BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO TRUNG ĐẠT

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
LAMIVUDIN VÀ ZIDOVUDINE
TRONG VIÊN NÉN BẰNG QUANG
PHỔ ĐẠO HÀM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2023


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO TRUNG ĐẠT
MÃ SINH VIÊN: 1801102

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
LAMIVUDIN VÀ ZIDOVUDINE
TRONG VIÊN NÉN BẰNG QUANG
PHỔ ĐẠO HÀM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. PGS.TS Vũ Đặng Hồng
2. ThS. Phí Thị Tuyết Nhung
Nơi thực hiện:
Khoa Hóa phân tích và Kiểm nghiệm thuốc
Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2023


LỜI CẢM ƠN
Khoá luận này được thực hiện tại Khoa Hóa phân tích và Kiểm nghiệm thuốc trường
Đại học Dược Hà Nội.
Với lịng biết ơn và kính trọng sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Vũ Đặng
Hoàng – Giảng viên Khoa Hóa phân tích và Kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược
Hà Nội đã dành nhiều thời gian, cơng sức, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong q trình
nghiên cứu và hồn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn ThS. Phí Thị Tuyết Nhung – Giảng viên Kiểm Nghiệm
thuốc và Hóa dược – Khoa Dược Đại học Thành Đô đã dành nhiều thời gian hướng dẫn,
tận tình giúp đỡ, động viên em trong q trình thực hiện khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh/chị kỹ thuật viên tại Khoa Hóa phân
tích và Kiểm nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình chỉ bảo và tạo
những điều kiện tốt nhất để em có thể hồn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, các phòng ban, các thầy cơ và tồn thể
cán bộ cơng nhân viên Trường Đại học Dược Hà Nội đã trực tiếp giảng dạy và giúp đỡ em
trong suốt quá trình học tập và hoạt động tại trường.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới người thân, bạn bè đã luôn động viên và khuyến
khích em trong q trình học tập cũng như thời gian em thực hiện đề tài này.
Hà Nội, ngày tháng 06 năm 2023
Sinh viên

Đào Trung Đạt


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................................

MỤC LỤC............................................................................................................................i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................... iii
DANH MỤC BẢNG ..........................................................................................................iv
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................................. v
ĐẶT VẤN ĐỀ ..................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................. 2
1.1. Đại cương về quang phổ đạo hàm ............................................................................ 2
1.2. Ứng dụng của quang phổ đạo hàm trong định lượng hỗn hợp hai thành phần......... 5
1.2.1.Phương pháp đạo hàm giao điểm không (zero-crossing derivative
spectrophotometry) ...................................................................................................... 6
1.2.2.Phương pháp đạo hàm phổ tỷ đối (Ratio spectra derivative spectrophotometry 6
1.3. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu .............................................................. 8
1.3.1. Đặc tính lý hóa của Lamivudin và Zidouvudin ................................................. 8
1.3.2. Ứng dụng lamivudin và zidovudin trong điều trị HIV ...................................... 9
1.3.3. Phương pháp định lượng đồng thời Lamivudin và Zidovudin .......................... 9
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 13
2.1. Đối tượng – nguyên liệu thiết bị ............................................................................. 13
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu: ..................................................................................... 13
2.1.2. Nguyên liệu và thiết bị ..................................................................................... 13
2.2 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 14
2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời 3TC và AZT trong
hỗn hợp bằng các phương pháp quang phổ đạo hàm................................................. 14
2.2.2. Ứng dụng các phương pháp đã thẩm định để định lượng đồng thời và thử độ
hòa tan của 3TC và AZT trong chế phẩm viên nén ................................................... 14
2.2.3. Xử lý số liệu ..................................................................................................... 14
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................................... 16
3.1. Kết quả thực nghiệm .............................................................................................. 16
3.1.1. Định lượng chế phẩm 2 thành phần chứa Lamivudin và Zidovudin ............... 16
3.1.2. Thử độ hòa tan ................................................................................................. 31
i



3.2. Bàn luận .................................................................................................................. 33
KẾT LUẬN ....................................................................................................................... 35
KIẾN NGHỊ ...................................................................................................................... 36

ii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
A

Độ hấp thụ

AZT

Zidovudin

3TC

Lamivudin

ARV

Thuốc kháng virus (Antiretroviral drug)

C

Nồng độ (Concentration)


CTPT

Công thức phân tử

KLPT

Khối lượng phân tử

CTHH

Công thức hóa học

SKĐ

Số đăng ký

NSX

Ngày sản xuất

HD

Hạn dùng

UV

Tử ngoại (Ultra Violet)

UV-Vis


Tử ngoại - Khả kiến (Ultra Violet - Visible)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography)

SD

Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

TLTK

Tài liệu tham khảo

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Một số đặc tính lý hóa của Lamivudin và Zidovudin ......................................... 8
Bảng 1.2: Một số phương pháp HPLC để định lượng đồng thời lamivudin và zidovudin
trong hỗn hợp hai thành phần . ............................................................................................ 9
Bảng 1.3: Một số phương pháp quang phổ đạo hàm để định lượng đồng thời lamivudin và
zidovudin trong hỗn hợp hai thành phần ........................................................................... 11
Bảng 3. 1. Khối lượng cân nồng độ thực tế chuẩn gốc ..................................................... 16
Bảng 3. 2: Khối lượng cân viên nén Lamzidivir ............................................................... 16
Bảng 3. 3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính ................................................................. 24

Bảng 3.4: Khối lượng cân thực tế mẫu thử định lượng ..................................................... 25
Bảng 3.5: Kết quả định lượng Lamivudin trong viên nén Lamzidivir bằng quang phổ đạo
hàm bậc 1 giao điểm không. .............................................................................................. 26
Bảng 3.6: Kết quả định lượng Zidovudin trong viên nén Lamzidivir bằng quang phổ đạo
hàm bậc 1 giao điểm không. .............................................................................................. 27
Bảng 3.7: Kết quả định lượng Lamivudin trong viên nén Lamzidivir bằng quang phổ đạo
hàm bậc 1 tỷ đối. ................................................................................................................ 28
Bảng 3.8: Kết quả định lượng Zidovudin trong viên nén Lamzidivir bằng quang phổ đạo
hàm bậc 1 tỷ đối ................................................................................................................. 28
Bảng 3.9: Khối lượng cân của các mẫu thẩm định độ đúng .............................................. 29
Bảng 3.10: Độ đúng của các phương pháp định lượng ..................................................... 30
Bảng 3. 11: Kết quả thử độ hòa tan của Lamivudin và Zidovudin trong viên nén
Lamzidivir bằng phương pháp đạo hàm bậc nhất giao điểm không sau 30 phút. ............. 32

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Tiếp tuyến với đường cong tại một số điểm ....................................................... 2
Hình 1.2: Phổ hấp thụ và đạo hàm của dải phổ tuân theo định luật phân bố Gauss ............ 4
Hình 1.3: Ảnh hưởng của tán xạ ánh sáng lên phổ hấp thụ và phổ đạo hàm bậc 1 ............ 5
Hình 1.5: Đạo hàm bậc 1 của lamivudin (1) 15µg/ml; (2) 20 µg/ml; (3) 30 µg/ml (đường
nét liền) và zidovudin (1) 30 µg/ml; (2) 50 µg/ml; (3) 75 µg/ml (đường nét đứt) trong
methanol. Mũi tên chỉ bước sóng định lượng ...................................................................... 6
Hình 1.6: (a) Phổ tỷ đối của acetaminophen tại các nồng độ (a) 5,0 µg/ml, (b) 17,5
µg/ml, (c) 25,0 µg/ml, (d) 37,5 µg/ml, (e) 50,0 µg/ml khi nồng độ của số chia
(mephenoxalon) là 12,5 µg/ml trong methanol (Δλ = 4 nm). (b) Phổ đạo hàm tỷ đối bậc 1
của acetaminophen tại các nồng độ (a) 5,0 µg/ml, (b) 17,5 µg/ml, (c) 25,0 µg/ml, (d)
37,5µg/ml, (e) 50,0 µg/ml khi nồng độ của số chia (mephenoxalon) là 12,5 µg/ml trong
methanol (Δλ = 4 nm). ......................................................................................................... 7

Hình 3.1: Phổ hấp thụ của dung dịch 3TC 10 mg/L, AZT 20 mg/L, hỗn hợp 3TC10 mg/L
và AZT 20 mg/L, chế phẩm (3TC 10 mg/L và AZT 20 mg/L) và phổ cộng của 3TC 10
mg/L và AZT 20 mg/L ....................................................................................................... 17
Hình 3.2: Phổ đạo hàm bậc nhất của dãy dung dịch 3TC (4 – 14 mg/L) và AZT (8– 28
mg/L) và dung dịch thử 1................................................................................................... 19
Hình 3.3: Phổ đạo hàm tỷ đối của hỗn hợp 3TC10 mg/L + AZT 20 mg/L;3TC 10 mg/L
với số chia AZT 8 mg/L, AZT 12 mg/L, AZT 16 mg/L , AZT 20 mg/L. .......................... 20
Hình 3.4: Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn gồm AZT 20 mg/L + 3TC (4 – 14
mg/L) với số chia AZT 20 mg/L và chế phẩm. .................................................................. 21
Hình 3.5: Phổ đạo hàm tỷ đối của hỗn hợp 3TC 10 mg/L + AZT 20 mg/L; AZT 20 mg/L
với số chia 3TC 4 mg/L, 3TC 6 mg/L, 3 TC 8 mg/L và 3 TC 10 mg/L. .......................... 22
Hình 3.6: Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn gồm 3TC 10 mg/L + AZT (8 – 28
mg/L) với số chia 3TC 10 mg/L và chế phẩm. .................................................................. 23

v


ĐẶT VẤN ĐỀ
HIV/AIDS là căn bệnh nguy hiểm và có chiều hướng gia tăng ở nước ta. Số ca nhiễm
HIV/AIDS tại Việt Nam từ năm 2020 có xu hướng gia tăng, với hơn 13.000 trường hợp
nhiễm HIV mới mỗi năm, tăng hơn 3.000 trường hợp/năm so với giai đoạn 2017-2019.Tại
Việt Nam, theo Cục Phòng, chống HIV/AIDS, số người nhiễm HIV hiện đang còn sống
được báo cáo đến thời điểm 30/9/2021 là 212.769 trường hợp [4].
Hiện nay, các thuốc ức chế enzyme sao chép ngược nucleotid (NRTIs - Nucleotide
Reverse Transcriptase Inhibitors) được sử dụng phổ biến để điều trị HIV, ví dụ: abacavir,
didanosin, emtricitabin, lamivudin, stavudin và tenofovir [18]. Theo hướng dẫn điều trị
HIV/AIDS đầu tiên được ban hành năm 2002, tổ chức y tế thế giới (WHO) khuyến cáo sử
dụng phác đồ phồi hợp sử dụng phác đồ phồi hợp có 2 thuốc thuộc nhóm NRTIs.
Lamivudin (3-TC) và Zidovudin (AZT) là 2 thuốc thuộc nhóm NRTIs được sử dụng hàng
đầu điều trị HIV/AIDS (phác đồ chính và các phác đồ thay thế) [2]. Viên nén kết hợp 3TC

và AZT được đã được sử dụng kể từ lần được duyệt tại Hoa Kỳ [21].
Theo quy định của Dược điển Việt Nam V, định lượng và thử độ hòa tan trong viên
nén 3TC - AZT được tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
[3].Tuy nhiên, đây là phương pháp tốn kém dung môi hữu cơ và thời gian khi số lượng
mẫu phân tích nhiều (ví dụ:giám sát chất lượng sản phẩm trong quá trình sản xuất).
Với mong muốn đề xuất phương pháp quang phổ tử ngoại có tính khả thi trong kiểm
tra chất lượng viên nén 3TC - AZT, đặc biệt tại các cơ sở chưa có điều kiện sử dụng máy
sắc ký, chúng tôi tiến hành đề tài: “Định lượng đồng thời lamivudin và zidovudin trong
viên nén bằng quang phổ đạo hàm” với hai mục tiêu chính:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời thời lamivudin
và zidovudin trong hỗn hợp bằng quang phổ đạo hàm
2. Áp dụng phương pháp đã được thẩm định để định lượng và thử độ hòa tan
của lamivudin và zidovudin trong một số chế phẩm viên nén đang lưu hành
trên thị trường.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về quang phổ đạo hàm
Quang phổ đạo hàm là kỹ thuật phân tích được Giese và French giới thiệu lần đầu
tiên vào năm 1955 [9]. Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc sử dụng thuật toán lấy đạo hàm
phổ hấp thụ nhằm thu được nhiều hơn các thơng tin định tính, định lượng đối với các dải
phổ khơng được phân tách hồn tồn. Phép lấy đạo hàm một đường cong hay hàm toán
học của đường cong về bản chất là sự ước lượng độ dốc tại mỗi điểm trên đường cong khảo
sát (Hình 1.1) [8].

Hình 1.1: Tiếp tuyến với đường cong tại một số điểm
Trong phương pháp quang phổ UV-Vis, mối quan hệ giữa khả năng hấp thụ ánh sáng
và nồng độ của một dung dịch được miêu tả qua biểu thức toán học của định luật

Bouguer – Lambert – Beer:
𝐼𝜆
= 𝑒 ─𝐶𝑙𝜀𝜆 = 𝑇𝜆
𝐼0,𝜆
C: nồng độ của chất hấp thụ (mol/l)
l : độ dài quang học (cm)
𝜀𝜆 : hệ số hấp thụ phân tử của chất hấp thụ tại bước sóng 𝜆
Iλ : cường độ của ánh sáng sau khi đi qua chất hấp thụ
I0,λ : cường độ ánh sáng tới (I0,λ không đổi).

2

(1*)


Đạo hàm bậc 1 của (1*):
dI 1
dε
. = ─ Cl
dλ I
dλ

(2*)

Đạo hàm bậc 1 của T tỷ lệ thuận với nồng độ tại mỗi bước sóng. Độ nhạy của phép
đo đặc biệt cao gần các điểm uốn khi giá trị

𝑑𝜀
𝑑𝜆


cực đại.

Đạo hàm bậc 2 của phương trình:
2
d2 I 1
d2 ε
2 2 dε
. = C l ( ) ─ Cl 2
dλ
dλ2 I
dλ

(3*)

Nếu đạo hàm bậc 1 của 𝜀 bằng 0, đạo hàm bậc 2 sẽ tỷ lệ với nồng độ của chất hấp
thụ. Trong trường hợp cịn lại, đạo hàm khơng thể tuyến tính với nồng độ theo phương
trình của hàm số bậc nhất; việc khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và tín hiệu đạo
hàm sẽ trở nên phức tạp. Ngồi ra, tại các bước sóng mà

𝑑2 𝜀
𝑑𝜆2

đạt cực trị, độ nhạy của phép

đo cũng rất cao. Kết quả này cũng đúng cho đạo hàm bậc 3 và bậc 4.
Có thể nhận thấy khi tăng bậc đạo hàm (n) mối tương quan tuyến tính giữa đạo hàm
T và nồng độ C chỉ có được trong các điều kiện đặc biệt. Khác với T, giá trị đạo hàm của
độ hấp thụ quang A (4*) luôn tỷ lệ với C dù n vơ cùng lớn. Chính vì lý do này, trong quang
phổ đạo hàm A thường được dùng nhiều hơn T.
A = log10


I
1
= log10 = Clε
I0
T

(4*)

Đạo hàm bậc 1 của A:
dA
dε
= Cl
dλ
dλ

(5*)

Đạo hàm bậc 2:
d2 A
dλ2

= Cl

d2 ε

(6*)

dλ2


Đạo hàm bậc n:
dn A
dn ε
= Cl n
dλn
dλ
3

(7*)


Hình 1.2 biểu diễn phổ hấp thụ và các phổ đạo hàm tương ứng của một dải phổ tuân
theo định luật phân bố Gauss. Theo tính chất của đạo hàm, ta có thể nhận thấy: Các cực trị
ở đạo hàm bậc n sẽ có giá trị 0 tại đạo hàm bậc (n + 1) còn các điểm uốn ở đạo hàm bậc n
lại trở thành cực trị ở đạo hàm bậc kế tiếp. Do đó, xuất phát từ 1 peak ban đầu sau n lần
đạo hàm sẽ cho n cực trị mới được gọi là cực trị ảo (virtual extrema) hay các vệ tinh
(satellites). Sự xuất hiện của các cực trị ảo và các vệ tinh này sẽ làm tăng khả năng phân
tích phổ hấp thụ ban đầu [12].

Hình 1.2: Phổ hấp thụ và đạo hàm của dải phổ tuân theo định luật phân bố Gauss
Trong đo quang thường gặp các hiện tượng trôi đường nền và tán xạ ánh sáng. Ngun
nhân làm trơi đường nền có thể do trang thiết bị (đèn và detector không ổn định) hoặc thao
tác (đặt lệch cuvet) trong khi đó sự có mặt của các tiểu phân nhỏ trong mẫu gây nên hiện
tượng tán xạ ánh sáng. Một trong những ưu điểm nổi bật của quang phổ đạo hàm là có thể
loại bỏ được hiện tượng trôi nền và giảm ảnh hưởng của tán xạ ánh sáng qua đó cải thiện
độ chính xác của phép định lượng (Hình 1.3) [12].
4


Hình 1.3: Ảnh hưởng của tán xạ ánh sáng lên phổ hấp thụ và phổ đạo hàm bậc 1

Ví dụ trên cho thấy ảnh hưởng của tán xạ ánh sáng lên phổ hấp thụ và phổ đạo hàm
có sự khác nhau rõ rệt. Trong khi tán xạ ánh sáng làm sai lệch biên độ của peak ở phổ hấp
thụ lên tới 10% thì ở phổ đạo hàm biên độ chỉ biến đổi 1%. Khi bậc đạo hàm tăng, cường
độ tín hiệu của các dải phổ rộng sẽ giảm nhiều so với các dải phổ hẹp. Do vậy việc định
lượng các dải phổ hẹp sẽ chính xác hơn.
1.2. Ứng dụng của quang phổ đạo hàm trong định lượng hỗn hợp hai thành phần
Vì phổ đạo hàm là kết quả của phép biến đổi từ phổ hấp thụ nên giá trị của phổ đạo
hàm tại các bước sóng cũng có sự cộng tính như phổ hấp thụ của dung dịch có nhiều thành
phần với điều kiện tương tác giữa các thành phần này là khơng đáng kể và có thể bỏ qua:
A = (ε1 C1 +ε2 C2 +…+εk Ck )l

(9*)

dA
dε1
dε2
dεk
= ( C1 +
C2 + …+
C )l
d
d
d
d k

(10*)

Trong đó εi và Ci lần lượt là độ hấp thụ phân tử và nồng độ của thành phần Si trong
dung dịch có 𝑘 thành phần (1 ≤ 𝑖 ≤ 𝑘).
5



1.2.1. Phương pháp đạo hàm giao điểm không (zero-crossing derivative
spectrophotometry)
Đây là phương pháp được sử dụng phổ biến trong việc ứng dụng quang phổ đạo hàm
để định lượng đồng thời hỗn hợp hai thành phần. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc
bước sóng được lựa chọn là bước sóng tại đó đạo hàm độ hấp thụ của một trong hai thành
phần cần định lượng bằng 0 và thành phần còn lại khác 0. Với phương pháp này phổ đạo
hàm được sử dụng thường có bậc một hoặc hai. Hình 2.1 là phổ đạo hàm bậc 1 của
lamivudin và zidovudin tại các nồng độ khác nhau. Tại bước sóng 271,6 nm, đạo hàm bậc
1 của lamivudin bằng 0 và tại bước sóng 265,6 nm, đạo hàm bậc 1 của zidovudin bằng 0.
Do đó, có thể định lượng lamivudin tại 265,6 nm và zidovudin tại 271,6 nm trong hỗn hợp
hai thành phần .[16]

Hình 1.4: Đạo hàm bậc 1 của lamivudin (1) 15µg/ml; (2) 20 µg/ml; (3) 30 µg/ml
(đường nét liền) và zidovudin (1) 30 µg/ml; (2) 50 µg/ml; (3) 75 µg/ml (đường nét
đứt) trong methanol. Mũi tên chỉ bước sóng định lượng
1.2.2. Phương pháp đạo hàm phổ tỷ đối (Ratio spectra derivative spectrophotometry
Xét dung dịch có hai thành phần 𝑆1 , 𝑆2 và có tính chất cộng tính ánh sáng. Khi đó ta
có phương trình:
A= (ε1 C1 +ε2 C2 )l

(11*)

Chia phổ hấp thụ của dung dịch cho phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn 𝑆1 có nồng
độ C0,S1 ta được phổ tỷ đối:
6


(ε C1 +ε2 C2 )l C1 ε2 C2

A
= 1
=
+
A0,S1
ε1 C0,S1 l
C0,S1 ε1 C0,S1

(12*)

Đạo hàm hai vế của phương trình :
d A
d C1 ε2 C2
d ε2 C2
d ε2 C2
[
] =
[
]= 0 +
[ ]
[ ]
+
=
d A0,S1
d C0,S1 ε1 C0,S1
d ε1 C0,S1 d ε1 C0,S1

(13*)

Tại một bước sóng xác định, phổ đạo hàm tỷ đối chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất

𝑆2 và nồng độ của dung dịch chuẩn 𝑆1 . Vì nồng độ của dung dịch chuẩn 𝑆1 đã biết nên có
thể xác định được nồng độ của chất 𝑆2 trong dung dịch tại một bước sóng được lựa chọn
thích hợp (tín hiệu đạo hàm có giá trị khác 0). Hình 2.2 minh họa phương pháp đạo hàm tỷ
đối trong định lượng đồng thời acetaminophen và mephenoxalon. Trên phổ đạo hàm tỷ đối
bậc 1 của acetaminophen khi mephenoxalon là số chia, các cực trị tại 288,9 nm có thể sử
dụng để định lượng acetaminophen [7].

Hình 1.5: (a) Phổ tỷ đối của acetaminophen tại các nồng độ (a) 5,0 µg/ml, (b) 17,5
µg/ml, (c) 25,0 µg/ml, (d) 37,5 µg/ml, (e) 50,0 µg/ml khi nồng độ của số chia
(mephenoxalon) là 12,5 µg/ml trong methanol (Δλ = 4 nm). (b) Phổ đạo hàm tỷ đối
bậc 1 của acetaminophen tại các nồng độ (a) 5,0 µg/ml, (b) 17,5 µg/ml, (c) 25,0
µg/ml, (d) 37,5µg/ml, (e) 50,0 µg/ml khi nồng độ của số chia (mephenoxalon) là

7


12,5 µg/ml trong methanol (Δλ = 4 nm).
1.3. Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu
1.3.1. Đặc tính lý hóa của Lamivudin và Zidouvudin

Một số đặc tính lý hóa của 3TC và AZT được trình bày ở bảng 1.1 [3] [19], [20].
Bảng 1.1: Một số đặc tính lý hóa của Lamivudin và Zidovudin
Lamivudin

Zidovudin

CTPT

C8H11N3O3S


C10H13N5O4

KLPT

229,3 g/mol

267,2 g/mol

CTHH

Tên khoa 4-amino-1- [(2R, 5S) -21-[(2R,4S,5S)-4-azido-5học
(hydroxymethyl)-1,3-oxathiolan-5- (hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5yl] pyrimidin-2-one
methylpyrimidine-2,4-dione
Tính chất

Bột kết tinh trắng hoặc gần như Chất rắn kết tinh màu trắng đến màu
trắng
be

Tnc

160-162C

Độ tan

Tan trong nước, hơi tan trong Khó tan trong nước, tan trong một số
methanol, khó tan trong ethanol dung mơi hữu cơ
96%.
Độ tan khoảng 25 mg/ml ở 25 độ C
Độ tan khoảng 70 mg/ml trong


120-122C

nước ở 20C
LogP

-1,4

0,05

Năng suất -135o (dung dịch 0.38% trong +60.5 đến 63.0o (dung dịch 1% trong
quay cực
methanol)
ethanol)
8


1.3.2. Ứng dụng lamivudin và zidovudin trong điều trị HIV
Hiện nay, trên thế giới có 5 nhóm thuốc kháng virus (ARV) được phân chia theo tác
động của chúng lên những bước khác nhau trong chu trình nhân bản của HIV trong tế bào
vật chủ [1].Trong đó lamivudin và zidovudin thuộc nhóm 1 - thuốc ức chế men sao chép
ngược có gốc nucleoside (nucleosid reverse transcriptase inhibitors = NRTIs) - là 2 thuốc
được sử dụng hàng đầu trong phác đồ điều trị HIV/AIDS (phác đồ chính và các phác đồ
thay thế) [2].
Liều dùng dựa trên thể trọng và tuổi của người bệnh, bệnh lý mắc kèm. Với người
lớn cân nặng từ 50kg trở lên sử dụng Lamivudin 150 mg/2 lần/ngày và Zidovudin 300
mg/2 lần/ngày.
1.3.3. Phương pháp định lượng đồng thời Lamivudin và Zidovudin
Định lượng đồng thời lamivudin và zidovudin trong hỗn hợp hai thanh phần có thể
tiến hành bằng các phương pháp HPLC hoặc quang phổ đạo hàm (bảng 1.2 và bảng 1.3)


Bảng 1.2: Một số phương pháp HPLC để định lượng đồng thời lamivudin và
zidovudin trong hỗn hợp hai thành phần .
Thơng số kỹ thuật`
Cột C18 (25 cm × 3 mm, 5 µm).
Detector: 270 nm.
Nhiệt độ cột: 40 °C
Tốc độ dịng: 0,5 ml/min.
Thể tích tiêm: 10 µl.

Kết quả nghiên cứu

Mẫu

Tính hàm lượng 3TC và Viên
AZT có trong viên dựa vào nén
diện tích pic 3TC và AZT
thu được trên sắc ký đồ cùa
dung dịch thử, dung dịch
chuẩn.

Pha động A, B, C: Tiến hành chạy
theo chương trình dung mơi.
Pha động A: Dung dịch
amoni acetat 0,025 M, điều
chỉnh pH 4,0 bằng acid
acetic băng.
Pha động B: Methanol
Pha động C: Acetonitril
9


TLTK
[3]


Thông số kỹ thuật`

Kết quả nghiên cứu

Mẫu

Cột: Xterra C18 (150 x 4,6 mm, 5 Thời gian lưu 3TC và AZT Viên
µm)
là 2,90 và 7,52 phút.
nén

TLTK
[14]

Pha động: Nước (điều chỉnh pH 2,5 Khoảng tuyến tính: 75 - 225
bằng o-phosphoric acid): methanol μg/ml và 150 - 450 μg/ml
(70:30)
đối với 3TC và AZT.
Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút.
Detector: 275 nm
Thể tích tiêm: 20µl
Cột BDS Hypersil C18 (5 µm ,25 Thời gian lưu của 3TC và Viên
cm x 4,6 mm)
AZT là 2,64 phút và 4.96 nén
Pha động: Acid o-phosphoric: phút.


[13]

methanol (70:30 v/v) được đệm và Khoảng tuyến tính: 10 - 30
điều chỉnh đến độ pH 5 bằng μg/ml và 10 - 50 μg/ml đối
triethylamine.
với 3TC và AZT
Tốc độ dòng: 1,4 ml/phút
Detector: 220 nm.
Cột: ZORBAX Eclipse XDB-C18 Thời gian lưu 3TC và AZT Viên
(RP18, ODS, Octadecyl), (5 µm, lần lượt là 2,3 và 12,1 phút. nén
150 × 4,6 mm)
Khoảng tuyến tính: 0,025 Pha động: methanol: 10 mM 0,2 µg/ml với 3TC và 0,05
KH2PO4 (70:30).
- 0,4 µg/ml với AZT.
Tốc độ dòng: 1 mL/phút
Detector: 254,0 nm

10

[17]


Bảng 1.3: Một số phương pháp quang phổ đạo hàm để định lượng đồng thời
lamivudin và zidovudin trong hỗn hợp hai thành phần
Thông số kỹ thuật
Thiết bị: Máy quang phổ UV/Vis
2 chùm tia JASCO (Model V630).

Kết quả nghiên cứu


Viên
nén

[5]

Viên
nén
bao
phim

[11]

Thiết bị: Máy quang phổ UV/Vis Đạo hàm giao điểm không:
Viên
hai chùm tia Genesys
Các bước sóng 235,4 và
nén
249,5 nm được chọn để định
Dung môi pha mẫu: Nước.
lượng 3TC và AZT tương
Dải bước sóng 200 - 340 nm
ứng.
λ =3 nm
Khoảng tuyến tính: 0 - 50
Tốc độ quét 1800 nm/phút.
μg/ml đối với cả 3TC và
AZT.

[15]


Dung mơi pha mẫu: Nước

[10]

Dải bước sóng: 200 - 400 nm.
Dung môi pha mẫu: Dung dịch
HCl 0,1M.
Thiết bị: Máy quang phổ UV/Vis
hai chùm tia Shimadzu 1601.
Dung môi pha mẫu: Dung dịch
methanol.
Dải bước sóng: 200 - 350 nm.

Dải bước sóng: 200 - 300 nm
Tốc độ quét: 8,3 nm/s
λ =1 nm

Đạo hàm giao điểm khơng:
Các bước sóng 279 nm và
300 nm được chọn để định
lượng 3TC và AZT tương
ứng.

Mẫu TLTK

Khoảng tuyến tính: 1 - 50
μg/ml với 3TC và AZT.
Đạo hàm giao điểm khơng:
Các bước sóng 263 nm và

246 nm được chọn để định
lượng 3TC và AZT tương
ứng.

Đạo hàm giao điểm không:
Viên
Các bước sóng 267,3 và
nén
249,3 nm được chọn để định
lượng 3TC và AZT tương
ứng.

11


Thơng số kỹ thuật

Kết quả nghiên cứu

Mẫu TLTK

Khoảng tuyến tính: 0.6 - 50
và 0.12 - 100 μg/ml đối với
3TC và AZT.
Thiết bị: Máy quang phổ UV/Vis Đạo hàm giao điểm khơng:
hai chùm tia Shimadzu 1601.
Các bước sóng 265,6 và
271,6 nm được lựa chọn để
Dung môi pha mẫu: Methanol
định lượng 3TC và AZT.


Viên
nén

[16]

Viên
nén

[16]

Khoảng tuyến tính: 1 - 50
μg/ml với3TC và 2 - 100
μg/ml với AZT.
Thiết bị: Máy quang phổ UV/Vis Đạo hàm tỷ đối: Điểm định
hai chùm tia Shimadzu 1601.
lượng được chọn ở bước
sóng 239.5 và 245.3 nm đối
Dung mơi pha mẫu: Methanol.
với 3TC và 225.1 và 251.5
Δλ = 4 nm
nm đối với AZT.
Với đạo hàm tỷ đối để xác định
Khoảng tuyến tính: 1 - 50
3TC lấy số chia là AZT (20 µg/ml).
μg/ml đối với 3TC và 2 Với đạo hàm tỷ đối để xác định 100 μg/ml đối với AZT.
AZT lấy số chia là 3TC (15 µg/ml).

12



CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng – nguyên liệu thiết bị
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu:
Viên nén bao phim Lamzidivir của Công ty TNHH LD Stada -Việt Nam
SĐK: VD-29500-18
Số lô: 010322
NSX: 260322
HD: 260326
Thành phần: 150 mg amivudin + 300 mg zidovudin và các tá dược khác.
2.1.2. Nguyên liệu và thiết bị
 Nguyên liệu:

 Chất chuẩn:
Chuẩn quốc gia Lamivudin (200mg/lọ) hàm lượng 99,5% C8H11N3O3S tính theo
nguyên trạng, SKS 0312146.03, Viện kiểm nghiệm thuốc TW - Bộ Y Tế.
Chuẩn quốc gia Zidovudin (200mg/lọ) hàm lượng 99,48% C10H13N5O4 tính theo
nguyên trạng, SKS 0210143.02, Viện kiểm nghiệm thuốc TW - Bộ Y tế.

 Nước loại ion: là nước cất hai lần mới, được lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết có cột
trao đổi ainon và cation, sau đó lọc qua màng lọc 0,2 µm.

 Dung dịch acid hydrocloric (HCl) 0,1M: Pha loãng 8,5 ml HCl (TT) với nước vừa
đủ 1000 ml.
 Thiết bị:
Máy móc và thiết bị nghiên cứu sử dụng được đặt tại Khoa Hóa phân tích và Kiểm
nghiệm thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội.

 Máy quang phổ UV-VIS Shimadzu UV1800 được kết nối với máy tính (chạy hệ
điều hành Window XP) với phần mềm chuyên dụng UV Probe. Chế độ đo

Spectrum:
 Start Lamda: 200 nm – Stop Lamda: 300 nm;
 Data Mode: Absorbance;
 Scan Speed: Medium;
 Scampling Interval: 0.1 nm;
13


 Cuvet thạch anh bề dày 1cm.
 Máy siêu âm: Ultrasonic LC 60H.
 Cân phân tích: Sartorius d = 0,1 mg.
 Máy thử hòa tan ERWEKA.
 Các dụng cụ khác: bình định mức (loại 25;50;100;250 mL), pipet tự động loại
100÷1000 μL, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, ống đong, giấy lọc băng xanh, chày cối.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng đồng thời 3TC và AZT trong
hỗn hợp bằng các phương pháp quang phổ đạo hàm
-

Chọn bước sóng định lượng thích hợp.

-

Chọn khoảng nồng độ có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và các giá trị phổ
đạo hàm, phổ đạo hàm tỷ đối.

-

Kiểm tra độ lặp lại của phương pháp.


-

Kiểm tra độ đúng của phương pháp.

2.2.2. Ứng dụng các phương pháp đã thẩm định để định lượng đồng thời và thử độ
hòa tan của 3TC và AZT trong chế phẩm viên nén
Tiến hành định lượng đồng thời 3TC và AZT trong cùng một mẫu bằng các phương
pháp: Quang phổ đạo hàm;Quang phổ đạo hàm tỷ đối.
2.2.3. Xử lý số liệu
Sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ với tín hiệu đo (trong các phương pháp đo
quang)) được thiết lập bằng phương pháp bình phương tối thiểu với hệ số tương quan của
đường chuẩn ≥ 0,990.
Các giá trị độ lệch chuẩn tương đối, phương trình hồi quy, hệ số tương quan hồi quy
được xác định bằng phần mềm Microsoft Excel 2016.
̅=
X

Giá trị trung bình:

Độ lệch chuẩn:

S=√

14

∑ni=1 Xi
n

̅ )2
∑ni=1 (Xi ─X

n-1


Phương sai:
2

S=

Độ lệch chuẩn tương đối:

∑ni=1 (Xi ─𝑋̅ )

RSD =

15

2

n-1
S
x 100
̅
X


CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả thực nghiệm
3.1.1. Định lượng chế phẩm 2 thành phần chứa Lamivudin và Zidovudin
3.1.1.1. Chuẩn bị dung dịch
 Dung dịch chuẩn gốc Lamivudin (3TC): Cân chính xác khoảng 0,1000 g 3TC chuẩn,

pha với dung dịch HCl 0,1M vừa đủ trong bình định mức 100mL, lắc đều được dung
dịch gốc 3TC có nồng độ khoảng 1000 mg/L.
 Dung dịch chuẩn gốc Zidovudin (AZT): Cân chính xác khoảng 0,1000g AZT chuẩn,
pha với dung dịch HCl 0,1M vừa đủ trong bình định mức 50mL, lắc đều được dung
dịch gốc AZT có nồng độ khoảng 2000 mg/L.

Bảng 3. 1. Khối lượng cân nồng độ thực tế chuẩn gốc
Khối lượng cân thực tế

Nồng độ thực tế

Chuẩn Lamivudin (3TC)

0,1000 g

1000 mg/L

Chuẩn Zidovudin (AZT)

0,1000 g

2000 mg/L

 Dung dịch thử: Cân chính xác 20 viên bất kỳ, tính khối lượng trung bình của viên và
nghiền thành bột mịn. Cân chính xác khoảng một lượng bột viên tương ứng với khoảng
50 mg 3TC và 100 mg AZT, chuyển vào bình định mức 100mL. Thêm 80mL dung dịch
HCl 0,1M, siêu âm 15 phút, thêm dung dịch HCl 0,1M đến vạch và trộn đều. Lọc, bỏ
10mL dịch lọc đầu. Lấy chính xác 1 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50mL, thêm
dung dịch HCl 0,1M đến vạch và lắc đều.


Bảng 3. 2: Khối lượng cân viên nén Lamzidivir
Khối lượng cân
Khối lượng trung bình của viên

0,6779 g

Khối lượng cân lý thuyết

0.2260 g

3.1.1.2. Xây dựng phương pháp
A. Chọn bước sóng định lượng
a. Khảo sát phổ hấp thụ tử ngoại

 Cách tiến hành:
16


Chuẩn bị dung dịch khảo sát:
 Dung dịch chuẩn 3TC 10 mg/L : Hút chính xác 500 μl dung dịch chuẩn gốc
3TC pha với dung dịch HCl 0,1M vừa đủ trong bình định mức 50mL.
 Dung dịch chuẩn AZT 20 mg/L: Hút chính xác 500 μl dung dịch chuẩn gốc
AZT pha với dung dịch HCl 0,1M vừa đủ trong bình định mức 50mL
 Dung dịch hỗn hợp chuẩn 3TC 10mg/L + AZT 20 mg/L: Hút chính xác 500 μl

dung dịch chuẩn gốc 3TC + 500 μl dung dịch chuẩn gốc AZT pha với dung
dịch HCl 0,1M vừa đủ trong bình định mức 50mL.
 Dung dịch thử với khối lượng bột cân m = 0,2250g
Tiến hành đo phổ hấp thụ tử ngoại trong vùng bước sóng khảo sát 200 – 300 nm của
các dung dịch khảo sát.

Các phổ hấp thụ được làm trơn bằng chức năng transformation (Order: Smoothing;
Delta lamda: 4).
Phổ cộng của 3TC 10 mg/L và AZT 20 mg/L được lấy bằng chức năng Data Set
(Operation: Addition)

 Kết quả
Phổ hấp thụ của các dung dịch khảo sát được biểu diễn ở hình 3.1.

Hình 3.1: Phổ hấp thụ của dung dịch 3TC 10 mg/L, AZT 20 mg/L,
hỗn hợp 3TC10 mg/L và AZT 20 mg/L, chế phẩm (3TC 10 mg/L và AZT 20 mg/L)
và phổ cộng của 3TC 10 mg/L và AZT 20 mg/L
17