghiên
cứu ......................................................................................................................... 124

viii



DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Tổng hợp các nghiên cứu tách chiết RNA vi rút từ NTHMV .................. 17
Bảng 1.2 Nhận xét các phương pháp xác định vi rút gây bệnh thực phẩm ............. 21
Bảng 1.3 Tổng hợp các bộ mồi và mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu ..................... 23
Bảng 1.4 Chu trình nhiệt của các phản ứng Real-time RT-PCR .............................. 25
Bảng 1.5 Tổng hợp một số nghiên cứu về vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm tại
Việt Nam................................................................................................................... 35
Bảng 2.1. Thông tin mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ thu thập trên thị trường ............ 39
Bảng 2.2. Trình tự mồi, mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu xây dựng quy trình Realtime RT-PCR phát hiện và định lượng RNA vi rút từ NTHMV .............................. 39
Bảng 2.3. Tổng hợp các bộ mồi sử dụng trong phản ứng Nested RT-PCR xác định
kiểu gen vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV .............................. 41
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR định lượng RNA vi rút sử dụng
SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit............................................ 49
Bảng 2.5. Thông tin các biến được phân tích bằng phần mềm SPSS ...................... 55
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại cDNA của NoV, HAV, HEV và
HAstV trong NTHMV .............................................................................................. 56
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR với mồi trong để khuếch đại cDNA của NoV,
HAV, HEV và HAstV trong NTHMV ..................................................................... 57
Bảng 3.1. Đặc điểm kỹ thuật của tổ hợp mồi Schlosser và Jothikumar ................... 60
Bảng 3.2. Đặc điểm kỹ thuật của các tổ hợp mồi sau khi hiệu chỉnh và ứng dụng
công nghệ MGB, LNA ............................................................................................. 63
Bảng 3.3. Kết quả tối ưu nồng độ ion Mg2+ đối với hai tổ hợp mồi A và B ............ 68
Bảng 3.4. Kết quả tối ưu nồng độ mồi đối với hai tổ hợp mồi A và B .................... 70
Bảng 3.5. Kết quả tối ưu nồng độ mẫu dò đối với hai tổ hợp mồi A và B ............... 71
Bảng 3.6. Thành phần tối ưu của phản ứng Realt-time RT-PCR phát hiện HEV .... 72
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi của quy trình Real-time RT-PCR phát
hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn ................................................. 73
Bảng 3.8. Tối ưu hóa thời gian gắn mồi và kéo dài mạch của quy trình Real-time
RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn .......................... 74


ix


Bảng 3.9. Giới hạn phát hiện của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV trong
NTHMV.................................................................................................................... 75
Bảng 3.10. Giới hạn phát hiện với xác suất 95% của phản ứng Real-time RT-PCR
xác định HEV ........................................................................................................... 77
Bảng 3.11. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện và định lượng HEV trong NTHMV .......................................................... 78
Bảng 3.12. Kết quả phản ứng chéo của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV
trong NTHMV .......................................................................................................... 82
Bảng 3.13. Vị trí trình tự gen HAstV tham chiếu và giá trị nhiệt độ nóng chảy (Tm)
của của bộ mồi, mẫu dò của Cann ............................................................................ 83
Bảng 3.14. Đặc điểm kỹ thuật của trình tự mồi phát hiện HAstV sau khi hiệu chỉnh
và ứng dụng công nghệ LNA ................................................................................... 86
Bảng 3.15. Kết quả tối ưu nồng độ ion Mg2+ của phản ứng Real-time RT-PCR phát
hiện HAstV ............................................................................................................... 89
Bảng 3.16. Kết quả tối ưu nồng độ mồi HAstV ....................................................... 90
Bảng 3.17. Kết quả tối ưu nồng độ mẫu dò HAstV ................................................. 91
Bảng 3.18. Thành phần tối ưu của phản ứng Realt-time RT-PCR phát hiện HAstV
.................................................................................................................................. 91
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi của phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện HAstV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn ...................................... 92
Bảng 3.20. Tối ưu hóa thời gian gắn mồi và kéo dài mạch của phản ứng Real-time
RT-PCR phát hiện HAstV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn ....................... 93
Bảng 3.21. Giới hạn phát hiện của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HAstV
trong NTHMV .......................................................................................................... 94
Bảng 3.22. Giới hạn phát hiện với xác suất 95% của phản ứng Real-time RT-PCR
xác định HAstV ........................................................................................................ 95

Bảng 3.23. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện và định lượng HAstV trong NTHMV....................................................... 96
Bảng 3.24. Kết quả phản ứng chéo của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện
HAstV trong NTHMV .............................................................................................. 99
Bảng 3.25. Tổng hợp tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2016 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu ........................................ 100

x


Bảng 3.26. Tổng hợp mức nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2016 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu ........................................ 101
Bảng 3.27. Tổng hợp tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2022 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu ........................................ 106
Bảng 3.28. Tổng hợp mức nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2022 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu ........................................ 107

xi


DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tên đầy đủ tiếng Anh

Tên đầy đủ tiếng Việt

AiV

Aichivirus


CRE

Cis-reactive element

CT

Cycle Threshold

DNA

Deoxyribonucleic acid

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay

EU

European Union

Liên minh châu Âu

Food and Agriculture Organization of

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp

the Unated Nation

Liên hợp Quốc


FDA

Food and Drug Administration

Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược
phẩm Mỹ

GuSCN

Guanidinium Isothiocyanate

HAV

Hepatitis A virus

Vi rút viêm gan A

HAstV

Human Astrovirus

Astro vi rút người

HEV

Hepatitis E virus

Vi rút viêm gan E


ISO

International Organization for
Standardization

Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế

LNA

Locked Nucleic Acids

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lượng

MGB

Minor Groove Binders

NAFIQAD

National Agro-Forestry-Fisheries

Quality Assurance Department

Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm
sản và Thủy sản – Bộ Nông nghiệp
và Phát triển nông thôn

NCBI

The National Center for
Biotechnology Information

Trung tâm thông tin Công nghệ
sinh học Quốc gia (Hoa Kỳ)

FAO

Chu kỳ ngưỡng

xii

Phương pháp hấp phụ miễn dịch gắn
enzyme


NoV

Norovirus

NTP


Nucleoside triphosphatase

NTHMV

Nhuyễn thể hai mảnh vỏ

NVWA

Netherlands Food and Consumer
Product Safety Authority

PEG

Polyethylene glycol

RNA

Acid ribonucleic

RT-LAMP

Reverse transcription loop-mediated
isothermal amplification

Cơ quan An toàn Sản phẩm Tiêu dùng
và Thực phẩm Hà Lan

Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt
thơng qua cấu trúc vịng phiên mã
ngược


RT-PCR

Reverse Trancription Polymerase Chain Phương pháp dựa trên phản ứng chuỗi
Reaction
polymerase phiên mã ngược

RASFF

Rapid Alert System for Food and Feed

Hệ thống cảnh báo nhanh về thực
phẩm và thức ăn chăn nuôi

Ta

Annealing Temperature

Nhiệt độ gắn mồi

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TLTK

Tài liệu tham khảo

Tm


Melting Temperature

Nhiệt độ nóng chảy

VASEP

Vietnam Association of Seafood
Exporters and Producers

Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ
sản Việt Nam

VFA

Vietnam Food Administration

Cục An toàn Thực phẩm – Bộ Y tế

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

xiii


MỞ ĐẦU
1.


Tính cấp thiết của đề tài
Báo cáo thống kê ngành thủy sản toàn cầu của Tổ chức Lương thực và Nông

nghiệp Liên hợp Quốc (FAO) cho thấy nhu cầu đối với các mặt hàng nhuyễn thể hai
mảnh vỏ (NTHMV) tăng mạnh vào năm 2021 so với 2020 [1]. Theo thống kê của
Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2021, xuất khẩu
NTHMV của Việt Nam đạt 141,6 triệu USD, tăng 35% so với năm 2020; trong đó,
ngao là sản phẩm chủ lực, chiếm 73% với 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2].
Nhuyễn thể của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước; trong đó, Liên minh
châu Âu (EU) là thị trường nhập khẩu NTHMV lớn nhất, chiếm 62% tổng giá trị
xuất khẩu mặt hàng này của Việt Nam ra các thị trường trên thế giới [3]. Tuy nhiên,
EU cũng là thị trường có quy định chặt chẽ nhất đối với các sản phẩm nhập khẩu,
gây nhiều thách thức đối với ngành nuôi trồng NTHMV ở Việt Nam. Tháng 4 năm
2022, trong “Diễn đàn phát triển thủy sản bền vững”, lãnh đạo Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn đã khẳng định việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể có vai
trị quan trọng trong việc hoàn thành mục tiêu phát triển kinh tế thủy sản đã đề ra,
trong đó việc bảo đảm kiểm sốt chất lượng An tồn thực phẩm từ khâu sản xuất
ban đầu đến sơ chế, chế biến là hết sức cần thiết [4].
Trong những năm qua, tình trạng viêm dạ dày ruột, viêm gan do tiêu thụ
NTHMV nhiễm vi rút luôn là vấn đề được lưu tâm. Theo dấu hiệu lâm sàng, đã xác
định được hơn 100 loại vi rút đường ruột có mặt trong thực phẩm bị ơ nhiễm; trong
đó, Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và
Astrovirus ở người (HAstV) là các vi rút gây bệnh thường gặp trong NTHMV [5].
Đáng chú ý, một số nghiên cứu về các vi rút này tại Việt Nam đã cho thấy tình trạng
đồng nhiễm nhiều tác nhân vi rút trên cùng một mẫu bệnh phẩm [6-8].
Trước tình hình ơ nhiễm thực phẩm do tác nhân vi rút ngày càng tăng cao,
cùng với những kết quả về tình trạng đồng nhiễm các tác nhân vi rút, việc phát triển
quy trình phát hiện và định lượng bốn tác nhân vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm thường gặp (NoV, HAV, HEV, HAstV) là hết sức cần thiết [7]. Hiện nay,
trong khi quy trình chuẩn ISO 15216-1:2013 có thể ứng dụng để xác định NoV và

HAV trong thực phẩm thì các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV và
HEV cịn chưa được chuẩn hóa, gây nhiều hạn chế trong cơng tác kiểm nghiệm. Vì
vậy, việc xây dựng quy trình xác định HAstV và HEV với bộ mồi, mẫu dò đảm bảo

1


độ bao phủ trên các biến chủng hiện có, đồng thời tối ưu các điều kiện của phản ứng
Real-time RT-PCR, cho phép xác định cùng lúc bốn tác nhân NoV, HAV, HEV và
HAstV với một chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 sẽ góp phần rút ngắn thời
gian phân tích, hỗ trợ kịp thời cho cơng tác điều trị.
Bên cạnh đó, các số liệu về đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh
truyền qua thực phẩm trong NTHMV tại Việt Nam cịn rất hạn chế. Vì vậy, việc xác
định đặc điểm sinh học phân tử của vi rút thông qua xác định kiểu gen (genotype) là
công đoạn cần thiết để đánh giá chính xác nguy cơ bùng phát dịch bệnh gây ra bởi
các tác nhân vi rút có mặt trong NTHMV, hướng tới đề xuất biện pháp ứng phó kịp
thời, ngăn chặn sự lây lan vi rút trong cộng đồng, hạn chế những thiệt hại về sức
khỏe, kinh tế và xã hội. Do vậy, luận án “Nghiên cứu xây dựng phương pháp
phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm
sinh học phân tử” đã được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu

2.
-

Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và

HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO
15216-1:2013.

-

Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh

truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ trên thị trường
-

Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực

phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ.

3.

Nội dung nghiên cứu

3.1.

Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng
RNA của HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

3.1.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA
của HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
-

Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR

phát hiện HEV
-

Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên mã


in vitro
-

Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu trình nhiêt

theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013
2


-

Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện

RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này
- Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định
lượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình
nhiệt của ISO 15216-1:2013
3.1.2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA
của HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
-

Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR

phát hiện HAstV
-

Tách dịng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng phiên

mã in vitro

- Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu trình nhiêt
theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013
- Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện
RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này
- Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định
lượng HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu
trình nhiệt của ISO 15216-1:2013
3.2.

Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền
qua thực phẩm trên NTHMV

- Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2016
- Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2022
- So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2016 và năm 2022
3.3.

Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh
truyền qua thực phẩm trong NTHMV

-

Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của NoV phát hiện trong NTHMV

-

Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HEV phát hiện trong NTHMV


-

Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HAstV phát hiện trong NTHMV

3


4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1.

Ý nghĩa khoa học

-

Thiết kế, hiệu chỉnh bộ mồi, mẫu dò có độ bao phủ cao với các trình tự HEV

và HAstV hiện có trên ngân hàng dữ liệu GenBank.
-

Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR để có thể phát hiện được RNA của HEV

và HAstV theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-1:2013; từ đó mở ra
khả năng phát hiện và định lượng được 4 tác nhân vi rút NoV, HAV, HEV và
HAstV trong một lần chạy Real-time RT-PCR.
-


Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện

RNA của HEV và HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh các vi rút này
-

Xác định các kiểu gen (genotype) của NoV, HAV, HEV và HAstV nhiễm tạp

trong NTHMV, góp phần đánh giá nguy cơ bùng phát dịch bệnh.
4.2.
-

Ý nghĩa thực tiễn
Cung cấp một quy trình phân tích cả 4 tác nhân NoV, HAV, HEV và HAstV

với tính chính xác cao (4 phản ứng Real-time RT-PCR riêng rẽ chạy cùng một chu
trình nhiệt) trong NTHMV nói riêng và trong các mẫu thực phẩm, bệnh phẩm, mơi
trường nói chung để các cơ sở xét nghiệm có thể ứng dụng trong phân tích.
-

Góp phần nâng cao năng lực kiểm sốt an tồn thực phẩm, tăng tính cạnh

tranh của NTHMV và các mặt hàng thủy sản xuất khẩu trên thị trường quốc tế.

Tính mới của đề tài

5.
-

Thiết kế, hiệu chỉnh được tổ hợp mồi, mẫu dò phát hiện và định lượng RNA


của HEV và HAstV có độ bao phủ cao với các trình tự hiện có trên Ngân hàng dữ
liệu Genbank.
-

Tối ưu hóa phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của

HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO
15216-1:2013.
-

Xác định được tỷ lệ và mức nhiễm tạp của 4 tác nhân NoV, HAV, HEV và

HAstV trong NTHMV trong năm 2016 và 2022 tại Việt Nam.
-

Xác định được kiểu gen của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV

trong năm 2016 tại Việt Nam.

4


1. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và
thách thức về an toàn thực phẩm
1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ
Theo FAO, nhu cầu đối với các mặt hàng NTHMV (NTHMV) tăng mạnh
vào năm 2021 so với 2020 do các hạn chế về COVID-19 đã giảm bớt ở các quốc gia
tiêu thụ chính những mặt hàng này. Trong năm 2021, khoảng 71.000 tấn hàu đã
được nhập khẩu trên toàn thế giới, cao hơn 15.000 tấn so với năm 2020 và thậm chí

cao hơn 6.000 tấn so với năm 2019. Cũng trong năm 2021, tổng thương mại ngao
trên toàn thế giới tăng, khoảng 287.000 tấn đã được nhập khẩu, nhiều hơn 20.000
tấn so với năm 2020 [1].
Việt Nam có đặc điểm địa lý thuận lợi để phát triển hoạt động khai thác và
ni trồng các lồi nhuyễn thể nhờ vùng nội thuỷ và lãnh hải rộng 226.000 km2 nằm
bên bờ Tây của Biển Đông - là một biển lớn của Thái Bình Dương, vùng biển đặc
quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 cùng hơn 4.000 hòn đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm
phá với tổng diện tích 1.160km2 được che chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền [9]. Năm
2021, diện tích nhuyễn thể của Việt Nam đạt trên 35.000 ha, sản lượng 471.000 tấn;
trong đó, diện tích và sản lượng nuôi ngao chiếm khoảng 50%; cụ thể, năm 2021,
diện tích ni trên 17.000 ha, sản lượng đạt trên 236.000 tấn. Đến nay, nhuyễn thể
của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước. Theo thống kê của Hiệp hội Chế
biến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam (VASEP), xuất khẩu NTHMV của Việt Nam
năm 2021 đạt 141,6 triệu USD, tăng 35% so với năm 2020. Trong đó, ngao là sản
phẩm chủ lực, chiếm 73% với gần 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2]. Số liệu của
Trung tâm Thương mại Thế giới (ITC) cho thấy các thị trường nhập khẩu chính
NTHMV của Việt Nam là: Liên minh châu Âu EU (Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha,
Italy), Mỹ, Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc. Trong đó, EU là thị trường nhập khẩu
NTHMV lớn nhất, chiếm tỷ trọng 62% tổng giá trị xuất khẩu mặt hàng này của Việt
Nam ra các thị trường trên thế giới [3].

5


Hình 1.1. Xuất khẩu NTHMV Việt Nam 2020-2021 [2]

Đáng chú ý, EU cũng là thị trường có quy định chặt chẽ nhất đối với các sản
phẩm nhập khẩu, đây cũng chính là thách thức lớn đối với ngành ni trồng
NTHMV Việt Nam. Trên thực tế, trong thời gian qua, các lơ hàng NTHMV xuất
khẩu vẫn bị nước ngồi cảnh báo về nguy cơ nhiễm vi rút. Mới đây nhất, hàng loạt

lô hàng hàu tươi ướp đá từ Vân Đồn Quảng Ninh bị cảnh báo phát hiện NoV: 10 lô
hàng năm 2020 và 2 lô hàng năm 2021. Tháng 4 năm 2022, trong Diễn đàn về phát
triển thủy sản bền vững, Thứ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
Phùng Đức Tiến đã khẳng định, việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể có vai trị
quan trọng trong việc hồn thành mục tiêu phát triển kinh tế thủy sản đã đề ra; trong
đó việc bảo đảm kiểm sốt chất lượng An toàn thực phẩm từ khâu sản xuất ban đầu
đến sơ chế, chế biến là hết sức cần thiết [4].
1.1.2. Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ
Với đặc điểm sinh sống theo hình thức lọc nước để lấy thức ăn, NTHMV là
đối tượng thực phẩm có nguy cơ ơ nhiễm cao bởi các vi rút và các tác nhân gây
bệnh khác có trong môi trường nước. Theo các nghiên cứu trên thế giới về nhóm vi
rút gây ơ nhiễm nguồn nước có khả năng lây nhiễm sang thực phẩm, có đến hơn
100 loại vi rút được tìm thấy trong đường ruột người. Các vi rút này được phân làm
3 nhóm chính theo hội chứng lâm sàng: nhóm vi rút gây viêm dạ dày ruột, vi rút gây
viêm gan và các vi rút gây một số bệnh khác. Trong số các vi rút này, Norovirus
(NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus ở người
(HAstV) là các vi rút thường gặp trong NTHMV [5]. Đáng chú ý, thống kê 359 vụ

6