TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Tối ưu quá trình biểu hiện và tinh sạch
protein Nucleocapsid virus SARS-CoV-2
trong vi khuẩn E.coli
NGUYỄN MINH QUANG

Ngành Kỹ thuật sinh học
Chuyên ngành Sinh học phân tử

Giảng viên hướng dẫn:

TS. Nguyễn Thanh Hịa
Chữ ký của GVHD

Bộ mơn:

Vi sinh – Hóa sinh – Sinh học phân tử

Viện:

Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm

HÀ NỘI, 08/2022


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

ĐỀ TÀI TỐT NGHIỆP
Họ và tên sinh viên: Nguyễn Minh Quang
Khóa: 63

MSSV: 20180366

Viện: Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm

Ngành: Kỹ thuật sinh học.

1. Đề tài nghiên cứu: “Tối ưu quá trình biểu hiện và tinh sạch protein
Nucleocapsid virus SARS-CoV-2 trong vi khuẩn E.coli”
2. Nội dung chính của đề tài:
• Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện protein nucleocapsid virus SARS-CoV-2 trong
vật chỉ E.coli
• Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện, tinh sạch protein nucleocapsid virus SARS-CoV2 từ E.coli tái tổ hợp
• Tinh sạch, đánh giá hoạt tính protein nucleocapsid thu được
3. Họ tên cán bộ hướng dẫn: TS. Nguyễn Thanh Hòa
4. Ngày giao nhiệm vụ đồ án: Ngày 01 tháng 04 năm 2022
5. Ngày hoàn thành đồ án: Ngày 20 tháng 07 năm 2022
Ngày 22 tháng 07 năm 2022
Trưởng bộ môn

Cán bộ hướng dẫn

(Ký, ghi rõ họ tên)

(Ký, ghi rõ họ tên)

Sinh viên đã hoàn thành và nộp đồ án tốt nghiệp ngày…..tháng…năm…..


ii

Người duyệt

Sinh viên

(Ký, ghi rõ họ tên)

(Ký, ghi rõ họ tên)


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô trong Viện Công nghệ Sinh học và
Công nghệ thực phẩm, cũng như các thầy cô trong trường Đại học Bách Khoa Hà
Nội đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian học
tập tại trường.
Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới cơ Nguyễn
Thanh Hịa, Phó trưởng Bộ mơn vi sinh, hóa sinh, sinh học phân tử Viện
CNSH&CNTP đã hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đồ án.
Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy Trương Quốc Phong, viện phó Viện
CNSH&CNTP đã khơi dậy niềm cảm hứng, tạo điều kiện và giúp đỡ cho em xuyên
suốt quãng thời gian nghiên cứu khoa học tại trường.
Em cũng xin cảm ơn sự hướng dẫn, giúp đỡ nhiệt tình của các anh/chị/em
phịng thí nghiệm 307 B1 – Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh
học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội trong thời gian em làm nghiên cứu và

học tập tại đây.
Với tất cả lịng kính u và sự biết ơn chân thành nhất, em xin gửi tới gia
đình: bố, mẹ, em trai, những người đã ln nhiệt tình động viên, tạo điều kiện và
là chỗ dựa tinh thần cho em trong quá trình học tập tại trường. Trong quá trình
thực hiện đề tài tốt nghiệp, do thời gian và kiến thức còn hạn chế nên có những
thiếu sót khơng thể tránh khỏi. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến, chỉ
bảo tận tình của q thầy cơ để khố luận hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 22 tháng 07 năm 2022

iii


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hịa

TĨM TẮT NỘI DUNG ĐỒ ÁN
Cuối năm 2019, thế giới ghi nhận ca nhiễm Coronavirus đầu tiên tại Vũ Hán, Trung
Quốc. Kể từ đó, số lượng các ca nhiễm ngày càng tăng và mức độ của dịch bệnh
ngày càng nghiêm trọng khi các biến thể mới của virus corona được phát hiện. Với
tốc độ lây lan nhanh chóng, hiện nay thế giới đã trải qua 2 năm đại dịch với nhiều
lần phát sinh biến chủng lây lan mạnh hơn, lẩn tránh hệ miễn dịch tốt hơn. Các
biến chủng này không ngừng thay phiên trở thành biến chủng chủ đạo gây khó
khăn cho cơng tác phòng chống dịch bệnh. Protein nucleocapsid của SAR-CoV-2
là mục tiêu chính của các KIT test nhanh dựa trên kháng nguyên, kháng thể hiện
nay với ưu thế tồn tại lâu, hàm lượng cao trong cơ thể người bệnh; nhờ đó đóng
vai trị quan trọng trong sản xuất KIT test nhanh phục vụ cơng tác phịng chống
dịch bệnh. Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu đã thực hiện đề
tài: “Tối ưu quá trình biểu hiện và tinh sạch protein Nucleocapsid virus SARSCoV-2 trong vi khuẩn E.coli”

Kết quả đạt được trong đồ án:
• Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện protein nucleocapsid virus SARS-CoV-2 tái tổ
hợp trong vật chủ E.coli
• Tối ưu hóa điều kiện biểu hiện, tinh sạch protein nucleocapsid virus SARS-CoV2 từ E.coli tái tổ hợp
• Tinh sạch, đánh giá hoạt tính protein nucleocapsid virus SARS-CoV-2 tái tổ hợp
thu được

Sinh viên thực hiện
Ký và ghi rõ họ tên

iv


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

ACE2 : Angiotensin Converting Enzyme 2
Amp : Ampicillin
ARN : Axit Ribonucleic
Bp : base pair
CTD: C-terminal domain
E.coli : Escherichia coli
EDTA : Ethylen diamine tetraacetic acid
ELISA : Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay
ICTV : International Committee on Taxonomy of Viruses
IDR: Intrinsically disordered regions
Ig : Immunoglobulin
IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kDa : Kilo Dalton
LB : Luria Bertani
LKR: Linker region
MERS: Middle East Respiratory Syndrome
NTD: N terminal domain
OD : Optical Density
PBS : Phosphate Buffered Saline
PBS-T : Phosphate Buffered Saline – Tween – 20
PCR : Polymerase Chain Reaction
PHEIC : Public Health Emergency of International Concern
RNP: Ribonucleoprotein particle
RT : Room temperature
SARS : Severe acute respiratory syndrome
SARS-CoV-2 : Severe acute respiratory syndrome corona virus 2
SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis
v


Đồ án tốt nghiệp
TMB : Tetramethybenzidine
TEMED: Tetramethylethylenediamine
v/v : Volume/ volume
WHO : World Health Organization

vi

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa


Đồ án tốt nghiệp


GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hịa

DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1-1:Tình hình bùng phát dịch Covid-19 trên tồn thế giới ............. 12
Hình 1-2: Hình ảnh virus SARS-CoV-2 trên kính hiển vi điện tử [5] .... 16
Hình 1-3: Cấu trúc các thành phần chính virus SARS-CoV-2 [6] .......... 17
Hình 1-4: Mô phỏng tổng quan cấu trúc Protein Nucleocapsid SARS-CoV2 [9] ...................................................................................................................... 18
Hình 1-5: Sự biến thiên ước tính theo thời gian của các xét nghiệm chẩn
đoán SARS-CoV 2 liên quan đến thời gian khởi phát triệu chứng[22] ............... 20
Hình 2-1: Vector biểu hiện pET22b(+) và trình tự ORF ......................... 24
Hình 3-1 Kết quả điện di SDS-PAGE kiểm tra sự biểu hiện của protein N
ở các pH môi trường LB lỏng khác nhau.. ........................................................... 33
Hình 3-2: Kết quả điện di SDS-PAGE kiểm tra sự biểu hiện của protein N
ở các tỷ lệ cấp giống khác nhau.. ......................................................................... 35
Hình 3-3: Kết quả điện di SDS-PAGE kiểm tra sự biểu hiện protein N ở
các điều kiện nhiệt độ, thời gian: ......................................................................... 36
Hình 3-4: Kết quả điện di SDS-PAGE kiểm tra ảnh hưởng nồng độ IPTG
đến sự biểu hiện protein N.. ................................................................................. 38
Hình 3-5: Kết quả điện di kiểm tra khảo sát các nồng độ Imidazole trong
đệm rửa tinh sạch. ................................................................................................ 40
Hình 3-6: Kết quả điện di SDS-PAGE khảo sát nồng độ Imidazole trong
đệm rửa giải protein N tinh sạch .......................................................................... 41
Hình 3-7: Kết quả Western Blot trên màng nhuộm ink (A) và sau khi dừng
phản ứng cơ chất bằng nước Deion (B).. ............................................................. 42

vii


Đồ án tốt nghiệp


GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2-1: Hóa chất pha gel điện di SDS-PAGE .................................................. 28
Bảng 2-2: Công thức pha đường chuẩn Bradford. ............................................... 30
Biểu đồ 3-1: Lượng protein đích thu được ở các pH môi trường LB lỏng khác
nhau……………………………………………………………………………...34
Biểu đồ 3-2: Lượng protein 48kDa thu được ở các tỷ lệ cấp giống khác nhau .. 35
Biểu đồ 3-3: Lượng protein kích thước 48kDa thu được ở các nhiệt độ, thời gian
cảm ứng ................................................................................................................ 37
Biểu đồ 3-4: Lượng Protein 48kDa thu được ở các nồng độ IPTG cảm ứng khác
nhau ...................................................................................................................... 38
Biểu đồ 3-5: Kết quả ELISA đánh giá hoạt tính protein N tái tổ hợp so sánh với
protein N thương mại của hãng Medicon............................................................. 43

viii


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hịa

MỤC LỤC

TĨM TẮT NỘI DUNG ĐỒ ÁN ..................................................................... iv
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...........................................................................v
DANH MỤC HÌNH VẼ ................................................................................. vii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ........................................................................... viii
MỤC LỤC ..........................................................................................................9

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................12
1.1

Tổng quan tình hình dịch bệnh COVID-19 thế giới và Việt Nam ........12
Tình hình dịch bệnh COVID-19 thế giới: ..........................................12
Tình hình dịch bệnh COVID-19 tại Việt Nam: ..................................13

1.2

Virus SARS-CoV-2, tác nhân gây ra dịch bệnh COVID-19: ................15
Đặc điểm cấu trúc và di truyền virus SARS-CoV-2: .........................16
Đặc điểm protein N virus SARS-CoV-2: ...........................................18
Đóng gói bộ gen virus – chức năng chính protein N virus SARS-CoV-

2:……………………………………………………………………………..19
1.3

Các phương pháp chẩn đoán SARS-CoV-2: .........................................20
Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền virus SARS-CoV-2 ..........20
Phương pháp phát hiện kháng nguyên/kháng thể virus SARS-CoV-

2:……………………………………………………………………………..21
1.4

Protein nucleocapsid của SARS-CoV-2 và ứng dụng: ..........................22
Protein nucleocapsid tái tổ hợp: .........................................................22
Sản xuất protein nucleocapsid tái tổ hợp trong hệ biểu hiện E.coli và

ứng dụng: .........................................................................................................22


9
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............24
2.1

Vật liệu:..................................................................................................24
Chủng vi sinh vật:...............................................................................24
Vector biểu hiện pET22b(+) ..............................................................24
Các kháng thể sử dụng cho Western Blot và ELISA: ........................25
Mơi trường, hóa chất: .........................................................................25

2.2

Thiết bị: ..................................................................................................26

2.3

Phương pháp nghiên cứu: ......................................................................27
Phương pháp vi sinh ...........................................................................27
Phương pháp hóa sinh: .......................................................................27
Phương pháp miễn dịch: .....................................................................31
Phương pháp tin sinh: .........................................................................31

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................33

3.1

Nghiên cứu điều kiện tối ưu biểu hiện protein N tái tổ hợp virus SARS-

CoV-2 trong E.coli BL21 (DE3):...................................................................................33
Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện pH môi trường đến sự biểu hiện
protein N tái tổ hợp: .........................................................................................33
Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện cấp giống theo thể tích đến sự biểu
hiện protein N tái tổ hợp: .................................................................................34
Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian, nhiệt độ nuôi cảm ứng đến sự biểu
hiện protein N tái tổ hợp: .................................................................................36
Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ IPTG đến sự biểu hiện protein N tái tổ
hợp:…………………………………………………………………………..37
Kết quả tối ưu biểu hiện protein N tái tổ hợp virus SARS-CoV-2: ...39
3.2

Nghiên cứu điều kiện tối ưu tách chiết và tinh sạch protein N tái tổ hợp

virus SARS-CoV-2 ........................................................................................................40

10
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Imidazole trong đệm rửa tinh sạch
protein N phương pháp sắc ký ái lực gắn gel Ni2+-IDA: .................................40

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ Imidazole trong đệm rửa giải tinh
sạch protein N phương pháp sắc ký ái lực gắn gel Ni2+- IDA: ........................41
3.3

Kết quả Western Blot kiểm tra protein N: .............................................42

3.4

Kết quả ELISA kiểm tra hoạt tính protein N tái tổ hợp: .......................43

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................44
4.1

Kết luận: .................................................................................................44

4.2

Kiến nghị: ..............................................................................................44

PHỤ LỤC .........................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO: .............................................................................49

11
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan tình hình dịch bệnh COVID-19 thế giới và Việt Nam
Tình hình dịch bệnh COVID-19 thế giới:
Tháng 12 năm 2019, tại Vũ Hán – Trung Quốc xuất hiện một số ca bệnh có triệu
chứng tương tự viêm phổi. Tác nhân sau đó được xác định là do một loại virus corona
chủng mới gây ra.
Ngày 11/02/2020, WHO đưa ra tên gọi chính thức của virus corona chủng mới
là SARS-CoV-2, đặt tên cho dịch bệnh mới do virus này gây ra là COVID-19. Trước
tốc độ lây lan mạnh mẽ của virus SARS-CoV-2 trên toàn thế giới, ngày 11 tháng 03 năm
2020, WHO chính thức tuyên bố COVID-19 là đại dịch tồn cầu.

Hình 1-1:Tình hình bùng phát dịch Covid-19 trên tồn thế giới

Tính đến ngày 10 tháng 06 năm 2022, 534.789.733 ca nhiễm và 6.308.113 ca tử
vong COVID-19 đã được ghi nhận trên toàn thế giới. Hiện tại, bất chấp việc vaccine đã
ra đời và tỷ lệ tiêm chủng cao tại nhiều khu vực trên thế giới, virus SARS-CoV-2 vẫn
tiếp tục lây lan mạnh. Tại Mỹ, tính đến hiện tại đã có hơn 85 triệu người nhiễm và hơn
1 triệu người chết. [1]
Mặc dù hiện tại các vaccine và chiến lược phòng chống dịch bệnh tỏ ra hiệu quả
trong việc giảm thiểu các biến chứng nặng của bệnh cũng như tỷ lệ tử vong, nhưng do

12
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

tốc độ lây lan quá nhanh đã dẫn đến phát sinh nhiều biến chủng mới. Từ chủng phát sinh

ban đầu ở Vũ Hán, SARS-CoV-2 đã biến đổi và thay thế lẫn nhau nhiều lần
Biến chủng Delta được báo cáo lần đầu ở Ấn Độ vào tháng 10 năm 2020, trong
giai đoạn bùng phát mạnh nhất, nó đã lan đến 135 quốc gia và trở thành biến chủng
chiếm ưu thế tuyệt đối (tới 93%) ở tất cả những nơi mà nó có mặt, gây ra một làn sóng
dịch mới, làm đảo lộn thành quả chống dịch ở nhiều nước trên thế giới, ngay cả ở những
quốc gia đã từng rất thành công trong cuộc chiến chống COVID-19 nhờ vắc xin [2].
Khu vực Đông Nam Á là một trong những khu vực bị ảnh hưởng nặng nề bởi biến chủng
này, với số ca mắc bệnh và số ca tử vong tăng rất cao.
Biến thể Omicron lần đầu tiên được báo cáo cho WHO từ Nam Phi vào ngày 24
tháng 11 năm 2021. Biến chủng Omicron là biến chủng nổi bật bởi khả năng lẩn trốn hệ
miễn dịch, mặc dù triệu chứng do biến chủng gây ra nhẹ hơn biến chủng Delta và tỷ lệ
tử vong thấp hơn nhưng với khả năng lây nhiễm mạnh mẽ, biến chủng này đã gây ra ảnh
hưởng mạnh mẽ cho đời sống, kinh tế-xã hội nhiều quốc gia. [3]
Biến chủng mới Omicron BA.5 được phát hiện lần đầu tiên tại Nam Phi vào
tháng 1/2022, sau đó lan sang nhiều quốc gia trên thế giới. BA.5 mang nhiều thay đổi
trên protein gai ở đột biến L452R, F486V khiến độ độ bám của virus vào tế bào của vật
chủ nhanh và dễ dàng hơn. Sự nguy hiểm của biến thể này ở điểm tốc độ lây lan của
chúng rất nhanh, đến hiện tại biến chủng này đang dần thay thế biến chủng BA.1 và
BA.2 hiện tại. Theo những công bố của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), việc gây bệnh
nặng và khiến cho các ca tử vong tăng lên của BA.5 khơng bằng Delta song chúng lại
có khả năng tấn cơng, gây lây nhiễm cho những người từng mắc Omicron và những biến
chủng trước đó. Chính vì vậy, nhiều khu vực hiện nay như Nhật Bản đang ghi nhận
chúng rất có thể gây ra một làn sóng dịch khác và các chun gia cho rằng virus cịn sẽ
tiến hóa nhiều hơn khiến cho nhiều người có thể mắc bệnh tới 3 hoặc 4 lần cùng với
những triệu chứng kéo dài không dứt. [4]
Tình hình dịch bệnh COVID-19 tại Việt Nam:
Từ đầu năm 2020 đến nay, Việt Nam đã trải qua 4 đợt bùng phát. Quy mô, địa
bàn và mức độ lây lan qua mỗi đợt đều có xu hướng phức tạp hơn. Tính đến ngày
16/01/2022, cả nước ghi nhận 2.023.546 ca mắc, trong đó 2.018.838 ca trong nước, đã
13

SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hịa

có 1.727.290 người khỏi bệnh, 35.480 ca tử vong. Trong đợt dịch thứ 4 đã ghi nhận
2.020.694 ca mắc, trong đó có 2.017.268 ca trong nước (99,8%), 1.724.473 người đã
khỏi bệnh (85,3%), 35.445 tử vong tại 52 tỉnh, thành phố. Đến nay, nước ta đã ghi nhận
68 ca nhiễm biến thể Omicron là các trường hợp nhập cảnh đã được quản lý, cách ly kịp
thời, trong đó Hà Nội (1), Quảng Nam (27), TP HCM (30), Hải Dương (1), Hải Phịng
(1), Thanh Hóa (2), Đà Nẵng (3), Khánh Hòa (2) và Long An (1).
Tính trên 1 triệu dân, số mắc xếp thứ 143/224 nước trên thế giới, 06/11 nước
khu vực ASEAN; số tử vong xếp thứ 130/224 nước trên thế giới, 05/11 nước khu vực
ASEAN. Tỷ lệ tử vong trên số mắc là 1,8%, xếp thứ 26/224 nước trên thế giới, 03/11
nước trong ASEAN. [5]
Giai đoạn 1 từ ngày 22/1/2020 đến 22/7/2020: ghi nhận 415 ca mắc (309 ca
trong nước và 106 ca nhập cảnh), khơng có tử vong. Ca bệnh ghi nhận đầu tiên là trường
hợp nhập cảnh từ thành phố Vũ Hán, Trung Quốc vào Việt Nam. Sau đó ghi nhận ổ dịch
đầu tiên tại cộng đồng với 06 trường hợp mắc là những người thân, họ hàng trong gia
đình trên địa bàn xã Sơn Lơi, huyện Bình Xun, tỉnh Vĩnh Phúc có tiếp xúc gần với
bệnh nhân đi về từ Vũ Hán. Các ổ dịch tiếp theo được ghi nhận tại qn Bar Buddha
(TP. Hồ Chí Minh), Hạ Lơi (Mê Linh, Hà Nội) và Bệnh viện Bạch Mai (Hà Nội). [5]
Giai đoạn 2 từ ngày 23/7/2020 đến ngày 27/01/2021: ghi nhận 1.136 ca mắc
(1.073 ca trong nước và 63 ca nhập cảnh) với 35 ca tử vong do có bệnh lý nền nặng17.
Các ca mắc tập trung ở Thành phố Đà Nẵng và các địa phương có yếu tố dịch tễ liên
quan đến Đà Nẵng; đặc biệt dịch đã xâm nhập các khoa điều trị bệnh nhân nặng như hồi
sức cấp cứu, thận nhân tạo, sau đó lan ra cộng đồng ở 15 tỉnh, thành phố. [5]
Giai đoạn 3 từ ngày 28/01/2021 đến ngày 26/4/2021: ghi nhận 1.301 ca mắc

(910 ca mắc trong nước và 391 ca nhập cảnh), không có tử vong . Ca mắc đầu tiên được
phát hiện khi nhập cảnh vào Nhật Bản, đây là công nhân từng làm việc trong cụm cơng
nghiệp ở Chí Linh, Hải Dương sau đó tiếp tục lây lan ra cộng đồng tại 13 tỉnh, thành
phố. [5]
Giai đoạn 4 từ ngày 27/4/2021 đến nay Ghi nhận 2.020.694 ca, trong đó có
2.017.268 ca trong nước (99,8%), 1.724.473 người đã khỏi bệnh (85,3%), 35.445 tử
vong tại 52 tỉnh, thành phố. Bắt đầu từ đợt dịch thứ 4 khởi đầu ngày 27/4/2021, với đa
14
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

nguồn lây, đa chủng, đa ổ bệnh và đã xâm nhập sâu trong cộng đồng, xuất hiện ở mọi
lứa tuổi (bao gồm cả trẻ em) tấn công vào các khu công nghiệp, nhà máy, cơ sở y tế,
trường học, cơ quan hành chính, nhóm sinh hoạt tơn giáo... và tại các khu vực có mật
độ dân cư cao làm số mắc tăng nhanh. Đến cuối tháng 5/2021, dịch đã lây lan ra hơn 30
tỉnh, thành phố và bùng phát mạnh tại tỉnh Bắc Ninh, Bắc Giang; tấn công vào các khu
công nghiệp, nhà máy, xí nghiệp, nơi ở và sinh hoạt tập trung đơng cơng nhân, cộng
đồng dân cư nơi có cơng nhân lưu trú. Đến cuối tháng 6/2021, Bắc Ninh, Bắc Giang đã
cơ bản kiểm soát được dịch bệnh. Trong thời gian này tại Đà Nẵng, Hà Nội, Thành phố
Hồ Chí Minh và một số địa phương khác cũng ghi nhận các ca bệnh khơng rõ nguồn
lây. Thành phố Hồ Chí Minh ghi nhận rải rác các ca mắc mới từ cuối tháng 4/2021, đầu
tháng 5/2021. Dịch bắt đầu bùng phát từ ngày 26/5/2021 với các ca bệnh được phát hiện
từ nhóm truyền giáo Phục Hưng; sau đó số mắc tăng nhanh với hơn 20 chuỗi lây nhiễm
trên toàn địa bàn Thành phố. Đến 31/5/2021, Thành phố Hồ Chí Minh đã ghi nhận 260
ca mắc và quyết định áp dụng giãn cách xã hội theo Chỉ thị 15/CT-TTg trên toàn địa
bàn và một số khu vực theo Chỉ thị 16/CT-TTg. Trong hơn 1 tháng thực hiện giãn cách

xã hội, dịch bệnh vẫn tiếp tục gia tăng và lan rộng, số mắc hằng ngày tăng liên tục, đến
ngày 05/7/2021 đã vượt 1.000 ca mắc mới mỗi ngày. Đến ngày 09/7/2021, Thành phố
quyết định áp dụng Chỉ thị số 16/CT-TTg trên toàn địa bàn. Ngoài ra tại các tỉnh trọng
điểm kinh tế trong khu vực phía Nam như Bình Dương, Đồng Nai, Long An và các tỉnh
Trung Bộ và Tây Nam Bộ dịch bắt đầu lan rộng.
Sau hơn 5 tháng xảy ra đợt dịch thứ 4, đến hết ngày 10/10/2021 dịch đã cơ bản
được kiểm sốt trên phạm vi tồn quốc với 835.036 ca mắc tại cộng đồng ở 62 tỉnh,
thành phố, trong đó có 20.520 ca tử vong (tỷ lệ chết/mắc là 2,4%). Đến nay dịch bệnh
đã cơ bản được kiểm soát trên phạm vi cả nước. Tất cả các tỉnh, thành phố đều đã chuyển
sang trạng thái “Thích ứng an tồn, linh hoạt, kiểm soát hiệu quả dịch COVID-19” theo
Nghị quyết 128/NQ-CP của Chính phủ. Tuy nhiên, dịch bệnh vẫn diễn biến phức tạp
với số ca nhiễm mới khoảng 15.000 ca/ngày tại hầu hết các tỉnh, thành phố trên cả nước
[5].
1.2 Virus SARS-CoV-2, tác nhân gây ra dịch bệnh COVID-19:
Virus corona gây hội chứng hơ hấp cấp tính nặng 2, viết tắt là SARS-CoV-2
(tiếng Anh: Severe acute respiratory syndrome corona virus 2), trước đây có tên là virus
15
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

corona mới 2019 (2019-nCoV), là virus thuộc họ Coronaviridae gây ra bệnh viêm đường
hô hấp cấp do virus corona 2019 (COVID-19). Virus được phát hiện lần đầu tiên vào
tháng 12 năm 2019, trong đợt bùng phát dịch bệnh viêm phổi lạ ở thành phố Vũ Hán,
Trung Quốc. Bất chấp các nỗ lực ngăn cản và phong tỏa virus của chính quyền thành
phố Vũ Hán, virus vẫn tiếp tục lây lan mạnh mẽ ra toàn thế giới.
Ngày 12 tháng 01 năm 2020, virus được WHO đặt tên là 2019-nCoV. Đến ngày

11 tháng 02 năm 2020, Ủy ban Quốc tế về Phân loại Virus (ICTV) quyết định đặt tên
virus này là SARS-CoV-2 sau những nghiên cứu phân tích di truyền chỉ ra rằng virus
này có là một chủng loại thuộc cùng họ với virus gây ra dịch bệnh SARS hồi 2003 và
virus gây ra dịch MERS. Trong tháng 12 năm 2019 khi COVID-19 còn là dịch bệnh lạ,
thơng qua phân tích hình thái virus cùng phân tích di truyền đã xác nhận sự tồn tại của
chủng virus chịu trách nhiệm cho dịch bệnh tồi tệ nhất trong vòng 100 năm trở lại đây.
Đặc điểm cấu trúc và di truyền virus SARS-CoV-2:

Hình 1-2: Hình ảnh virus SARS-CoV-2 trên kính hiển vi điện tử [6]

Các thành viên virus họ Coronaviridae có dạng hình cầu bề mặt gai với đường
kính xấp xỉ 125nm, với cấu trúc theo thứ tự từ trong ra ngoài như sau:

16
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hịa

• Lõi acid nucleic: Bộ gen của virus, cụ thể là sợi ARN đơn, dương giúp virus
có khả năng tổng hợp các thành phần cấu tạo bằng hình thức tự sao RNA và phiên mã
ngược khi xâm nhập vào tế bào vật chủ. Kích thước bộ gen của họ Coronaviridae được
xem là lớn nhất trong số các loại virus ARN: 26-32 kilobase.
• Vỏ protein (vỏ capsit): Lớp vỏ bọc bên ngoài bộ gen được cấu tạo từ các
capsomeđóng vai trị bảo vệ.
• Lớp vỏ ngoài: Cấu tạo từ lớp kép lipit và protein, bên trên có lớp gai protein.
Lớp gai này có khả năng bám vào thụ thể ACE2 trên màng tế bào vật chủ, giúp virus có
khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào.

Các hạt virus Coronavirus chứa bốn protein cấu trúc chính: protein spike (S),
màng (M), vỏ (E) và nucleocapsid (N), tất cả đều được mã hóa trong đầu 3′ của bộ gen
virus.

Hình 1-3: Cấu trúc các thành phần chính virus SARS-CoV-2 [7]

Protein S có trọng lượng khoảng 150 kDa đa số gồm hai tiểu phần S1 hình cầu
ở đầu và S2 là phần cuống, tạo nên cấu trúc gai đặc biệt trên bề mặt của virus và có vai
trị trung gian gắn vào thụ thể ACE2 của tế bào vật chủ.
Protein M là protein cấu trúc chính của màng virus khiến virion có hình cầu.
Protein E (8 -12 kDa) nằm trên vỏ virus và có vai trị chính trong việc lắp ráp và giải
phóng virus.
Protein N tồn tại trong Nucleocapsid và có vai trị liên kết bộ gen virus thành
cấu trúc kiểu chuỗi hạt để đóng gói bộ gen thành các hạt virus.
17
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hịa

Ngồi 4 protein chính trên, cịn có protein phi cấu trúc hemagglutinin-esterase
(HE), có vai trò tăng cường sự xâm nhập của virus qua trung gian protein S và giúp virus
xâm nhập vào tế bào niêm mạc. Các protein phi cấu trúc khác có vai trò trong đảm bảo
các hoạt động của virus. [8]
Đặc điểm protein N virus SARS-CoV-2:
Protein N của SARS-CoV-2 được mã hóa bởi ORF thứ chín của virus và bao
gồm 419 axit amin. Giống như các Coronavirus khác, protein N của SARS-CoV-2 có tổ
chức mơ-đun có thể được chia thành các vùng rối loạn nội tại (IDR) và các vùng cấu

trúc bảo tồn. Vùng rối loạn nội tại bao gồm ba mô-đun: N-arm, vùng trung tâm liên kết
linh hoạt giàu Ser/Arg (LKR) và đuôi C, trong khi các vùng cấu trúc được bảo tồn bao
gồm hai mô-đun: N-terminal domain (NTD) và C-terminal domain (CTD). Trong cấu
trúc sơ cấp, NTD và CTD được nối với nhau bằng LKR và thường được nối với nhau
bởi N-arm và C-tail.

Hình 1-4: Mơ phỏng tổng quan cấu trúc Protein Nucleocapsid SARS-CoV-2 [10]

Cho đến này, cấu trúc miền N và miền C đã được làm rõ cho thấy 2 miền này
mang tính bảo thủ và giống với các Coronavirus khác [11, 12]. Đối với protein SARSCoV-2 N, mỗi phân tử NTD có hình dạng nắm tay thuận tay phải. Miền phụ lõi bao gồm
18
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

một cấu trúc liên kết 5 chuỗi β đối song song hình chữ U tạo bởi β4 – β2 – β3 – β1 – β5,
được kẹp giữa hai chuỗi xoắn α ngắn (α1 trước sợi β2 và α2 sau β5). Có một kẹp β nhô
ra lớn (tạo bởi β2′ – β3 ′) giữa β2 và β3 như một cầu nối để kết nối chúng, nhơ bật ra
khỏi lõi. Về CTD, nó tồn tại dưới dạng homodimer chặt và có hình dạng phiến hình chữ
nhật, trong đó mỗi protomer bao gồm 5 chuỗi xoắn α, 2 chuỗi gấp β và 2 chuỗi xoắn
310. Kẹp tóc β từ một protomer này được đưa vào khoang của protomer khác, dẫn đến
sự hình thành của tấm β gồm, đối song song tại mặt phân cách dimer. Tấm β tạo thành
một mặt của dimer, trong khi ở mặt đối diện của dimer, bề mặt được hình thành bởi các
chuỗi xoắn α và các vòng lặp. Tương tác liên kết hydro mở rộng giữa hai kẹp tóc và
tương tác kỵ nước giữa chuỗi gấp β và các chuỗi xoắn α làm cho cấu trúc dime có độ ổn
định cao. [13]
Đóng gói bộ gen virus – chức năng chính protein N virus SARS-CoV-2:

Chức năng chính của protein N là đóng gói bộ gen virus SARS-CoV-2 thành
cấu trúc hạt RNP (Ribonucleoprotein particle). Do đó, protein N có khả năng nhận biết
và liên kết RNA. Trong miền N-NTD, kẹp tóc β nhơ ra (β2′ – β3 ′) được cấu tạo chủ yếu
từ các gốc axit amin cơ bản. Phân tích sâu hơn về điện thế tĩnh điện bề mặt cho thấy một
túi tích điện dương ở phần tiếp giáp giữa kẹp tóc cơ bản và cấu trúc lõi, đóng vai trị như
một vị trí liên kết RNA giả định. Bằng cách xây dựng các mơ hình ngun tử của phức
hợp protein - RNA, Dinesh và cộng sự đã chứng minh rằng cả dsRNA và ssRNA liên
kết theo cách tương tự như hẻm núi tích điện dương nằm giữa kẹp tóc β cơ bản và lõi
của N-NTD, nơi chứa các gốc arginine (R92, R107 và R149) liên kết trực tiếp với
RNA. Các nghiên cứu trước đây đã chứng minh sự hiện diện của một vùng liên kết RNA
khác có rãnh tích điện dương trong mặt xoắn của chất dimer N-CTD [14, 15]. Đối với
SARS-CoV-2 N-CTD, rãnh tích điện dương bao gồm các gốc K256, K257, K261 và
R262 [13]. Ngoài ra, cả 2 đầu N của IDR và LKR đều có hoạt tính liên kết RNA [16].
Tổng hợp lại, NTD, CTD và một số vùng bị rối loạn của protein N có thể kết hợp để
liên kết RNA nhằm mục đích thúc đẩy quá trình đóng gói RNP.
Một đặc tính quan trọng khác của protein N đối với q trình đóng gói bộ gen là
khả năng tự liên kết của nó. N-CTD của các β-CoV khác được xác nhận là tự liên kết để
tạo thành oligomer (dimer, trimer, tetramer, hoặc hexamer tùy thuộc vào nồng độ) [12,
13, 17-19]. Nghiên cứu chỉ ra rằng vùng tận cùng C (gốc 365–419) cũng có thể tự lắp
19
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

ráp và tiếp tục làm trung gian hình thành tetrame protein [11]. Các nghiên cứu cũng chỉ
ra rằng phần giàu Ser / Arg của vùng LKR được phosphoryl hóa cao, điều này khơng
chỉ ảnh hưởng đến con thoi nucleocytoplasmic của protein N mà còn điều chỉnh sự tự

liên kết của protein N [20]. Các thí nghiệm tiếp theo đã chứng minh rằng sự phosphoryl
hóa LKR làm giảm tổng điện tích dương của protein N và do đó điều chỉnh q trình
oligome hóa của protein N thông qua hiệu ứng tĩnh điện [21]. Do đó, việc lắp ráp protein
N có chiều dài đầy đủ thành các sợi xoắn là một quá trình sinh học phức tạp, được thực
hiện bởi các tương tác hợp tác giữa một số miền.
1.3 Các phương pháp chẩn đoán SARS-CoV-2:
Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền virus SARS-CoV-2

Hình 1-5: Sự biến thiên ước tính theo thời gian của các xét nghiệm chẩn đoán SARSCoV 2 liên quan đến thời gian khởi phát triệu chứng[22]

Là xét nghiệm nhằm mục đích xác định vật chất di truyền của virus từ dịch hơ
hấp. Cho đến nay, đây là có độ tin cậy cao nhất trong chẩn đoán, được thực hiện bằng
phương pháp RT-PCR. Cơ chế của nó là tìm ra đoạn gen RNA của virus có trong mẫu
bệnh phẩm, lấy từ dịch phết mũi họng hoặc những vùng khác của đường hô hấp như
phết họng, dịch rửa phế quản, nước bọt. Xét nghiệm RT-PCR phát hiện được virus từ
ngày 1 của triệu chứng và nhạy nhất trong vòng tuần đầu tiên sau khi có triệu chứng. Tỷ
lệ dương tính giảm dần đến tuần thứ 3 và sau đó khơng thể phát hiện được, ngoại trừ ở
một số bệnh nhân nặng. Có một vài trường hợp có thể phát hiện được RNA virus đến
tuần thứ 6 sau lần xét nghiệm dương tính đầu tiên. [22]
20
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

RT-PCR hiện tại là tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán một người hiện có đang nhiễm
SARS-CoV-2 hay khơng. Tuy nhiên, RT-PCR thực hiện có nhược điểm là chậm, thường
trong phịng thí nghiệm cần 4-6 giờ để cho ra kết quả; cần chuyên viên có kỹ thuật cao

thực hiện. Độ nhạy và độ đặc hiệu của RT-PCR có thể đạt tới lần lượt là 99% và 100%.
Điều này gần đồng nghĩa với việc tỷ lệ dương tính giả (Xét nghiệm dương tính, nhưng
khơng bệnh) gần như là khơng có. Âm tính giả (Xét nghiệm kết quả âm tính, nhưng có
bệnh) chủ yếu là do thời gian lấy mẫu không phù hợp với diễn tiến bệnh hoặc thiếu sót
trong kỹ thuật lấy mẫu, đặc biệt là phết mũi họng.
Tỷ lệ phát hiện RT-PCR RNA dương tính đã được chứng minh là phụ thuộc vào
loại mẫu, với sự khác biệt giữa dịch rửa phế quản phế nang (93%), sinh thiết bàn chải
ống soi phế quản (46%), đờm (72%), gạc mũi ( 63%), dịch gạc hầu họng (32%), phân
(29%) và máu (1%). Điều thú vị là việc sử dụng nước bọt để phát hiện SARS-CoV-2 đã
được chứng minh là nhạy và đáng tin cậy hơn so với việc sử dụng tăm bông mũi họng
(NS). Hơn nữa, một nghiên cứu của Lippi và cộng sự cho rằng sai sót trước khi phân
tích, sai số thu thập mẫu vật và các yếu tố vận chuyển cũng có ảnh hưởng đến độ chính
xác phát hiện xét nghiệm. Hơn nữa, tỷ lệ dương tính giảm với sự hồi phục của bệnh
nhân.[22] Nhược điểm của phương pháp này là yêu cầu cơ sở có chun mơn, chun
viên có kỹ thuật, thời gian trả kết quả lâu và khó khăn nếu phải xử lý lượng mẫu quá
lớn, dễ gây quá tải đối với hạ tầng cơ sở xét nghiệm ở Việt Nam, nhất là tuyến cơ sở.
Phương pháp phát hiện kháng nguyên/kháng thể virus SARS-CoV-2:
Xét nghiệm tìm kháng nguyên virus SARS-CoV-2 là tìm virus trực tiếp thông
qua xác định kháng nguyên virus trong cơ thể. Mục tiêu chủ yếu của phương pháp này
là kháng nguyên N của virus SARS-CoV-2 vốn tồn tại từ rất sớm trong dịch hầu họng
người bệnh với hàm lượng cao; bản chất ít đột biến do nằm sâu trong hạt virus và có sự
sai khác với kháng nguyên N của các chủng corona khác. Từ đó, các kit test nhanh nhắm
đến mục tiêu là kháng nguyên này có triển vọng có thể phát hiện sớm virus ngay từ giai
đoạn đầu của bệnh nhân và có thể sử dụng phát hiện nhiều biến chủng tương lai mà
không ảnh hưởng quá nhiều đến độ nhạy cũng như độ đặc hiệu.
Xét nghiệm tìm kháng thể là tìm virus gián tiếp thơng qua xác định kháng thể
trong máu. Kháng thể là các protein đặc biệt (IgM, IgG) mà cơ thể sản sinh ra để chống
21
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366



Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

lại các bệnh nhiễm trùng. Thông thường, sau khi nhiễm bệnh, phải mất một thời gian để
cơ thể sản sinh ra các kháng thể và có thể phát hiện được trong máu, bởi vậy, tuy không
bị ảnh hưởng bởi các thao tác lấy mẫu như phương pháp phát hiện kháng nguyên, nhưng
các phương pháp này thường chỉ phát hiện được kháng thể từ tuần thứ 3 của bệnh (Hình
1-5). Hiện nay có 2 kỹ thuật để tìm kháng thể:
• Kỹ thuật ELISA giúp định lượng nồng độ kháng thể IgM và IgG trong máu,
trung bình phải mất 1-5 giờ để có kết quả nồng độ kháng thể trong máu.
• Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (xét nghiệm nhanh hay test nhanh): định tính kháng
thể, tương tự như que thử thai. Kỹ thuật này đơn giản, chi phí ít, cho kết quả nhanh. Chỉ
cần 15-20 phút đã có kết quả có hay khơng có kháng thể. Xét nghiệm kháng thể huyết
thanh rất quan trọng khi sử dụng trong cộng đồng để hiểu được sự phát tán của COVID19 và phát hiện những người có kháng thể và có khả năng tự bảo vệ trước virus. Xét
nghiệm này quan trọng với cộng đồng, nhưng không được khuyến khích dùng để chẩn
đốn một người có đang nhiễm SARS-CoV-2 hay không.
1.4 Protein nucleocapsid của SARS-CoV-2 và ứng dụng:
Protein nucleocapsid tái tổ hợp:
Đã có nhiều nghiên cứu xung quanh vấn đề tạo protein N trên các hệ biểu hiện
như E.coli [23, 24]. Mặc dù biểu hiện protein tái tổ hợp trong vi khuẩn tương đối đơn
giản và dễ thực hiện, nhưng khó khăn là phải tạo ra protein N với các đặc điểm cấu trúc
và đặc điểm miễn dịch tự nhiên nhằm ứng dụng sản xuất kit thử nhanh bằng cách sử
dụng hệ thống biểu hiện vi khuẩn vốn biểu hiện rất mạnh, dễ gây ảnh hưởng đến hoạt
tính. Ví dụ như ở nghiên cứu của Djukic, Teodora và cộng sự, protein N được biểu hiện
trong vật chủ E.coli tuy nhiên mức độ biểu hiện thể hiện qua bản điện di còn kém [23].
Còn ở nghiên cứu của Li, Guang và cộng sự, protein N được biểu hiện ở thể vùi, gây
khó khăn trong việc thu nhận, tinh sạch, bảo quản [24].
Sản xuất protein nucleocapsid tái tổ hợp trong hệ biểu hiện E.coli và

ứng dụng:
Escherichia coli là vi khuẩn gram âm, hiếu khí tùy tiện, hình que, có kích thước
khoảng 0,3-1,0 x 1,0- 6,0µm, di động, xuất hiện khắp nơi trong tự nhiên. Do nhu cầu

22
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

dinh dưỡng đơn giản, khả năng sinh trưởng nhanh nên ứng dụng nhiều trong cơng nghiệp
với nhiều mục đích.
Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của E. coli là 37ºC, pH 6,0 – 7,0, mơi trường tối
thiểu gồm glucose, muối khống (Na2HPO4, K2HPO4, NH4Cl, NaCl, Mg2SO4, CaCl2).
Sự lựa chọn hệ biểu hiện phụ thuộc vào mối liên hệ giữa cấu trúc protein với
hoạt tính sinh học và ứng dụng của protein tái tổ hợp. Vị trí biểu hiện trong tế bào vật
chủ sẽ ảnh hưởng đến sự lựa chọn phương pháp tách và tinh sạch sản phẩm.
Hệ thống vector pET cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp với một
homooligohistidine (6xHis). Sự biểu hiện gen mục tiêu của vector được kiểm soát bởi
promotor T7 nhờ vào hoạt tính RNA polymerase của tế bào chủ được biến đổi bởi phage
T7, hoạt tính này được kiểm soát bởi IPTG cảm ứng trong promotor lac.

23
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp


GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu:
Chủng vi sinh vật:
Chủng vi khuẩn E.coli BL21(DE3) chứa vector pET22b(+)::prN do Trung tâm
Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ
Thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội cung cấp. Đây là chủng vi khuẩn có
hiệu quả biến nạp và biểu hiện tốt, chủng vi sinh vật này đã được biến nạp và biểu hiện
protein N ở thể tan. Plasmid lưu trữ trong E.coli BL21(DE3) với số lượng bản copy lớn,
ổn định. Trong hệ gen của chủng này có gen mã hóa cho enzyme T7 RNA polymerase
giúp cho chủng này có khả năng biểu hiện các vector có hệ thống T7 promoter được gắn
vào. Mặt khác, gen mã hóa cho T7 RNA polymerase của E.coli BL21(DE3) được kiểm
soát bởi operator lac giúp q trình kiểm sốt sự biểu hiện của gen đích trong tế bào
E.coli BL21(DE3) chặt chẽ hơn.
Vector biểu hiện pET22b(+)

Hình 2-1: Vector biểu hiện pET22b(+) và trình tự ORF
Vector biểu hiện pET-22b (+) (Novagen), mang gen lacI mã hóa cho protein lac
repressor, điều khiển q trình điều hịa, hoạt động của promotor T7 trên vector cùng
với chất cảm ứng IPTG. Kích thước 5493 bp, có các ưu điểm là: có promotor T7 mạnh,
vùng đa nối chứa 10 trình tự cắt của enzyme cắt giới hạn, đầu N có chứa trình tự dẫn
24
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Thanh Hòa


pelB đưa protein tổng hợp periplasmic, đầu C có đi dung hợp His-tag dễ dàng tinh
sạch với gel IDA; NTA gắn Ni2+, có vùng tái bản f1 origin.
Các kháng thể sử dụng cho Western Blot và ELISA:
2.1.3.1 . Kháng thể sử dụng trong Western Blot:
• Kháng thể sơ cấp: Kháng thể chuột đặc hiệu với protein N virus SARS-CoV-2
• Kháng thể thứ cấp: Kháng thể kháng – kháng thể IgG chuột gắn AP (Alkaline
Photphatase)
2.1.3.2. Kháng thể sử dụng trong ELISA:
• Kháng thể sơ cấp: Kháng thể thỏ kháng protein N virus SARS-CoV-2
• Kháng thể thứ cấp:
Kháng thể kháng – kháng thể IgG thỏ đánh dấu HRP (horseradish

-

peroxidase antibody)
Kháng thể kháng – kháng thể IgG người đánh dấu HRP (horseradish

-

peroxidase antibody)
Mơi trường, hóa chất:
2.1.4.1. Mơi trường ni cấy:
• Mơi trường LB (Luria Bertani) lỏng v c
ã Khỏng sinh Ampicillin nng 100 g/àl
2.1.4.2. Húa chất:
• Các hóa chất dùng trong ni cấy, phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật:
peptone, cao nấm men, NaCl, Agar,…
• Chất cảm ứng IPTG
• Các hóa chất dùng trong điện di Polyacrylamide: Acrylamide, Tris–HCl,
SDS, APS, TEMED, …

• Thang chuẩn protein được sử dụng:
• “GangNam-STAIN Prestained Protein Ladder” của hãng iNtRON
Biotechnology gồm có 12 băng, kích thước thang chuẩn từ 10 kDa đến 245
kDa

25
SVTH: Nguyễn Minh Quang - Mã số sinh viên: 20180366