BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Phan Thị Thanh Hà

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
MỘT SỐ VI RÚT CĨ NGUY CƠ CAO TRONG NHUYỄN THỂ
HAI MẢNH VỎ VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ

Ngành: Cơng nghệ Sinh học
Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Lê Quang Hòa
2. PGS. TS. Trương Tuyết Mai

Hà Nội - 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng
dẫn của TS. Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố.
TM. Tập thể hướng dẫn

Tác giả của luận án

TS. Lê Quang Hòa

Phan Thị Thanh Hà

i


LỜI CẢM ƠN
Từ năm 2005 đến nay, trong những năm học Đại học, làm luận văn Thạc sĩ
và luận án Tiến sĩ tại Đại học Bách khoa Hà Nội thân yêu, tôi đã thu nhận được rất
nhiều kiến thức quý báu về lý thuyết cũng như thực hành nghiên cứu thuộc lĩnh
vực công nghệ Sinh học – công nghệ Thực phẩm. Tôi vô cùng biết ơn các Thầy
Cô giáo, Ban Giám hiệu, các cán bộ tại Phịng thí nghiệm, Ban Đào tạo, Ban Tài
chính – Kế hoạch …đã dạy dỗ, bảo ban giúp đỡ tơi về mọi mặt.
Hồn thành Luận án Tiến sĩ này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.
Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dành
nhiều thời gian trao đổi, định hướng trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu
cũng như viết Luận án. Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô, các cán bộ của Trung
tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ
sinh học - Công nghệ thực phẩm, Ban Đào tạo đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều
kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện và báo cáo đề tài Luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Dinh dưỡng, lãnh đạo và
các đồng nghiệp Khoa Vi sinh vật Thực phẩm và Sinh học phân tử đã tạo điều
kiện, giúp đỡ tơi hồn thành cơng việc chun mơn được phân cơng.
Lời cảm ơn sâu sắc xin gửi tới Gia đình, Bạn bè ln chia sẻ khó khăn,
động viên khích lệ tơi vượt qua mọi trở ngại để hoàn thành nhiệm vụ nghiên cứu
và học tập!

Hà Nội ngày

tháng


năm 2023

Nghiên cứu sinh

Phan Thị Thanh Hà

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... I
LỜI CẢM ƠN ...........................................................................................................II
MỤC LỤC ............................................................................................................... III
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................... VI
DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... VI
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT...................................................... X
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ............................................................ 3
5. Tính mới của đề tài ............................................................................................. 4
TỔNG QUAN ........................................................................................................ 5
1.1. Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và thách thức về an tồn
thực phẩm ................................................................................................................... 5
1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ............................ 5
1.1.2. Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể
hai mảnh vỏ .......................................................................................................... 6
1.2. Đặc điểm sinh học các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể
hai mảnh vỏ ................................................................................................................ 8

1.2.1. Norovirus ................................................................................................... 8
1.2.2. Hepatitis A virus ...................................................................................... 10
1.2.3. Hepatitis E virus ...................................................................................... 11
1.2.4. Astrovirus ................................................................................................ 12
1.3. Quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ .......... 13
1.3.1. Các phương pháp tách chiết RNA vi rút ................................................. 13
1.3.2. Các phương pháp xác định vi rút ............................................................. 17
1.4. Các quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa
trên kỹ thuật Real-time RT-PCR .............................................................................. 21
1.5. Ứng dụng công nghệ MGB và LNA nhằm tăng nhiệt độ nóng chảy của bộ mồi,
mẫu dị trong phản ứng Real – time RT - PCR ........................................................ 25
1.5.1. Công nghệ MGB (Minor Groove Binders) ............................................. 26
1.5.2. Công nghệ LNA (Locked Nucleic Acids) ............................................... 27
iii


1.6. Phương pháp xác định kiểu gen vi rút ............................................................... 28
1.6.1. Kỹ thuật Nested RT - PCR ...................................................................... 28
1.6.2. Kỹ thuật giải trình tự Sanger ................................................................... 30
1.7. Tình hình nghiên cứu sự lưu hành các kiểu gen của NoV, HAV, HEV, HAstV
trên thế giới và tại Việt Nam .................................................................................... 32
1.7.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .......................................................... 32
1.7.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam ......................................................... 35
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 39
2.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................ 39
2.1.1. Vật liệu kiểm soát .................................................................................... 39
2.1.2. Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ .................................................................. 39
2.1.3. Oligonucleotide ....................................................................................... 39
2.1.4. Hóa chất ................................................................................................... 43
2.1.5. Thiết bị ..................................................................................................... 43

2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 44
2.2.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của
HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ....................................................... 44
2.2.2. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh
truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ ........................................ 52
2.2.3. Xác định kiểu gen của các chủng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm
phát hiện được trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ ................................................... 56
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................................... 59
3.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV
từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ....................................................................................... 59
3.1.1. Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RTPCR phát hiện HEV ........................................................................................... 59
3.1.2. Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên
mã in vitro........................................................................................................... 64
3.1.3. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV với chu
trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 ................................................... 67
3.1.4. Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát
hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này ................................ 71
3.1.5. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng
HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình
nhiệt của ISO 15216-1:2013............................................................................... 74
iv


3.2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của
HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ ........................................................................... 84
3.2.1. Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RTPCR phát hiện HAstV ........................................................................................ 84
3.2.2. Tách dịng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng
phiên mã in vitro ................................................................................................. 88
3.2.3. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV với chu
trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 ................................................... 89

3.2.4. Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát
hiện RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này ............................. 93
3.2.5. Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng
HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình
nhiệt của ISO 15216-1:2013............................................................................... 94
3.3. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm
trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ .................................................................................. 100
3.3.1. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể
hai mảnh vỏ năm 2016 ..................................................................................... 100
3.3.2. Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể
hai mảnh vỏ năm 2022 ..................................................................................... 107
3.3.3. So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 và năm 2022 ............................................. 113
3.4. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ......................................................................... 117
3.4.1. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng NoV phát hiện trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ.................................................................................... 117
3.4.2. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HEV phát hiện trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ.................................................................................... 126
3.4.3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HAstV phát hiện
trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ .......................................................................... 129
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 133
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN ............. 135
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................... 136
PHỤ LỤC 1 KẾT QUẢ BỔ TRỢ CỦA LUẬN ÁN............................................... 1
PHỤ LỤC 2 SẢN PHẨM CỦA LUẬN ÁN .......................................................... 13

v



DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Xuất khẩu NTHMV Việt Nam 2020-2021 ................................................. 6
Hình 1.3 Cấu tạo khung đọc mở NoV ........................................................................ 9
Hình 1.4 Cấu trúc virion Hepatitis A virus .............................................................. 10
Hình 1.5 Cấu trúc hệ gen Hepatitis A virus ............................................................. 10
Hình 1.6 Cấu trúc virion Hepatitis E virus ............................................................... 11
Hình 1.7 Cấu trúc hệ gen Hepatitis E virus ............................................................. 11
Hình 1.8 Cấu trúc virion HAstV............................................................................... 12
Hình 1.9 Cấu trúc hệ gen HAstV.............................................................................. 12
Hình 1.10 Bộ 4 mồi chính của phản ứng LAMP ...................................................... 18
Hình 1.11 Nguyên tắc phản ứng Real-time PCR ..................................................... 19
Hình 1.12 Vị trí gắn của MGB trên mẫu dị và cấu trúc hóa học của MGB ............ 26
Hình 1.13 Cấu trúc của nucleotide thơng thường và của nucleotidd LNA (B) ........ 27
Hình 1.14 Nguyên lý kỹ thuật Nested RT - PCR ..................................................... 28
Hình 1.15 Nguyên lý của kỹ thuật giải trình tự Sanger ............................................ 30
Hình 2.1. Quy trình lựa chọn, hiệu chỉnh, thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứng
Real-time RT-PCR xác định HEV và HAstV .......................................................... 44
Hình 2.2. Quy trình tách dịng trình tự gen đại diện của HEV và HAstV................ 45
Hình 2.3. Quy trình phiên mã in vitro tạo chứng dương RNA................................. 47
Hình 2.4. Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và
HAstV ...................................................................................................................... 48
Hình 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng
HEV và HAstV ......................................................................................................... 49
Hình 2.6. Tóm tắt quy trình phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm trong NTHMV ................................................................................................ 52
Hình 2.7. Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi
rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo ISO 15216-1:2013 .......... 54
Hình 2.8. Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR với mồi ngồi khuếch đại RNA
của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV..................................................... 57
Hình 2.9. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với mồi trong để khuếch đại cDNA

của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV..................................................... 57
Hình 3.1. Cấu trúc hệ gen chuẩn HEV của WHO (mã số AB630970) .................... 59

vi


Hình 3.2. Đặc điểm bộ mồi của Schlosser và của Jothikumar trên trình tự gen HEV
chuẩn của WHO (mã số AB630970) ........................................................................ 60
Hình 3.3. Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Schlosser và
Jothikumar với các hệ gen HEV cơng bố trên GenBank......................................... 61
Hình 3.4. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV-A trên gel agarose ........ 65
Hình 3.5. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích
HEV.A sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose 2,5%. ............................ 65
Hình 3.6. Kết quả giải trình tự một dịng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen
HEV.A .................................................................................................. 66
Hình 3.7. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV.B trên gel agarose ....... 66
Hình 3.8. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích
HEV.B sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose....................................... 67
Hình 3.9. Kết quả giải trình tự một dịng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.B ........ 67
Hình 3.10. Chu trình nhiệt rút gọn của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV
từ NTHMV ............................................................................................................... 74
Hình 3.11. Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của
phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV ........................................................... 78
Hình 3.12. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện và định lượng HEV trong NTHMV .......................................................... 82
Hình 3.14. Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Cann và cộng
sự............................................................................................................................... 85
Hình 3.15. Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HAstV trên gel agarose ...... 88
Hình 3.16. Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E. coli DH5α mang đoạn gen đích
HAstV sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose ....................................... 88

Hình 3.17. Kết quả giải trình tự một dịng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HAstV
.................................................................................................................................. 89
Hình 3.18. Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của
phản ứng Real-time RT-PCR xác định HAstV sử dụng chu trình nhiệt rút gọn; sử
dụng chu trình nhiệt theo ISO .................................................................................. 96
Hình 3.19. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện và định lượng HAstV trong NTHMV sử dụng chu trình nhiệt rút gọn; sử
dụng quy trình ISO ................................................................................................... 98
Hình 3.20. Các đường chuẩn định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện

vii


và định lượng HAstV trong NTHMV. Sử dụng chu trình nhiệt rút gọn; Sử dụng chu
trình nhiệt theo ISO .................................................................................................. 98
Hình 3.21. Kết quả phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi rút gây
bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV năm 2016............................................. 101
Hình 3.22. Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2016 .............. 105
Hình 3.23. Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2016 ................................................ 106
Hình 3.24. Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo
thời điểm lấy mẫu năm 2016 .................................................................................. 106
Hình 3.25. Kết quả phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi rút gây
bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV năm 2022............................................. 108
Hình 3.26. Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2022 .............. 112
Hình 3.27. Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2022 ................................................ 112
Hình 3.28. Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo
thời điểm lấy mẫu năm 2022 .................................................................................. 113
Hình 3.29. So sánh tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV

năm 2016 và năm 2022 ........................................................................................... 114
Hình 3.30. So sánh sự phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2016
và năm 2022............................................................................................................ 114
Hình 3.31. Kết quả đánh giá mối tương quan giữa các yếu tố (loại mẫu, địa điểm lấy
mẫu, thời điểm lấy mẫu, dịch Covid-19) đến tình trạng nhiễm vi rút trong NTHMV
bằng phần mềm SPSS ............................................................................................. 116
Hình 3.32. Kết quả đánh giá mối tương quan giữa các yếu tố (loại mẫu, địa điểm lấy
mẫu, thời điểm lấy mẫu, năm lấy mẫu) đến mức nhiễm NoV GI và NoV GII trong
NTHMV bằng phần mềm SPSS ............................................................................. 116
Hình 3.33. Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại vùng gen ORF1-ORF2
của NoV GI và NoV GII trên gel agarose 1,5%. .................................................... 118
Hình 3.34. Cây phát sinh loài của các mẫu NoV GI phát hiện được trong nghiên cứu
với các trình tự NoV GI tham chiếu từ GenBank. Chiều dài nhánh (Branch length)
thể hiện mối liên hệ về di truyền giữa các trình tự. ................................................ 120
Hình 3.35. Phân bố kiểu gen Norovirus GI của các mẫu phát hiện được trong nghiên
cứu .......................................................................................................................... 121

viii


Hình 3.36. Cây phát sinh lồi của các mẫu NoV GII phát hiện được trong nghiên
cứu với các trình tự NoV GII tham chiếu từ GenBank. Chiều dài nhánh (Branch
length) thể hiện mối liên hệ về di truyền giữa các trình tự..................................... 124
Hình 3.37. Phân bố kiểu gen Norovirus GII của các mẫu phát hiện được trong
nghiên cứu .............................................................................................................. 125
Hình 3.38. Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại HEV trên gel agarose
1,5% ........................................................................................................................ 127
Hình 3.39. Cây phát sinh lồi của các mẫu HEV phát hiện được trong nghiên cứu
với các trình tự HEV tham chiếu từ GenBank. Chiều dài nhánh (Branch length) thể
hiện mối liên hệ về di truyền giữa các trình tự. ...................................................... 128

Hình 3.40. Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại HEV trên gel agarose
1,5% ........................................................................................................................ 129
Hình 3.41. Cây phát sinh lồi của bốn chủng HAstV phát hiện được trong .......... 131
nghiên cứu với các trình tự HAstV tham chiếu từ GenBank. Chiều dài nhánh
(Branch length) thể hiện mối liên hệ về di truyền giữa các trình tự....................... 131

ix


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Tổng hợp các nghiên cứu tách chiết RNA vi rút từ NTHMV .................. 16
Bảng 1.2 Nhận xét các phương pháp xác định vi rút gây bệnh thực phẩm ............. 20
Bảng 1.3 Tổng hợp các bộ mồi và mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu phát hiện NoV,
HAV, HEV và HAstV ............................................................................................. 22
Bảng 1.4 Chu trình nhiệt của các phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện NoV,
HAV, HEV, HAstV ................................................................................................. 23
Bảng 1.5 Tổng hợp một số nghiên cứu về vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm tại
Việt Nam................................................................................................................... 36
Bảng 2.1. Trình tự mồi, mẫu dị sử dụng trong nghiên cứu xây dựng quy trình Realtime RT-PCR phát hiện và định lượng RNA vi rút từ NTHMV .............................. 40
Bảng 2.2. Tổng hợp các bộ mồi sử dụng trong phản ứng Nested RT-PCR xác định
kiểu gen vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV .............................. 41
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR định lượng RNA vi rút sử dụng
SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit............................................ 49
Bảng 2.4. Thơng tin các biến được phân tích bằng phần mềm SPSS ...................... 55
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại cDNA của NoV, HAV, HEV và
HAstV trong NTHMV .............................................................................................. 56
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR với mồi trong để khuếch đại cDNA của NoV,
HAV, HEV và HAstV trong NTHMV ..................................................................... 57
Bảng 3.1. Đặc điểm kỹ thuật của tổ hợp mồi Schlosser và Jothikumar ................... 60
Bảng 3.2. Đặc điểm kỹ thuật của các tổ hợp mồi sau khi hiệu chỉnh và ứng dụng

công nghệ MGB, LNA ............................................................................................. 63
Bảng 3.3. Kết quả tối ưu nồng độ ion Mg2+ đối với hai tổ hợp mồi A và B ............ 68
Bảng 3.4. Kết quả tối ưu nồng độ mồi đối với hai tổ hợp mồi A và B .................... 70
Bảng 3.5. Kết quả tối ưu nồng độ mẫu dò đối với hai tổ hợp mồi A và B ............... 70
Bảng 3.6. Thành phần tối ưu của phản ứng Realt-time RT-PCR phát hiện HEV .... 71
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi của quy trình Real-time RT-PCR phát
hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn ................................................. 72
Bảng 3.8. Tối ưu hóa thời gian gắn mồi và kéo dài mạch của quy trình Real-time
RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn .......................... 73

x


Bảng 3.9. Giới hạn phát hiện của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV trong
NTHMV.................................................................................................................... 75
Bảng 3.10. Giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của phản ứng Realtime RT-PCR xác định HEV .................................................................................... 79
Bảng 3.11. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện và định lượng HEV trong NTHMV .......................................................... 80
Bảng 3.12. Kết quả phản ứng chéo của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV
trong NTHMV với các tác nhân nhân virus gây bệnh đường ruột thường gặp trong
NTHMV.................................................................................................................... 83
Bảng 3.13. Vị trí trình tự gen HAstV tham chiếu (mã số NC_001943.1) và giá trị
nhiệt trên độ nóng chảy (Tm) của của bộ mồi, mẫu dò của Cann ............................. 85
Bảng 3.14. Đặc điểm kỹ thuật của trình tự mồi phát hiện HAstV sau khi hiệu chỉnh
và ứng dụng công nghệ LNA ................................................................................... 87
Bảng 3.15. Kết quả tối ưu nồng độ ion Mg2+ của phản ứng Real-time RT-PCR phát
hiện HAstV ............................................................................................................... 90
Bảng 3.16. Kết quả tối ưu nồng độ mồi HAstV ....................................................... 91
Bảng 3.17. Kết quả tối ưu nồng độ mẫu dò HAstV ................................................. 92
Bảng 3.18. Thành phần tối ưu của phản ứng Realt-time RT-PCR phát hiện HAstV

.................................................................................................................................. 92
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi của phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện HAstV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn ...................................... 93
Bảng 3.20. Tối ưu hóa thời gian gắn mồi và kéo dài mạch của phản ứng Real-time
RT-PCR phát hiện HAstV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn ....................... 94
Bảng 3.21. Giới hạn phát hiện của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HAstV
trong NTHMV .......................................................................................................... 95
Bảng 3.22. Giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của phản ứng Realtime RT-PCR xác định HAstV ................................................................................. 97
Bảng 3.23. Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện và định lượng HAstV trong NTHMV....................................................... 97
Bảng 3.24. Kết quả phản ứng chéo của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện
HAstV trong NTHMV với các tác nhân nhân virus gây bệnh đường ruột thường gặp
trong NTHMV .......................................................................................................... 99

xi


Bảng 3.25. Tổng hợp tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2016 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu ........................................ 102
Bảng 3.26. Tổng hợp mức nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2016 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu ........................................ 103
Bảng 3.27. Tổng hợp tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2022 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu ........................................ 109
Bảng 3.28. Tổng hợp mức nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2022 theo loại mẫu và địa điểm lấy mẫu ........................................ 110
Bảng 3.29. Kết quả xác định kiểu gen các mẫu NoV GI đã phát hiện ................... 118
Bảng 3.30. Kết quả xác định kiểu gen các mẫu NoV GII đã phát hiện ................. 122
Bảng 3.31. Kết quả xác định kiểu gen các mẫu HAstV đã phát hiện .................... 130

xii



DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tên đầy đủ tiếng Anh

Tên đầy đủ tiếng Việt

CRE

Cis-reactive element

DNA

Deoxyribonucleic acid

ELISA

Enzyme-linked immunosorbent assay

Phương pháp hấp phụ miễn dịch gắn
enzyme

EU

European Union

Liên minh châu Âu


FAO

Food and Agriculture Organization of
the Unated Nation

Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp
Liên hợp Quốc

FDA

Food and Drug Administration

Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược
phẩm Mỹ

HAV

Hepatitis A virus

Vi rút viêm gan A

HAstV

Human Astrovirus

Astro vi rút người

HEV

Hepatitis E virus


Vi rút viêm gan E

ISO

International Organization for
Standardization

Tổ chức tiêu chuẩn quốc tế

LNA

Locked Nucleic Acids

LOD

Limit of detection

MGB

Minor Groove Binders

Giới hạn phát hiện

Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm
sản và Thủy sản – Bộ Nông nghiệp
và Phát triển nông thôn

NAFIQAD


NoV

Norovirus

NTP

Nucleoside triphosphatase

NTHMV

NVWA

Nhuyễn thể hai mảnh vỏ
Netherlands Food and Consumer
Product Safety Authority

xiii

Cơ quan An toàn Sản phẩm Tiêu dùng
và Thực phẩm Hà Lan


PEG

Polyethylene glycol

RNA

Acid ribonucleic


RT-LAMP

Reverse transcription loop-mediated
isothermal amplification

RT-PCR

Reverse Trancription Polymerase Chain Phương pháp dựa trên phản ứng chuỗi
Reaction
polymerase phiên mã ngược

RASFF

Rapid Alert System for Food and Feed

Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt
thông qua cấu trúc vòng phiên mã
ngược

Hệ thống cảnh báo nhanh về thực
phẩm và thức ăn chăn nuôi

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TLTK

Tài liệu tham khảo


VASEP

Vietnam Association of Seafood
Exporters and Producers

Cục An toàn Thực phẩm – Bộ Y tế

VFA
WHO

Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ
sản Việt Nam

Tổ chức Y tế Thế giới

World Health Organization

xiv


MỞ ĐẦU
1.

Tính cấp thiết của đề tài

Báo cáo thống kê ngành thủy sản toàn cầu của Tổ chức Lương thực và Nông
nghiệp Liên hợp Quốc (FAO) cho thấy nhu cầu đối với các mặt hàng nhuyễn thể hai
mảnh vỏ (NTHMV) tăng mạnh vào năm 2021 so với 2020 [1]. Theo thống kê của
Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), năm 2021, xuất khẩu
NTHMV của Việt Nam đạt 141,6 triệu USD, tăng 35% so với năm 2020; trong đó,

ngao là sản phẩm chủ lực, chiếm 73% với 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2].
Nhuyễn thể của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước; trong đó, Liên minh
châu Âu (EU) là thị trường nhập khẩu NTHMV lớn nhất, chiếm 62% tổng giá trị
xuất khẩu mặt hàng này của Việt Nam ra các thị trường trên thế giới [3]. Tuy nhiên,
EU cũng là thị trường có quy định chặt chẽ nhất đối với các sản phẩm nhập khẩu,
gây nhiều thách thức đối với ngành nuôi trồng NTHMV ở Việt Nam. Tháng 4 năm
2022, trong “Diễn đàn phát triển thủy sản bền vững”, lãnh đạo Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn đã khẳng định việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể có vai
trị quan trọng trong việc hoàn thành mục tiêu phát triển kinh tế thủy sản đã đề ra,
trong đó việc bảo đảm kiểm sốt chất lượng An tồn thực phẩm từ khâu sản xuất
ban đầu đến sơ chế, chế biến là hết sức cần thiết [4].
Trong những năm qua, tình trạng viêm dạ dày ruột, viêm gan do tiêu thụ
NTHMV nhiễm vi rút luôn là vấn đề được lưu tâm. Theo dấu hiệu lâm sàng, đã xác
định được hơn 100 loại vi rút đường ruột có mặt trong thực phẩm bị ơ nhiễm; trong
đó, Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và
Astrovirus ở người (HAstV) là các vi rút gây bệnh thường gặp trong NTHMV [5].
Đáng chú ý, một số nghiên cứu về các vi rút này tại Việt Nam đã cho thấy tình trạng
đồng nhiễm nhiều tác nhân vi rút trên cùng một mẫu bệnh phẩm [6-8].
Trước tình hình ơ nhiễm thực phẩm do tác nhân vi rút ngày càng tăng cao,
cùng với những kết quả về tình trạng đồng nhiễm các tác nhân vi rút, việc phát triển
quy trình phát hiện và định lượng bốn tác nhân vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm thường gặp (NoV, HAV, HEV, HAstV) là hết sức cần thiết [7]. Hiện nay,
trong khi quy trình chuẩn ISO 15216-1:2013 có thể ứng dụng để xác định NoV và
HAV trong thực phẩm [9-12] thì các quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HAstV
và HEV cịn chưa được chuẩn hóa, gây nhiều hạn chế trong cơng tác kiểm nghiệm.
Vì vậy, việc xây dựng quy trình xác định HAstV và HEV với bộ mồi, mẫu dò đảm
bảo độ bao phủ trên các biến chủng hiện có, đồng thời tối ưu các điều kiện của phản
ứng Real-time RT-PCR, cho phép xác định cùng lúc cả bốn tác nhân NoV, HAV,
1



HEV và HAstV với một chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 sẽ góp phần rút ngắn
thời gian phân tích, hỗ trợ kịp thời cho cơng tác điều trị.
Bên cạnh đó, các số liệu về đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh
truyền qua thực phẩm trong NTHMV tại Việt Nam cịn rất hạn chế. Vì vậy, việc xác
định đặc điểm sinh học phân tử của vi rút thông qua xác định kiểu gen (genotype) là
công đoạn cần thiết để đánh giá chính xác nguy cơ bùng phát dịch bệnh gây ra bởi
các tác nhân vi rút có mặt trong NTHMV, hướng tới đề xuất biện pháp ứng phó kịp
thời, ngăn chặn sự lây lan vi rút trong cộng đồng, hạn chế những thiệt hại về sức
khỏe, kinh tế và xã hội. Do vậy, luận án nghiên cứu sinh “Nghiên cứu xây dựng
phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh
vỏ và đặc điểm sinh học phân tử” đã được thực hiện.

Mục tiêu nghiên cứu

2.

- Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và
HAstV trong NTHMV theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-1:2013.
- Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh
truyền qua thực phẩm trong NTHMV trên thị trường
-

Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực

phẩm trên NTHMV.

3.

Nội dung nghiên cứu


3.1.

Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng
RNA của HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

3.1.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA
của HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
- Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện HEV
- Tách dịng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên mã
in vitro
- Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu trình nhiêt
theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013
- Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện
RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này
- Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định
lượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình
nhiệt của ISO 15216-1:2013
2


3.1.2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA
của HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
- Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện HAstV
- Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng phiên
mã in vitro
- Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu trình nhiêt
theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013

- Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện
RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này
- Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định
lượng HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu
trình nhiệt của ISO 15216-1:2013
3.2.

Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền
qua thực phẩm trên NTHMV

- Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2016
- Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2022
- So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
NTHMV năm 2016 và năm 2022
3.3.

Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh
truyền qua thực phẩm trong NTHMV

-

Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của NoV phát hiện trong NTHMV

-

Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HEV phát hiện trong NTHMV

-


Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HAstV phát hiện trong NTHMV

4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

4.1.

Ý nghĩa khoa học

- Thiết kế, hiệu chỉnh bộ mồi, mẫu dị có độ bao phủ cao với các trình tự HEV
và HAstV hiện có trên ngân hàng dữ liệu GenBank.
- Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR để có thể phát hiện được RNA của HEV
và HAstV theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-1:2013; từ đó mở ra
khả năng phát hiện được đồng thời 4 tác nhân vi rút NoV, HAV, HEV và HAstV
trong một lần chạy Real - time RT-PCR.

3


- Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện
RNA của HEV và HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh các vi rút này
- Xác định các kiểu gen (genotype) của NoV, HAV, HEV và HAstV nhiễm tạp
trong NTHMV, góp phần đánh giá nguy cơ bùng phát dịch bệnh.
4.2.

Ý nghĩa thực tiễn

- Cung cấp một quy trình phân tích đồng thời cả 4 tác nhân NoV, HAV, HEV

và HAstV với tính chính xác cao (4 phản ứng Real-time RT-PCR riêng rẽ chạy
đồng thời với cùng một chu trình nhiệt) trong NTHMV nói riêng và trong các mẫu
thực phẩm, bệnh phẩm, mơi trường nói chung để các cơ sở xét nghiệm có thể ứng
dụng trong phân tích.
- Góp phần nâng cao năng lực kiểm sốt an tồn thực phẩm, tăng tính cạnh
tranh của NTHMV và các mặt hàng thủy sản xuất khẩu trên thị trường quốc tế.

Tính mới của đề tài

5.
-

Thiết kế, hiệu chỉnh được tổ hợp mồi, mẫu dò phát hiện và định lượng RNA

của HEV và HAstV có độ bao phủ cao với các trình tự hiện có trên Ngân hàng dữ
liệu Genbank.
- Tối ưu hóa phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của
HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO
15216-1:2013.
- Xác định được tỷ lệ và mức nhiễm tạp của 4 tác nhân NoV, HAV, HEV và
HAstV trong NTHMV trong năm 2016 và 2022 tại Việt Nam.
- Xác định được kiểu gen của NoV, HAV, HEV và HAstV lưu hành trong
NTHMV trong năm 2016 tại Việt Nam.

4


TỔNG QUAN
1.1. Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và
thách thức về an toàn thực phẩm

1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ
Theo FAO, nhu cầu đối với các mặt hàng NTHMV (NTHMV) tăng mạnh
vào năm 2021 so với 2020 do các hạn chế về COVID-19 đã giảm bớt ở các quốc gia
tiêu thụ chính những mặt hàng này. Trong năm 2021, khoảng 71.000 tấn hàu đã
được nhập khẩu trên toàn thế giới, cao hơn 15.000 tấn so với năm 2020 và thậm chí
cao hơn 6.000 tấn so với năm 2019. Cũng trong năm 2021, tổng thương mại ngao
trên toàn thế giới tăng, khoảng 287.000 tấn đã được nhập khẩu, nhiều hơn 20.000
tấn so với năm 2020 [1].
Việt Nam có đặc điểm địa lý thuận lợi để phát triển hoạt động khai thác và
ni trồng các lồi nhuyễn thể nhờ vùng nội thuỷ và lãnh hải rộng 226.000km2 nằm
bên bờ Tây của Biển Đông - là một biển lớn của Thái Bình Dương, vùng biển đặc
quyền kinh tế rộng hơn 1 triệu km2 cùng hơn 4.000 hòn đảo, tạo nên 12 vịnh, đầm
phá với tổng diện tích 1.160km2 được che chắn tốt dễ trú đậu tàu thuyền [13]. Năm
2021, diện tích nhuyễn thể của Việt Nam đạt trên 35.000 ha, sản lượng 471.000 tấn;
trong đó, diện tích và sản lượng ni ngao chiếm khoảng 50%; cụ thể, năm 2021,
diện tích ni trên 17.000 ha, sản lượng đạt trên 236.000 tấn [2]. Đến nay, nhuyễn
thể của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước. Theo thống kê của Hiệp hội Chế
biến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam (VASEP), xuất khẩu NTHMV của Việt Nam
năm 2021 đạt 141,6 triệu USD, tăng 35% so với năm 2020. Trong đó, ngao là sản
phẩm chủ lực, chiếm 73% với gần 103 triệu USD, tiếp đến là hàu [2]. Số liệu của
Trung tâm Thương mại Thế giới (ITC) cho thấy các thị trường nhập khẩu chính
NTHMV của Việt Nam là: Liên minh châu Âu EU (Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha,
Italy), Mỹ, Nhật Bản, Đài Loan, Hàn Quốc. Trong đó, EU là thị trường nhập khẩu
NTHMV lớn nhất, chiếm tỷ trọng 62% tổng giá trị xuất khẩu mặt hàng này của Việt
Nam ra các thị trường trên thế giới [3].

5


Hình 1.1. Xuất khẩu NTHMV Việt Nam 2020-2021 [2]


Đáng chú ý, EU cũng là thị trường có quy định chặt chẽ nhất đối với các sản
phẩm nhập khẩu, đây cũng chính là thách thức lớn đối với ngành ni trồng
NTHMV Việt Nam. Trên thực tế, trong thời gian qua, các lơ hàng NTHMV xuất
khẩu vẫn bị nước ngồi cảnh báo về nguy cơ nhiễm vi rút. Mới đây nhất, hàng loạt
lô hàng hàu tươi ướp đá từ Vân Đồn Quảng Ninh bị cảnh báo phát hiện NoV: 10 lô
hàng năm 2020 và 2 lô hàng năm 2021. Tháng 4 năm 2022, trong Diễn đàn về phát
triển thủy sản bền vững, Thứ trưởng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
Phùng Đức Tiến đã khẳng định, việc phát triển ngành hàng nhuyễn thể có vai trị
quan trọng trong việc hồn thành mục tiêu phát triển kinh tế thủy sản đã đề ra; trong
đó việc bảo đảm kiểm sốt chất lượng An toàn thực phẩm từ khâu sản xuất ban đầu
đến sơ chế, chế biến là hết sức cần thiết [4].
1.1.2. Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong
nhuyễn thể hai mảnh vỏ
Với đặc điểm sinh sống theo hình thức lọc nước để lấy thức ăn, NTHMV là
đối tượng thực phẩm có nguy cơ ơ nhiễm cao bởi các vi rút và các tác nhân gây
bệnh khác có trong môi trường nước. Theo các nghiên cứu trên thế giới về nhóm vi
rút gây ơ nhiễm nguồn nước có khả năng lây nhiễm sang thực phẩm, có đến hơn
100 loại vi rút được tìm thấy trong đường ruột người. Các vi rút này được phân làm
3 nhóm chính theo hội chứng lâm sàng: nhóm vi rút gây viêm dạ dày ruột, vi rút gây
viêm gan và các vi rút gây một số bệnh khác. Trong số các vi rút này, Norovirus
(NoV), vi rút viêm gan A (HAV), vi rút viêm gan E (HEV) và Astrovirus ở người
(HAstV) là các vi rút thường gặp trong NTHMV [5]. Đáng chú ý, thống kê 359 vụ

6


ngộ độc thực phẩm trên NTHMV từ năm 1980 đến năm 2012 trên thế giới đã chỉ ra
NoV và HAV là hai vi rút gây bệnh phổ biến, chiếm tỉ lệ lần lượt là 83,7% và
12,8% [14].

Theo các số liệu thống kê dịch tễ gần đây, NoV được coi là một trong những
tác nhân chính gây bệnh truyền qua thực phẩm trên toàn thế giới. Ở Mỹ, NoV là
nguyên nhân của trung bình 570–800 ca tử vong, 56.000–71.000 ca nhập viện,
400.000 ca cấp cứu và 19–21 triệu ca bệnh mỗi năm [15]. NoV là vi rút gây bệnh
xuất hiện nhiều nhất trong các loại NTHMV, chiếm 83,7% [16]. Một nghiên cứu
giám sát mức độ nhiễm NoV trên NTHMV được thực hiện bởi Cơ quan An toàn
Sản phẩm Tiêu dùng và Thực phẩm Hà Lan (NVWA) trên 756 mẫu trong khoảng
thời gian từ năm 2013 đến năm 2017 đã phát hiện 45,5% mẫu dương tính với NoV
[17]. Tại Nhật Bản, nghiên cứu về tình hình nhiễm vi rút đường ruột trong NTHMV
trên 732 mẫu được thu thập trong 5 năm, từ 2014 đến 2018 đã chỉ ra tồn tại mối liên
hệ giữa tỉ lệ nhiễm NoV trong NTHMV với số ca tiêu chảy diễn ra trong cộng đồng.
Tại Đông Nam Á, nghiên cứu được thực hiện trên 300 mẫu NTHMV thu thập từ các
chợ tại Thái Lan đã phát hiện NoV trong 12,3% mẫu; trong đó tỉ lệ nhiễm trên hàu
là 14%, ngao là 6% [18].
Hàng năm trên thế giới có khoảng 1,4 triệu người mắc HAV và khoảng 200
triệu người mang bệnh nhưng khơng thể hiện triệu chứng. HAV có thể lây truyền từ
người sang người hoặc thông qua nước và thực phẩm bị ô nhiễm, đặc biệt ở
NTHMV không xử lý nhiệt đủ yêu cầu. Lịch sử đã ghi nhận vụ dịch lan truyền rộng
rãi nhất tại Thượng Hải, Trung Quốc vào năm 1988 với gần 300.000 trường hợp do
tiêu thụ ngao đánh bắt tại vùng nước bị ô nhiễm nước thải [19]. Tại Tây Ban Nha,
hai vụ dịch lớn do tiêu thụ ngao nhiễm HAV được nhập khẩu từ Peru đã được ghi
nhận với số ca nhiễm lên tới 184 người năm 1999 và 100 người năm 2008. Liên
quan đến hai vụ dịch này, Bộ Y tế Tây Ban Nha đã kích hoạt Hệ thống cảnh báo
nhanh về thực phẩm và thức ăn chăn nuôi (RASFF) của châu Âu; hàng loạt hô hàng
NTHMV từ Peru vào thời điểm đó đã được cảnh báo và cấm nhập khẩu vào châu
Âu [20]. Đặc biệt, nghiên cứu của David Polo và cộng sự đánh giá nguy cơ nhiễm
vi rút gây bệnh đường ruột thực hiện trên 50 mẫu NTHMV được nhập khẩu từ Ma
rốc, Peru, Hàn Quốc và Việt Nam đã phát hiện tỉ lệ nhiễm HAV lên tới 50% trên
các mẫu NTHMV đến từ Việt Nam [21].
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, có trên 2,3 triệu người nhiễm HEV

mỗi năm với khoảng 70.000 ca tử vong, chủ yếu liên quan đến việc sử dụng thực
phẩm được thu hoạch từ các vùng có nguồn nước bị ơ nhiễm với tỷ lệ cao nhất ở
Đông và Nam Á [22]. Tại Trung Quốc, nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của ô nhiễm
nguồn nước đến sức khỏe cộng đồng thông qua tiêu thụ NTHMV tại vịnh Bột Hải
7


đã tìm thấy HEV trong 17,5% số mẫu thu thập [23]. Tại châu Âu, một cuộc điều tra
năm 2008 trên 789 du khách trở về từ chuyến du thuyền sang Anh cho thấy có đến
195 người dương tính với vi rút HEV, trong đó 33 người có triệu chứng nhiễm
trùng cấp tính. Phân tích ngun nhân cho thấy có mối liên hệ chặt chẽ với việc tiêu
thụ sò và trai đến từ vùng nước ô nhiễm tại Southampton [24]. Nghiên cứu của
Rivadulla thực hiện trên 168 mẫu NTHMV tại hai vùng nuôi trồng thủy sản tại Tây
Ban Nha đã phát hiện 24,4% mẫu nhiễn HEV [25].
Tương tự như NoV, HAstV thường được tìm thấy trong NTHMV được ni
ở vùng nước ô nhiễm. Trẻ em là đối tượng có nguy cơ mắc HAstV cao nhất, theo
một nghiên cứu năm 2013, có đến 3% trẻ em dưới năm tuổi mắc vi rút này nhập
viện mỗi năm [26]. Một nghiên cứu khác thực hiện tại Nhật Bản, nơi có 4700 trẻ em
trong độ tuổi đi học bị ảnh hưởng bởi bệnh viêm dạ dày ruột cấp tính, HAstV đã
được tìm thấy trong 26% mẫu phân. Năm 2019, nghiên cứu của Diem Lan Vu và
cộng sự thực hiện trên 384 mẫu bệnh phẩm tại Tây Ban Nha cho thấy tỷ lệ nhiễm
HAstV chiếm 13,3% và được tìm thấy trong 66% các mẫu đồng nhiễm với các loại
vi rút khác [27]. Một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra phương thức lây truyền
chính của HAstV là do thực phẩm bị ô nhiễm, điển hình là NTHMV tại các vùng
nước bị ơ nhiễm [28]. Nghiên cứu của Vilarino và cộng sự thực hiện tại Tây Ban
Nha trên 41 mẫu NTHMV đã phát hiện 12,2% mẫu nhiễm HAstV [29]. Nghiên cứu
của David Polo và cộng sự trên 50 mẫu NTHMV nhập khẩu từ Ma rốc, Peru, Hàn
Quốc và Việt Nam đã phát hiện HAstV trong 18% số mẫu; đáng chú ý, mẫu
NTHMV nhập khẩu từ Việt Nam nhiễm HAstV cũng đồng nhiễm với HAV và NoV
nhóm GI [21].

Từ các số liệu về tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm kể
trên, có thể thấy tồn tại nguy cơ nhiễm NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV.
Đặc biệt, một số nghiên cứu đã chỉ ra tình trạng đồng nhiễm nhiều vi rút trên cùng
một mẫu, cho thấy tính phức tạp trong chẩn đốn và điều trị. Vì vậy, việc nghiên
cứu một phương pháp cho phép xác định đồng thời các vi rút sẽ là đóng góp hiệu
quả trong q trình tìm ngun nhân gây bệnh.

1.2. Đặc điểm sinh học các vi rút gây bệnh truyền qua thực
phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
1.2.1. Norovirus
NoV là một vi rút thuộc họ Caliciviridae, có cấu tạo là một vi rút RNA sợi
đơn dương, có kích thước gần 7,6kb. Hạt vi rút của NoV rất nhỏ, khơng có màng
bao quanh với đường kính khoảng 27-35 nm. Trong cùng genocluster, trình tự vỏ

8


capsid của vi rút thường rất giống nhau với khối 20 mặt đối xứng (Hình 1.2). Vỏ
capsid gồm có 90 dimer, khối lượng phân tử là 58 kDa [30].

Hình 1.2 Cấu trúc virion NoV [31]

Hình 1.3 Cấu tạo khung đọc mở NoV [32]

Phân tích về trình tự chiều dài hệ gen của NoV chỉ ra các chủng vi rút trong
một nhóm gen thường có trên 69% tương đồng về nucleotide. Hệ gen của NoV
được chia thành 3 khung đọc mở (ORF1, ORF2, và ORF3) (Hình 1.3). Khung đọc
mở thứ nhất ORF1 (~5 kb) mã hóa một phân tử polyprotein có kích thước 194kDa,
phân tử polyprotein này bị phân cắt bởi chính protease của NoV để tạo thành 6 phân
tử protein gồm (1) N-Term, protein chưa rõ chức năng (~48 kDa); (2) NTP

nucleoside triphosphatase (~40 kDa) có khả năng liên kết và thủy phân toàn bộ
NTP; (3) p22 tương tự như vùng N-Term, chưa rõ chức năng (~22kDa); (4) VPg,
protein đóng vai trị quan trọng trong q trình nhân bản và dịch mã RNA (~16
kDa); (5) 3C, 3C-like protease (~19 kDa), có vai trị phân cắt ORF1 polyprotein
thành các phân tử protein và (6) RdRp, RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp)
(~57 kDa). ORF2 chủ yếu mã hóa protein VP1 có tính biến đổi cao. ORF3 mã hóa
một protein VP2 cơ bản nhỏ nằm bên trong hạt vi rút, có vai trị tham gia vào quá
trình tổng hợp capsid và hình thành hệ gen. Trong đó, vùng RdRp tại khu vực giao
giữa ORF1-ORF2 và vùng VP1 là hai vùng chính thường được sử dụng để phân
loại đặc điểm di truyền của NoV hiện nay; cịn vùng C tương ứng với vùng trình tự
nhỏ ở đầu 5′ của VP1 thường được sử dụng để xác định kiểu gen (genotype) của
NoV [32, 33]. Nghiên cứu về tính di truyền và đa dạng kiểu gen của NoV những
năm gần đây đã chỉ ra NoV được phân thành 49 kiểu gen thuộc 10 nhóm từ GI đến
9


GX (9 GI, 27 GII, 3 GIII, 2 GIV, 2 GV, 2 GVI, 1GVII, 1GVIII, 1 GIX và 1 GX) với
GI, GII, GIV là những kiểu gen thường gặp ở người; trong đó, NoV GI và NoV GII
là hai kiểu gen gây bệnh phổ biến [34, 35].
1.2.2. Hepatitis A virus
HAV là một vi rút RNA khơng có lớp vỏ ngồi, có đường kính khoảng 27-32
nm và có cấu trúc đối xứng 20 mặt (Hình 1.4). Hệ gen của HAV gồm một phân tử
RNA mạch đơn, dương, có kích thước 7.5 kb. HAV có hệ gen tương tự với các
Picornavirus khác với cấu trúc được chia làm 3 vùng: vùng 5' không dịch mã
(5'UTR) chiếm xấp xỉ 10% hệ gen, một khung đọc mở (ORF), và vùng 3' khơng mã
hóa (3'UTR) [36] (Hình 1.5).

Hình 1.4 Cấu trúc virion Hepatitis A virus [37]

Hình 1.5 Cấu trúc hệ gen Hepatitis A virus [37]


Vùng 5' UTR là vùng bảo thủ nhất trong hệ gen của HAV, với độ tương
đồng về trình tự nucleotide lên tới trên 89% trong 7 chủng đại diện cho các kiểu
gen I, II, III [38]; do đó, đây cũng là vùng gen được sử dụng để xác định HAV.
Vùng 5' UTR có độ dài khoảng 735 đến 745 nucleotid, có liên kết đồng hóa trị
với protein 3B được mã hóa bởi chính hệ gen (protein VPg), và có chứa một vị
trí đi vào ribosom (internal ribosomal entry site-IRES). Đầu 5'UTR có cấu trúc
RNA bậc hai ở mức độ cao, với một vài cấu trúc dạng kẹp tóc phức tạp. Khung
đọc mở mã hóa cho tất cả các protein của vi rút, với các vùng như P1 mã hóa cho
10