ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

Phạm Thị Phương Thảo

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ PHÁT HIỆN
ĐỘT BIẾN GENE CALR TYPE 1 VÀ TYPE 2
Ở NHỮNG BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG
TĂNG SINH TỦY ÂM TÍNH VỚI
ĐỘT BIẾN JAK2V617F

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH KĨ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC

Hà Nội - 2023


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

Phạm Thị Phương Thảo

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐỂ PHÁT HIỆN
ĐỘT BIẾN GENE CALR TYPE 1 VÀ TYPE 2
Ở NHỮNG BỆNH NHÂN MẮC HỘI CHỨNG
TĂNG SINH TỦY ÂM TÍNH VỚI
ĐỘT BIẾN JAK2V617F
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH KĨ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC
Cán bộ hướng dẫn: Ts. Dương Quốc Chính

Ths. Trần Tuấn Anh

Hà Nội - 2023


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Dương
Quốc Chính – Giảng viên trường đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội
kiêm Trưởng Khoa Di truyền & Sinh học phân tử - Viện Huyết học và Truyền
máu Trung Ương. Giảng viên đã hướng dẫn tơi trong q trình nghiên cứu, đã
ln tận tình hướng dẫn, quan tâm, giải đáp những thắc mắc, khó khăn, đồng
thời ln động viên tơi trong suốt q trình, giúp tơi học được những bài học
q báu, để tơi có thể hồn thành tốt đề tài của mình.
Tơi xin trân trọng cảm ơn ThS. Trần Tuấn Anh- Thạc sĩ kỹ thuật xét nghiệm
– Khoa Di truyền & Sinh học phân tử - Viện Huyết học và Truyền máu Trung
Ương, người đã hướng dẫn tôi những điều cơ bản nhất từ ngày đầu tiên tham
gia vào nhóm nghiên cứu thực nghiệm, hỗ trợ nhiệt tình cho tơi trong suốt q
trình thực hành từ những thao tác nhỏ nhất và giúp đỡ, chia sẻ cho tơi những
tài liệu hữu ích trong suốt thời gian là thành viên của nhóm. Đặc biệt hơn cả,
anh đã giúp tơi thêm gắn bó chặt chẽ với các thành viên trong nhóm và mơi
trường thực hành ở viện.
Đồng thời không thể thiếu được, tôi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Viện
Huyết học Truyền máu Trung ương cho đề tài. Trong quá trình học tập, làm
việc và thực hiện khóa luận, tơi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy
cơ, anh chị và các bạn sinh viên làm việc tại thực tập tại Khoa Di truyền – Sinh
học phân tử. Tôi xin chân thành cảm ơn.

Để thực hiện tốt khóa luận này, tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm
khoa, cùng tồn thể các thầy cơ giáo trường đại học Y dược - Đại học Quốc gia
Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu trong quá trình học tập tại trường.
Hà Nội, ngày 24 tháng 05 năm 2023

Phạm Thị Phương Thảo


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tên đầy đủ

Từ tiếng việt

CALR

Calreticulin

CML

Chronic myelogenous
leukemia

DNA


Deoxyribonucleotid acid

EDTA

Ethylenediaminetraacetic acid

ET

Essential thrombocythaemia

Bệnh tăng tiểu cầu tiên
phát

JAK2

Janus kinase 2

Gen JAK2

MPNs

Myeloproliferative neoplasm

Bệnh tăng sinh tủy mạn

MPL

Myeloproliferative leukemia
virus oncogene


Gen MPL

NC

Normal Control

Mẫu chứng âm

NGS

Next Generation Sequencing

Giải trình tự gen thế hệ
mới

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng khuếch đại
chuỗi

Ph

Philadelphia chromosome

Nhiễm sắc thể
Philadelphia

PMF


Primary myelofibrosis

Bệnh xơ tủy nguyên
phát

POS

Positive

Mẫu chứng dương

Bệnh Lơ-xê-mi kinh
dòng hạt


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

Bệnh đa hồng cầu
nguyên phát

PV

Polycythaemia vera

RNA

Ribonucleic acid


WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế thế giới

G-CSF

Granulocyte
colonystimulating factor

Yếu tố kích thích bạch
cầu hạt

HSC

Hematopietic stem cells

Các tế bào gốc tạo máu

TBCAT

Tăng bạch cầu ái toan

TBCAK

Tăng bạch cầu ái kiềm

AS- PCR


Allele-specific PCR

Đặc hiệu allene


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Vị trí của nhiễm sắc thể chứa gen CALR...............................6
Hình 1.2. Toạ độ của gen CALR trên nhiễm sắc thể số 19.....................6
Hình 1.3. Cấu trúc của protein Calreticulin........................................... 7
Hình 1.4. Đột biến gen CALR type 1 và type 2 trên exon 9 [18]...........8
Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu..............................................................12
Hình 2.2. Ngun lí của phản ứng PCR................................................15
Hình 2.3. Vị trí của mồi đầu (F) Forward và mồi đầu (R) Reverse....16
Hình 3.1. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong PCR phát hiện đột
biến CALR type 1.......................…….......................................................25
Hình 3.2. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi trong PCR phát hiện đột
biến CALR type 2 ............................…….................................................27


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Các biến số trong nghiên cứu ...................................................... 10

Bảng 2.2. Dụng cụ và vật tư tiêu hao sử dụng trong thí nghiệm .............. 11
Bảng 2.3. Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR phát hiện đột . 16
biến CALR type 1 ........................................................................................... 16
Bảng 2.4. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR phát hiện đột biếnCALR
type 2............................................................................................................... 17
Bảng 3.1: Phân bố về giới tính của nhóm nghiên cứu ............................... 19
Bảng 3.2: Phân bố từng nhóm bệnh nghiên cứu ........................................ 19
Bảng 3.3: Phân bố khoảng tuổi của nhóm bệnh nghiên cứu ..................... 20
Bảng 3.4. Phân bố khoảng tuổi theo từng nhóm bệnh nghiên cứu ........... 20
Bảng 3.5. Thiết kế mồi phát hiện đột biến CALR type 1 ........................... 22
Bảng 3.6. Thiết kế mồi phát hiện đột biến CALR type 2 ........................... 23
Bảng 3.7. Phân bố tỷ lệ đột biến trong nghiên cứu .................................... 26
Bảng 3.8. Phân bố tỷ lệ đột biến theo nhóm bệnh ...................................... 27
Bảng 3.9. Phân bố tỷ lệ đột biến theo giới tính ở nhóm nghiên cứu ......... 28
Bảng 3.10. Phân bố tỷ lệ đột biến theo khoảng tuổi ở nhóm nghiêncứu .. 28
Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ thể bệnh trong nhóm nghiên cứu ……………………24


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU.......................................................3
1.1. Tổng quan về hội chứng tăng sinh tuỷ.............................................…..…3
1.1.1. Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học.........................................………....3
1.1.2. Cơ chế sinh bệnh học................................................................………. 4
1.1.3. Tổng quan về gen liên quan đến hội chứng rối loạn tăng sinh tủy…….5
1.2. Tổng quan về gen CALR...................................................................…….6
1.2.1. Đặc điểm di truyển của gen CALR.............................................………6
1.2.2. Vai trò của gen CALR trong hội chứng tăng sinh tủy................……….7
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........9
2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................……9

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................……….9
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn..................................................................... ……..9
2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ.....................................................................……….9
2.1.4. Phương pháp chọn mẫu..............................................................……….9
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu.......................................................……9
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu....................................................................………9
2.2.2. Thời gian nghiên cứu.................................................................………..9
2.3. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................…...9
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang........................................………..9
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu...........................................................………..9
2.3.3. Biến số nghiên cứu...................................................................………..10
2.4. Vật tư, hóa chất và trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu.............. …..10
2.5. Quy trình nghiên cứu........................................................................…….12
2.5.1. Quy trình kỹ chiết DNA tổng số sử dụng hạt từ......................………...12
2.5.2. Kiểm tra, đánh giá nồng độ DNA trên máy quang phổ Nano
Drop......................................................................................................………13
2.5.3. Kỹ thuật PCR trong phát hiện đột biến CALR type 1 và type 2…………14
2.6. Quản lý và phân tích số liệu.............................................................……..19
2.7. Vấn đề đạo đức nghiên cứu...............................................................……19
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ...............................................................................20
3.1. Đặc điểm chung của bệnh nhân nghiên cứu...................................……...20


3.1.1. Đặc điểm về giới tính của nhóm nghiên cứu..........................……....20
3.1.2. Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu.......................................…. 20
3.1.3. Đặc điểm về các thể bệnh của nhóm nghiên cứu...................……....22
3.2. Xây dựng và hồn thiện quy trình PCR phát hiện đột biến CALR type
1 và type 2................................................................................................….22
3.2.1. Nghiên cứu các cặp mồi cho qui trình PCR............................……....23
3.2.1.1. Các cặp mồi suy biến cho đột biến CALR type 1.................……....23

3.2.1.2. Các cặp mồi đặc hiệu cho đột biến CALR type 2...............………..23
3.2.2. Tối ưu nhiệt độ kỹ thuật PCR phát hiện đột biến CALR........... …….24
3.3. Kết quả ứng dụng quy trình PCR phát hiện đột biến CALR type 1 và
CALR type 2.............................................................................................… 27
3.3.1. Đặc điểm, phân bố hai loại đột biến gen CALR trong nghiên cứu…..27
CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN............................................................................31
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT...........................................................................34
4.1. Kết luận............................................................................................... …34
4.2. Đề xuất..............................................................................................…...34
TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................
PHỤ LỤC.............................................................................................………


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hội chứng tăng sinh tủy (Myeloproliferative neoplasm-MPNs) là sự tăng
sinh bất thường của các tế bào gốc tủy xương, biểu hiện là tăng tiểu cầu, tăng
hồng cầu hoặc bạch cầu trong máu và đôi khi tăng sinh xơ trong tủy xương với
diễn biên tiếp theo là sinh máu ngoài tủy (sự sản xuất tế bào bên ngoài tủy
xương) và chúng được phân loại là tăng tiểu cầu tiên phát (Essential
thrombocythaemia - ET), Xơ tủy nguyên phát (Primary myelofibrosis - PMF),
Đa hồng cầu nguyên phát (Polycythaemia vera - PV), Lơ xê mi kinh dịng tủy.
Ngồi ra các thể tăng sinh tủy ít phổ biến hơn bao gồm hội chứng tăng bạch cầu
ái toan và tăng tế bào mastocytosis và các hội chứng tăng bạch cầu hạt khác.
Các khối u tăng sinh tủy cũng có thể tương đồng với các hội chứng tăng sinh
tủy.
Tuy có tên chung là hội chứng tăng sản tủy nhưng các kiểu bệnh khác nhau

mang các đặc điểm di truyền học khác nhau và trong đó, đột biến gen
JAK2V617F và gen CALR được xác định là những dấu ấn có giá trị trong chẩn
đoán hội chứng tăng sinh tủy [1]. Janus kinase 2 là một thành viên của họ enzym
Tyrosine kinase loại I và tham gia vào q trình truyền tín hiệu cho các thụ thể
erythropoietin, thrombopoietin và yếu tố kích thích bạch cầu hạt. Các đột biến
của gen Janus kinase 2 (JAK2) là nguyên nhân gây ra bệnh đa hồng cầu và
chiếm một tỷ lệ cao các trường hợp tăng tiểu cầu tiên phát và bệnh xơ tủy nguyên
phát.[2]
Gen CALR cũng bị đột biến ở một tỷ lệ đáng kể ở bệnh nhân tăng tiểu cầu
tiên phát và bệnh nhân xơ tủy nguyên phát và hiếm khi ở bệnh đa hồng cầu. Đột
biến gen CALR trong hội chứng tăng sinh tủy đã được báo cáo là dấu hiệu quan
trọng trong chẩn đoán phân tử, đặc biệt ở những bệnh nhân âm tính với JAK2
V617F[3]. Gen CALR đã được xác định là đột biến gây bệnh ở một phần tư các
bệnh nhân mắc ET và PMF [4].
Trong những năm gần đây người ta phát hiện thấy sự xuất hiện của đột biến
gen CALR trên các nhóm hội chứng tăng sản tủy khơng mang đột biến JAK2 vì
thế đột biến CALR nhanh chóng trở thành một tiêu chí để chẩn đốn bệnh này[5].
Để tìm hiểu và chuẩn đốn rõ hơn về các biến thể đột biến gen CALR, các đột
biến CALR được phân tích bằng các kỹ thuật bao gồm kỹ thuật PCR đặc hiệu

1


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

allene (Allele-specific polymer chain reaction- AS-PCR), PCR định lượng thời
gian thực (Real Time PCR – qPCR), giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation
Sequencing - NGS),...Trong đó PCR là kỹ thuật một dễ làm, mang lại hiệu quả

kinh tế cao đang được sử dụng để phát hiện đột biến gen CALR ở những bệnh
nhân mắc hội chứng tăng sinh tủy. Tuy nhiên phương pháp này và các bộ kit để
xét nghiệm chưa được áp dụng phổ biến ở Việt Nam.
Vì vậy chúng tơi tiến hành nghiên cứu “Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện
đột biến gen CALR type 1 và type 2 ở những bệnh nhân mắc hội chứng tăng
sinh tủy âm tính với JAK2V617F” nhằm ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị
hội chứng tăng sản tủy.
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Xây dựng quy trình xét nghiệm sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện đột
biến gen CALR ở những bệnh nhân mặc hội chứng tăng sinh tủy âm tính
với JAK2V617F.
2. Bước đầu áp dụng quy trình vào phát hiện đột biến gen CALR type 1
và type 2 ở những bệnh nhân tăng sinh tủy.

2


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về hội chứng tăng sinh tuỷ
1.1.1. Khái niệm và đặc điểm dịch tễ học
Khái niệm về bệnh tăng sinh tủy lần đầu tiên được đề xuất vào năm 1951
bởi nhà huyết học William Dameshek[6]. Tăng sinh tủy chính là một loại bệnh
lý huyết học ác tính. MPNs là loại ung thư máu bắt đầu bằng những đột biến bất
thường trong các tế bào gốc tạo máu trong tủy xương. Sự thay đổi dẫn đến sản
xuất quá mức của các tế bào bạch cầu, hồng cầu, tiểu cầu hoặc tổ hợp của các
dòng tế bào trên. Bệnh tiến triển đến giai đoạn mạn tính là do có liên quan đến

khả năng biệt hóa tới giai đoạn trưởng thành của những tế bào máu kể trên.
MPN ban đầu có thể không gây ra triệu chứng cho bệnh nhân và do q trình
bệnh kéo dài, nên có khả năng nhiều người bị MPNs vẫn khơng được chẩn đốn.
Bệnh nhân sống chung với MPNs thường có các triệu chứng ảnh hưởng đến
chất lượng cuộc sống của họ.
MPNs có các dạng như bệnh đa hồng cầu, khiến cơ thể sản xuất quá mức
các tế bào hồng cầu; tăng tiểu cầu tiên phát, biểu hiện bởi sự tăng sinh quá mức
tiểu cầu và xơ tủy nguyên phát, dư thừa megakaryocyte dẫn đến tăng xơ hóa tủy
xương. Những rối loạn này được gọi là MPNs âm tính Philadelphia, phân biệt
chúng với bệnh bạch cầu dịng tủy mạn tính rối loạn dương tính Philadelphia,
bệnh này cũng đã được xác định là MPNs trong bản sửa đổi năm 2016 đối với
phân loại ung thư dòng tủy của WHO (World Health Organization- WHO)[7].
Tất cả nhóm bệnh MPNs đều có một số đặc điểm tương đồng, đặc biệt là sự
hiện diện của các đột biến trong các gen JAK2, CALR hoặc MPL[1]. Việc phát
hiện ra sự liên kết của MPNs với dấu hiệu gen JAK2 vào năm 2005 và dấu hiệu
CALR vào năm 2013 đã cải thiện khả năng phân loại hội chứng tăng sinh tủy[8].
MPNs được Tổ chức Y tế Thế giới phân loại là ung thư máu vào năm 2008[9].
Trước đây, chúng được gọi là bệnh tăng sinh tủy và Mastocytosis cũng được
phân loại là MPNs. Năm 2016, Mastocytosis khơng cịn được phân loại là MPNs
và MPNs đã được xác định trong bản sửa đổi năm 2016 đối với phân loại ung
thư dòng tủy của WHO[10].
Theo chương trình “Seer is an authoritative source for cancer statistics in
the United States - SEER” tạm dịch là “Giám sát, Dịch tễ học và Kết quả Cuối

3


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học


cùng của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ”, ước tính trên phạm vi rộng có xấp
xỉ 20.000 người mắc MPNs mỗi năm và có khoảng 295.000 người “sống chung”
với MPNs [9, 11]. Bắt đầu từ năm 2005, các cuộc điều tra, thống kê về MPNs,
cụ thể về 2 đột biến gen JAK2V617F và CALR thu được kết quả như sau: Đột
biến gen Janus Kinase được phát hiện ở 95% bệnh nhân mắc PV và khoảng
50% bệnh nhân mắc ET và PMF[9, 12]. Độ tuổi được chuẩn đoán mắc MPNs
thường là sau 50 tuổi, hầu hết các bệnh nhân trong khoảng 60-70 tuổi và hiếm
gặp ở ngưởi trẻ hơn 50 tuổi[11].
Vào năm 2013, các đột biến trong gen CALR đã được xác định trong hai loại
ung thư tăng sinh tủy tăng sinh ở nhiễm sắc thể Philadelphia (Ph) (MPNs), bệnh
tăng tiểu cầu tiên phát và đã được phát hiện trên 20 – 30% bệnh nhân xơ tủy
nguyên phát âm tính với đột biến gen JAK2 và MPL[13]. Ngoài ra, đột biến
CALR hiếm khi được phát hiện ở bệnh nhân bạch cầu myelomonocytic mãn
tính, hội chứng loạn sản tủy/ung thư tăng sinh tủy và một số bệnh nhân mắc hội
chứng loạn sản tủy[14]. CALR là một protein chaperone tham gia vào nhiều quá
trình tế bào trong tế bào chất và trong lưới nội chất (Endoplasmic reticulum ER).
1.1.2. Cơ chế sinh bệnh học
MPNs phát sinh khi các tế bào tiền thân (tế bào blast) của các dòng tủy trong
tủy xương phát triển các đột biến soma khiến chúng phát triển bất thường. Có
một loại bệnh tương tự đối với dòng bạch huyết, các rối loạn tăng sinh dòng
lympho bệnh bạch cầu lympho cấp tính, u lympho, bệnh bạch cầu lympho mãn
tính và đa u tủy. Di truyền học được cho là đóng vai trị trung tâm trong sự phát
triển của MPNs, đặc biệt là trong việc phát triển các biến chứng huyết khối và
chảy máu. Các bệnh tăng sinh tủy được coi là do “rối loạn về dòng tế bào”. Rối
loạn về dòng tế bào xảy ra khi ADN của các tế bào gốc trong tủy xương có một
hay nhiều thay đổi. Các tế bào gốc tạo máu (Hematopietic stem cells - HSC), là
loại tế bào máu non có khả năng phát triển thành một trong ba dịng tế bào máu
chính: hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu. Các thay đổi ở tế bào gốc tạo máu có thể
khiến chúng tăng sinh hoặc hoạt động liên tục từ đó tạo ra các loại tế bào máu

bất thường trong cơ thể[15]. Trong hầu hết trường hợp, nguyên nhân khiến cho
tế bào gốc bị biến đổi không được biết, các đột biến có thể xảy ra do các yếu tố

4


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

môi trường hoặc do gặp lỗi trong q trình phân chia tế bào. Tuy có các báo cáo
về các trường hợp xảy ra bệnh đa hồng cầu nguyên phát, tăng tiểu cầu nguyên
phát và xơ tủy ở nhiều thành viên trong cùng một gia đình, các bệnh này thường
không phải do di truyền [11]. Các bệnh này thường phát sinh do gen bị đột biến
trong cuộc sống của một người. Trường hợp này được gọi là đột biến mắc phải
hay đột biến soma.
Nhiều người bị bệnh tăng sinh tủy có thể gặp ít triệu chứng hoặc hồn tồn
khơng có triệu chứng gì trong thời gian kéo dài nếu được theo dõi và điều trị
đúng cách. Những người bị bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát thường có tuổi thọ
gần như bình thường. Những người bị bệnh đa hồng cầu nguyên phát có thể có
tuổi thọ ngắn hơn so với người bình thường, nhưng bệnh này thường có thể
được kiểm soát hiệu quả trong thời gian dài [16].
1.1.3. Tổng quan về gen liên quan đến hội chứng rối loạn tăng sinh tủy
Theo WHO về phân loại MPNs, tất cả đều có chung một số đặc điểm, đặc
biệt là sự hiện diện của các đột biến trong JAK2, CALR và MPL[4, 10]. Điều
quan trọng là những nhóm MPNs này khơng có sự chuyển đoạn nhiễm sắc thể
tạo ra gen dung hợp BCR/ABL, biểu hiện của bệnh bạch cầu dòng tủy mạn tính
MPNs dương tính với nhiễm sắc thể Philadelphia. Do đó, sự hiện diện của đột
biến JAK2, CALR hoặc MPL thường là dấu hiệu của bệnh MPNs cổ điển và hiện
tại. Hoặc hiện diện dấu ấn dòng khác (khi khơng có bất kì đột biến nào trong ba

đột biến chính, tìm đột biến khác liên quan đến tăng sinh dịng tủy (ASXL1,
EZH2, TET2, IDH1, IDH2, SRSF2, SF3B1) có thể giúp ích trong việc xác định
dịng bệnh.
Kết quả của các nghiên cứu đã thực hiện trên thế giới chỉ ra các gen sau đây
là nguyên nhân phổ biến nhất trong hội chứng rối loạn tăng sinh tủy: JAK2,
CALR và MPL[1].
- Đột biến JAK2V617F là đột biến điểm mắc phải trong vùng pseudokinase
của Janus kinase 2, là đột biến tăng chức năng, có thể được phát hiện từ mẫu
DNA của người bệnh.
- Đột biến gen CALR - một gen mã hóa cho protein Calreticulin,
Calreticulin một protein chaperone của mạng lưới nội chất thường liên kết các

5


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

protein bị sai lệch trong ER và ngăn chặn việc xuất chúng sang Golgi. Hai loại
đột biến CALR đã biết trước đây CALR-type 1 và CALR-type 2.
- Đột biến gen MPL là các đột biến tăng chức năng liên quan gen MPL
(MPLW515L/K) gặp trong 5% trường hợp xơ tủy nguyên phát, còn lại khoảng
40% trường hợp xơ tủy nguyên phát chưa phát hiện đột biến gen[1].
1.2. Tổng quan về gen CALR
1.2.1. Đặc điểm di truyển của gen CALR
Vị trí của gen CALR nằm trên nhiễm sắc thể số 19, gồm 9 exon và kéo dài
4,2kb (Tọa độ bộ gen : 19:12.938.609-12.944.489) [17].

Hình 1.1. Vị trí của nhiễm sắc thể chứa gen CALR


Hình 1.2. Toạ độ của gen CALR trên nhiễm sắc thể số 19
Gen CALR cung cấp các hướng dẫn để tạo ra một loại protein đa chức năng
gọi là Calreticulin. Protein này được tìm thấy trong một số phần của tế bào, bao
gồm bên trong cấu trúc gọi là mạng lưới nội chất, tại không gian chứa đầy chất
lỏng bên trong tế bào (tế bào chất) và ở bề mặt bên ngoài của tế bào. ER tham
gia vào quá trình xử lý và vận chuyển protein, và trong cấu trúc này, Calreticulin
đóng vai trị đảm bảo sự gấp nếp thích hợp của các protein mới hình thành. ER

6


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

cũng là nơi lưu trữ các nguyên tử canxi tích điện (ion canxi) và Calreticulin
tham gia vào việc duy trì mức ion canxi chính xác trong cấu trúc này. Thông
qua việc điều chỉnh canxi và các cơ chế khác, Calreticulin được cho là có vai
trị kiểm soát hoạt động của gen, sự phát triển và phân chia tế bào (tăng sinh) và
di chuyển (di cư), sự gắn kết của các tế bào với nhau (sự kết dính) và quy định
về sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Chức năng của protein này
rất quan trọng đối với chức năng của hệ thống miễn dịch và chữa lành vết
thương.
Calreticulin là một protein chaperone có ba miền với các đặc tính gây ung
thư được phản ánh bởi miền đầu C. Miền đầu C của CALR đột biến khơng có
mơ-đun KDEL (KDEL là một trình tự gồm 4 acid amin: Lysin – Aspartate –
Glutamat – Leucin, có tác dụng như một tín hiệu cho việc lưu giữ protein này
tại lưới nội chất đồng thời thu hồi protein này từ bộ Golgi trở lại lưới nội chất
để thực hiện các chức năng quan trọng của nó), điều này rất quan trọng đối với

việc duy trì protein trong ER. Miền đầu C bị đột biến chứa một chuỗi axit amin
mới mang điện tích dương.

Hình 1.2. Cấu trúc của protein Calreticulin
(Nguồn: Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Hematology)
1.2.2. Vai trò của gen CALR trong hội chứng tăng sinh tủy
Đột biến gen CALR có ý nghĩa rất lớn ở những bệnh nhân MPNs. Đây là đột
biến gặp trong khoảng 25% trường hợp xơ tủy nguyên phát và là đột biến thường
gặp nhất sau JAK2V617F[18]. Các đột biến CALR gây ra các biến đổi liên quan
trực tiếp đến con đường truyền tín hiệu JAK-STAT và là nhân tố tiên lượng độc
lập về mức độ nguy cơ mắc bệnh. Khi xảy ra đột biến CALR, protein Calreticulin
bị thay đổi ở vùng C-terminus và làm mất vùng KDEL, dẫn tới sự tăng sinh bất
thường các dòng tế bào máu và sinh bệnh. Khi phân tích về thời gian sống tồn
bộ của các trường hợp xơ tủy nguyên phát, nhiều nghiên cứu đã cho thấy các

7


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

bệnh nhân mang đột biến CALR có nguy cơ tử vong thấp hơn so với các bệnh
nhân mang đột biến JAK2V617F hoặc MPL[8,
18].
Sự hiện diện của đột biến CALR đã được mô tả là một phát hiện đặc biệt
trong các trường hợp bệnh đa hồng cầu nguyên phát với vai trò gây bệnh chưa
biết. Kể từ khi được phát hiện, [19]. Giá trị chẩn đoán của xác nhận đột biến
CALR chỉ mới được xác định gần đây bằng cách đưa đột biến CALR vào tiêu
chí chẩn đoán ET/PMF trong bản sửa đổi năm 2016 đối với phân loại u nguyên

bào tủy và bệnh bạch cầu cấp tính của Tổ chức Y tế Thế giới[20]. Gen CALR
có nhiều kiểu đột biến khác nhau, tuy nhiên những đột biến thường gặp với tần
suất lớn gồm:
- Type 1: Đột biến mất đoạn 52 nucleotide (p. L367fs*46). Dạng đột biến
type 1 thường gặp tỷ lệ ≈ 50% các trường hợp đột biến CALR.
- Type 2: Đột biến thêm đoạn 5 nucleotide “TTGTC” (p. K385fs*47).
Dạng đột biến type 2 thường gặp ≈ 30% các trường hợp đột biến CALR.

Hình 1.3. Đột biến gen CALR type 1 và type 2 trên exon 9 [18]

8


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
196 bệnh nhân được đến khám và điều trị tại Viện Huyết học – Truyền máu
Trung ương trong thời gian từ tháng 05/2022 đến tháng 05/2023.
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn
- Bệnh nhân được chẩn đoán bước đầu là tăng sinh tủy mạn theo tiêu chuẩn
hướng dẫn chẩn đoán của WHO 2016
- Bệnh nhân đã được làm các xét nghiệm phát hiện đột biến JAK2V617F
theo phương pháp PCR (Quy trình đã được đánh giá và đạt chứng chỉ công nhận
ISO:15189), và CALR (type 1, type 2)
2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ
- Bệnh nhân thuộc nhóm tăng sinh tủy mạn có Ph (+).

- Các bệnh nhân được chẩn đoán tăng sinh tủy chưa được xếp loại, hoặc
tăng sinh tủy thứ phát: sau cắt lách, tăng sinh tủy phản ứng do lao, tăng hồng
cầu thứ phát, tăng tiểu cầu thứ phát.
2.1.4. Phương pháp chọn mẫu
Chọn mẫu thỏa mãn điều kiện tiêu chuẩn lựa chọn trên trong khoảng
thời gian
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu được tiến hành phân tích đánh giá tại Khoa Di truyền &
Sinh học phân tử, Viện Huyết học & Truyền máu Trung Ương.
2.2.2. Thời gian nghiên cứu
- Thời gian tiến hành nghiên cứu: Từ tháng 05/ 2022 đến tháng 05/ 2023.
- Thời gian thu thập mẫu: Từ tháng 12/2022 đến hết tháng 01/2023.
- Thời gian tối ưu, hồn thiện quy trình: Từ tháng 12/2022 đến tháng
05/2023.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: cắt ngang
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu

9


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

- Thu thập thông tin chọn lọc mẫu theo bảng khảo sát tổng hợp (phụ lục I) - Các
kỹ thuật xét nghiệm được tiến hành trong nghiên cứu:
+ Tách chiết DNA sử dụng hạt từ.
+ PCR.

+ Điện di.
2.3.3. Biến số nghiên cứu
Bảng 2.1. Các biến số trong nghiên cứu
Đặc điểm nghiên cứu

Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu

Biến số

Loại biến
số

Tuổi

Định lượng

Giới tính

Định tính

Thể bệnh
Gen đột biến
Ứng dụng quy trình

Gen đột biến

2.4. Vật tư, hóa chất và trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
- Mẫu nhóm bệnh nghiên cứu: Mẫu máu/ mẫu tủy đã được chống đông
EDTA và bảo quản ở tủ lạnh âm sâu (-80º).
- Bộ kit tách chiết DNA sử dụng hạt từ.

- Mồi dùng trong phản ứng PCR được thiết kế bởi.
- Master mix và hóa chất đi kèm dùng trong phản ứng PCR: GoTaq Green
Master Mix được cung cấp bới Promega.
- Máy chạy phản ứng PCR: ProFlex PCR System được sản xuất bởi
Thermo Fisher Scientific.
- Hình ảnh điện di được chụp trên máy UVP MultiDoc - Analytik Jena của
Mỹ và phần mềm xử lý VisionWorks.
- Máy tách chiết
- Máy NanoDrop đo nồng độ, độ tinh sạch DNA hãng Titertek- Berthold
của Đức.
- Hóa chất điện di: Gel Agarose, Ladder, đệm TBS.

10


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

- Bể điện di, máy chụp kết quả điện di.
- Các dụng cụ, vật tư tiêu hao có liên quan.
Bảng 2.2. Dụng cụ và vật tư tiêu hao sử dụng trong thí nghiệm
Tên dụng cụ

Hãng sản xuất

Nước sản xuất
Việt Nam

Pipette (1mL, 25mL)

Đầu côn pipette

Eppendorf

Đức

Pipette đa kênh

Eppendorf

Đức

Ống Falcon 15, 50mL

Corning

Hoa Kỳ

Ống Eppendorf 1,5mL

Corning

Hoa Kỳ

Đĩa 96 giếng

Corning

Hoa Kỳ


11


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

2.5. Quy trình nghiên cứu

Hình 2.1. Quy trình nghiên cứu
2.5.1. Quy trình kỹ chiết DNA tổng số sử dụng hạt từ
- Chuẩn bị các ống Eppendorf 1,5ml và mã hố thơng tin bệnh nhân, 1 đĩa
deep well 96 giếng kí hiệu Sample đồng thời mã hố các giếng theo thứ tự mẫu
sẽ chuyển vào ở bước sau.
- Thêm vào mỗi ống Eppendorf 250µl máu ngoại vi/ dịch tủy xương /200µl
cặn tế bào ối sau ni cấy.
- Thêm 20µl protease K.
- Thêm 290µl AL Buffer.
- Đồng nhất hỗn hợp bằng cách sử dụng bơm kim tiêm, hút mẫu lên, xuống
từ 3-5 lần.

12


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

+ Với mẫu tủy xương có thể tăng số lần thao tác trộn mẫu bằng bơm lên 510 lần để mẫu đồng nhất hoàn toàn.
- Chuyển dung dịch mẫu vào đĩa Sample, mỗi mẫu 1 giếng, theo sơ đồ.

- Thêm 500µl VHB Buffer vào đánh dấu là VHB1.
- Thêm 500µl VHB Buffer vào đánh dấu là VHB2.
- Thêm 500µl SPM Buffer vào đĩa 96 giếng đánh dấu là SPM.
- Thêm 500µl Elution B vào đĩa 96 giếng và đánh dấu là Water.
- Thêm 500µl Elution B vào đĩa 96 giếng và đánh dấu là Elution.
- Đặt Tipcomb 96 vị trí vào đĩa 96 giếng và đánh dấu là Tipcomb.
- Khởi chạy chương trình: “Blood _DNA_M6399” được lưu sẵn trên máy
tính.
- Đặt theo vị trí tương ứng được mơ tả trên màn hình máy tính.
- Sau khi có chng báo máy tạm dừng, lấy đĩa Sample ra khỏi máy.
- Thêm lần lượt 400µl HDQ Binding B và 20µl HDQ Magnetic Particles
vào mỗi giếng, trộn đều bằng pipet.
- Đưa đĩa Sample vào vị trí tương ứng trong máy → Nhấn Start để tiếp
tục chương trình tách DNA.
- Sau khi chuông báo kết thúc, lần lượt lấy các đĩa ra khỏi máy. Chuyển
dịch chứa DNA sang ống Eppendorf 1,5ml vô trùng đã ghi mã xét nghiệm trên
nắp và thành ống.
- Ly tâm 14000 rpm/ 1 phút.
- Dung dịch thu được là DNA. Bảo quản ở -20ºC.
2.5.2. Kiểm tra, đánh giá nồng độ DNA trên máy quang phổ Nano Drop
Nguyên lý: Dựa trên độ hấp phụ ánh sáng của các base nitơ ở bước sóng
260nm (A260). Phương pháp này giúp đánh giá được nồng độ và độ tinh sạch
của DNA. Độ hấp thụ ánh sáng của mẫu DNA pha loãng được đo ở bước sóng
260 và 280 nm.

13


Khóa luận tốt nghiệp


Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

Áp dụng định luật Beer-Lambert để tính tốn mật độ DNA:
A = ECL
Trong đó:
A: Độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng nhất định
C: Nồng độ acid nucleid
L: Chiều dài đường truyền của ánh sáng qua mẫu hay độ dày cuvet (1 cm)
E: Hệ số hấp thụ (đối với DNA E= 0,025 (mg/ml)-1cm-1).
- Tỷ số A260/A280 dùng để đánh giá độ tinh sạch của DNA.
+ A260/A280 ≈ 1.8 – 2.1 cho thấy DNA đã tinh sạch được tiếp tục cho chạy PCR
+ Việc nhiễm protein sẽ làm tỷ số 260/280 thấp hơn 1,8 ngoài ra sự hiện diện
của các chất hữu cơ như phenol, chloroform có thể ảnh hưởng đến nồng độ và độ
tinh sạch của DNA. Từ đó, ta cần phải thực hiện tách lại mẫu.
Mẫu DNA sau khi được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch được lưu ở tủ âm 20ºC
hoặc âm 80ºC.
2.5.3. Kỹ thuật PCR trong phát hiện đột biến CALR type 1 và type 2[21]
Kỹ thuật PCR được chúng tôi chọn vì thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần
khoảng 1 giờ 10 phút là có thể khuếch đại được một trình tự đang quan tâm.
Thực hiện đơn giản và ít tốn kém trong ống plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu
và tiến hành đồng thời được nhiều phản ứng.
Trong nghiên cứu này, tôi chọn sử dụng phương pháp PCR cho phép nhân
lên một cách chính xác đoạn DNA đang quan tâm lên hàng triệu lần, với đoạn
mồi đặc trưng để phát hiện đột biến. Phản ứng dựa trên sự thay đổi nhiệt độ theo
chu kỳ, trải qua 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1 - Biến tính: DNA khn được biến tính từ mạch đơi thành
mạch đơn ở nhiệt độ cao (95ºC).
- Giai đoạn 2 - Gắn mồi: Nhiệt độ được hạ thấp xuống từ 55ºC đến 65ºC
để tạo điều kiện cho mồi gắn vào DNA khuôn.
- Giai đoạn 3 - Kéo dài và nhân lên đoạn DNA đích: Nhiệt độ tăng được

lên khoảng 72ºC cho enzyme DNA polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài
chuỗi DNA nhờ trình tự mồi. Sau 3 bước nhiệt độ, chu trình phản ứng được lặp
lại liên tiếp từ 40 chu kì.

14


Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

- GoTaq Green Master Mix được cung cấp bởi Promega là master mix 2X
sẵn sàng sử dụng bao gồm đầy đủ các thành phần của một phản ứng PCR như
GoTaq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl 2 và dung dịch đệm phản ứng ở nồng
độ tối ưu để khuếch đại hiệu quả các mẫu DNA bằng PCR. 2X GoTaq MM cũng
bao gồm hai thuốc nhuộm (xanh dương và vàng) cho phép theo dõi tiến trình di
chuyển của DNA trên bản gel trong quá trình điện di. Thuốc nhuộm màu xanh
nặng hơn nên khi điện di sẽ kéo DNA rơi xuống giếng khi di chuyển trong gel
agarose. Thuốc nhuộm màu vàng di chuyển trước mồi (<50bp).
Chúng tôi chọn sử dụng cặp mồi dụng mồi phù hợp và đặc trưng cho từng
đột biến nhằm áp dụng và đạt được kết quả như mong muốn. Để phát hiện đột
biến CALR type 1 sử dụng cặp mồi CALR x9F (mồi đầu xuôi) và Primer CALRtype1_mutR (mồi đầu ngược). Trong phát hiện đột biến CALR type 2 chúng tôi
sử dụng cặp mồi CALR x9F và CALR x 9R; CALR-type2_mutR.

Hình 2.2. Ngun lí của phản ứng PCR
( Nguồn ảnh: Antisense Science)

15



Khóa luận tốt nghiệp

Phạm Thị Phương Thảo - K8 Kỹ thuật xét nghiệm y học

Hình 2.3. Vị trí của mồi đầu (F) Forward và mồi đầu (R) Reverse
Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng được sử dụng trong các quy trình
phát hiện đột biến như sau:
Bảng 2.3. Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR phát hiện đột
biến CALR type 1
Thành phần

Ý nghĩa

Primer CALR x9F

Mồi cho gen bình thường
(chiều xuôi)

Primer
CALRtype1_mutR

Mồi cho gen đột biến (chiều
ngược)

H2O
2X GoTaq MM

Nguyên liệu của phản ứng
PCR


DNA

Mẫu bệnh nhân cần xét
nghiệm.

16

Điều kiện phản
ứng

95ºC, 3 phút
[95ºC, 20 giây
60ºC, 25 giây
72ºC, 30 giây]
x 40 chu kỳ
72ºC, 1 phút
15ºC, forever.