BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHỊNG

HỌC VIỆN QN Y

HỒNG ĐẮC THĂNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC,
ĐỘC TÍNH VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC
CỦA CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.)
Ngành : Dược lý-Độc chất
Mã số

: 9 72 01 18

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI, 2023


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI: HỌC VIỆN QN Y
Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Trương Thị Thu Hiền
2. PGS. TS. Hoàng Lê Tuấn Anh

Phản biện 1: PGS TS. Nguyễn Văn Long
Phản biện 2: PGS.TS. Đoàn Cao Sơn
Phản biện 3: PGS.TS. Lê Văn Đông

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường
họp tại Học viện Qn y vào hồi

Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Thư viện Học viện Quân y

giờ

ngày

tháng

năm


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh gan mãn tính vẫn là một trong những vấn đề sức khỏe
nghiêm trọng nhất trên toàn thế giới. Theo ước tính của WHO tỉ lệ tử
vong do xơ gan ở các nước kém và đang phát triển là khoảng
22/100.000 người đây cũng là một trong 10 bệnh có tỉ lệ tử vong cao
nhất. Trong những năm gần đây, nhiều loại dược liệu và hợp chất tự
nhiên từ thực vật đã được nghiên cứu như là phương pháp điều trị bổ
sung và hỗ trợ giúp dự phòng và điều trị cho các bệnh gan.
Loài An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) thường được sử dụng
trong các bài thuốc dân gian hỗ trợ điều trị các bệnh về gan. Hiện
nay, các nghiên cứu đã tách chiết được một số hợp chất có hoạt tính
chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan, và chống sự phát triển tế bào
ung thư. Các nghiên cứu bước đầu cho thấy hiệu quả bảo vệ tế bào
gan trên thực nghiệm của cây An xoa. Trên thế giới và ở Việt Nam
các nghiên cứu tác dụng dược lý của lồi này cịn chưa tồn diện.

Vậy cây An xoa có độc hay khơng? Cây có tác dụng điều trị và dự
phòng các bệnh về gan hay khơng? Các hoạt chất chính có tác dụng
dược lý trong cây là gì? Vì vậy đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa
học, độc tính và một số tác dụng sinh học của cây An xoa
(Helicteres hirsuta Lour.)” thực hiện nhằm ba mục tiêu:
Xác định thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung
thư gan của một số hợp chất phân lập từ cây An xoa
Đánh giá tính độc tính cấp và bán trường diễn của cao chiết cây
An xoa
Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của cao chiết cây
An xoa


2
Những đóng góp mới của Luận án:
- Phân lập được 23 hợp chất từ lồi An xoa, trong đó có 06 hợp
chất lần đầu tiên phân lập được từ chi Helicteres gồm: Nicotiflorin
(HH9), syringaresinol-β-D-glucoside (HH11), (6S,9R)-roseoside
(HH16),

2-O-β-D-glucopyranosyl

methyl

salicylate

(HH20),

byzantionoside B (HH25), citrusin C (HH26), siringin (HH29) và
3,4ʹ,7,8-tetrahydroxyflavone (HH30).

- Đánh giá được độc tính cấp, bán trường diễn và tác dụng dự
phòng, điều trị xơ gan của 2 loại cao chiết An xoa: cao ciết methanol
(HHM) và cao chiết nước (HHW). Hai cao chiết này khơng thể hiện
độc tính cấp và bán trường diễn trên động vật thực nghiệm. Đồng
thời có tác dụng chống lại quá trình xơ hóa gan trên động vật thực
nghiệm, sử dụng điều trị sau xơ gan làm giảm mức độ xơ gan trên
động vật gây xơ gan bởi CCl4.
Bố cục luận án: Luận án gồm 135 trang (chưa bao gồm tài liệu
tham khảo và phụ lục). Trong đó, Đặt vấn đề: 2 trang; Tổng quan tài
liệu: 28 trang; Đối tượng, phương pháp nghiên cứu: 26 trang; Kết
quả nghiên cứu: 35 trang; Bàn luận: 40 trang; Kết luận: 2 trang; Kiến
nghị: 1 trang; Danh mục các công trình đã công bố 1 trang.
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về chi Helicteres
Chi Helicteres (Thâu kén ) thuộc Họ Sterculiaceae (họ Trôm),
bộ Malvales (Bông), lớp Magnoliopsida (Mộc lan), ngành
Magnoliophyta (Mộc lan). Chi Helicteres gồm khoảng 60 loài ở
vùng nhiệt đới của Châu Á và Châu Mỹ. Ở Việt Nam qua thống kê
tác giả Phạm Hồng Hộ cho thấy có 7 lồi và 2 thứ lồi. Trong đó 3
lồi H. angustifolia L., H. hirsuta L., H. isora L., thường xuyên được


3
dùng y học cổ truyền làm thuốc chữa các bệnh đái tháo đường, viêm
gan, viêm loét dạ dày, sốt rét, cảm mạo, tiêu chảy… Các nghiên cứu
trong nước và quốc tế đã tách chiết được 166 hợp chất từ các lồi
thuộc chi Helicteres. Các hợp chất chủ yếu thuộc nhóm các hợp chất
terpenoids, flavonoid, phenolic, lignoids và steroid. Trong đó nhiều
hợp chất đã được đánh giá có hoạt tính sinh học cao, có triển vọng
trong các nghiên cứu sâu hơn về tác dụng dược lý, tiềm năng sử dụng

trong điều trị các bệnh lý khác nhau.
1.2. Tổng quan cây An xoa (Helicteres hirsuta L.)
Các nghiên cứu hiện nay trên thế giới và trong nước chủ yếu tập
trung vào tách chiết phân lập các hợp chất hố học trong lồi này,
chưa có nhiều đánh giá tác dụng dược lý của An xoa trên thực
nghiệm. Các nghiên cứu đã phân lập được 28 hợp chất từ cây An xoa
trong đó gồm: 08 hợp chất terpenoid, 03 steriod, 04 flavonoid, 04
phenolic, 06 lignoid và 03 hợp chất khác.
Dược liệu này thể hiện các tác dụng chống viêm, chống ung thư,
chống các gốc oxy hóa, kháng khuẩn và virus. Các nghiên cứu hiện
nay trên thế giới và trong nước chủ yếu tập trung vào phân lập các
hợp chất hố học trong lồi này, chưa có nhiều đánh giá tác dụng
dược lý của An xoa trên thực nghiệm
1.3. Bệnh lý viêm gan, xơ gan
Nguyên nhân tổn thương gan do: virus, khuẩn, ký sinh trùng,
do rượu; do tự miễn; do thuốc và hóa chất, tổn thương gan không rõ
nguyên nhân. Các nguyên nhân này tác động gây tổn thương gan,
thường tiến triển theo các giai đoạn: viêm gan cấp, viêm gan mạn, xơ
hóa gan, xơ gan và cuối cùng ưng thư gan
Viêm gan là những trường hợp bệnh lý gây nên tổn thương


4
thối hóa, hoại tử tế bào gan và những tổn thương của mô đệm trong
gan do phản ứng viêm gây nên.
Xơ gan là một tình trạng xơ hoá lan toả trong nhu mô gan làm
đảo lộn cấu trúc của gan, tạo các dải xơ, chia cắt các tiểu thuỳ gan
thành các tiểu thuỳ gan giả. Trước đây xơ gan được cho rằng không
thể chữa được. Tuy nhiên ngày nay cùng với sự phát triển của y học
hiện đại, kết hợp với y học cổ truyền, điều trị xơ gan cũng có những

bước tiến vượt bậc. Các phương pháp dùng dược liệu hỗ trợ và điều
trị xơ gan đã được chứng minh là có hiệu quả qua các nghiên cứu
trên động vật cũng như ở người, đây là những phương pháp chữa
bệnh dùng các dược liệu từ tự nhiên với rất ít tác dụng khơng mong
muốn, và có thể điều trị lâu dài, phù hợp với đặc điểm lâm sàng của
bệnh mạn tính như xơ gan. Từ việc sử dụng các dược liệu riêng lể
đến việc sử dụng kết hợp các dược liệu tác dụng điều trị gan. Và tiến
bộ hơn là tách chiết và sử dụng các hoạt chất đã được chứng minh có
hoạt tính tốt trong điều trị các bệnh về gan.
1.4. Một số mơ hình thực nghiệm gây tổn thương gan
Mô hình đánh giá các thuốc bảo vệ gan thường gắn liền trực tiếp
với các mô hình gây tổn thương gan cấp tính hoặc mạn tính. Tổn
thương gan cấp tính thường dùng các thuốc và hố chất gây độc đến
gan như PAR, CCl4. Trong khi đó tổn thương gan mạn tính có thể
dùng nhiều tác nhân khác nhau: tác nhân gây độc đến gan, hoá chất,
chế độ ăn uống gây tổn thương gan mạn tính, hay các can thiệp gây
rối loạn chức năng gan (gây tắc mật, chuyển gen...), hoặc kết hợp
nhiều biện pháp với nhau. Trong đó hai mô hình phổ biến nhất là mô
hình gây tổn thương gan cấp tính bằng paracetamol, và mơ hình gây
tổn thương gan mạn tính, xơ gan bằng CCl4.


5
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Cao chiết từ phần trên mặt đất của cây An xoa (Helicteres
hirsuta Lour.) tại huyện A Lưới, tỉnh Thừa Thiên Huế bằng các dung
môi khác nhau: methanol, nước. Tên khoa học được xác định bởi
PGS.TS. Vũ Tiến Chính, Viện Bảo tàng Tự nhiên, Viện Hàn lâm

Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam (VAST).
2.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất, trang bị nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phịng thí nghiệm.
2.3. Động vật nghiên cứu
Chuột nhắt trắng dòng Swiss 65 con, trọng lượng 22±2g, Chuột
cống trắng dịng Wistar khơng phân biệt đực cái: 150 chuột trọng
lượng 200±20g,
2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phương pháp nghiên cứu thành phần hố học và hoạt tính
gây độc tế bào ung thư gan của một số hợp chất từ cây An xoa
Phương pháp tạo cao chiết toàn phần với 2 loại dung môi:
methanol và nước.
Phương pháp tách chiết hợp chất: Sắc ký cột, phương pháp sắc
lớp mỏng, phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế (PTLC)
Phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất phân lập được
bằng phương pháp phổ nghiệm: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một
chiều: 1H-NMR,

13

C-NMR và DEPT. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

hai chiều: HSQC, HMBC, 1H-1H COSY và NOESY.
Đánh giá khả năng gây độc tế bào ung thư gan và hoạt tính
apoptosis sử dụng tế bào HepG2


6


2.4.2. Xác định độc tính của cao chiết An xoa
2.4.2.1. Xác định độc tính cấp
Phương pháp đánh giá độc tính dược liệu theo khuyến cáo của
Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế (OECD).
Chuột được phân ngẫu nhiên vào 3 lô, mỗi lô 5 con.
Lô 1 uống nước cất với liều 20 ml/kg. Lô 2 (HHM) uống HHM
với liều 10 g/kg. Lô 3 (HHW) uống HHW với liều 10 g/kg.
Theo dõi hàng ngày trong thời gian 14 ngày.
2.4.2.2. Phương pháp nghiên cứu độc tính bán trường diễn

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu độc tính bán trường diễn của HHM
Chuột cống trắng chia làm 4 lô, mỗi lô 10 con.
Lô 1 (ĐCSL) uống nước cất 10ml/kg TT. Lô 2 (Lô HHM
1,3g): uống HHM liều 1,3 g/kg TT. Lô 3 (Lô HHM 2,6g): uống
HHM liều 2,6 g/kg. Lô 4 (Lô HHM 3,9 g): uống HHM liều 3,9 g/kg.
Đánh giá tình trạng chung, cơng thức máu; sinh hóa máu:
(ALT, AST, GGT, protein tồn phần, bilirubin huyết tương, ure,
creatinin); mơ bệnh học gan, thận.
2.4.3. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa bảo bệ gan
của cao chiết An xoa
2.4.3.1. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa
Phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng DPPH: theo
phương pháp của Abramovič và cộng sự (2018).
Phương pháp chống oxi hóa thơng qua ức chế quá trình
peroxidation lipid màng tế bào (thử nghiệm MDA) được thực hiện
theo phương pháp của Jelili A Badmus et al., (2011).


7
Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan trên in vitro

sử dụng dòng tế bào HepG2, mẫu đối chứng trolox: đánh giá khả
năng sống sót của tế bào dưới tác động của CCl4.
2.4.3.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng bảo bệ gan cấp tính

Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan cấp tính của cao
chiết An xoa
50 chuột khơng phân biệt giới tính được chia thành 5 lô
Lô 1 (ĐCLS): uống nước cất 10 ml/kg; Lô 2 (Lô đối chứng
bệnh lý): uống nước cất; Lô 3 (ĐC tham khảo): uống silymarin liều
0,1 g/kg; Lô 4 (HHM): uống HHM liều 2,3 g/kg; Lô 5 (HHW): uống
HHW liều 2,2 g/kg;
Gây tổn thương gan cấp bằng PAR vào ngày thứ 8 cho các lô
2-6. Xét nghiệm đánh giá hoạt độ AST, ALT, và mô bệnh học gan.
2.4.3.3. Phương pháp nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình
gây xơ gan thực nghiệm

Hình 2.7. Sơ đồ nghiên cứu tác dụng dự phòng xơ gan của cao chiết
Chuột cống trắng được chia làm 5 lô, mỗi lô 10 con
Lô 1: (ĐCSL) uống nước cất 10 ml/kg và chuột được tiêm dưới
da dầu olive 2ml/kg. Lô 2: (CCl4) uống nước cất 10 ml/kg. Lô 3:
(Silymarin) chuột uống silymarin liều 0,2 g/kg. Lô 4: (HHM) uống
HHM liều 1,34 g/kg. Lô 5: (HHW) uống HHW liều 1,3 g/kg.


8
Cách tiêm CCl4: tiêm dưới da dung dịch CCl4 pha trong dầu
olive theo tỉ lệ 1/1 (v/v), 2 lần 1 tuần vào thứ 3 và thứ 6, liều 2ml/kg
trong thời gian 12 tuần cho lô 2-6.
Theo dõi chuột trong suốt thời gian làm thí nghiệm: đánh giá
chung thể trạng chuột; Xét nghiệm sinh hóa, huyết học và xét

nghiệm mơ bệnh học để đánh giá tổn thương gan.
2.4.3.4. Phương pháp nghiên cứu tác dụng điều trị xơ gan của cao
chiết dược liệu trên mô hình gây xơ gan thực nghiệm

Hình 2.8. Sơ đồ nghiên cứu tác dụng điều trị xơ gan của cao chiết
Chuột được chia làm 6 lô, mỗi lô 10 con
Trong 12 tuần đầu: tiến hành gây xơ gan cho 60 chuột bằng
cách tiêm dưới da dung dịch CCl4/olive liều 2ml/kg; 10 chuột cịn lại
(lơ 1) tiêm dưới da dầu olive 2ml/kg.
Trong 12 tuần tiếp theo, tiến hành đánh giá tác dụng điều trị xơ
gan của sản phẩm nghiên cứu
Lô 1: ĐCSL, uống nước cất 10 ml/kg; Lô 2: (Ngừng CCl4)
uống nước cất 10 ml/kg và dừng tiêm CCl4. Lơ 3: (Duy trì CCl4)
chuột uống nước cất 10 ml/kg và tiếp tục tiêm CCl4.

Lô 4:

(Silymarin) uống silymarin liều 0,2g/kg. Lô 5: (HHM) uống HHM
liều 1,34 g/kg. Lô 6: (HHW) uống HHW liều 1,3 g/kg.
Theo dõi đánh giá chung thể trạng chuột, lấy máu chuột làm xét
nghiệm sinh hóa, huyết học; lấy gan làm xét nghiệm mô bệnh học.
2.5. Phương pháp xử lý số liệu


9
Số liệu được thu thập được nhập vào phần mềm Excel 16.0 và
phần mềm SPSS 20.0. Giá trị các chỉ tiêu nghiên cứu được trình bày
dưới dạng số trung bình ± độ lệch chuẩn ( X ± SD) với độ tin cậy
95%. Kiểm định phi tham số để so sánh sự khác biệt giữa các biến
nghiên cứu. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p<0,05.

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Thành phần hố học và hoạt tính gây độc tế bào gan của các
hợp chất phân lập từ cây An xoa

3.1.1. Tạo cao chiết toàn phần bằng dung môi methanol và nước
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết suất cao chiết An xoa
Khối lượng
Hiệu suất
Ký hiệu
Dung môi Khối lượng
bột khô (g) cao chiết (g)
chiết
cao chiết
Methanol 20.000
1920
9,6%
HHM
Nước

10.000

930

9,3%

HHW

Hai cao chiết HHM và HHW có dạng đặc sệt, mùi thơm nhẹ,
HHM có màu xanh đen trong khi đó HHW có màu nâu đen, với hiệu
suất tương tự nhau, lần lượt là 9,6%, và 9,3%.


3.1.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ cao chiết methanol

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chiết dichloromethan


10

Hình 3.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chiết ethyl acetate
Từ cao chiết HHM phân lập được 23 hợp chất: 8 flavonoid (HH9- Nicotiflorin, HH18- Isoquercitrin,
HH19- Apigenin, HH24- kaempferol-3-β-D-(6-O-trans-p-coumaroyl) glucopyranoside, HH27-Rutin,
HH30-3,4ʹ,7,8-tetrahydroxyflavone, HH31- Quercetin, HH32- Kaempferol 3-O-- L- rhamopyranoside), 1
sterol (HH28-20-hydroxyecdysone), 1 indol (HH7-indole-3-carboxaldehyde), 4 megastigmane (HH1-4,5dihydroblumenol A, HH14-Cucumegastigmane I, HH16-(6S,9R)-roseoside, HH25- byzantionoside B), 4
hợp chất phenolic glycoside (HH26- citrusin C, HH20: 2-O-β-D-glucopyranosyl methyl salicylate, HH23:
benzyl

2-O-β-D-glucopyranosyl-2,6-dihydroxybenzoate,

HH29-

syringin),

4

lignan

(HH5-(+)-

syringaresinol, HH11- acteosid, HH12- icariol A2, HH15- methyl rosmarinate) và 1 apo carotenoid
sesquiterpenoid (HH22- dihydrophaseic acid).



11

Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ H. hirsuta
3.1.3. Khả năng ức chế tế bào ung thư gan HepG2 của một số hợp
chất


12
Bảng 3.3. Khả năng gây độc tế bào ung thư gan HepG2 in vitro của
một số hợp chất phân lập từ cây An xoa
Tên chất
HH1

% tế bào bị ức chế theo nồng độ các chất
100
20
4
0,8
(µg/mL) (µg/mL) (µg/mL) (µg/mL)
74,83
11,72
1,83
-2,54

IC50
(µg/mL)
69,02±3,60


HH5

70,67

20,7

12,37

4,89

64,52±3,00

HH7

91,64

49,28

24,98

19,6

20,96±1,54

HH12

97,66

41,3


19,95

8,13

27,98±1,11

11,69
0,4
(µg/mL)

9,43
0,08
(µg/mL)

96,83±7,86

49,23

23,45

0,37±0,04

HH24

51,24
18,64
10
2
Ellipticine
(µg/mL) (µg/mL)

90,94

76,69

Các hợp chất khác (HH9, HH11, HH14, HH15,

>100

HH16, HH18, HH19, HH20, HH22, HH23, HH24,
HH25, HH26, HH27, HH28, HH29, HH30 và HH31)
Trong đó: Ellipticine là chất đối chứng tham khảo

Kết quả cho thấy, trong 23 hợp chất thử nghiệm, chỉ có 05
chất là: HH1, HH5, HH7, HH12 và HH24 thể hiện hoạt tính ức chế
sự phát triển của tế bào ung thư với giá trị IC50 từ 20,96 – 96,83
µg/mL. Trong đó hợp chất HH7 thể hiện hoạt tính hiệu quả nhất với
IC50 đạt 20,96 µg/mL. Các mẫu cịn lại khơng thể hiện hoạt tính với
IC50>100 µg/mL

3.1.4. Hoạt tính cảm ứng apoptosis của hợp chất HH7


13
Bảng 3.4. Tỉ lệ tế bào apoptosis
% tế bào
Sống Apoptosis Apoptosis
Mẫu NC

Hoại


sớm

muộn

tử

ĐC âm

96,18

1,83

0,18

1,82

HH7 (10 µg/mL)

93,52

2,74

0,34

3,40

HH7 (20 µg/mL)

87,85


7,53

0,88

3,74

HH7 (40 µg/mL)

64,06

20,28

2,90

12,77

Camptothecin (0,35µg/ml)

67,10

29,08

0,56

3,26

Nghiên cứu khả năng apoptosis của mẫu HH7 thấy tỉ lệ tế bào ở
giai đoạn apoptosis sớm, apoptois muộn và tế bào hoại tử đều tăng
lên so với đối chứng và tăng lên khi nồng độ thử nghiệm tăng. HH7
gây độc cho tế bào thơng qua cảm ứng apoptosis.

3.2. Độc tính cao chiết cây An xoa

3.2.1. Độc tính cấp của cao chiết cây An xoa
Với cao chiết HHM, HHW khi cho chuột uống với liều là
10g/kg TT đều không thấy chuột chết khi theo dõi trong 14 ngày và
không gây các triệu chứng ngộ độc trong thời gian theo dõi.

3.2.2. Độc tính bán trường diễn của cao chiết HHM
3.2.2.1. Ảnh hưởng của cao chiết nghiên cứu đến trọng lượng chuột
Khơng có sự khác biệt trọng lượng cơ thể giữa các lô chuột ở cả
3 thời điểm nghiên cứu với p>0,05.
3.2.2.2. Ảnh hưởng của cao chiết nghiên cứu đến chỉ tiêu huyết học
Số lượng hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu của các lô chuột ở cả
3 thời điểm nghiên đều trong giới hạn bình thường
3.2.2.3. Ảnh hưởng của cao chiết nghiên cứu chức năng gan, thận
Chỉ số AST, ALT, GGT, protein toàn phần, bilirubin, ure và
creatinin ở các thời điểm đều trong giới hạn sinh lý bình thường.


14
3.2.2.4. Sự thay đổi hình ảnh mơ bệnh học gan, thận

Hình 3.9. Hình ảnh vi thể gan ở các nhóm nghiên cứu (HE 200X)

Hình 3.11. Hình ảnh vi thể thận các nhóm nghiên cứu (HE 200X)
Hình ảnh vi thể gan, thận chuột cũng cho thấy khơng có sự khác
biệt rõ rệt giữa lô uống chế phẩm và lô đối chứng.
3.3. Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ

3.3.1. Tác dụng chống oxy hố của cao chiết

Bảng 3.9. Hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro của HHM và HHW
thơng qua trung hòa gốc tự do của DPPH
Nồng độ

Phần trăm trung hòa gốc tự do của DPPH (%)

(µg/mL)

HHW

HHM

500

87,13

90,02

100

85,14

89,61

91,62

20

23,84


51,21

91,30

4

4,30

17,39

27,96

0,8
IC50

Ascorbic acid

1,51
47,67 ±3,19

21,19 ±3,04

7,91 ± 0,21


15
HHM và HHW đều thể hiện hoạt tính chống oxi hóa có hiệu quả
tốt thơng qua phép thử trung hịa gốc tự do của DPPH với IC50 từ
21,19 – 47,67 µg/mL.
Bảng 3.10. Hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro của HHM và

HHW thông qua ức chế quá trình peroxy hố lipid màng tế bào
% ức chế peroxy hóa lipid (MDA)
Nồng độ
(µg/mL)
HHW
HHM
Trolox
500
71,27
71,68
100
69,21
64,81
73,41
20
47,49
51,34
66,79
4
33,06
36,22
41,70
0,8
32,71
IC50
24,52 ±3,11
20,20 ±2,02
6,21 ± 0,44
HHM và HHW đều thể hiện hoạt tính ức chế sự peroxy hóa
lipid màng tế bào với giá trị IC50 từ 20,20 – 26,58 µg/ml.


3.3.2. Tác dụng bảo vệ gan cấp tính của cao chiết An xoa trên mơ
hình gây tổn thương gan bằng paracetamol
Bảng 3.12. Sự thay đổi hoạt độ enzym gan các lô chuột trên mô hình
gây tổn thương gan bằng paracetamol
Lô
AST
ALT
ĐCSL

*

92,00 ± 12,62

53,54 ± 13,47
***

PAR

883,74 ± 141,47

495,52 ± 93,39***

Silymarin

409,68 ± 85,88***###

238,83 ± 92,78***###

HHM


449,53 ± 110,75***###

295,08 ± 82,48***###

HHW

541,43 ± 88,2***###

354,14 ± 98,04***##

HHE1/1

443,72 ± 86,71***###

256,81 ± 76,69***###

so sánh với nhóm ĐCSL; # so sánh với nhóm PAR. * p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001;
# p<0.05, ## p<0.01, ### p<0.001 (Mann-Whitney test)


16
Hoạt độ AST, ALT tăng cao ở các nhóm nghiên cứu so với
nhóm chứng tại thời điểm sau uống PAR 2 ngày với p<0,001. So với
nhóm uống PAR, các nhóm chuột được uống dược liệu đều có hoạt
độ AST, ALT thấp hơn có ý nghĩa thống kê với p<0,001 và p<0,01.

Hình 3.1. Ảnh vi thể gan chuột gây độc bằng paracetamol (HE
200X)
Các lơ silymarin, HHM hình ảnh các tế bào gan bị thối hóa

nhẹ, kèm theo xâm nhiễm của các tế bào viêm. Lơ HHW các tế bào
gan bị thối hóa nặng hơn, kèm theo xung huyết và xâm nhiễm các tế
bào viêm. Lơ PAR có hình ảnh các ổ hoại tử tế bào gan.
3.3.3. Tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình gây xơ gan thực nghiệm
3.3.3.1. Chỉ tiêu sinh hóa sau đánh giá tác dụng dự phịng xơ gan
Bảng 3.14. Hoạt độ một số enzym gan sau nghiên cứu
Lô chuột
Lô ĐCSL
Lô CCl4

AST sau NC
116,97 ± 19,00

ALT sau NC
53,55 ± 12,45

***

2234,7 ± 325,19

903,37 ± 183,84

GGT sau NC
1,7 ± 2,11

***

Lô silymarin 1183,29 ± 276,57***### 730,55 ± 157,15***#

10,1 ± 3,38***

6,0 ± 3,74**#

Lô HHW

1214 ± 357,21***###

653,46 ± 226,01***#

Lô HHM

1076 ± 398,5***###

452,35 ± 115,73***### 6,3 ± 4,4**

* so

7,1 ± 2,08***#

sánh với nhóm ĐCSL; # so sánh với nhóm CCl4. * p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001;
# p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,001(Mann-Whitney test)


17
Nhóm chuột ĐCSL hoạt độ của cả 3 enzym đều duy trì ở mức
trung bình, trong khi đó ở các nhóm chuột cịn lại đều tăng mạnh.
Hoạt độ AST nhóm silymarin, HHM, HHW thấp hơn có ý nghĩa so
với nhóm CCl4 với p<0,001. Hoạt độ ALT, GGT của nhóm chuột chỉ
tiêm CCl4 cao hơn có ý nghĩa thống kê so với các nhóm chuột được
dùng thêm các chế phẩm bảo vệ gan với p<0,05, p<0,01 và p<0,001.


3.3.4. Hình ảnh mơ học sau đánh giá tác dụng dự phòng xơ gan
Sau thí nghiệm lơ ĐCSL 10/10 gan vẫn ở mức F0. Lơ tiêm CCl4
có 7/10 chuột bị xơ gan giai đoạn F4 và 2 chuột xơ hóa gan giai đoạn
F3. Lơ chuột được uống silymarin chỉ có 2 chuột bị xơ gan F4. Các
lơ uống cao chiết An xoa có diễn biến tương tự nhau với tỉ lệ xơ hóa
gan ở các giai đoạn khác biệt không đáng kể. Chủ yếu gan xơ hóa ở
giai đoạn trung gian F2-F3.
3.3.4.1. Hình ảnh đại thể

Hình 3.14. Hình ảnh đại thể gan chuột sau nghiên cứu
Nhóm chứng sinh lý, silymarin, HHM và HHW, hình ảnh đại
thể cho thấy gan bình thường. Lô chuột chứng bệnh lý: Gan có màu
vàng nâu, bề mặt gan sần sùi có nhiều nốt lồi lên kích thước từ 13mm. Mật độ gan tương đối chắc.


18
3.3.4.2. Hình ảnh vi thể

Hình 3.16. Hình ảnh vi thể gan chuột nhuộm ba màu Masson
(100x)
Hình ảnh vi thể: gan chuột lơ chứng bệnh lý có tăng sinh mơ
liên kết xơ mật độ cao với các dải xơ dày. Gan chuột nhóm
silymarin, với các dải xơ mảnh, thưa, có rất ít cầu nối. Hình ảnh phù
hợp với giai đoạn xơ hóa gan F1-F3. Nhóm uống HHW, HHM: vẫn
giữ cấu trúc của gan với các tiểu thùy, khoảng cửa, bè gan, tĩnh mạch
trung tâm. Tuy nhiên có xuất hiện và dải xơ ngắn làm rộng khoảng
cửa. Có một vài cầu nối xơ hóa giữa khoảng cửa và tĩnh mạch trung
tâm, khoảng cửa với khoảng cửa.

3.3.5. Tác dụng điều trị xơ gan của cao chiết trên mơ hình gây xơ

gan động vật thực nghiệm
3.3.5.1. Chỉ tiêu sinh hóa trong nghiên cứu tác dụng điều trị xơ gan
Tại thời điểm trước khi nghiên cứu, chỉ tiêu sinh hóa các lơ
chuột nằm trong giời hạn sinh lý bình thường, khơng có sự khác biệt
đáng kể giữa các lô chuột trước nghiên cứu. Kết quả xét nghiệm ở
các thời điểm khác thể hiện qua các bảng biểu sau:


19
Bảng 3.17. Hoạt độ enzym gan sau 12 tuần điều trị
Lô chuột
AST sau 12
ALT sau 12
GGT sau 12
tuần điều trị
tuần điều trị
tuần điều trị
ĐCSL (n=10) (1)
123,78 ± 17,20 52,78 ± 9,90 2,30 ± 1,77
Ngừng CCl4 (n=8) (2) 189,24 ± 81,73

60,28 ± 10,14 3,38 ± 1,92

Duy trì CCl4 (n=6) (3) 153,18 ± 50,12

62,47 ± 7,19

Silymarin (n=10) (4)

160,57 ± 48,78


58,95 ± 13,93 3,40 ± 2,07

HHW (n=10) (5)

198,99 ± 45,72

64,48 ± 12,39 3,00 ± 1,33

HHM (n=10) (6)

182,15 ± 56,29 63,32 ± 11,00
p1-6>0,05;
p1-6>0,05;
p2-6>0,05
p2-6>0,05
Sau 12 tuần được điều trị bằng silymarin và

3,67 ± 2,25

4,90 ± 1,52
p1-6>0,05;
p2-6>0,05
các chế phẩm

nghiên cứu hoạt độ enzym gan giảm rõ rệt. Kể cả hai lô đối chứng
bệnh lý cũng đều thấy hoạt độ enzym gan giảm về gần giá trị của các
lơ nghiên cứu. Khơng cịn thấy sự khác biệt đáng kể giữa các lô
chuột ở 3 chỉ tiêu này.
3.3.5.2. Kết quả mô học trong nghiên cứu tác dụng điều trị xơ gan


Hình 3.17. Hình ảnh đại thể gan chuột các lơ chuột sau điều trị
Gan nhóm chứng sinh lý gan bình thường
Gan lơ chuột tiếp tục duy trì tiêm CCl4: Gan có màu vàng nâu,
bề mặt gan sần sùi có nhiều nốt kích thước từ 1-3mm. Mật độ gan


20
tương đối chắc, đàn hồi kém.
Nhóm chuột dừng tiêm CCl4 nhưng khơng điều trì trong 12 tuần
cuối, gan vẫn có màu nâu đỏ, bề mặt cũng có những nốt to nhỏ
không đều, mật độ tương đối chắc đàn hồi kém.
Các lô được dùng silymarin, cao chiết An xoa trong 12 tuần
cuối hình ảnh tương tự nhưng mức độ nhẹ hơn.

Hình 3.19. Ảnh vi thể gan chuột nhuộm ba màu Masson (100x)
Hình ảnh nhuộm ba màu masson, cho thấy hình ảnh rõ nét hơn
của các sợi collagen phát triển trong nhu mơ gan.
Lơ chuột tiếp tục duy trì tiêm CCl4 cho thấy các sợi collagen
phát triển mạnh nhất với sợi xơ dày và mật độ cao, diện tích sợi xơ
chiếm tỉ lệ cao trên vi trường quan sát, tiếp đó là lô chuột dừng tiêm
CCl4 nhưng không điều trị bằng các chế phẩm nghiên cứu các sợi xơ
dày nối với nhau chia cắt nhu mơ gan.
Các lơ chuột cịn lại các sợi xơ mảnh và thưa hơn, trên nền các
tế bào gan bị thối hóa hạt, thối hóa mỡ, các xoang mạch hình sin
dãn rộng.


21


Bảng 3.2. Tỉ lệ diện tích collagen trên tiêu bản nhuộm 3 màu
Masson
Lơ chuột
Diện tích
Lơ chuột
Diện tích
(n=10)
collagen
(n=10)
collagen
Lơ dừng CCl4
23,07 ± 5,41
Lơ HHW 15,14 ± 3,65**###
Lơ duy trì CCl4

24,78 ± 5,45

Lơ silymarin

12,91 ± 3,13***###

* So

Lô HHM

15,11 ± 4,38**##

sánh với lô ngừng CCl4, # so với lơ duy trì CCl4; * p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001;
# p<0,05, ## p<0,01, ### p<0,001 (Mann-Whitney test)


Diện tích sợi collagen có sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm
được điều trị bằng silymarin, HHM và HHW so với nhóm tiếp tục
duy trì tiêm CCl4 và nhóm dùng CCl4 nhưng khơng được điều trị gì
với p<0,01 và p<0,001.
Chương 4. BÀN LUẬN
4.1. Thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào gan của một
số hợp chất phân lập từ cây An xoa
Trong số 23 hợp chất phận lập được từ An xoa, có 06 hợp chất
lần đầu tiên phân lập từ chi Helicteres. Trong số đó, nhiều hợp chất
thể hiện hoạt tính sinh học đã được báo cáo: chống oxy hóa, bảo vệ
gan, ức chế tế bào ung thư, chống viêm, chống đái tháo đường...
Năm hợp chất HH1, HH5, HH7, HH12 và HH24 ) thể hiện hoạt
tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư thử nghiệm (IC50 từ
20.96 đến 96.83µg/mL. HH7 có hiệu quả gây độc tế bào ung thư tốt
nhất thông qua cơ chế gây cảm ứng apoptosis.
4.2. Độc tính cao chiết cây An xoa
4.2.1. Độc tính cấp của cao chiết cây An xoa
Với liều 10g/kg TT không gây chết cũng như triệu chứng ngộ
độc trên chuột nhắt trắng, theo mức đánh giá độc tính của thang đo


22
Hodge và Sterner cao chiết này thực tế không độc hại đến chuột nhắt
qua đường tiêu hóa khi theo dõi trong 14 ngày.
4.2.2. Độc tính trường diễn của cao chiết cây An xoa
Chuột cống được uống cao chiết HHM với cả 3 loại liều: tương
đương trên người, liều gấp đôi và liều gấp 3 lần dự kiến sử dụng trên
người. Đều không gây ảnh hưởng đến thể trạng chung, chức năng
gan, thận, tạo máu và các triệu chứng nhiễm độc khác trong thời gian
nghiên cứu 90 ngày. Vì vậy cao chiết HHM là tương đối an toàn

trong sử dụng dài ngày trên chuột cống trắng.
4.3. Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ gan của cao chiết An xoa
4.3.1. Tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ gan trên in vitro
Cao chiết HHM và HHW có hoạt tính chống oxy hóa mạnh:
qt gốc DPPH với IC50: 21,19 và 47,67 µg/ml, và khả năng ức chế
peroxyd hóa lipid với IC50: 20,20 và 26, 58 µg/mL.
Nồng độ 100 và 20µg/mL, HHM và HHW đều có hiệu quả bảo
vệ tế bào HepG2. Trong đó, HHW có hiệu quả bảo vệ cao nhất, với
phần trăm tế bào sống lên tới 98,15%.
4.3.2. Tác dụng bảo vệ gan cấp tính trên mơ hình gây độc bằng
paracatamol
Khi sử dụng cao chiết HHM, HHW với liều tương đương dự
kiến sử dụng trên người, có tác dụng bảo vệ gan dưới tác động của
PAR liều cao cấp tính. Hạn chế tổn thương tế bào gan, hạn chế tăng
men gan trong nghiên cứu.
4.3.3. Tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình gây xơ gan thực nghiệm
Trong thử nghiệm dự phòng gây xơ gan thực nghiệm, động vật
được dùng chế phẩm nghiên cứu cùng với tác nhân gây tổn thương
gan mạn tính (gây xơ gan thực nghiệm). HHM và HHW có tác dụng
làm ức chế tiến triển của xơ gan, hiệu quả được so sánh với nhóm
chứng bệnh lý và nhóm đối chứng dương sử dụng silymarin. HHM


23
và HHW có tác dụng giảm mức độ tăng men gan, giảm các thay đổi
trong xét nghiệm huyết học, và xét nghiệm sinh hóa so với lơ chứng
bệnh lý. Trong xét nghiệm mô bệnh học cho thấy mức độ xơ hóa
giảm đáng kể, gan ở lơ dùng cao chiết chủ yếu ở giai đoạn xơ hóa
F2-F3 so với các lơ chứng bệnh lý đa số gan bị xơ gan giai đoạn F4.
4.3.4. Tác dụng điều trị xơ gan trên mô hình gây xơ gan thực

nghiệm
Ngày nay, điều trị xơ gan đã có những bước tiến quan trọng,
nhiều nghiên cứu đã chứng minh xơ gan có thể đảo ngược được khi
ngừng các tác nhân gây tổn thương và có liệu pháp điều trị thích hợp.
Trong nghiên cứu của chúng tơi, sau khi gây xơ gan, chuột được
dùng cao chiết An xoa để điều trị, đối chứng dương tính lơ chuột
uống silymarin, đối chứng bệnh lý với 2 lô: lô chuột gây xơ gan
nhưng không điều trị và lô chuột tiếp tục tiêm CCl4, kết quả cho thấy
khi dùng cao chiết sau 12 tuần, mức độ xơ gan đã giảm so với lô
không được điều trị và lô tiếp tục gây tổn thương gan. Tỉ lệ diện tích
collagen giảm có ý nghĩa, cũng như các triệu chứng toàn trang được
cải thiện tốt ở các lô được dùng chế phẩm nghiên cứu. Hơn nữa,
khơng có chuột nào bị tử vong trong lơ được điều trị. Lơ duy trì tiêm
CCl4 có 4 chuột bị tử vong, và lơ khơng điều trị có 2/10 chuột tử
vong. Vì vậy cho thấy hiệu quả tốt trong việc cải thiện mức xơ hóa
gan và kéo dài thời gian sống cho động vật của cao chiết An xoa.
Chương 5. KẾT LUẬN
Thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư
gan của một số hợp chất phân lập từ cây An xoa
Hiệu suất cao chiết: HHM 9,6% và HHW 9,3%. Từ cao chiết
toàn phần HHM đã phân lập được 23 hoạt chất, trong đó có 5 hoạt
chất có hoạt tính chống tế bào ung thư gan, hợp chất indole-3-