BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

MAI NHƢ PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU SỰ KÍCH THÍCH TÍNH KHÁNG
BỆNH CHÁY BÌA LÁ LÚA DO VI KHUẨN
Xanthomonas oryzae pv. oryzae BẰNG DỊCH
TRÍCH CỎ CỨT HEO Ageratum conyzoides L.

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
CHUYÊN NGÀNH BẢO VỆ THỰC VẬT
MÃ SỐ 62 62 01 12

2023


CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Người hướng dẫn: PGS.TS. Trần Thị Thu Thủy
Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp cơ
sở.
Họp tại: Phòng bảo vệ luận án tiến sĩ, lầu 2, nhà điều hành, trường
Đại học Cần Thơ. Vào lúc 8 giờ ngày 25 tháng 6 năm 2023

Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Hồng Sơn
Phản biện 2: PGS. TS. Lê Văn Vàng
Xác nhận đã xem lại của Chủ tịch Hội đồng

PGS.TS. Trần Vũ Phến

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
- Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ.
- Thư viện Quốc gia Việt Nam


DANH MỤC NHỮNG BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ
1.Mai Như Phương, Trần Thị Thu Thủy, (2023). Phân lập và tuyển
chọn các chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh
cháy bìa lá lúa tại tỉnh Bạc Liêu. Tạp chí Bảo Vệ Thực Vật. Số 12023. Trang 9-13.
2.Mai Như Phương, Trần Thị Thu Thủy, (2023). Biện pháp xử lý dịch
trích cỏ cứt heo (Ageratum conyzoides L.) phịng trừ bệnh cháy bìa lá
lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae trong điều kiện nhà
lưới. Tạp chí Bảo Vệ Thực Vật. Số 1-2023. Trang 14-18.
3.Mai Như Phương, Trần Thị Thu Thủy, (2023). Đánh giá khả năng
kháng khuẩn của Ageratum conyzoides L. ức chế vi khuẩn Xanthomonas
oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa, Tạp chí Khoa học và cơng
nghệ Đại học Thái Ngun. 228(09): 95-101.


CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của luận án
Việt Nam là một trong những quốc gia có sản lượng xuất khẩu
gạo hằng năm đứng thứ 2 – 4 trong số các nước xuất khẩu lúa gạo trên
thế giới, sau Thái Lan (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008). Theo thống kê của Chi
Cục Trồng Trọt và Bảo vệ Thực Vật Bạc Liêu năm 2021, bệnh cháy bìa
lá nhiễm nặng vào vụ Hè Thu với diện tích trên 25.000 ha. Theo Ou
(1985) và Liu et al. (2014), bệnh cháy bìa lá gây hại nặng vào thời điểm
mưa nhiều có thể giảm sản lượng lúa đến 30% - 75% năng suất. Để
quản lý bệnh cháy bìa lá lúa, hầu hết nơng dân ở ĐBSCL nói chung và ở
Bạc Liêu nói riêng vẫn phụ thuộc nhiều loại thuốc hóa học. Việc lạm

dụng thuốc trong sản xuất nông nghiệp đã đến mức đáng báo động gây
ảnh hưởng đến chất lượng lúa gạo. Một trong những biện pháp thân
thiện mơi trường là nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh trên cây
trồng. Tại Việt Nam có nhiều nghiên cứu về bệnh cháy bìa lá lúa bằng
kích kháng như Nguyễn Tuyết Minh (2009) đã dùng .ba loại dịch trích
chống lại bệnh cháy bìa lá (Xanthomonas oryzae pv. oryzae). Sau đó,
Nguyễn Văn Tứ (2011) đã quản lý bệnh cháy bìa lá lúa lá
(Xanthomonas oryzae pv. oryzae) bằng sử dụng dịch trích cỏ cứt heo ở
ngồi đồng. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào khảo sát cơ
chế kích kháng bệnh cháy bìa lá lúa bằng dịch trích cỏ cứt heo. Vì vậy,
đề tài “Nghiên cứu sự kích thích tính kháng bệnh cháy bìa lá do vi
khuẩn (Xanthomanas oryzae pv. oryzae) trên lúa bằng dịch trích cỏ cứt
heo Ageratum conyzoides L.” được thực hiện với mục tiêu nhằm xác
định nồng độ và cách thức áp dụng dịch trích cây cỏ cứt heo để kiểm
sốt bệnh cháy bìa lá trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng trên giống
lúa RVT tại tỉnh Bạc Liêu. Đồng thời cũng xác định sự gia tăng hoạt
tính của một số emzyme liên quan đến sự kích kháng.

1


1.2 Tính mới của luận án
Xác định nồng độ và cách thức áp dụng dịch trích cây cỏ cứt heo
để kiểm sốt bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng
tại tỉnh Bạc Liêu. Bên cạnh đó cũng xác định sự gia tăng hoạt tính của
một số emzyme liên quan đến sự kích kháng.
1.3 Mục đích nghiên cứu
Xác định nồng độ và biện pháp xử lý dịch trích cỏ cứt heo có khả
năng giúp hạn chế bệnh cháy bìa lá lúa (Xanthomonas oryzae pv.
oryzae). và sự gia tăng hoạt tính của một số emzyme liên quan đến sự

kích kháng chống lại bệnh cháy bìa lá lúa tại Tỉnh Bạc Liêu.
1.4 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Thu thập và đánh giá khả năng gây hại của các chủng
vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa.
Nội dung 2: Đánh giá khả năng ức chế của dịch trích cỏ cứt heo đối
với vi khuẩn gây bệnh cháy bìa lá lúa và ảnh hưởng của dịch trích cỏ cứt
heo đến sự mọc mầm của hạt lúa. Trong điều kiện nhà lưới, nghiên cứu
cũng tìm ra nồng độ và phương pháp xử lý mang lại hiệu quả giảm bệnh
cháy bìa lá lúa.
Nội dung 3: Khảo sát sự gia tăng hoạt tính của một số emzyme
liên quan đến sự kích thích tính cây trồng kháng bệnh cháy bìa lá lúa.
Nội dung 4: Đánh giá khả năng hạn chế bệnh cháy bìa lá lúa của dịch
trích cỏ cứt heo trong điều kiện ngoài đồng.
1.5 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
1.5.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là bệnh cháy bìa lá do vi khuẩn
Xanthomonas oryzae pv. oryzae, dịch trích cỏ cứt heo Agertum
conyzoides L..
2


1.5.2 Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu của luận án được thực hiện thu thập mẫu
bệnh vi khuẩn gây bệnh cháy bìa lá ngồi đồng ở Bạc Liêu, sau đó
thực hiện phân lập và tuyển chọn vi khuẩn triển vọng trong điều kiện
phịng thí nghiệm và điều kiện nhà lưới.
Đánh giá khả năng gây hại của vi khuẩn X. oryzae pv. oryzae gây
bệnh cháy bìa lá trên giống lúa RVT trồng phổ biến tại Bạc Liêu. Đánh
giá khả năng ức chế của dịch trích cỏ cứt heo đối với vi khuẩn cháy bìa lá
lúa

Đánh giá khả năng gây hại của chủng vi khuẩn gây hại nặng
trên một số giống lúa
Xác định nồng độ và biện pháp xử lý của dịch trích cỏ cứt heo
(Ageratum coinyzoides) trong điều kiện nhà lưới.
Đánh giá hiệu quả của dịch trích cỏ cứt heo đối với bệnh cháy bìa lá
lúa trong điều kiện nhà lưới và ngồi đồng.
Khảo sát cơ chế liên quan kích kháng của dịch trích cỏ cứt heo như
hoạt động enzyme PAL, PPO, CAT trong điều kiện phịng thí nghiệm.
1.6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.6.1 Ý nghĩa khoa học
Luận án là cơng trình nghiên cứu có giá trị khoa học có tính hệ
thống tốt từ phịng thí nghiệm đến ngồi đồng về sử dụng dịch trích cỏ
cứt heo để quản lý bệnh cháy bìa lá lúa. Các số liệu của luận án được
thu thấp đầy đủ và thống kê rõ ràng chính xác. Kết quả cơng trình
nghiên cứu là cơ sở cho bài giảng của các trường Đại học.
1.6.2 Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu là cơ sở để các nhà quản lý đề xuất chiến lược
quản lý bệnh hại theo hướng thân thiện môi trường. Đồng thời nó cũng
là kết quả để nơng dân hạn chế sử dụng thuốc hóa học và thay thể bằng
dịch trích thực vật để quản lý bệnh cháy bìa lá lúa.
3


CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Bệnh cháy bìa lá lúa (Bacterial leaf blight disease)
2.1.1 Tình hình và mức độ gây hại của bệnh cháy bìa lá lúa
Ở Việt Nam, bệnh cháy bìa lá lúa xuất hiện và gây hại đáng kể từ
năm 1965 – 1966. Ở ĐBSCL, bệnh cháy bìa lá xuất hiện rất nặng vào
năm 1978 đến năm 1979, bệnh gây hại từ trung bình đến nặng chiếm
khoảng 90% diện tích vụ Hè Thu tại các huyện Châu Thành, Ơ Mơn,

Thốt Nốt (Cần Thơ), Kế Sách, Thạnh Trị (Sóc Trăng) (Lê Thị Thủy,
1980). Theo Viện Bảo Vệ Thực Vật cho biết trên giống lúa IR8, cây lúa
nhiễm bệnh với mức độ là 20 – 40% thì tỷ lệ hạt lép là 15%, trọng lượng
1000 hạt là 29,3 gram và năng suất đạt được là 5,62 tấn/ha. Trên diện
tích lúa mùa cấy giống NN8 bị bệnh ở mức độ 60% – 100%, giảm năng
suất từ 30 – 60% (Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999). Bệnh thường
phát triển ở giai đoạn lúa nảy chồi tối đa hay có đòng, nên làm tăng số
hạt lép, hạt lửng và giảm phẩm chất, trọng lượng hạt, đồng thời làm tăng
tỷ lệ tấm khi xay xát. Bệnh cũng làm giảm lượng đạm và protein thơ
trong hạt (Võ Thanh Hồng và Nguyễn Thị Nghiêm, 1993).
2.1.2 Triệu chứng bệnh
Triệu chứng thường gặp nhất của bệnh là triệu chứng cháy bìa lá
mà trong đó điển hình là vết cháy dọc theo 2 bên bìa của lá lúa, rồi lan
dần vào gân chính của lá. Vi khuẩn gây bệnh xâm nhập vào lá lúa qua
các thủy khẩu dọc theo rìa lá nên vết bệnh có thể bắt đầu từ rìa lá lan
dần vào bên trong (Phạm Văn Kim, 2016). Tuy nhiên, một số trường
hợp vết bệnh có khi bắt đầu ở ngay giữa phiến lá, vết bệnh tạo những
mép viền hình sóng mơ bệnh xanh tái rồi trở nên vàng trong vài ngày
cuối cùng cháy khô có màu nâu xám. Các vết bệnh có thể phát sinh trên
một hoặc cả hai rìa lá. Bệnh tiến triển các vết bệnh lan rộng phủ kín cả
hai mặt lá, khi đẫm nước vết bệnh sẽ lan dài ra và có những vệt màu
vàng và phát triển dần ra tạo thành màu vàng xám hoặc xám khơ chạy
theo 2 rìa lá (Agrios, 2005). Ở các nước nhiệt đới, trong lúc cấy người ta
4


cắt chóp lá mạ. Các lá bị cắt chóp thường bị bệnh đầu tiên. Triệu chứng bệnh
xuất hiện sớm nhất là vết bệnh dạng thấm nước màu xanh ở ngay dưới bề
mặt vết cắt sau đó nhanh chóng chuyển màu xanh xám nhạt. Toàn bộ lá bị
cuộn lại và héo, tiếp đến bẹ lá cũng bị héo. Vi khuẩn truyền theo mạch xylem

đến đỉnh sinh trưởng của cây non và nhiễm bệnh cho các lá khác, dẫn đến cây
non bị chết toàn bộ. Trong các giai đoạn sớm, khi chỉ có một vài lá già bị héo
và trơng như bị nổi trên mặt nước. Ở Java của Indonesia người ta gọi đó là
bệnh “Kresek”(Ou, 1985). Triệu chứng Kresek là triệu chứng nghiêm
trọng nhất và gây khô chồi (Jambhulkar et al., 2014). Kresek cho thấy
sự phá hủy nhiều hơn với các triệu chứng biểu hiện là màu vàng nhạt,
héo trong giai đoạn từ cây con đến nảy chồi (Mew, 1993).

2.2 Khái niệm về kích kháng
Kích thích tính kháng thường được gọi tắt là “kích kháng”, là sự
kích thích để tạo ra tính kháng bệnh của thực vật. Hiện tượng này giúp
giống cây trồng bị nhiễm trở nên có khả năng kháng được bệnh ở mức
độ nào đó sau khi xử lý chất kích kháng. Phương pháp kích kháng
khơng có tác dụng loại trừ trực tiếp mầm bệnh như những thuốc trừ dịch
hại mà dựa trên sự kích thích của những cơ chế tự nhiên của cây trồng.
Chất kích kháng có thể là một lồi vi sinh vật khơng gây bệnh, khơng
mang tính độc đối với cây trồng hoặc có thể là một loại hóa chất nào đó
khơng độc và khơng có tác động trực tiếp diệt mầm bệnh như những hóa
chất được dùng trong nông dược (Phạm Văn Kim, 2002). Dịch trích
thực vật là một nhóm các chất được trích ra từ các bộ phận khác nhau
của cây trồng có chứa rất nhiều hợp chất có thể có tính kháng với vi sinh
vật gây bệnh. Các hợp chất này có thể thu được từ rễ, vỏ, hạt, chồi, lá và
trái cây (Davidson, 1997). Dịch trích thực vật của một số lồi cây đã
được chứng minh là có hiệu quả như là những chất mồi cho các phản
ứng kháng bệnh ở cây (Llorens et al., 2017).

5


CHƢƠNG 3. PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU
Thời gian: từ tháng 7 năm 2016 đến tháng 12 năm 2022
Địa điểm: Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông Nghiệp, Trường Đại
Học Cần Thơ. Huyện Phước Long và Hồng Dân tỉnh Bạc Liêu
3.1 Dụng cụ thiết bị: Các dụng cụ dùng trong thí nghiệm là chậu lớn
(nhỏ) nhựa, ống nghiệm, đĩa Petri (đường kính 9 cm), đũa vạch vi
khuẩn, lame, lamel, bình tam giác, chai thuỷ tinh, đèn cồn, kim mũi
giáo, kéo, kẹp, ống hút (pipette). Một số thiết bị dùng trong thí nghiệm.
3.2 Phƣơng pháp thí nghiệm
3.2.1 Thu thập, phân lập và đánh giá khả năng gây hại của các
chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá
lúa trên giống lúa RVT
Mục tiêu: Xác định chủng vi khuẩn gây bệnh cháy bìa lá lúa
nặng nhất trên giống lúa RVT. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức
hồn toàn ngẫu nhiên mỗi nghiệm thức là chủng vi khuẩn. Mỗi lặp lại là
một chậu lúa với 3 cây (chồi) được lây bệnh, mỗi chồi 3 lá trên cùng
được lây bệnh.
Chuẩn bị lúa: Ngâm hạt trong nước ấm (khoảng 540 C – 2 sôi 3
lạnh) trong 15 phút. Khử trung bằng NaOCl 2,63% trong 30 phút và sau
đó rửa 3 - 5 lần bằng nước vô trùng (Ella et al., 2011). Hạt giống được
ủ trong đĩa Petri có lót giấy thấm vơ trùng và duy trì ẩm độ bằng nước
cất vô trùng cho hạt nứt nanh. Lúa được trồng trong chậu với 1,5 kg đất
khô (tương ứng 2,04 kg đất ở ẩm độ 36%). Mỗi chậu gieo 5 hạt. Lúa sau
trồng được chăm sóc và bón phân theo cơng thức của Nguyễn Ngọc Đệ
(2008): 120N – 40P2O5 – 30K2O. Lây bệnh nhân tạo: Lúa 45 ngày
tuổi được sử dụng lây bệnh nhân tạo theo phương pháp cắt chóp lá
(Leaf-clipping method) của Kauffman (1973) bằng cách nhún mũi kéo
vào huyền phù vi khuẩn đã chuẩn bị sẵn (OD600nm=0,3) và cắt chóp lá
6



một đoạn khoảng 2-3 cm trên lá trưởng thành của chồi, mỗi chồi cắt 3 lá
trên cùng và mỗi chậu cắt 3 chồi. Chậu lúa sau khi đã lây bệnh được bao
phủ bằng bọc kiếng trong (kích thước 40*60 cm) và ủ tối ở 25°C trong
24 giờ ở điều kiện phòng ủ bệnh (nhiệt độ: 250C, ẩm độ 90%). Ghi
nhận chỉ tiêu: Chiều dài vết bệnh tính phần trăm tỷ lệ chiều dài vết
bệnh theo công thức (Gnanamanickam et al (1999).
Ghi nhận các chỉ tiêu bệnh : +Tỷ lệ (%) chiều dài vết bệnh (TLCDVB)
TLCDVB = (Chiều dài vết bệnh/chiều dài lá)*100
Chỉ số bệnh: Thang đánh giá cấp bệnh theo Ezuka và Horino (1972).
Bảng 3.1: Thang đánh giá cấp bệnh theo Kauffman (1973)
Cấp bệnh

Mô tả cấp bệnh

1

Không bệnh

3

Chiều dài vết bệnh <1/4 chiều dài lá

5

Chiều dài vết bệnh từ 1/4- 1/2 chiều dài lá

7

Chiều dài vết bệnh >1/2 chiều dài lá


9

Chiều dài vết bệnh bằng chiều dài lá hoặc gây lá chết

Từ
đó
tính
ra
chỉ
số
bệnh
theo
cơng
thức:
Y(%)=(a1*X1+a2*X2+…+anXn)/PN*100. Trong đó: Y(%): Chỉ số
bệnh; A1.….an: Số lá bệnh ở cấp 1,…,n; X1…Xn: Cấp bệnh 1,…n; P:
Tổng số lá quan sát; N: Cấp bệnh cao nhất trong thang đánh giá.
3.2.2 Đánh giá khả năng gây hại của chủng vi khuẩn BL36 trên một
số giống lúa phổ biến tại tỉnh Bạc liêu
Mục tiêu: Xác định mức độ gây bệnh của chủng vi khuẩn BL36
trên 5 giống lúa được trồng phổ biến tại Bạc Liêu. Thí nghiệm được bố
trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố gồm 5 nghiệm thức là 5
giống lúa Jasmine 85, RVT, OM18, OM5451, Đài thơm 8 với 3 lặp lại.
Chuẩn bị lúa lây bệnh: tương tự thí nghiệm 3.2.1 Chuẩn bị huyền phù vi
khuẩn: tương tự thí nghiệm 3.2.1. Lây bệnh nhân tạo: tương tự thí
7


nghiệm 3.2.2.1. Chỉ tiêu ghi nhận: Tỷ lệ (%) chiều dài vết bệnh tương tự thí

nghiệm 3.2.1. vào thời điểm 7 NSLB và 14 NSLB
3.2.3 Xác định nồng và biện pháp xử lý dịch trích cỏ cứt heo
(Ageratum conyzoides L.) có hiệu quả kích kháng cây lúa chống lại
bệnh cháy bìa lá lúa trong điều kiện nhà lƣới
3.2.3.1 Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.
oryzae của dịch trích cỏ cứt heo
Mục tiêu: Xác định khả năng ức chế trực tiếp của các nồng độ
dịch trích khác nhau lên vi khuẩn BL36. Thí nghiệm được bố trí theo thể
thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 7 nghiệm thức và 5 lần lặp lại. Tương
ứng với, 5 nồng độ dịch trích cỏ cứt heo 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, một
nghiệm thức đối chứng (0%), 1 nghiệm tức thuốc Starner 20WP. Chuẩn
bị dịch trích cỏ cứt heo: Ly trích phương pháp ly trích dịch trích theo
Trần Thị Thu Thủy và ctv. (2015) (nồng độ dịch trích = trọng lượng lá/
lượng nước cần ly trích, 100 g cỏ cứt heo tươi thì sau khi sấy khơ ẩm độ
60% thì cịn 20g). Các bộ phận của cây cỏ cứt heo gồm thân và lá được
thu thập vào sáng sớm. Cân mẫu và rửa sạch phần thân lá của cỏ cứt heo
dưới vòi nước. Sau đó dùng máy xay sinh tố nghiền nhỏ các bộ phận để
thu dịch trích với dung mơi nước cất ở nhiệt độ phịng, sau đó lược qua
vải the được xếp thành nhiều lớp ở các nồng độ. Dịch trích thực vật sau
khi pha được thanh trùng bằng cách lọc qua màng lọc vi khuẩn có kích
thước ø = 0,2 µm (lọc nhỏ nhất dành cho vi khuẩn) trong điều kiện vô
trùng. Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn: Tƣơng tự 3.2.1. Thực hiện thí
nghiệm: Theo phương pháp khuếch tán đĩa của De Zoysa et al. (2019)
cụ thể như sau: Hịa tan 1 ml vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae
có mật số 109 cfu/ml vào bình tam giác chứa 100 ml môi trường
Wakimoto 1,6% agar đã nấu tan và giữ ở nhiệt độ khoảng 500C, lắc nhẹ
để vi khuẩn được trộn đều vào môi trường, đổ nhanh vào đĩa Petri vô
trùng, tráng đều để tạo bề mặt phẳng của môi trường khi đặc lại. Các
khoanh giấy có đường kính 6 mm, được thấm dịch trích thực vật dùng
làm thí nghiệm được đặt vào đĩa Petri có chứa vi khuẩn gây bệnh theo

8


các điểm đã được đánh dấu (ba khanh giấy thấm trên đĩa). Sau đó, các
đĩa Petri được ủ ở điều kiện nhiệt độ 280C- 300C. Quan sát sau 48, 72 và
96 giờ cho đến khi thấy môi trường đục và có vịng vơ khuẩn xuất hiện
rõ thì có thể đánh giá kết quả. Các chỉ tiêu ghi nhận: Đo đường kính
vịng vơ khuẩn tại các thời điểm 48, 72 và 96 giờ sau khi xử lý.
3.2.3.2 Đánh giá ảnh hƣởng của dịch trích cỏ cứt heo (Ageratum
conyzoides L.) lên sự phát triển của rễ mầm và diệp tiêu
Mục tiêu: Xác định sự ảnh hưởng của các nồng độ dịch trích cỏ
cứt heo lên sự phát triển của rễ mầm và diệp tiêu.Thí nghiệm hồn tồn
ngẫu nhiên gồm 5 nghiệm thức với 5 lần lặp lại mỗi nghiệm thức tương
ứng với 1 mức nồng độ khác nhau 2%, 4%, 8 %, 1 đối chứng nước cất
vô trùng, 1 nghiệm thức thuốc Staner 20WP. Thực hiện thí nghiệm:
Cân 25 g hạt lúa cho mỗi nghiệm thức và khử trùng theo phương pháp
3.2.1 và ngâm hạt trong 100 ml dịch trích thực vật trong 24 giờ (đối với
các nghiệm thức ngâm dịch trích) hoặc áo với 2 ml dịch trích trong 1
giờ, sau đó ủ hạt trên đĩa Petri có lót giấy thấm tẩm nước cất thanh
trùng. Đối với nghiệm thức đối chứng được ngâm ủ với nước cất. Hạt
lúa vô trùng sau khi xử lý với dịch trích được trải ra đĩa Petri có sẵn giấy
thấm vơ trùng và duy trì ẩm độ bằng nước cất vơ trùng với 4ml/ đĩa. Sau
đó đĩa Petri được ủ trong điều kiện chiếu sáng tối xen kẽ (12 giờ sáng và
12 giờ tối) ở 250C. Chỉ tiêu ghi nhận: Tiến hành đo chiều dài rễ mầm
và diệp tiêu vào các thời điểm 48, 72 và 96 giờ sau khi xử lý.
3.2.3.3 Xác định nồng độ và biện pháp xử lý dịch trích cỏ cứt heo
cho hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá trong điều kiện nhà lƣới
Mục tiêu: Xác định nồng độ và biện pháp xử lý cỏ cứt heo cho
hiệu quả giảm bệnh cháy bìa lá lúa cao nhất. Thí nghiệm được bố trí
theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố (nhân tố A nồng độ dịch

trích và nhân tố B biện pháp xử lý) với 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 1
chậu với 5 cây (Chậu C7: 15*14 cm) có chứa sẵn một 1,5 kg đất khơ
(tương ứng 2,04 kg đất ở ẩm độ 36%). Nhân tố A (Nồng độ dịch trích):
Ba nồng độ dịch trích được sử dụng 2%, 4%, 8% và đối chứng nước cất
9


vô trùng. Nhân tố B (Biện pháp xử lý): Năm biện pháp xử lý tương ứng
là: 1. Ngâm hạt bằng dịch trích cỏ cứt heo; 2. Áo hạt bằng dịch trích cỏ
cứt heo; 3. Phun dịch trích cỏ cứt heo ở thời điểm lúa 25 ngày; 4. Phun
dịch trích cỏ cứt heo ở thời điểm lúa 35 ngày; 5. Phun kết hợp phun dịch
trích cỏ cứt heo ở thời điểm lúa 25 +35 ngày. Chuẩn bị hạt lúa vô
trùng tƣơng tự 3.2.1, chuẩn bị dịch trích cỏ cứt heo, chuẩn bị huyền
phù vi khuẩn: Tương tự như thí nghiệm 3.2.3.1. Ghi nhận chỉ tiêu: Tỷ
lệ bệnh được tính theo cơng thức, Tỷ lệ bệnh (%) = số lá nhiễm
bệnh/tổng số lá*100, cấp bệnh được đánh giá theo Kauffman (1973) và
chỉ số bệnh được tính theo cơng thức tương tự như ở thí nghiệm 3.2.1.
Hiệu quả giảm bệnh dựa vào tỷ lệ bệnh được tính theo cơng thức Abbott
(1925): HQGB (%) = ĐC-NT/ĐC*100 HQGB: Hiệu quả giảm bệnh;
ĐC: Đối chứng; NT: Nghiệm thức.
3.2.3.4 Đánh giá hiệu quả của dịch trích cỏ cứt heo đối với bệnh
cháy bìa lá trong điều kiện nhà lƣới
Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của biện pháp kết hợp của nồng độ
và biện pháp xử lý của dịch trích cỏ cứt heo trong điều kiện nhà lưới.
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hồn tồn ngẫu nhiên hai
nhân tố (nhân tố A nồng độ xử lý và nhân tố B biện pháp xử lý) với
nhân tố A nồng độ 2%, 4%, đối chứng nước cất vô trùng và nhân tố B
biện pháp xử lý là: 1. Ngâm kết hợp phun 25 ngày sau khi gieo; 2.
Ngâm kết hợp phun 25+35 ngày sau khi gieo; 3. Áo hạt kết hợp phun 25
ngày sau khi gieo; 4. Áo hạt kết hợp phun 25+35 ngày sau khi gieo. Mỗi

nghiệm thức 4 lần lặp lại, mỗi lặp lại là 1 chậu. Cách lấy chỉ tiêu: Chỉ
tiêu ghi nhận vào thời điểm 7 và 14 ngày sau khi chủng bệnh. Trước khi
chủng ta tiến hành đánh dấu lá (lá thứ 5 trên cùng nở hoàn toàn). Ghi
nhận tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh và hiệu quả giảm bệnh tương tự như thí
nghiệm 3.2.1.

10


3.2.4 Khảo sát hoạt tính enzyme có liên quan đến tính kháng chống
bệnh cháy bìa lá lúa của dịch trích cỏ cứt heo
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hồn
tồn ngẫu nhiêm gồm 4 nghiệm thức 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 1
chậu lúa gồm 10 cây lúa. Nghiệm thức 1: Đối chứng-khơng chủng bệnh.
Nghiệm thức 2: Kích kháng- khơng chủng bệnh. Nghiệm thức 3: Đối
chứng- có chủng bệnh. Nghiệm thức 4: Kích kháng-có chủng bệnh. Thu
mẫu phân tích: Sau khi lây bệnh nhân tạo tiến hành thu mẫu lá tại các
thời điểm khảo sát. Mẫu lá lúa được thu vào các thời điểm 0, 12, 24, 48,
72 giờ sau khi lây bệnh (GSLB) và 5, 7 ngày sau khi lây bệnh (NSLB)
bằng cách dùng kéo cắt tồn cây lúa, sau đó đông lạnh ngay với nitơ
lỏng và trữ trong điều kiện lạnh ≤ -800C trước khi phân tích enzyme.
Mẫu được dùng chung cho các thí nghiệm từ 3.2.4.1-3.2.4.3
3.2.4.1 Khảo sát sự gia tăng hoạt tính enzyme Phenylalanine
ammonia lyase
Mục tiêu: Khảo sát hoạt tính enzyme phenylalanine ammonia
lyase (PAL) trong mơ tế bào cây lúa. Ly trích mẫu: Mẫu nghiền với
nitơ lỏng và ly trích bằng dung dịch đệm buffer (25 mM Tris HCl, pH
8,8 + 32 mM β-mercaptoethanol), ly tâm. Ƣớc lƣợng protein trong
mẫu: được ước lượng bằng đường chuẩn protein BSA (Bovine serum
albumin) gồm hàm lượng BSA (0 - 7 µg/µl) và thể tích Bradford tương

ứng để đạt 260 µl/giếng ở bước sóng 595 nm. Tiến hành đo hàm lượng
protein bằng cách kết hợp các giếng chứa mẫu (5 µl dịch trích mẫu +
255 µl Bradford) với đường chuẩn BSA, được đọc trên máy ELISA ở
bước sóng 595 nm.
Phân tích enzyme PAL: Đường chuẩn cinamic acid (CA) được
xây dựng gồm hỗn hợp: Tris HCl 25 mM với pH 8,8 (100 µl/giếng);
Tris HCl 100 mM với pH 8,8 (125 µl/giếng); chuẩn bị dung dịch stock
CA 20 mM, thực hiện rút với thể tích tăng dần 0-6 µl qua các giếng
(tương ứng nồng độ đường chuẩn 0-0,12 mM CA/µl) và thể tích Tris
HCl 25 mM + β-mercaptoethanol 32 mM tương ứng để đạt 250
11


µl/giếng, thực hiện lặp lại 2 lần. Sau 1 giờ ủ ở 400C, ngừng phản ứng
bằng 15 µl HCl 5N và đọc ở bước sóng 290 nm để xác định đường
chuẩn CA. Hoạt tính enzyme PAL trong mỗi giếng được xác định với
hỗn hợp phản ứng gồm 25 µl dịch trích enzyme, 125 µl substrate (Lphenylalanin 50 mM trong Tris HCl 100 mM, pH 8,8), 100 µl Tris HCl
25 mM (pH 8,8, không chứa mercaptoethanol). Tương ứng với mỗi
giếng trên là giếng mẫu blank gồm 25 µl dịch trích enzyme và 225 µl
Tris HCl 25 mM, thự hiện đo lặp lại 2 lần/mẫu. Tiếp tục, ủ ở 400C trong
1 giờ, ngừng phản ứng bằng 15 µl HCl 5N, tiến hành đọc phản ứng trên
máy ELISA ở bước sóng 290 nm. Qua cơng thức: (mM của CA x
1000)/(µg của protein x 1 giờ).
Hàm lượng enzyme PAL =
3.2.4.2 Khảo sát sự gia tăng hoạt tính của enzyme Peroxidase: Hoạt
tính enzyme peroxidase được xác định theo mô tả của Kapchina và
Yakimova (1997). Hỗn hợp phản ứng bao gồm 0,25 % guaiacol và 10
mM H2O2 được hòa tan trong kali photphat 0,1 M (pH 7,0). Chiết xuất
protein 5µl được thêm vào từng giếng của tấm ELISA và phản ứng được
bắt đầu bằng cách thêm 225 µl hỗn hợp phản ứng. Sự tăng độ hấp thụ ở

bước sóng 470 nm là do tạo thành sản phẩm có màu tetraguaicol trong
10 phút 20 giây đo 1 lần. Hoạt tính peroxidase được tính theo µmol sản
phẩm dehydroguaicol mg-1 protein second-1.
3.2.4.3 Hoạt tính enzyme Catalase: Hỗn hợp phản ứng bao gồm 30ml
potassium phosphate buffer 50 mM và 30µl H2O2. Chiết xuất protein
5µl được thêm vào từng giếng của tấm ELISA và phản ứng được bắt
đầu bằng cách thêm 225µl hỗn hợp phản ứng. Hoạt tính của enzyme
được đo bằng đầu đọc ELISA ở bước sóng 240 nm trong 10 phút 20
giây đo một lần. Hoạt tính enzyme catalase được tính với theo µmol sản
phẩm mg-1 protein second-1.

12


3.2.5 Đánh giá khả năng hạn chế bệnh cháy bìa lá lúa của dịch trích
cỏ cứt heo ở điều kiện ngồi đồng
Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của dịch trích cỏ cứt heo tại 2 địa
điểm qua 2 mùa vụ tại Bạc Liêu. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được
bố trí theo thể thức khối hồn tồn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức, 3 lần
lặp lại, mỗi lặp lại có diện tích 50m2. Nghiệm thức 1: Đối chứng;
Nghiệm thức 2: Nơng dân; Nghiệm thức 3: Xử lý dịch trích cỏ cứt heo.
Chuẩn bị hạt giống: Nghiệm thức nông dân quy trình canh tác lúa.
Nghiệm thức đối chứng: Xử lý theo quy trình của nghiệm thức nơng dân
nhưng khơng phun thuốc trừ bệnh. Nghiệm thức dịch trích: Xử lý theo
quy trình của nghiệm thức nông dân nhưng không sử dụng thuốc trừ
bệnh cháy bìa lá. Chỉ tiêu ghi nhận: Trong mỗi lặp lại, chỉ tiêu được
ghi nhận với 5 khung diện tích 20x20cm theo đường chéo góc. Lấy chỉ
tiêu thí nghiệm về tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh, hiệu quả giảm bệnh (tương tự
như thí nghiệm 3.2.3.4) và tỷ lệ hạt chắc và năng suất thực tế: thu hoạch
toàn bộ lúa trong khung 2 m2. Cân trọng lượng sau khi loại bỏ hạt lép,

lửng và đo ẩm độ hạt tại thời điểm cân, sau đó quy ra ẩm độ 14%. Từ đó
tính năng suất thực tế (NSTT) theo cơng thức: W14%=[Wo x (100 –
Ho)]/86. Trong đó: W14% : trọng lượng lúa thu hoạch được ở ẩm độ
14% (kg) Wo: trọng lượng ở thời điểm đo ẩm độ (kg) Ho: ẩm độ của hạt
cân trọng lượng (%).

CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thu thập, phân lập và đánh giá khả năng gây hại của các chủng
vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bệnh cháy bìa lá lúa
trên giống lúa RVT
4.1.1 Phân lập và đánh giá khả năng gây hại của các chủng vi
khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae trên giống RVT
Kết quả phân lập 46 chủng vi khuẩn gây bệnh cháy bìa lá lúa tại
Bạc Liêu cho thấy bệnh gây hại trên nhiều giống lúa khác nhau và gây
hại trên nhiều khu vực khác nhau, bao gồm: Hồng Dân, Vĩnh Lợi,
13


Phước Long, Giá Rai và Hịa Bình. Tất cả các chủng vi khuẩn phân lập
đều có khả năng gây bệnh trên giống RVT. Kết quả đánh giá khả năng
gây bệnh, đã tuyển chọn được vi khuẩn BL36 (Ngan Dừa) có khả năng
gây hại cao nhất trên giống lúa RVT cụ thể thông qua tỷ lệ chiều dài vết
bệnh là 68,26% và chỉ số bệnh 9,67% ở thời điểm 14NSLB và khác biệt
với các nghiệm thức cịn lại. Do đó, chủng BL36 được sử dụng là vật
liệu cho các nghiên cứu tiếp theo.
4.1.2 Khả năng gây hại của chủng vi khuẩn BL36 trên một số
giống lúa trong điều kiện nhà lƣới
Kết quả thí nghiệm cho thấy 5 giống lúa được chọn làm thí
nghiệm là Jasmine 85, RVT, OM18, OM5451, Đài thơm 8. Trong đó
giống Jasmine 85 là giống nhiễm bệnh cháy bìa lá lúa và khơng có canh

tác tại Bạc Liêu đem vào thí nghiệm này để so sánh và 4 giống lúa còn
lại là 4 giống lúa được trồng phổ biến tại Bạc Liêu. Do đó, dựa vào sự
tích lũy tỷ lệ chiều dài vết bệnh theo thời gian (AUDPC) cho thấy giống
Jasmine 85 và RVT là giống nhiễm bệnh và có tỷ lệ chiều dài vết bệnh
lần lượt là 17,84 và 19, 66% ở thời điểm 7NSLB và cao hơn ba giống
lúa còn lại gồm OM18, OM5451, Đài Thơm 8. Như vậy dựa vào tỷ lệ
chiều dài vết bệnh và AUDPC cho thấy chủng vi khuẩn BL36 có khả
năng gây bệnh nặng trên giống lúa Jasmine 85 và RVT. Do đó, chủng vi
khuẩn BL36 và giống lúa RVT được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp
tục.
4.2 Xác định nồng độ và biện pháp xử lý dịch trích cỏ cứt heo
(Ageratum conyzoides L.) trong phịng trừ bệnh cháy bìa lá lúa
trong điều kiện nhà lƣới
4.2.1 Đánh giá ảnh hƣởng của dịch trích cỏ cứt heo (Ageratum
conyzoides L.) đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Từ kết quả trên, có thể kết luận dịch trích cỏ cứt heo ở 5 nồng độ
được sử dụng (2%, 4%, 6%, 8% và 10%) không thấy khả năng ức chế
trực tiếp vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae trong điều kiện đĩa
14


Petri. Thí nghiệm có nghiệm thức thuốc Starner 20WP cho hiệu quả ức
chế vi khuẩn Xoo cao với bán kính vịng vơ khuẩn là 7,2 mm ở thời
điểm 96h và khác biệt với tất cả 5 nồng độ dịch trính cũng như nước cất
vì starner là dẫn xuất của hoạt chất Quinoline, là thuốc nội hấp có hiệu
quả cao với vi khuẩn Gram âm.
4.2.2 Ảnh hƣởng quá trình nảy mầm hạt lúa của dịch trích cỏ cứt
heo (Ageratum conyzoides L.)
Ở thời điểm 48 giờ sau xử lý, chiều dài diệp tiêu giữa các nồng độ
khảo sát khơng có sự khác biệt so với đối chứng nhưng chiều dài rễ

mầm thì có sự khác biệt ý nghĩa thống kê. Các nghiệm thức ngâm hạt thì
có chiều dài rễ mầm tương đương nhau và khơng khác biệt so với đối
chứng, trong đó nghiệm thức áo hạt thì thấy chiều dài rễ mầm ngắn hơn
và khác biệt ý nghĩa so với đối chứng có thể ở biện pháp áo có thể ảnh
hưởng đến sự phát triển chiều dài rễ. Dịch trích cỏ cứt heo ở các nồng
độ khác nhau không làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của
chiều dài rễ mầm và diệp tiêu hạt lúa cho thấy dịch trích cỏ cứt heo tiếp
tục có tiềm năng để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo trong nghiên cứu
tính kích kháng bệnh cháy bìa lá cho cây lúa của loại dịch trích này.
4.2.3 Hiệu quả các nồng độ dịch trích trong phịng trừ bệnh cháy
bìa lá lúa ở điều kiện nhà lƣới
Khi đánh giá hiệu quả phịng trừ bệnh cháy bìa lá lúa ở điều kiện
nhà lưới của 3 nồng độ dịch trích (2%, 4%, 8 %) cỏ cứt heo, đã cho
thấy cả 3 nồng độ áp dụng đều ít nhiều thể hiện khả năng phịng trị bệnh
cháy bìa lá lúa. Điều đó được thể hiện rõ qua tỷ lệ bệnh, chỉ số bệnh và
hiệu quả giảm bệnh ở cả 2 thời điểm 7 và 14 NSLB
Tỷ lệ bệnh ở thời điểm 7 NSLB: trung bình tỷ lệ bệnh qua các
nồng độ dịch trích 2%, 4% và 8% (lần lượt 5,01%, 5,06 và 5,32%) đều
khơng có sự khác biệt ý nghĩa thống với nhau nhưng đều thấp hơn và
khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với đối chứng (7,46%).

15


Chỉ số bệnh: Ở thời điểm 7 NSLB, trung bình chỉ số bệnh ở cả 3
nồng độ dịch trích 2%, 4% và 8% (lần lượt 4,17%; 4,45% và 4,33%)
đều tương đương nhau, đồng thời thấp hơn và có sự khác biệt ý nghĩa
thống kê ở mức 1% so với đối chứng (5,23%). Ở thời điểm 14 NSLB,
trung bình chỉ số bệnh ở cả 3 nồng độ dịch trích 2%, 4% và 8% (dao
động 6,14 – 6,71%) đều đồng thời thấp hơn và có sự khác biệt ý nghĩa

thống kê ở mức 1% so với đối chứng (8,38%).
Trung bình hiệu quả giảm bệnh ở thời điểm 7 và 14 NSLB đều
cao, đạt trên 60% ở thời điểm 7 NSLB và trên 70% ở thời điểm 14
NSLB.
4.2.4 Hiệu quả của các nồng độ và biện pháp xử lý dịch trích trong
phịng trừ bệnh cháy bìa lá lúa ở điều kiện nhà lƣới
Bảng 4.1: Tỷ lệ bệnh ở thời điểm 14 ngày sau khi lây bệnh
Áo +
Nghiệm
Ngâm + phun
Ngâm + phun
phun 25
thức
25 NSS
25, 35 NSS
NSS
ab
2%
7,45
7,02 c
7,52 b

Áo + phun
25, 35 NSS

Trung
bình (A)

7,84 a


7,46 B

4%
7,42 ab
7,13 b
7,44 ab
7,79 a
7,45 B
a
a
a
a
Đối chứng 9,12
9,55
9,78
9,45
9,5 A
AB
B
A
A
Trung
7,97
7,73
8,02
8,20
bình (B)
Mức ý
F(A)**, F(B)** ,
nghĩa

F(AXB)**
CV(%)
19,50
Ghi chú: Trong cùng một bảng những số có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì
khơng khác biệt ở mức ý nghĩa 5% trong phép thử Duncan. **: khác biệt ở mức ý nghĩa
1%. *: khác biệt ở mức ý nghĩa 5%.

16


B

A

C

Hình 4.1 Hiệu quả phịng trừ bệnh cháy bìa lá lúa của các nồng độ dịch trích cỏ
cứt heo so với biện pháp đối chứng ở thời điểm 14 ngày sau lây bệnh
A. Đối chứng; B. Ngâm + phun 25,35 NSKS ở nồng độ 2%; C. Ngâm + phun
25,35 NSKS ở nồng độ 4%

Qua phân tích các kết quả về tỷ lệ bệnh (%), chỉ số bệnh (%) và
hiệu quả giảm bệnh (%) ở 2 thời điểm 7 và 14 NSLB của các nghiệm
thức cho thấy khi kết hợp 1 trong 2 nồng độ dịch trích cỏ cứt heo (2 và
4%) với 1 trong các biện pháp xử lý (áo hạt, ngâm hạt, phun 25 NSS,
phun kết hợp 25+35 NSS) đều thể hiện hiệu quả phịng trị bệnh cháy bìa
lá lúa ở điều kiện nhà lưới. Tuy nhiên, việc áp dụng nồng độ dịch trích
2% và 4% kết hợp với biện pháp ngâm + phun 25+35 NSS thể hiện hiệu
quả phịng trị bệnh cháy bìa lá lúa tốt trong điều kiện nhà lưới, đặc biệt
là nồng độ dịch trích 2% kết hợp với biện pháp ngâm + phun 25+35

NSS cho thấy có phần hiệu quả hơn đạt bảng 4.1 cho thấy 2% với biện
pháp kết hợp phun 25+35 cho tỷ lệ bệnh thất nhất 7,02 và khác biệt với
các nghiệm thức cịn lại. Nên sử dụng dịch trích 2% kết hợp biện pháp
ngâm và phun kết hợp 25+35 ngày để tiếp tục đánh giá ngoài đồng.

17