BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHỊNG

HỌC VIỆN QN Y

HỒNG ĐẮC THĂNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC,
ĐỘC TÍNH VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC
CỦA CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI, 2023


BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

BỘ QUỐC PHỊNG

HỌC VIỆN QN Y

HỒNG ĐẮC THĂNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC,
ĐỘC TÍNH VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC
CỦA CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.)

Ngành: Dược lý-Độc chất
Mã số: 9 72 01 18

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. TRƯƠNG THỊ THU HIỀN
2. PGS. TS. HOÀNG LÊ TUẤN ANH

HÀ NỘI, 2023


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong đề tài
nghiên cứu có tên: “Đánh giá tài nguyên cây thuốc và tri thức bản địa về các loài
cây dược liệu phục vụ phát triển cơng nghiệp hóa dược tỉnh Thừa Thiên Huế”. Kết
quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà tơi là một thành viên chính.
Tơi đã được Chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu
đồng ý cho phép sử dụng đề tài này vào trong luận án để bảo vệ lấy bằng tiến sĩ.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai cơng bố
trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả luận án

Hoàng Đắc Thăng


LỜI CẢM ƠN
Tơi đã hồn thành luận án này với nỗ lực và cố gắng của bản thân.
Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và động
viên của các thầy, cô, đồng nghiệp và người thân.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Đảng ủy, Ban giám đốc Học viện Quân y, Phòng sau Đại học, Trung

tâm Đào tạo, nghiên cứu Độc học và phóng xạ - Học viện Quân Y, Viện Quân
y 103, Viện bỏng Quốc gia Lê Hữu Trác, Viện nghiên cứu Khoa học Miền
trung, Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hóa Học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam, đã cho phép, tạo điều kiện giúp đỡ tơi trong q trình
học tập và hồn thành luận án.
Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới:
TS. Trương Thị Thu Hiền – Giảng viên Trung tâm Đào tạo, nghiên cứu
Độc học và phóng xạ - Học viện Qn Y và PGS.TS. Hồng Lê Tuấn Anh Phó giám đốc Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam là những người Thầy tận tình, hết lịng
vì học trị, đã trực tiếp hướng dẫn, cung cấp cho tôi những kiến thức và
phương pháp luận quý báu trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Hoàng Anh Tuấn – Giám đốc Trung tâm
Đào tạo, nghiên cứu Độc học và phóng xạ, các thầy cơ, và các đồng nghiệp
của Trung tâm đã giúp đỡ tôi trong q trình học tập và nghiên cứu.
Tơi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô và cùng các đồng nghiệp bộ môn
Dược lý, Viện Đào tạo Dược, Học viện Quân y cũng đã giúp đỡ tơi trong q
trình thực nghiệm, thu thập số liệu và nghiên cứu.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô trong Hội đồng Chấm luận án đã
đóng góp nhiều ý kiến q báu giúp tơi hồn thành luận án.
Cuối cùng tơi xin gửi lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã
ln ở bên cạnh, động viên, chia sẻ những khó khăn để tơi n tâm học tập và
hồn thành luận án.
Nghiên cứu sinh

Hoàng Đắc Thăng


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cam đoan

Mục lục
Danh mục chữ viết tắt trong luận án
Danh mục các bảng
Danh mục các biểu đồ
Danh mục các sơ đồ
Danh mục các ảnh
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Tổng quan về chi Helicteres ...................................................................... 3
1.1.1. Phân loại .............................................................................................. 3
1.1.2. Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chi Helicteres L. ........ 4
1.2. Tổng quan cây An xoa (Helicteres hirsuta L.) .......................................... 4
1.2.1. Nhận dạng thực vật ............................................................................. 4
1.2.2. Thành phần hóa học của cây An xoa .................................................. 6
1.2.3. Tác dụng sinh học của cây An xoa ..................................................... 6
1.2.4. Công dụng của cây An xoa ................................................................. 8
1.3. Bệnh lý viêm gan, xơ gan........................................................................... 9
1.3.1. Tổng quan các giai đoạn phát triển tổn thương gan............................ 9
1.3.2. Cơ chế bênh viêm gan ....................................................................... 11
1.3.3. Cơ chế bệnh xơ gan ........................................................................... 14
1.3.4. Vai trị gốc oxy hóa trong bệnh gan .................................................. 16
1.3.5. Tiến bộ trong điều trị xơ gan bằng dược liệu.................................... 20
1.4. Một số mơ hình thực nghiệm gây tổn thương gan bằng thuốc và hóa chất
......................................................................................................................... 23
1.4.1. Mơ hình tổn thương gan bằng paracetamol ...................................... 24


1.4.2. Mơ hình sử dụng carbon tetrachlorid gây tổn thương gan ................ 27
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............. 31
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 31

2.2. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 31
2.2.1. Hóa chất ............................................................................................ 31
2.2.2. Thiết bị .............................................................................................. 32
2.3. Động vật nghiên cứu ................................................................................ 33
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 34
2.4.1. Phương pháp nghiên cứu thành phần hoá học .................................. 35
2.4.2. Phương pháp nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của các hợp chất 38
2.4.3. Phương pháp xác định độc tính của cao chiết An xoa ...................... 40
2.4.4. Phương pháp nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của
cao chiết An xoa .......................................................................................... 44
2.4.5. Các xét nghiệm được thực hiện......................................................... 52
2.5. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 55
2.6. Phương pháp xử lý số liệu........................................................................ 56
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 57
3.1. Thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan của các hợp
chất phân lập từ cây An xoa ............................................................................ 57
3.1.1. Tạo cao chiết tồn phần bằng dung mơi methanol và nước ............. 57
3.1.2. Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ cao chiết methanol .............. 57
3.1.3. Khả năng ức chế tế bào ung thư gan HepG2 của một số hợp chất ... 62
3.1.4. Hoạt tính cảm ứng apoptosis của hợp chất HH7 .............................. 63
3.2. Độc tính cao chiết cây An xoa ................................................................. 64
3.2.1. Độc tính cấp của cao chiết cây An xoa ............................................. 64
3.2.2. Độc tính bán trường diễn của cao chiết HHM .................................. 66
3.3. Tác dụng chống oxy hoá bảo vệ gan của cây An xoa .............................. 70
3.3.1. Tác dụng chống oxy hoá của cao chiết trên in vitro ......................... 70


3.3.2. Tác dụng bảo vệ gan của cao chiết An xoa trên in vitro ................... 71
3.3.3. Tác dụng bảo vệ gan cấp tính của cao chiết cây An xoa trên mơ hình
gây tổn thương gan bằng paracetamol ........................................................ 72

3.3.4. Tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình gây xơ gan động vật thực nghiệm
..................................................................................................................... 73
3.3.5. Tác dụng điều trị xơ gan trên mơ hình gây xơ gan thực nghiệm ...... 81
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .............................................................................. 92
4.1. Thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan của các hợp
chất phân lập từ cây An xoa ............................................................................ 92
4.1.1. Thành phần hóa học của cây An xoa ................................................ 92
4.1.2. Khả năng ức chế tế bào ung thư gan HepG2 của một số hợp chất . 100
4.2. Độc tính của cao chiết cây An xoa ......................................................... 103
4.2.1. Độc tính cấp của cao chiết cây An xoa ........................................... 103
4.2.2. Độc tính bán trường diễn của cao chiết cây An xoa ....................... 104
4.3. Tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ gan của cao chiết cây An xoa ........... 109
4.3.1. Tác dụng chống oxy hoá, bảo vệ gan trên in vitro .......................... 109
4.3.2. Tác dụng bảo vệ gan cấp tính trên mơ hình gây độc bằng paracetamol
................................................................................................................... 112
4.3.3. Tác dụng dự phịng xơ gan trên mơ hình gây xơ gan động vật thực
nghiệm ....................................................................................................... 114
4.3.4. Tác dụng điều trị xơ gan trên mơ hình gây xơ gan thực nghiệm .... 121
KẾT LUẬN ................................................................................................... 132
KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 134
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ
ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
TT Phần viết tắt

Phần viết đầy đủ

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance

1

13

2

1

3

ALP

Alkalin phosphatase

4

ALT

Alanin Aminotransferase

5

AST

Aspartat Aminotransferase

6


ATP

Adenosin Triphosphat

7

c.c

Column chromatography (Sắc kí cột)

8

CCl4

Carbon tetrachlorid

9

DAMPs

10

ĐCSL

11

DEPT

12


DMSO

Dimethyl sulfoxid

13

DNA

Deoxyribonucleic acid

14

DPPH

1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl

15

ECM

Extracellular Matrix (Cấu trúc nền ngoại bào )

16

FBS

Fetal bovine serum (Huyết thanh bào thai bò)

17


GGT

γ-glutamin transpeptidase

18

GSH

Glutathion

19

HCC

20

HE

C-NMR

H-NMR

Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13)
Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
(Phổ cộng hưởng từ hạt nhận proton)

Damage-associated molecular patterns (Các mẫu phân
tử liên quan với tổn thương)
Đối chứng sinh lý
Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

(Phổ DEPT)

Hepatocellular carcinoma (Ung thư biểu mô tế bào
gan)
Hematoxylin Eosin


TT Phần viết tắt

Phần viết đầy đủ
Human hepatocellular carcinoma (Tế bào Ung thư gan

21

HepG2

22

HFD

High-fat diet (Chế độ ăn nhiều chất béo)

23

HHD

Phân đoạn dichloromethan của cao chiết An xoa

24


HHE

Phân đoạn ethyl acetate của cao chiết An xoa

25

HHH

Phân đoạn n-hexan của cao chiết An xoa

26

HHM

Cao chiết toàn phần methanol của An xoa

27

HHW

Cao chiết nước của An xoa

28

HHWF

Phân đoạn nước cao chiết của cao chiết An xoa

29


HMBC

30

HMGB1

High mobility group box 1 protein (Protein di động cao)

31

HSC

Hematopoietic stem cells (Tế bào hình sao gan)

32

HST

Huyết sắc tố

33

HSQC

34

Hyp

35


IC50

36

IL

Interleukin

37

LD50

Lethal dose 50% (Lethal dose, 50%)

38

MDA

Malonyl dialdehyde

39

MMPs

40

MTT

41


NAFLD

người)

Heteronuclear mutiple Bond Connectivity (Phổ tương
tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết)

Heteronuclear Single-Quantum Coherence (Phổ tương
tác dị hạt nhân qua 1 liên kết)
Hydroxyproline
Inhibitory concentration at 50% (Nồng độ ức chế 50%
đối tượng thử nghiệm)

Matrix Metalloproteinases (Enzym metalloproteinase
ngoại bào)
Methyl-thiazolyl tertrazolium
Non-alcoholic fatty liver disease (Bệnh gan nhiễm mỡ
không do rượu)


TT Phần viết tắt

Phần viết đầy đủ
Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated

42

NF-κB

B (Yếu tố hạt nhân tăng cường chuỗi nhẹ kappa của

các tế bào B)
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng

43

NMR

44

OD

45

OECD

46

PAR

Paracetamol

47

PS

Phosphatidylserine

48

RNA


Ribonucleic acid

49

ROS

Reactive oxygen species (Các gốc ôxy phản ứng )

50

SRB

Sulforhodamine B

51

TGF

52

TLC

Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

53

TNF-

Tumor necrosis factor anpha (Yếu tố hoại tử khối u


54

α-SMA

α-Smooth muscle actin (Sợi alpha actin cơ trơn)

hưởng từ hạt nhân)
Optical density (Mật độ quang học)
Organisation for Economic Cooperation and
Development (Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế )

Transforming growth factor (Yếu tố chuyển dạng tăng
trưởng)

anpha)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
Tên bảng
Trang
Bảng 2.1. Cách tính thể tích dung dịch cao chiết HHM cho chuột uống ....... 43
Bảng 2.2. Cách tính thể tích cao chiết, silymarin cho chuột nhắt trắng ......... 49
Bảng 2.3. Các chỉ tiêu huyết học bình thường trên chuột cống trắng ............ 53
Bảng 2.4. Chỉ số xét nghiệm sinh hóa bình thường chuột cống trắng ............ 53
Bảng 2.5. Đánh giá xơ hóa gan theo các thang điểm khác nhau .................... 54
Bảng 3.1. Hiệu suất chiết xuất cao chiết An xoa ............................................ 57
Bảng 3.2. Tên khoa học các hợp chất phân lập từ cây An xoa ....................... 61
Bảng 3.3. Khả năng gây độc tế bào ung thư gan HepG2 in vitro của một số

hợp chất phân lập từ cây An xoa ..................................................................... 62
Bảng 3.4. Tỉ lệ tế bào apoptosis ...................................................................... 63
Bảng 3.5. Trọng lượng cơ thể và gan các lơ chuột thử độc tính cấp (n=5) .... 65
Bảng 3.6. Chỉ số ure và creatinin ở các nhóm nghiên cứu ............................. 66
Bảng 3.7. Sự thay đổi một số chỉ số huyết học ở các nhóm nghiên cứu ........ 67
Bảng 3.8. Sự thay đổi enzym gan ở các nhóm nghiên cứu ............................. 68
Bảng 3.9. Hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro của HHM và HHW thơng qua
trung hịa gốc tự do của DPPH........................................................................ 70
Bảng 3.10. Hoạt tính chống oxy hóa trên in vitro của HHM và HHW thơng
qua ức chế q trình peroxy hố lipid màng tế bào ........................................ 71
Bảng 3.11. Tỉ lệ tế bào HepG2 sống dưới tác động bảo vệ của HHM và HHW
trên in vitro ...................................................................................................... 71
Bảng 3.12. Sự thay đổi hoạt độ enzym gan các lơ chuột trên mơ hình gây tổn
thương gan bằng paracetamol ......................................................................... 72
Bảng 3.13. Một số chỉ tiêu huyết học sau khi gây xơ gan .............................. 74
Bảng 3.14. Hoạt độ một số enzym gan sau nghiên cứu .................................. 75
Bảng 3.15. Nồng độ protein và bilirubin toàn phần sau nghiên cứu .............. 77
Bảng 3.16. Hoạt độ enzym gan sau gây xơ gan .............................................. 85


Bảng
Tên bảng
Trang
Bảng 3.17. Hoạt độ enzym gan sau 12 tuần điều trị ....................................... 86
Bảng 3.18. Nồng độ protein, bilirubin toàn phần trong máu sau 12 tuần điều
trị ..................................................................................................................... 87
Bảng 3.19. Tỉ lệ diện tích collagen trên tiêu bản nhuộm 3 màu Masson........ 91


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ

Tên biểu đồ

Trang

Biểu đồ 3.1. Sự thay đổi trọng lượng chuột ở các nhóm nghiên cứu (n=10) . 66
Biểu đồ 3.2. Sự thay đổi trọng lượng chuột trong thời gian nghiên cứu ........ 74
Biểu đồ 3.3. Sự thay đổi hoạt độ AST trong thời gian nghiên cứu ................ 76
Biểu đồ 3.4. Sự thay đổi hoạt độ ALT trong thời gian nghiên cứu ................ 76
Biểu đồ 3.5. Sự thay đổi hoạt độ GGT trong thời gian nghiên cứu ................ 77
Biểu đồ 3.6. Mức độ xơ gan của chuột từng lô ............................................... 78
Biểu đồ 3.7. Sự thay đổi trọng lượng trong thời gian nghiên cứu .................. 82
Biểu đồ 3.8. Sự thay đổi HST các lô chuột ..................................................... 83
Biểu đồ 3.9. Sự thay đổi tiểu cầu giữa các lô chuột........................................ 84
Biểu đồ 3.10. Sự thay đổi số lượng bạch cầu.................................................. 84
Biểu đồ 3.11. Sự thay đổi AST các lô chuột điều trị ...................................... 86
Biểu đồ 3.12. Sự thay đổi ALT các lô chuột điều trị ...................................... 87
Biểu đồ 3.13. Kết quả mô bệnh học gan các lô chuột điều trị ........................ 89


DANH MỤC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1. Helicteres hirsuta Lour. (thu hái tại Thừa Thiên Huế) ..................... 5
Hình 1.2. Giai đoạn tiến triển bệnh gan .......................................................... 10

Hình 1.3. Cơ chế gây viêm gan ....................................................................... 12
Hình 1.4. Cơ chế gây xơ gan ........................................................................... 15
Hình 1.5. Vai trị gốc oxy hóa trong các bệnh gan ......................................... 18
Hình 1.6. Cơ chế gây tổn thương gan của PAR .............................................. 24
Hình 1.7. Cơ chế tổn thương gan của CCl4..................................................... 27
Hình 2.1. Sơ đồ thiết kế nghiên cứu................................................................ 34
Hình 2.2. Sơ đồ tạo cao chiết với dung mơi nước .......................................... 35
Hình 2.3. Sơ đồ tạo cao chiết với dung mơi methanol.................................... 36
Hình 2.4 Sơ đồ nghiên cứu độc tính cấp cao chiết An xoa ............................. 40
Hình 2.5. Sơ đồ nghiên cứu độc tính bán trường diễn của HHM ................... 42
Hình 2.6. Sơ đồ nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan cấp tính của cao An xoa.... 48
Hình 2.7. Sơ đồ nghiên cứu tác dụng dự phòng xơ gan của cao chiết ........... 49
Hình 2.8. Sơ đồ nghiên cứu tác dụng điều trị xơ gan của cao chiết ............... 51
Hình 2.9. Các bước tính diện tích vùng ảnh bằng phần mền ImageJ ............. 55
Hình 3.1. Sơ đồ tạo cao chiết methanol và các cao chiết phân đoạn .............. 57
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chiết dichloromethan.............. 58
Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ dịch chiết nước ............................. 58
Hình 3.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cao chiết ethyl acetate................... 59
Hình 3.5. Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ H. hirsuta ............. 60
Hình 3.6. Tác động của HH7 đến quá trình apoptosis tế bào Hep-G2 ........... 64
Hình 3.7. Hình ảnh gan chuột sau thử độc tính cấp ...................................... 65
Hình 3.8. Hình ảnh gan chuột trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn .... 69
Hình 3.9. Hình ảnh vi thể gan ở các nhóm nghiên cứu (HE 200X) ............... 69
Hình 3.10. Hình ảnh thận chuột trong nghiên cứu.......................................... 69


Hình

Tên hình


Trang

Hình 3.11. Hình ảnh vi thể thận chuột ở các nhóm nghiên cứu (HE 200X) .. 70
Hình 3.12. Hình ảnh gan chuột gây tổn thương bằng paracetamol ................ 72
Hình 3.13. Ảnh vi thể gan chuột gây độc bằng paracetamol (HE 200X) ....... 73
Hình 3.14. Hình ảnh đại thể gan chuột sau nghiên cứu .................................. 78
Hình 3.15. Hình ảnh mơ bệnh học gan các lô chuột nhuộm HE 100x ........... 79
Hình 3.16. Hình ảnh vi thể gan chuột nhuộm ba màu Masson (100x) ........... 80
Hình 3.17. Hình ảnh đại thể gan chuột các lơ chuột sau điều trị .................... 88
Hình 3.18. Hình ảnh vi thể gan chuột các lơ chuột sau điều trị (HE 100x) .... 90
Hình 3.19. Ảnh vi thể gan chuột nhuộm ba màu Masson (100x) ................... 90
Hình 4.1. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của HH9 ............ 92
Hình 4.2. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của HH11 .......... 93
Hình 4.3. Cấu trúc hóa học của hợp chất HH16 ............................................. 95
Hình 4.4. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của HH20 .......... 96
Hình 4.5. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của HH29 .......... 97
Hình 4.6. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của HH30 .......... 98


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong các bệnh được điều trị bằng thuốc y học cổ truyền, có rất nhiều
phương thuốc điều trị các bệnh liên quan đến gan, cơ quan lớn và đảm nhiệm
nhiều chức năng quan trọng của cơ thể. Hơn nữa, các bệnh gan mạn tính vẫn
là một trong những vấn đề sức khỏe nghiêm trọng nhất trên toàn thế giới.
Theo thống kê của Fei Y. và cộng sự tỉ lệ tử vong do xơ gan đã gia tăng
47,15% vào năm 2022 so với năm 2017 [1]. Ở Mỹ, tỉ lệ tử vong do xơ gan
tăng 65% từ năm 1999-2016, xơ gan là một trong 10 bệnh có tỉ lệ tử vong cao
nhất ở các nước kém và đang phát triển [2], [3]. Quá trình tiến triển của các
bệnh gan có thể có những nguyên nhân gây bệnh khác nhau dấn đến các tổn

thương cho gan, từ viêm gan, đến xơ hóa gan, xơ gan hay cuối cùng là ung
thư gan. Cơ chế hình thành và phát triển các hình thái bệnh lý này các gốc
oxy hóa đóng vai trị quan trọng, góp phần làm trầm trọng thêm tình trạng của
bệnh xơ gan hay ung thư gan.
Điều trị bệnh gan giai đoạn này đầu tiên là điều trị theo nguyên nhân
gây bệnh, điều trị theo cơ chế gây bệnh, và điều trị triệu chứng và biến chứng
nhàm làm châm quá trình tiến triển của bệnh kéo dài thời gian sống cho người
bệnh. Tuy nhiên việc điều trị xơ gan, ung thư gan gạp nhiều khó khăn đặc biệt
khi chưa biết nguyên nhân gây bệnh. Các thuốc tân dược chủ yếu điều trị triệu
chứng và biến chứng của bệnh và đi kèm theo là nhiều tác dụng khơng mịn
muốn. Bên cạnh các phương pháp điều trị theo y học hiện đại, cũng có nhiều
bài thuốc phương thuốc dân gian giúp hỗ trợ và điều trị xơ gan, viêm gan với
ưu điểm có thể dùng thuốc trong thời gian dài và ít tác dụng khơng mong
muốn phù hợp với tình trạng bệnh lý mạn tính của xơ gan hay ung thư gan.
Trong các dược liệu sử dụng điều trị bệnh gan, loài An xoa (Helicteres
hirsuta Lour.) cũng đã thường xuyên được sử dụng trong các bài thuốc hỗ trợ
điều trị các bệnh về gan, ung thư gan, phổi, tiền liệt tuyến [4], [5]. Đã có một


2
số nghiên cứu về thành phần hóa học của dược liệu An xoa, các nghiên cứu
đã tách chiết được một số hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa và bảo vệ tế
bào gan, và chống sự phát triển tế bào ung thư như (±)-pinoresinol, 3bbenzoylbetulinic acid, betulinic acid, lupeol, 4-hydroxybenzoic acid,
soscutellarein, protosta-17(20),24-dien-3β-ol có tác dụng gây độc cho nhiều
dịng tế bào ung thư [6], [7], [5]. Các nghiên cứu bước đầu cho thấy hiệu quả
bảo vệ tế bào gan trên thực nghiệm của cây An xoa [8], [9], [10]. Trên thế
giới và ở Việt Nam các nghiên cứu tác dụng dược lý của lồi này cịn rất hạn
chế và chưa tồn diện. Vậy cây An xoa có độc hay khơng? Cây có tác dụng
điều trị và dự phịng các bệnh về gan hay khơng? Các hoạt chất chính có tác
dụng dược lý trong cây là gì? Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học của việc

có nên tiếp tục sử dụng loại dược liệu này để dự phòng điều trị các bệnh về
gan hay không, và định hướng khai thác, sử dụng và sản xuất dược liệu này.
Vì vậy đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính và một số tác dụng
sinh học của cây An xoa (Helicteres hirsuta Lour.)” thực hiện nhằm ba mục
tiêu:
1. Xác định một số thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào
ung thư gan của một số hợp chất phân lập từ cây An xoa
2. Đánh giá tính độc tính cấp và bán trường diễn của cao chiết cây
An xoa
3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan của cao chiết cây
An xoa


3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về chi Helicteres
1.1.1. Phân loại
Chi Helicteres (Thâu kén ) thuộc Họ Sterculiaceae (họ Trôm ), bộ
Malvales (Bông ), lớp Magnoliopsida (Mộc lan ), ngành Magnoliophyta (Mộc
lan ). Họ Sterculiaceae bao gồm khoảng 70 chi, với tổng cộng khoảng 1.500
loài cây thân gỗ và cây bụi khu vực nhiệt đới.
Chi Helicteres gồm khoảng 60 loài ở vùng nhiệt đới của Châu Á và
Châu Mỹ [11]. Ở Việt Nam qua thống kê tác giả Phạm Hồng Hộ cho thấy có
7 lồi và 2 thứ lồi, trong đó 6 lồi được ghi nhận làm thuốc [12]:
1. Tổ kén đực (Helicteres angustifolia L.)
1a. Dó mốc (Helicteres angustifolia var. glaucoides Pierre)
1b. Ồ kén hẹp (Helicteres angustifolia var. obtusa (Wall. Ex Kurz)
Pierre)
2. Ổ kén không lông (Helicteres glabriuscula Wall.)
3. An xoa (Thâu kén cái) (Helicteres hirsuta Lour.)

4. Dó tròn (Helicteres isora L.)
5. Thâu kén thon (Helicteres lanceolata DC.)
6. Dó trỉn (Helicteres viscida Blume)
7. Dó thường (Helicteres plebeja Kurz.)
Trong các lồi trên có 03 lồi gồm: H. angustifolia L., H. hirsuta L., H.
isora L., thường xuyên được dùng y học cổ truyền làm thuốc chữa các bệnh
tăng đường huyết, viêm gan, viêm loét dạ dày, sốt rét, cảm mạo, tiêu chảy…
Trong đó có nhiều nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng dược lý của
H. angustifolia L., H. isora L.,. Nhưng còn đối với H. hirsuta L., mặc dù
được sử dụng nhiều để điều trị các bệnh về gan, tuy nhiên có rất ít các nghiên
cứu đánh giá tác dụng đối với các bệnh gan của loài này.


4

1.1.2. Thành phần hóa học và tác dụng sinh học của chi Helicteres L.
Các nghiên cứu trong nước và quốc tế đã tách chiết được 166 hợp chất
từ các loài thuộc chi Helicteres. Các hợp chất chủ yếu gồm: 53 terpenoid, 28
flavonoid, 21 lignoid, 19 phenolic, 11 quinone, 9 steriod, và các hợp chất
khác: amin, saponin, lacton, coumarin, rượu, acid béo, ancaloid, pheophytin
và tannin. Các hợp chất tách chiết từ chi Helicteres được chứng minh có tác
dụng chống oxy hóa, ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào gây ung thư,
tác dụng chống viêm, chống xơ gan, và bảo vệ gan, chống đái tháo đường và
tác dụng ức chế virus, vi khuẩn [11], [13], [5], [14]. Danh sách các hợp chất
tách chiết từ chi này vẫn tiếp tục gia tăng trong những nghiên cứu đã, đang và
sẽ thực hiện trong tương lai.
Tác dụng sinh học của chi Helicteres cũng đã được chứng minh qua
nhiều nghiên cứu. Trong đó đáng lưu ý có hai lồi: H. isora và H.
angustifolia, có lịch sử sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền Trung Quốc, Ấn
Độ và đây cũng là hai đại diện được nghiên cứu nhiều nhất của chi

Helicteres. Các nghiên cứu đã cho thấy tác dụng: chống oxy hoá, chống viêm,
giảm đau, chống đái tháo đường, chống khối u, ung thư, bảo vệ gan chống đái
tháo đường và kháng khuẩn, virus, ký sinh trùng… của các loài thuộc
chi Helicteres [11]. Các tác dụng này phù hợp với các tác dụng của các nhóm
hợp chất đã được phân lập như đã nêu ở trên.
1.2. Tổng quan cây An xoa (Helicteres hirsuta L.)
Trong 03 loài thuộc chi Helicteres thường được dùng làm thuốc có ở
Việt Nam, lồi Helicteres hirsuta L. (An xoa) thường được dùng trong các bài
thuốc dân gian chữa các bệnh về gan, ung thư gan, phổi, tiền liệt tuyến [4],
[5], [15]. Tuy nhiên các nghiên cứu tác dụng dược lý của lồi này cịn rất hạn
chế cả trong nước và trên thế giới.
1.2.1. Nhận dạng thực vật
Tên thường gọi: An xoa, Thâu kén cái, Dó lơng, Tổ kén lông.


5

Hình 1.1. Helicteres hirsuta Lour. (thu hái tại Thừa Thiên Huế)
* Nguồn: tác giả chụp tại Thừa Thiên Huế (2019)

Mô tả: Cây thân thảo, sống lâu năm. Lá đơn, mọc cách, hình bầu dục
rộng, kích thước 9,5-14 x 5-10 cm, chóp nhọn đến trịn, mép có răng cưa khơng
đều, ngun, gốc nhọn đến tròn, gân gốc 5 nổi rõ ở cả 2 mặt của lá, gân bên 4-5
đôi, cuống lá dài 0,75-2,5 cm, có lơng, cả 2 mặt phủ lơng hình sao. Hoa mọc
thành chùm ở nách lá, thường mang ít hoa. Nụ hình trứng, có lơng hình sao bao
phủ, hoa lưỡng tính. Cuống hoa dài 2-3 mm, gốc có một lá bắc tiêu giảm. Đài
màu tía xanh, dài khoảng 1,3-1,8 cm, hợp thành hình ống, mang 5 thùy, phủ
lơng hình sao. Cánh hoa 5, rời, màu đỏ hoặc đỏ tía, có hình thìa, có 1 tai ở bên
cạnh, cánh khơng đều có 2 cánh lớn hơn các cánh khác. Cột nhị nhụy dài 1,5-2
cm, không lông. Nhị hữu thụ 10, nhị lép 5, chỉ nhị phần tự do ngắn khoảng 2,53 mm, khơng lơng; bao phấn 2 ơ, đính lưng, khi chín nứt theo chiều dọc. Bầu

thượng, hình bầu dục hẹp, có lơng, 5 ơ; mỗi ơ có 22-26 nỗn; vịi nhụy hình
trụ; núm nhụy dạng điểm. Quả nang, khơng xoắn, hình trụ thn dài, kích
thước 3-4,5 x 1-1,5 cm, chóp nhọn, phủ dày lơng hình sao mềm. Hạt nhiều,
hình lăng trụ, trơn trên bề mặt, kích thước 2-2,5 x 1-1,5 mm [16].
Sinh học và sinh thái: Ra hoa gần như quanh năm. Mọc phổ biến ở rừng
thưa, ven rừng, các bãi hoang, đồi savan, ở độ cao từ thấp đến 1500 m [16].
Phân bố: ở Việt Nam cây mọc phổ biến từ Bắc vào Nam. Cịn có ở Ấn
Độ, Myanmar, Trung Quốc (Vân Nam, Quảng Tây, Hải Nam), Lào,
Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippin [16].


6

1.2.2. Thành phần hóa học của cây An xoa
Các nghiên cứu hiện nay trên thế giới và trong nước chủ yếu tập trung
vào tách chiết phân lập các hợp chất hố học trong lồi này, chưa có nhiều
đánh giá tác dụng dược lý của An xoa trên thực nghiệm. Kết quả từ nghiên
cứu đã phân lập được 28 hợp chất từ cây An xoa trong đó gồm:
Tám hợp chất terpenoid bao gồm: Lup-20(29)-em-3β-ol, betulinic acid,
3β-benzoyl betulinic acid, betulinic acid methyl ester, 3β-acetoxybetulinic
acid, simiarenol AP, lupeol và lupeolactone [4], [13], [17], [18].
Ba steriod gồm: Stigmasterol, protosta-17(20) và 24-dien-3beta-ol, βstigmasterol [5], [17].
Bốn

flavonoid

methylisoscutellarein,

gồm:


7-O-methylisoscutellarein,

7,4’-di-O-

4’-methyl

8-O-β-D-

isoscutellarein

ether

glucopyranoside, 5,8-dihydroxy-7,4’-dimethoxyflavone [17], [18], [19], [20].
Bốn phenolic gồm: 4-hydroxybenzoic acid, 3,4-dihydroxybenzoic acid
methyl ester và 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid, methyl caffeate [17].
Sáu lignoid bao gồm: (+)-pinoresinol, (+/-)-medioresinol, (+/-)syringaresinol,

(-)-boehmenan,

(-)-boehmenan

H

và

(7S,8R)-

dihydrodehydrodiconiferyl alcohol [6], [20].
Ba hợp chất khác gồm 4-4’-sulfinylbis(2-(tert-butyl)-5-methylphenol,
icosanoic acid và acid alpha-truxillic [5], [18], [19], [21].

Các nghiên cứu tách chiết hoạt chất cịn chưa hồn tồn có định hướng
theo tác dụng sinh học chống oxy hóa, bảo vệ gan. Hiện nay loài An xoa vẫn
tiếp tục được các nhà khoa học nghiên cứu, hướng tới tìm ra các hoạt chất có
tác dụng dược lý tốt để phục vụ cho cơng tác điều trị, dự phịng bệnh tật. Do
vậy danh mục các hợp chất trên sẽ vẫn tiếp tục được bổ sung trong tương lai.
1.2.3. Tác dụng sinh học của cây An xoa
Song song với phân lập các hợp chất từ cây An xoa, các nghiên cứu
cũng chứng minh tác dụng của các hợp chất phân lập được cũng như cao chiết


7
từ lồi này với các dung mơi và các phân đoạn khác nhau. Các nghiên cứu cao
chiết từ các bộ phận trên mặt đất của H. hirsuta đã được thực hiện để chứng
minh cơ chế hoạt động chống viêm của chúng thông qua ức chế COX1 và
COX2 (Enzym cyclooxygenase-1 và Enzym cyclooxygenase-2) in vitro [19].
Vì vậy các lồi trong chi này có tiềm năng sử dụng trong giúp giảm đau và
chống viêm.
Năm 2005 Young W. C. và cộng sự nghiên cứu các chất tách chiết từ
H. hirsuta được lấy ở Indonesia, nhóm nghiên cứu đã tách chiết được 6 hợp
chất, trong đó (±)-pinoresinol có tác dụng gây độc cho tế bào ung thư [6].
Nghiên cứu khác của Phạm Hồng Ngọc Thủy và cộng sự cao chiết từ lá
và thân cây H. hirsuta ở Việt Nam bằng cả 2 loại dung mơi nước và butanol
đều có hoạt tính chống lại sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư trên in
vitro (MIA PaCa-2 (tế bào ung thư tuyến tụy); A2780 (tế bào ung thư buồng
trứng); H460 (tế bào ung thư phổi); A431 (tế bào ung thư da); Du145 (tế bào
ung thư tuyến tiền liệt); HT29 (tế bào ung thư ruột); MCF-7 (tế bào ung thư
vú); SJ-G2, U87, SMA (tế bào u não) và BE2-C (tế bào u nguyên bào thần
kinh) ở liều thấp (GI50 0,36–11,17 µg/ml) [22]. Kết quả tương tự trong
nghiên cứu Nguyễn Hữu Duyên và Lê Thanh Phước phân đoạn cao petroleum
ether, dichloromethane của H.hirsuta có biểu hiện hoạt tính gây độc với dịng

tế bào HepG2 (ung thư gan) [4]. Năm 2018 nghiên cứu các hoạt chất sinh học
có trong H.hirsuta thu hái ở Việt Nam nhóm tác giả cũng cho thấy tác dụng
chống tại 5 dòng tế bào ung thư (Hela, HepG2, SK-LU-1, AGS và SK-MEL2) với hoạt độ mức trung bình [17]. Đây là tiền đề cho nghiên cứu và ứng
dụng loại dược liệu này trong điều trị các bệnh mạn tính, đặc biệt ung thư, để
xây dựng nên những phương pháp điều trị mới an toàn, hiệu quả.
Cao chiết phân đoạn ethyl acetate từ rễ cây H.hirsuta có hàm lượng
phenolic và flavonoid cao và khả năng chống oxy hóa mạnh [10]. Các chất
chống oxy hóa có thể làm giảm tác hại của các gốc oxy tự do liên quan đến


8
các bệnh như ung thư, bệnh gan, bệnh tim mạch, đục thủy tinh thể, xơ vữa
động mạch, tiểu đường, viêm khớp, các bệnh suy giảm miễn dịch và lão hóa.
Một tác dụng dược lý khác của loài này cũng được đánh giá qua nghiên cứu
của Thùy Dung và cộng sự cho thấy cao chiết phân đoạn ethyl acetate từ rễ
cây H.hirsuta thể hiện khả năng kháng khuẩn Gr+ (Staphylococcus aureus và
Lactobacillus fermentum.) [10].
Qua các nghiên cứu cho thấy H. hirsuta thể hiện các tác dụng chống
viêm, chống sự phát triển của tế bào ung thư trong đó có cả các tế bào ung thư
gan, chống các gốc oxy hóa, kháng khuẩn và virus. Tuy nhiên các nghiên cứu
chủ yếu đành giá hoạt tính trên in vitro, để hướng tới việc sử dụng dược liệu
cho người cần có thêm nhiều nghiên cứu tác dụng dược lý trên in vivo, từ đó
cung cấp dữ liệu khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về dược liệu này.
1.2.4. Công dụng của cây An xoa
Cây dùng làm thuốc chữa ung nhọt. Rễ làm thuốc dịu đau, tiêu độc, kiết
lỵ, cảm cúm, đậu, sởi, sốt rét và rắn độc cắn. Lá dùng ngoài chữa ung nhọt
sưng lở [16].
Hiện nay, trong dân gian loài An xoa được sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp
với các vị thuốc khác như cà gai leo, mật nhân, bán chi liên, xạ đen trong các
bài thuốc chữa, hoặc hỗ trợ điều trị các bệnh về gan, đặc biệt các bệnh gan

mạn tính như viêm gan mạn tính, xơ gan, ung thư gan.
Dùng độc vị An xoa cho bệnh nhân ung thư gan: An xoa 100 g. Sắc với
1,5 lít nước, sắc còn 800 ml uống trong ngày.
Dùng cây An xoa kết hợp với cây xạ đen để hỗ trợ điều trị bệnh ung
thư: An xoa: 50 g, Xạ đen: 50 g. Hai vị trên sắc với 1,5 lít nước, sắc cạn cịn
0,8 lít đến 1 lít nước uống trong ngày.
Cách sử dụng Cây An xoa điều trị xơ gan, u gan giai đoạn đầu: 50 g Xạ
đen, 50 g Cà gai leo, 50 g An xoa. Nấu lần đầu cùng với 2 lít nước, mở lửa
nhỏ đến khi nước rút cịn 1 lít nước.


9

Dùng cây An xoa cho viêm gan B: An xoa: 30 g, Cà gai leo: 30 g. Hai
vị trên sắc với 1 lít nước, sắc cạn cịn 500 ml nước uống trong ngày.
Tuy nhiên chưa có nghiên cứu khoa học nào thống kê hay báo cáo hiệu
quả sử dụng của các bài thuốc đó trên thực tế. Trong nghiên cứu này chúng
tôi tiến hành phân lập một số hợp chất từ cây An xoa, đồng thời đánh giá hiệu
quả điều trị và dự phòng xơ gan của các cao chiết An xoa với các dung môi
khác nhau. Bước đầu cung cấp những bằng chứng về tác dụng dược lý của
loài này trên thực nghiệm, và định hướng cho các nghiên cứu trong tương lai.
1.3. Bệnh lý viêm gan, xơ gan
1.3.1. Tổng quan các giai đoạn phát triển tổn thương gan
Gan là tạng đặc lớn nhất trong cơ thể, nằm ở hạ sườn phải, dưới lồng
ngực. Gan đảm nhiệm nhiều chức năng quan trọng của cơ thể, gan là nơi diễn
ra q trình chuyển hố chính của cơ thể, các q trình chuyển hố protid,
glucid, lipid đều diễn ra ở gan, chuyển đổi sản phẩm hấp thu từ ruột thành các
chất cần thiết cho cơ thể. Gan là nơi sản xuất và bài tiết dịch mật trong đó
chứa các enzym quan trọng trong q trình hấp thu và chuyển hố lipid. Các
q trình chuyển hố cố định và thải trừ các chất độc đa phần diễn ra tại gan.

Gan tham gia tổng hợp các yếu tố của q trình đơng máu và chống đông
máu. Gan là nơi dự trữ nhiều loại vitamin và khoáng chất như sắt, vitamin A,
D, E, K, B12 của cơ thể [23].
Gan là cơ quan chuyển hóa quan trọng nhất trong cơ thể, là cửa ngõ
phơi nhiễm với các tác nhân gây tổn thương cả trong và ngồi cơ thể. Vì vậy
có nhiều ngun nhân khác nhau có thể làm tổn thương gan. Có thể chia làm
2 nhóm ngun nhân chính gây tổn thương gan bao gồm [24]:
Các yếu tố bên ngoài: do các vi sinh vật như virus ( virus HAV, HBV,
HCV, HDV, HEV và HGV), vi khuẩn (E. Coli và trực khuẩn lao) và ký sinh
trùng (Ký sinh trùng sốt rét, sán lá gan, giun). Do nhiễm độc các kiem loại
nặng như chì, thủy ngân, đồng; hoặc nhiễm độc các yếu tố khác như rượu,


10
aflatoxin, chloroform, cacbon tetrachlorid, và một số thuốc làm tổn thương
gan nhu paracetamol, thuốc điều trị lao, thuốc kháng sinh...[24]
Các yếu tố bên trong: ứ mật do tắc đường mật, chèn ép dường mật; ứ
trệ tuần hoàn do khối u chèn ép, suy tim. Bệnh gan do rối loạn chuyển hóa sắt,
đồng; thiếu các chất hướng mỡ (methionin, cholin), thiếu hụt Glucose 6phosphatase [24].
Quá trình tổn thương gan diễn biến qua nhiều giai đoạn khác nhau. Đầu
tiên là giai đoạn viêm gan kết thúc thường là xơ gan và ung thư gan.

Hình 1.2. Giai đoạn tiến triển bệnh gan
*Nguồn: theo Rodrigo C. và cộng sự (2019) [25]

Viêm gan: là phản ứng tự nhiên của cơ thể đối với tác tác nhân gây tổn
thương gan, là một phần quan trọng của quá trình chữa lành các tổn thương
gan. Các tế bào viêm và tế bào gan bị tổn thương sẽ tạo nên các tín hiệu để
kích hoạt các tế bào tham gia vào quá trình viêm: đại thực bào, tế bào Kuffer,
tế bào hình sao…[26]. Các tế bào này giải phóng collagen làm xơ cứng quanh

các tế bào bị tổn thương, khoanh vùng bị tổn thương, ngăn không cho các tổn
thương lan rộng, giúp bảo vệ các vùng tế bào bình thường. Khi q trình hồn
tất trong trường hợp tổn thương nhẹ, và thường là cấp tính lượng collagen này
có thể được phân giải và gan trở lại bình thường.