ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

DƯƠNG KHÁNH LINH

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN A-GLOBIN TRONG
CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH ALPHA THALASSEMIA
TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG TỪ
NĂM 2022 ĐẾN THÁNG 2 NĂM 2023

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KỸ THUẬT XÉT
NGHIỆM Y HỌC

Hà Nội – 2023


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

DƯƠNG KHÁNH LINH

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN A-GLOBIN TRONG
CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH ALPHA THALASSEMIA
TẠI VIỆN HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU TRUNG ƯƠNG TỪ
NĂM 2022 ĐẾN THÁNG 2 NĂM 2023

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KỸ THUẬT XÉT
NGHIỆM Y HỌC
Khóa: QH 2019.XN
Người hướng dẫn: 1. TS. Dương Quốc Chính
2. ThS.BSNT. Nguyễn Minh Thu

Hà Nội – 2023


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Dương Quốc
Chính – Giảng viên Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội, TS. Phạm
Thị Hồng Nhung – Giảng viên Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc gia Hà Nội,
những người thầy đã tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành đề tài khóa luận này,
ln hướng dẫn chỉ bảo tận tình, cho tơi nhiều ý kiến nhận xét quý báu cũng như
truyền đạt cho tôi tinh thần học hỏi, làm việc nghiêm túc trong q trình tơi thực hiện
khóa luận này.
Tơi xin chân thành cảm ơn ThS. BSNT Nguyễn Minh Thu – Khoa Di truyền
và Sinh học phân tử - Viện Huyết học Truyền máu Trung ương luôn tận tâm giúp đỡ
tôi trong quá trình học tập nghiên cứu, cung cấp cho tơi kiến thức, dữ liệu, thơng tin
cần thiết, nhiệt tình góp ý, sẵn sàng giải đáp mọi thắc mắc cũng như tạo mọi điều kiện
thuận lợi cho việc lập kế hoạch, triển khai và hồn thành khóa luận một cách tốt nhất.
Để thực hiện tốt khóa luận này, tơi trân trọng cảm ơn sự tài trợ của Viện Huyết
học -Truyền máu Trung ương cho đề tài. Trong quá trình học tập, làm việc và thực
hiện khóa luận, tơi đã nhận được sự giúp đỡ của các quý thầy cô, anh chị và các bạn
sinh viên làm việc và thực tập tại Khoa Di truyền – Sinh học phân tử. Tôi xin chân
thành cảm ơn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường, cùng tồn thể các thầy cơ
giáo trong Trường Đại học Y dược- Đại học Quốc gia Hà Nội đã truyền đạt cho tôi
những kiến thức quý báu trong q trình học tập tại trường.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã ln bên
cạnh, động viên, khích lệ tơi trong lúc khó khăn cũng như trong q trình thực hiện
khóa luận này.

Hà Nội, ngày 23 tháng 05 năm 2023


Dương Khánh Linh


DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Acid Deoxyribo Nucleotit

ARN

Acid ribonucleic

ddNTP

Dideoxynucleotide triphosphate

dNTP

Deoxynucleotide triphosphate

DPG

Diphosphoglycerate

FIL

Filipino

GAP - PCR


GAP - Polymerase Chain Reaction (PCR khoảng cách)

Hb

Hemoglobin (Huyết sắc tố)

HbCs

Hemoglobin Constant Spring

HbF

Hemoglobin Fetal

HbQs

Hemoglobin Quong Sze

HPLC

High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp)

MCV

Mean Corpuscular Volume (Thể tích trung bình hồng cầu)

MCH

Mean corpuscular Hemoglobin (Lượng huyết sắc tố trung bình

hồng cầu)

MCHC

Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration (Nồng độ huyết
sắc tố trung bình trong hồng cầu)

MLPA

Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification


NST

Nhiễm sắc thể

NGS

Next generation sequencing (Giải trình tự thế hệ mới)

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

RDW

Red Cell Distribution With (Dải phân bố hồng cầu)

SEA


South East Asian (Đông Nam Á)

THAI

Thái Lan

ARMS – PCR

Amplification-refractory mutation system


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Một số loại đột biến phổ biến của bệnh alpha thalassemia.........................6
Bảng 3.1. Tuổi trung bình của đối tượng nghiên cứu..................................................23
Bảng 3.2. Đặc điểm về tiền sử sản khoa của thai phụ.................................................24
Bảng 3.3. Đặc điểm siêu âm thai tại thời điểm xét nghiệm.........................................25
Bảng 3.4. Kiểu gen của thai phụ có nguy cơ cao sinh con mắc bệnh...........................26
Bảng 3.5. Đặc điểm huyết học theo kiểu gen của thai phụ có nguy cơ cao..................26
Bảng 3.6. Đặc điểm thành phần Hb theo kiểu gen alpha thalassemia ở thai phụ.........27
Bảng 3.7. Các kiểu đột biến gen α globin phát hiện được trên thai nhi.......................29


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1. Đặc điểm phân bố các đột biến gen chính của bệnh alpha thalassemia trên
thế giới ....................................................................................................... 3
Hình 1.2. Cấu trúc của phân tử Hemoglobin ............................................................5
Hình 1.3. Cấu trúc cụm gen α-globin ........................................................................5
Hình 1.4. Mối quan hệ kiểu gen - kiểu hình trong bệnh αlpha thalassemia .............7

Hình 1.5. Trẻ sơ sinh mắc hội chứng hemoglobin Bart's hydrops. ...........................8
Hình 1.6. Hồng cầu bất thường trong bệnh Thalassemia ..........................................9
Hình 1.7. Cơ chế di truyền bệnh alpha thalassemia ................................................11
Hình 1.8. Phát hiện các đột biến mất đoạn α3.7 bằng GAP – PCR ........................13
Hình 1.9. Hình ảnh đột biến --SEA/αα trên thanh test α – Globin Strip Assay ......14
Hình 1.10. Kết quả MLPA của người lành mang đột biến -αHbCs ..........................16
Hình 2.

Sơ đồ nghiên cứu .....................................................................................18

Hình 3.1. Phân bố nhóm tuổi của đối tượng nghiên cứu .........................................23
Hình 3.2. Tuổi của thai khi được làm xét nghiệm....................................................24
Hình 3.3. Tỷ lệ thiếu máu ở thai phụ........................................................................25
Hình 3.4. Kết quả chẩn đốn trước sinh tế bào dịch ối thai nhi ..............................28
Hình 3.5. Tỷ lệ các loại alen đột biến của thai nhi ..................................................30


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. Định nghĩa và đặc điểm dịch tễ của bệnh alpha thalassemia............................3
1.2. Cơ sở di truyền bệnh alpha thalassemia ...........................................................4
1.2.1. Sinh lý hồng cầu .........................................................................................4
1.2.2. Đột biến gen gây bệnh alpha thalassemia ..................................................5
1.3. Mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình ........................................................6
1.3.1. Bệnh phù thai hemoglobin Bart’s – thể nặng .............................................7

1.3.2. Bệnh hemoglobin H – thể trung gian .........................................................8
1.3.3. Thể nhẹ và thể ẩn........................................................................................9
1.4. Đặc điểm cận lâm sàng .....................................................................................9
1.5. Quy luật di truyền ...........................................................................................10
1.6. Tầm quan trọng của chẩn đoán trước sinh bệnh alpha Thalassemia ..............11
1.7. Phương pháp xác định đột biến gen alpha thalassemia ..................................12
1.7.1. GAP - PCR (GAP - Polymerase Chain Reaction) ...................................12
1.7.2. Strip Assay ...............................................................................................13
1.7.3. Giải trình tự Sanger ..................................................................................14
1.7.4. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) .................15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................17
2.1. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................17
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...............................................................................17
2.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................17


2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................17
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ..................................................................................17
2.2.2. Cỡ mẫu và cách chọn mẫu .......................................................................17
2.2.3. Tiến trình nghiên cứu ...............................................................................18
2.2.3.1. Sơ đồ nghiên cứu ...............................................................................18
2.2.3.2. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu ...........................................19
2.2.3.3. Các phương pháp và kỹ thuật xét nghiệm.........................................19
2.3. Các biến số và chỉ số nghiên cứu....................................................................20
2.4. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu ...........................................................22
2.5. Đạo đức nghiên cứu ........................................................................................22
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ .........................................................................................23
3.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu ...............................................................23
3.1.1. Tuổi của thai phụ ......................................................................................23
3.1.2. Tiền sử sản khoa của thai phụ ..................................................................24

3.1.3. Đặc điểm của thai khi làm xét nghiệm .....................................................24
3.2. Một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của thai phụ có nguy cơ cao sinh
con mắc bệnh alpha thalassemia ............................................................................25
3.2.1. Tỷ lệ thiếu máu của thai phụ ....................................................................25
3.2.2. Kết quả xét nghiệm đột biến gen của mẹ .................................................26
3.2.3. Một số chỉ số huyết học ở thai phụ có nguy cơ cao .................................26
3.3. Kết quả xét nghiệm đột biến gen α-globin từ bệnh phẩm nước ối của thai phụ
có nguy cơ cao sinh con mắc bệnh alpha thalassemia ...........................................28
3.3.1. Về số lượng đột biến gen của thai nhi ......................................................28
3.3.2. Kiểu gen alpha thalassemia của thai nhi ..................................................29
3.3.3. Số lượng alen đột biến của thai nhi ..........................................................30
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .......................................................................................31
4.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu ....................................................31


4.2. Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của các thai phụ có nguy cơ cao sinh con
mắc bệnh alpha thalassemia...................................................................................33
4.3. Kết quả xét nghiệm đột biến gen của thai nhi ................................................37
KẾT LUẬN ..............................................................................................................40
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh alpha thalassemia là nhóm bệnh lý huyết học gây ra bởi đột biến gen làm
mất hoặc giảm khả năng tổng hợp chuỗi alpha globin cấu tạo nên phân tử huyết sắc
tố của hồng cầu. Bệnh xuất hiện ở tất cả các khu vực, các quốc gia cũng như các
chủng tộc trên thế giới, với khoảng 5% dân số thế giới mang gen bệnh [1]. Đây là
bệnh đơn gen do đột biến gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường nên có khả năng di

truyền liên tục qua các thế hệ và khuếch tán âm ỉ trong cộng đồng, đặc biệt là ở các
nhóm dân tộc thiểu số có hơn nhân cận huyết, làm gia tăng tỉ lệ mang gen và tăng sự
biểu hiện gen đột biến trong cộng đồng. Tùy vào số lượng alen đột biến mà trẻ sinh
ra có các biểu hiện lâm sàng khác nhau. Với thể lâm sàng nặng, trẻ có thể phải điều
trị truyền máu và thải sắt suốt đời. Điều này sẽ ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống
của chính bệnh nhân cũng như trở thành gánh nặng về kinh tế cho gia đình và xã hội
khi phải chịu chi phí điều trị tốn kém. Ngoài ra, sản phụ sinh con mắc bệnh alpha
thalassemia có thể gặp nguy hiểm do tăng nguy cơ gặp các tai biến sản khoa. Với thể
lâm sàng nhẹ hoặc thể ẩn, mặc dù không biểu hiện triệu chứng nhưng vẫn có khả
năng di truyền gen bệnh cho thế hệ sau [2].
Hiện nay, trên thế giới có hơn 200 quốc gia và vùng lãnh thổ chịu ảnh hưởng
bởi căn bệnh này và nó cũng là vấn đề sức khỏe nghiêm trọng ở Đơng Nam Á trong
đó có Việt Nam. Theo nghiên cứu gần đây về thực trạng bệnh huyết sắc tố ở nước ta
cho thấy bệnh thalassemia thực sự là vấn đề nghiêm trọng, đe dọa chất lượng dân số
và giống nòi khi tất cả 63 tỉnh và 54 dân tộc đều có người mang gen bệnh, tỷ lệ mang
gen chung trên tồn quốc ước tính là 13,8% (khoảng 13-14 triệu người). Ước tính
nguy cơ và tỷ lệ thai nhi bị phù thai, trẻ sinh ra bị bệnh thalassemia thể nặng là đáng
báo động ở 21 tỉnh/thành phố trên cả nước [3]. Tuy nhiên, bệnh alpha thalassemia có
thể phòng và điều trị được. Các bằng chứng đã chỉ ra rằng việc mở rộng sàng lọc, tư
vấn di truyền kết hợp với chẩn đoán trước sinh ở những cặp đơi có nguy cơ cao sinh
con mắc bệnh thalassemia thể nặng, chẩn đoán và điều trị sớm đã giúp giảm tỷ lệ tử
vong cũng như tỷ lệ mắc bệnh thalassemia [4, 5]. Trong chẩn đốn trước sinh, các
thai phụ có nguy cơ cao sau khi được sàng lọc về công thức máu sẽ được chẩn đoán
xác định qua siêu âm phát hiện phù thai hoặc thơng qua chọc dị dịch ối để làm xét
nghiệm gen. Các kỹ thuật xét nghiệm di truyền phân tử vẫn được xem là tiêu chuẩn
vàng để chẩn đoán xác định phần lớn các bệnh di truyền nói chung cũng như bệnh
alpha thalassemia nói riêng.

1



Như vậy, tầm soát và chẩn đoán trước sinh bệnh alpha thalassemia là việc
phòng ngừa quan trọng để giảm tỷ lệ phù thai hoặc trẻ sinh ra bị bệnh thalassemia thể
nặng. Tại miền Bắc Việt Nam, có nhiều nghiên cứu về bệnh thalassemia song có rất
ít nghiên cứu tiến hành sàng lọc và chẩn đoán trước sinh bệnh alpha thalassemia ở
phụ nữ có thai. Vì vậy, tơi thực hiện đề tài “Khảo sát đặc điểm đột biến gen α-globin
trong chẩn đoán trước sinh bệnh alpha thalassemia tại Viện huyết - Truyền máu
Trung ương từ năm 2022 đến tháng 2 năm 2023” nhằm đạt được 2 mục tiêu sau:
1. Mô tả được một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của thai phụ có nguy
cơ cao sinh con mắc bệnh alpha thalassemia.
2. Mô tả được kết quả xét nghiệm đột biến gen α-globin từ bệnh phẩm nước
ối của thai phụ có nguy cơ cao sinh con mắc bệnh alpha thalassemia.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Định nghĩa và đặc điểm dịch tễ của bệnh alpha thalassemia
Bệnh alpha thalassemia là bệnh tan máu di truyền bẩm sinh gây ra do đột biến
làm giảm hoặc mất hẳn sự tổng hợp chuỗi α-globin trong phân tử hemoglobin [6]. Sự
suy giảm này có thể dẫn đến tăng tổng hợp quá mức chuỗi β-globin tạo phân tử γ4 ,
gọi là Hb Bart’s (trong thời kỳ mang thai), và β4, gọi là HbH (trong thời kỳ trưởng
thành). Mức độ biểu hiện bệnh tùy thuộc vào số lượng đột biến, kiểu đột biến và giai
đoạn phát triển của cá thể.
Bệnh alpha thalassemia xuất hiện rộng rãi ở Châu Phi, các nước Địa Trung
Hải, Trung Đông và Đông Nam Á (ĐNA), với khoảng 5% dân số thế giới mang gen
bệnh và có tỉ lệ hiện mắc khác nhau giữa các quốc gia và dân tộc [1, 6] (Hình 1.1).
Ở Đơng Nam Á, tỷ lệ người mang gen bệnh thalassemia rất cao. Theo Suthat
Fucharoen (2011), vùng biên giới giữa các nước Thái Lan, Lào và Campuchia có tới
30 - 40% người mang gen bệnh alpha thalassemia [7]. Tại Trung Quốc, người mang

gen alpha thalassemia chiếm 5-15% dân số, Hồng Kơng 4%, Thái Lan 15-30%, Lào
43%, Việt Nam 5%.

Hình 1.1. Đặc điểm phân bố và đột biến gen chính của bệnh alpha thalassemia
trên thế giới [1]

3


Thể bệnh lâm sàng nặng nhất Hb Bart’s được tìm thấy với tần số cao ở khu
vực này và một số khu vực Địa Trung Hải. Các đặc điểm alpha thalassemia được cho
là có khả năng bảo vệ cơ thể chống lại bệnh sốt rét vì chúng có thể được tìm thấy ở
90% dân số ở những quần thể có tỉ lệ mắc bệnh sốt rét cao [6, 8].
1.2. Cơ sở di truyền bệnh alpha thalassemia
1.2.1. Sinh lý hồng cầu
Hồng cầu là những tế bào máu khơng có nhân, hình đĩa lõm hai mặt có chức
năng cơ bản là vận chuyển khí. Hồng cầu vận chuyển oxy hịa tan từ phổi đến các mô
cơ quan và tế bào trong cơ thể thơng qua vai trị chủ yếu của huyết sắc tố-Hemoglobin
(Hb) có trong hồng cầu. Đồng thời, Hb vận chuyển khí CO2 chủ yếu dưới dạng ion
bicacbonat (HCO3-) hồ tan trong huyết tương đến phổi để thải ra môi trường ngồi
nhờ enzyme carbonic anhydrase. Hemoglobin là thành phần chính có trong hồng cầu,
đảm nhận nhiệm vụ vận chuyển khí cũng như có vai trị là hệ thống đệm cân bằng pH
máu. Hb được chứa trong hồng cầu để tránh bị thất thốt qua nước tiểu khi nó ở dạng
tự do [9].
Hemoglobin là một protein phức, chiếm 33% trọng lượng hồng cầu và có cấu
tạo phù hợp với chức năng vận chuyển khí. Một phân tử huyết sắc tố gồm 4 tiểu đơn
vị (tetramer), mỗi tiểu đơn vị (monomer) cấu tạo bởi 1 nhân Hem liên kết 1 phân tử
globin (Hình 1.2). Hem có cấu trúc là một vịng porphyryl với 4 nhân pyrol liên kết
với ion Fe++ tạo thành vị trí gắn với O2, CO2 hoặc diphosphoglycerate (DPG). Globin
là chuỗi polypeptide có cấu trúc bậc 4 thuộc 2 họ alpha và khơng alpha. Họ alpha

gồm chuỗi α và ζ, có 141 acid amin được mã hóa bởi gen nằm trên NST 16. Họ không
alpha gồm chuỗi: β, δ, γ, ε, có 146 acid amin do các gen nằm trên NST 11 chi phối.
Tùy theo giai đoạn phát triển cá thể mà globin gồm các chuỗi polypeptid khác nhau.
Trong giai đoạn phôi, Hb chủ yếu là Hb Gower I (ξ2ε2). Hb Gower II (α2ε2) và Hb
Portland (ξ2γ2) được thấy trong giai đoạn khi những gen của phơi đóng và những gen
của thai mở. Trong giai đoạn thai, Hb chủ yếu là HbF, gồm 2 chuỗi α và 2 chuỗi γ
(α2γ2). Trong giai đoạn trưởng thành, Hb chủ yếu là HbA (α2β2) và một ít HbA2
(α2δ2). Người trưởng thành bình thường có 96 – 98% là HbA, khoảng 2% HbA2 và
khoảng 0,5% HbF [10, 11].

4


Hình 1.2. Cấu trúc của phân tử Hemoglobin [11]
1.2.2. Đột biến gen gây bệnh alpha thalassemia
Họ gen α globin nằm trên cánh ngắn NST 16 (16p13.3) gồm 3 gen chức năng
là ζ, α1, α2 và 4 gen giả ψζ1, ψα1, ψα2, θ (Hình 1.3). Gen alpha 1 có chiều dài 840
bp gồm 3 exon và 2 intron, gen alpha 2 có chiều dài 830 bp gồm 3 exon và 2 intron.
Số lượng chuỗi α-globin được tổng hợp phụ thuộc vào số gen alpha hoạt động. Ngồi
ra, do trình tự khởi động (promoter) của 2 gen alpha khác nhau nên mức độ biểu hiện
của gen alpha 2 gấp 2-3 lần gen alpha 1 [12-14]. Do đó, đột biến xảy ra trên gen alpha
2 thường có hậu quả nặng nề hơn đột biến ở gen alpha 1.

Hình 1.3. Cấu trúc cụm gen α-globin [15]

5


Đột biến trên gen alpha có thể dẫn đến giảm sản xuất chuỗi α globin (α+thalassemia) hoặc không tổng hợp chuỗi a globin (α0-thalassemia). Hiện nay, trên thế
giới đã phát hiện được trên 500 đột biến gen alpha, trong đó có đến 90% là đột biến

mất đoạn [16, 17]. Trao đổi chéo không cân là nguyên nhân phổ biến gây xuất hiện
đột biến mất 1 gen alpha như -α4.2 , -α3.7 ,... Các đột biến mất cả 2 gen alpha như -SEA , -- THAI , -- FIL , -- 20.5,... thường do khuyết đoạn lớn trên NST 16 và đột
biến điểm [18]. Đột biến điểm ít phổ biến hơn do thêm, bớt, thay thế một hoặc một
vài nucleotit dẫn đến bất thường tổng hợp chuỗi globin và tạo ra huyết sắc tố khác
như Hb Constant spring - HbCs, HbQs, Hekinan,.... (Bảng 1.1).
Bảng 1.1. Một số loại đột biến phổ biến của bệnh alpha thalassemia [17]
Loại allen

Kiểu gen đột biến

Đột biến phổ biến

Alen α0-thalassemia
(--)

-/αα

-- SEA , -- THAI , -- FIL

-α/αα

-α3.7 và -α4.2

αTα/αα

αPA(AATAAG)α, αCSα

ααT/αα

HBA1: c.223G>C (HbQ-Thailand)


Alen α+-thalassemia
(-α) hoặc (αTα)

1.3. Mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình
Tùy thuộc vào mức độ tổn thương gen alpha mà có các thể bệnh lâm sàng khác
nhau tùy thuộc vào số lượng gen α-globin bị đột biến: Thể ẩn do đột biến liên quan
đến 1 gen, có thể do mất hẳn một allen hay đột biến điểm; Thể nhẹ do mất 2 allen
trên cùng một NST hoặc trên 2 NST tương đồng; Bệnh HbH có đột biến xảy ra ở 3
allen làm giảm hẳn khả năng tổng hợp chuỗi α-globin nên biểu hiện triệu chứng trên
lâm sàng; Hội chứng phù thai Hb Bart’s có đột biến ở cả 4 allen gây ra các biểu hiện
lâm sàng: phù thai, thiếu máu, suy tim, gan lách to, hệ thần kinh và sinh dục phát triển
bất thường,... Trẻ mắc bệnh này thường tử vong trước khi sinh nếu khơng được can
thiệp điều trị y khoa thích hợp (Hình 1.4).

6


Hình 1.4. Mối quan hệ kiểu gen kiểu hình trong bệnh alpha thalassemia [1]
1.3.1. Bệnh phù thai hemoglobin Bart’s – thể nặng
Đây là thể bệnh alpha thalassemia nặng nhất, phổ biến khắp vùng Đông Nam
Á do mất cả 4 gen α với biểu hiện đặc trưng: thai phù, vàng da, thiếu máu nặng, gan
và lách to, khuyết tật tim, bất thường hệ sinh sản và tiết niệu. Huyết sắc tố chủ yếu ở
thai nhi bình thường là HbF gồm 2 chuỗi globin α và γ. Khi mất cả 4 gen α, cơ thể
không tổng hợp được chuỗi α nên 4 chuỗi γ trùng hợp lại với nhau tạo nên huyết sắc
tố Bart’s – Hb Bart’s (γ4) có ái lực cao với oxy nên không nhả oxy cho tổ chức để
duy trì sự sống [19]. Hb Bart’s kết tụ lại làm giảm thời gian tồn tại hồng cầu và sinh
hồng cầu khơng hiệu lực. Do vậy, thai nhi có biểu hiện thiếu máu trầm trọng và thiếu
oxy bào thai [20].
Thai nhi mang Hb Bart’s phát triển bình thường ở giai đoạn đầu do còn một

lượng Hb bào thai Portland (ζ2γ2) tồn tại, có khả năng vận chuyển oxy để duy trì sự
sống và phát triển của thai nhi. Sau đó, khi oxy khơng cịn được cung cấp dẫn đến
tình trạng suy tim gây nên phù thai hoặc phù rau thai do ứ nước. Thiếu oxy làm rối
loạn quá trình hình thành cơ quan và phát triển thai nhi với nhiều dị tật được báo cáo
như: tật đầu nhỏ; dị tật tim, phổi, xương; khuyết tật chi [21];...Tiên lượng của thai rất

7


xấu: thai có thể chết trong tử cung hoặc ngay sau khi sinh nếu khơng được điều trị.
Tình trạng thiếu máu kích thích tăng sinh máu ở tủy xương và hấp thu sắt ở ruột. Tăng
sinh tạo máu phản ứng gây phì đại các xương dẹt làm biến dạng đầu, mặt như trán
dô, mũi tẹt, bướu chẩm… cùng với biểu hiện quá tải sắt: da sạm đen, khô; tổn thương
cơ quan như suy gan, suy nội tiết, suy tim. Đối với sản phụ, hội chứng Bart’s có thể
gây ra những biến chứng nguy hiểm trong quá trình mang thai như huyết áp cao kèm
theo phù người, sinh non, ra máu bất thường. Đặc biệt ở giai đoạn muộn của phù thai
người mẹ dễ bị tiền sản giật và tăng nguy cơ mắc các tai biến sản khoa như tiền sản
giật và băng huyết sau sinh [19].

Hình 1.5. Trẻ sơ sinh mắc hội chứng Hemoglobin Bart’s Hydrops [20]
Trẻ được sinh mổ khi thai được 31 tuần tuổi và đã tử vong trong vòng một giờ sau
khi sinh mặc dù đã hồi sức tích cực. (A) phù mặt và căng chướng bụng. (B) Khoang
ngực được lấp đầy bởi túi màng ngoài tim căng phồng do tràn dịch và tim to; có
gan to.
1.3.2. Bệnh hemoglobin H – thể trung gian
Chỉ còn 1 gen α hoạt động do mất đoạn hoặc đột biến làm ngừng tổng hợp
globin ở 3 gen. Cơ thể người bệnh không sản xuất đủ chuỗi α globin để tạo nên HbA
(α2β2), thay vào đó có sự tăng sản xuất chuỗi β globin. Cứ 4 phân tử β globin (β4) sẽ
kết hợp lại thành một Hb mới trong máu của người bệnh là hemoglobin H (HbH).
HbH có chức năng tương tự HbA trong việc tiếp nhận và giải phóng oxy của cơ thể.

Tuy nhiên cấu trúc của HbH không bền vững như HbA nên hồng cầu dễ bị phá hủy

8


hơn, có đời sống ngắn hơn dẫn đến biểu hiện lâm sàng là thiếu máu vừa hoặc nặng,
biểu hiện ngay từ khi mới sinh, có thể kèm theo các biến chứng khác như gan to, lách
to, viêm túi mật, sỏi mật, tăng nguy cơ nhiễm khuẩn, vàng da, huyết khối… đặc biệt
trong các trường hợp thiếu máu nặng cần truyền máu thường xuyên [22, 23].
Đa số người bệnh HbH có biểu hiện thiếu máu nhẹ, không cần truyền máu, chỉ
cần khám và theo dõi định kỳ. Một số người bệnh có biểu hiện thiếu máu trầm trọng
bắt buộc phải điều trị. Những người bị bệnh HbH cần được tư vấn trước kết hơn và
sàng lọc trước sinh vì họ là người truyền gen bệnh cho thế hệ sau.
1.3.3. Thể nhẹ và thể ẩn
Thể ẩn hay thể mang gen α+-thalassemia, do đột biến một gen α globin còn thể
nhẹ hay thể mang gen α0-thalassemia, do đột biến hai gen α globin. Hai thể đều khơng
có biểu hiện triệu chứng trên lâm sàng nên khơng thể phân biệt với người bình thường.
Trong cơng thức máu, thể nhẹ có thiếu máu hồng cầu nhỏ nhược sắc mức độ từ nhẹ
đến trung bình, với MCV, MCH giảm trong cơng thức máu. Thể ẩn có các tế bào
hồng cầu bình thường hoặc hơi nhỏ. Xét nghiệm máu định kỳ không phát hiện được
người mang mầm bệnh ẩn mà chỉ có thể xác nhận bằng xét nghiệm di truyền. Thể
nhẹ phổ biến ở các nước Đông Nam Á và Châu Phi [24].
1.4. Đặc điểm cận lâm sàng
Tổng phân tích tế bào máu ngoại vi: Hb giảm, hồng cầu nhỏ (MCV giảm),
hồng cầu nhược sắc (MCH giảm) do giảm tổng hợp chuỗi α globin. Thiếu máu sẽ
kích thích tủy xương tăng sinh hồng cầu nên chỉ số kích thước hồng cầu khơng đều
(RDW tăng), hồng cầu đa hình thái như hồng cầu bia bắn, hình giọt nước, có hồng
cầu non ra máu ngoại vi, số lượng hồng cầu lưới tăng [9, 25] (Hình 1.6).
HC bình thường


HC bất thường

Hình 1.6. Hồng cầu bất thường trong bệnh thalassemia [9]
Sinh hóa máu
9


Bilirubin toàn phần tăng, Bilirubin gián tiếp tăng
Biểu hiện thừa sắt: sắt huyết thanh, ferritin và độ bão hòa transferrin tăng,...
Biểu hiện của suy tuyến nội tiết: có thể thay đổi chỉ số hormon: Tuyến yên
(LH, GH, ACTH, FSH,...), tuyến sinh dục (FSH, Estradiol, progesterone, prolactin,
testosterone, GnRH, IGFI,…), tuyến giáp (T3, T4, FT3, FT4, TSH), tuyến cận giáp
(PTH, calcitonin), tụy nội tiết (Insulin, peptide C, Fructosamine, HbA1C),...
Có thể thay đổi các chỉ số khác: Glucose, GOT, GPT, phosphatase kiềm, GGT,
Ure, creatinin, acid uric, Protein, Albumin, Globulin, LDH, Canxi, Phosphate,
Magne, Vitamin B12, Acid folic,...[26]
Chẩn đốn hình ảnh: Siêu âm thai thấy phù, X – Quang xương,...
Điện di huyết sắc tố: thay đổi tỉ lệ huyết sắc tố: HbA, HbA2 giảm giảm kết nối
giữa chuỗi α với các chuỗi β, δ, γ; xuất hiện các huyết sắc tố bất thường như: HbH,
Hb Bart's, HbCs, HbQs,...[25]
Di truyền phân tử: các xét nghiệm di truyền học phân tử như Multiplex PCR,
ARMS – PCR, giải trình tự gen, … để phân tích các đột biến gen trên các gen α: -SEA , -- THAI , -- FIL , -α4.2 , -α3.7,...
1.5. Quy luật di truyền
Bệnh tuân theo quy luật: gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể (NST) thường. Gen
gây bệnh nằm trên cánh ngắn NST 16. Về cơ chế di truyền, bệnh có thể do gen bệnh
truyền từ bố mẹ sang con cái hoặc do đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao
tử ở bố hoặc mẹ. Bệnh do gen lặn trên NST thường nên tỉ lệ nam và nữ bị bệnh như
nhau. Con nhận 1 NST 16 từ bố, 1 NST 16 từ mẹ, 1 NST 16 bình thường mang 2 gen
alpha. Do đó nguy cơ mắc, mức độ biểu hiện bệnh tùy thuộc vào số gen bị đột biến
mà người con nhận được từ bố mẹ.

- Nếu cả bố và mẹ cùng mang gen bệnh thì mỗi lần sinh có 25% nguy cơ con
bị bệnh, 50% con mang gen bệnh và 25% con bình thường.
- Nếu bố hoặc mẹ là người mang gen, người cịn lại bình thường thì mỗi lần
sinh có 50% con bình thường và 50% con mang gen.
- Nếu bố hoặc mẹ là người bị bệnh, người còn lại bình thường thì mỗi lần sinh
có 100% con mang gen bệnh.
- Nếu bố hoặc mẹ là người bị bệnh, người cịn lại mang gen thì mỗi lần sinh
có 50% sinh con bị bệnh và 50% con mang gen.
10


- Nếu cả bố và mẹ đều bị bệnh thì 100% sinh con bị bệnh.

Hình 1.7. Cơ chế di truyền bệnh alpha thalassemia [27]
1.6. Tầm quan trọng của chẩn đoán trước sinh bệnh alpha Thalassemia
Bệnh alpha Thalassemia là bệnh tan máu bẩm sinh nguy hiểm nếu khơng được
tầm sốt, theo dõi và can thiệp kịp thời có thể dẫn đến nhiều ảnh hưởng xấu về di
truyền và sự phát triển của giống nòi. Bệnh do đột biến gen lặn trên NST thường gây
ra nên gen bệnh được di truyền liên tục qua các thế hệ. Mặc dù việc chẩn đoán và
điều trị khơng q phức tạp nhưng chi phí cho điều trị rất tốn kém vì phải điều trị
truyền máu suốt đời ở thể nặng. Nếu không được điều trị đầy đủ, bệnh sẽ gây ra nhiều
biến chứng làm người bệnh chậm phát triển cả thể chất và tinh thần. Ở các bệnh nhân
được nghiên cứu, ngay cả khi được điều trị tối ưu sau khi sinh, chậm phát triển và
chậm phát triển thần kinh ở một mức độ nào đó dường như là những kết quả bất lợi
lớn về lâu dài [28]. Đây được coi là một gánh nặng rất lớn cho cộng đồng. Vì vậy,
việc tầm sốt kịp thời người lành mang gen bệnh ở các cặp sắp kết hôn là vô cùng
quan trọng.
Tư vấn di truyền rất thích hợp cho các cặp vợ chồng đều là người mang gen
α0-Thalassemia vì theo cơ chế di truyền, họ có khả năng sinh con mắc bệnh alpha
thalassemia thể nặng (Hb Bart’s hydrop fetalis) là 25% trong mỗi lần sinh. Việc sàng

lọc ra những người có nguy cơ mang gen bệnh thalassemia rất đơn giản bằng xét
nghiệm tổng phân tích tế bào máu ngoại vi. Chẩn đoán trước sinh thường được chỉ
định trong trường hợp này khơng chỉ vì mức độ nghiêm trọng và khơng có phương

11


pháp điều trị đặc hiệu mà còn để tránh các biến chứng nặng cho người mẹ trong thai
kỳ [29]. Hiện nay chưa có biện pháp điều trị đặc hiệu bệnh α-thalassemia. Hầu hết
các thai mắc α-thalassemia thể nặng (Hb Bart’s) đều phù, chết lưu trong giai đoạn ba
tháng cuối thai kỳ, hoặc tử vong sớm sau sinh. Trẻ mắc HbH thể nặng đều phải phụ
thuộc truyền máu và thải sắt suốt đời, thường tử vong sớm vì các biến chứng của
truyền máu. Tuy nhiên, bệnh α-thalassemia có thể dễ dàng phát hiện chính xác nhờ
áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử, chẩn đốn hình ảnh từ giai đoạn sớm. Vì vậy,
chẩn đốn trước sinh là cần thiết ở các sản phụ có nguy cơ cao sinh con mắc bệnh αthalassemia, nhằm hạn chế tỷ lệ sinh con mắc bệnh Hb Bart’s, HbH thể nặng [30].
Chọc ối là phương pháp hiện nay được sử dụng rộng rãi nhất để lấy bệnh phẩm
thai nhi. Các tế bào thai nhi bong ra, có lẫn trong nước ối được lấy ra để làm các xét
nghiệm gen hay NST. Thủ thuật thường được thực hiện vào tuần 16 – 20 thai kỳ, đây
là thời điểm lấy nước ối thành công cao cũng như ít tai biến nhất . Ngồi ra, có thể
thực hiện sinh thiết rau thai, lấy máu cuống rốn để làm xét nghiệm. Chỉ duy nhất một
hình thái lâm sàng bệnh thalassemia có thể thăm dị trước sinh bằng siêu âm đó là
bệnh Hb Bart’s với biểu hiện là phù thai. Chẩn đốn trước sinh được phù thai Hb
Bart’s thì nên tư vấn đình chỉ thai cho sản phụ càng sớm càng tốt, trước khi có biểu
hiện phù thai để giảm nguy cơ tai biến sản khoa cho mẹ.
1.7. Phương pháp xác định đột biến gen alpha thalassemia
1.7.1. GAP - PCR (GAP - Polymerase Chain Reaction)
Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR là phương pháp sinh học phân tử phổ biến nhất
để phát hiện đột biến thalassemia mất đoạn. GAP – PCR hay gọi là PCR khoảng cách,
khuếch đại đoạn DNA mất bằng cách sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu bổ sung với
trình tự có trong vùng gen bị mất [31-33]. Do có đến trên 90% các đột biến alpha

thalassemia là đột biến mất đoạn vậy nên hầu hết đột biến đều có thể được phát hiện
bởi GAP – PCR. Với các đột biến mất đoạn lớn, hai đoạn mồi thiết kế ở vùng biên
chỉ nhân được allen đột biến mà khơng nhân được allen bình thường do khoảng cách
giữa hai mồi q lớn. Khi khơng có đột biến có thể thiết kế một mồi nằm bổ sung với
trình tự trong vùng mất đoạn, mồi cịn lại bổ sung với trình tự DNA vùng biên [27].
Các đột biến alpha Thalassemia phổ biến được phát hiện ở Việt Nam bao gồm 3 đột
biến mất đoạn gây α0-thalassemia (--SEA; --THAI; --FILL) và 2 đột biến mất đoạn
gây α+-thalassemia (-α3.7 ; -α4.2) [30, 34].

12


Hỗn hợp a2a1

Hình 1.8. Phát hiện các đột biến mất đoạn -a3.7 bằng GAP-PCR [32]
Việc xóa -α3.7. A1, A2 và A3 hiển thị vị trí của các đoạn mồi được sử dụng để phát
hiện sự xóa phổ biến -a3.7. Việc xóa sẽ loại bỏ phần 3 'của gen alpha 2 và phần 5'
của gen alpha 1, dẫn đến một gen alpha 2/alpha 1 lai. Kiểu gen đột biến được xác
định qua băng điện di.
Tương tự PCR thông thường, kỹ thuật này có độ chính xác cao nhưng chỉ phát
hiện các vùng DNA hay đột biến gen đã được biết rõ về trình tự, địi hỏi trình độ của
kỹ thuật viên, máy móc, trang thiết bị hiện đại. Vì vậy, xét nghiệm này khó có thể
được thực hiện phổ biến ở các phòng xét nghiệm tuyến dưới [35]. Mặt khác, GAPPCR thường đòi hỏi phải xử lý sau PCR nên tốn nhiều thời gian [32, 36, 37].
1.7.2. Strip Assay
Xét nghiệm xác định đột biến alpha thalassemia sử dụng bộ sinh phẩm α globin
strip assay là phương pháp phối hợp giữa multiplex-PCR và lai ngược DNA để phát
hiện cùng một lúc nhiều đột biến khác nhau. Với multiplex-PCR, các gen đột biến
được tách dịng và khuếch đại. Sau đó các sản phẩm PCR này sẽ được lai với mẫu dò
đặc hiệu đã được gắn sẵn trên màng (Strip Assay-nylon membrane). Phản ứng lai
DNA sau đó được phát hiện bằng các cơ chất tạo màu. Kết quả lai DNA sẽ được đối

chiếu với thang chuẩn để xác định loại đột biến và tình trạng đồng/ dị hợp tử ở các
mẫu phân tích. Xét nghiệm này rất có ý nghĩa trong việc sàng lọc ban đầu đối với
người mang gen hoặc thai nhi. Bộ xét nghiệm α globin strip assay cho phép sàng lọc
21 đột biến α thalassemia phổ biến trong khu vực Đông Nam Á. Kỹ thuật này được
Saiki và cộng sự mô tả lần đầu tiên vào năm 1989, sau đó được phát triển để phục vụ
chẩn đoán các bệnh di truyền mang nhiều đột biến, phổ biến nhất là bệnh thalassemia
và bệnh xơ nang (Cystic fibrosis). Ưu điểm của phương pháp này là dễ thực hiện, có
thể cùng lúc phát hiện được hầu hết các đột biến trong khoảng thời gian ngắn từ 6-8
giờ, lượng mẫu cần ít (10-50ng DNA), phương tiện máy móc đơn giản. Phân tích kết
13


quả đơn giản thông qua các băng vạch hiện màu trên thanh lai với độ chính xác cao
đồng thời phát hiện được đột biến đồng hợp tử hoặc dị hợp tử. Tuy nhiên, bộ kit Strip
assay chưa cho phép phát hiện được một số đột biến rất hiếm gặp ở Việt Nam và
Đông Nam Á. Alpha-Globin Strip Assay được chứng minh là một phương pháp sàng
lọc nhanh chóng, dễ thực hiện và đáng tin cậy để xác định > 90% đột biến α-globin
trong các khu vực lưu hành trên toàn thế giới [38].

Hình 1.9. Hình ảnh đột biến --SEA/αα trên thanh test A-globin strip assay [15]
1.7.3. Giải trình tự Sanger
Giải trình tự Sanger là kỹ thuật rất phù hợp để phân tích gen ở các bệnh di
truyền máu điển hình như Thalassemia hơn là phát hiện các đột biến ở các tế bào bệnh
máu ác tính do số lượng tế bào chứa biến đổi gen rất lớn. Vì kỹ thuật này thực hiện
giải trình tự DNA trực tiếp nên có thể phát hiện toàn diện tất cả các đột biến: mất/thêm
đoạn nhỏ tại vùng mã hóa (exon) của 2 gen , đột biến điểm, mới xuất hiện của bệnh
alpha thalassemia hay đa hình DNA mà khơng cần biết trước về các biến thể [39, 40].
Tuy nhiên, nó bộc lộ nhược điểm về hiệu suất phân tích mẫu thấp (thời gian dài, số
mẫu một lần xét nghiệm ít), chi phí xét nghiệm cao và phụ thuộc vào số mao quản


14


trên máy giải trình tự. Vì vậy, kỹ thuật này được sử dụng sau cùng khi các kĩ thuật
khác không phát hiện được đột biến hoặc để phát hiện các đột biến hiếm. Ngồi ra,
trình tự sắp xếp của các gen α-globin rất phức tạp, hai gen α-globin (HBA1 và HBA2)
gần như giống hệt nhau. Hơn nữa, trình tự của gen α-globin giàu guanin-cytosine hơn
so với trình tự của gen β-globin. Vậy nên việc tối ưu hóa các điều kiện PCR là cần
thiết trong các ứng dụng lâm sàng [33, 39, 41]. Những tiến bộ gần đây trong giải trình
tự thế hệ mới - NGS (Next - generation sequencing) cho phép phát hiện các biến thể
mới và cấu trúc bằng cách nhắm đích các gen cụ thể hoặc tồn bộ hệ gen [17].
Nguyên lý phương pháp dựa trên nguyên tắc bổ sung để tổng hợp chuỗi DNA
bổ sung với gen đích và trên nền tảng kỹ thuật PCR. Chuỗi DNA mới được kéo dài
bởi enzyme DNA polymerase khi có mặt của các dNTP và mồi. Thay vì sử dụng
dNTP, giải trình tự Sanger sử dụng nucleotit tự do đã được biến đổi là ddNTP
(dideoxynucleotid). Do nucleotit này đã bị mất nhóm 3’OH ở gốc đường nên khơng
thể hình thành được liên kết cộng hóa trị với nhóm 5’ phosphate của nucleotit tiếp
theo. Vì vậy, phản ứng tổng hợp chuỗi DNA sẽ bị dừng lại. Tùy theo ddNTP là gì mà
phản ứng sẽ bị ngừng tại vị trí có ddNTP đưa vào. Sau khi thực hiện PCR, hỗn hợp
phản ứng thu được sẽ chứa tập hợp tất cả các đoạn DNA kích thước chênh lệch nhau
1 nucleotit và điện di mao quản sẽ giúp phần mềm phân tích lắp ráp chính xác được
trình tự nucleotit của đoạn gen cần phân tích. Sau đó so sánh trình tự đoạn gen đích
và gen tham chiếu để phát hiện các đột biến [41].
1.7.4. MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)
MLPA là một kỹ thuật bán định lượng được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán
mất đoạn gen gây bệnh alpha thalassemia với nhiều ưu điểm: dễ thực hiện, cho kết
quả nhanh và có độ chính xác cao. Một hỗn hợp các đoạn đầu dò (probe) của MLPA
được thêm vào sau khi mẫu DNA được gây biến tính. Mỗi đầu dị MLPA bao gồm
hai oligonucleotide gắn trực tiếp trên trình tự đích và có chiều dài khuếch đại duy
nhất. Trong phản ứng PCR, tất cả các đoạn đầu dò đã lai được khuếch đại đồng thời

sử dụng cùng một cặp mồi PCR đánh dấu huỳnh quang. Từ đó cho phép các sản phẩm
khuếch đại được phát hiện trong phân tích đoạn bằng thiết bị điện di mao quản. Kết
quả hiển thị dưới dạng các peak (đỉnh tín hiệu), mỗi đỉnh thể hiện sản phẩm của một
probe. Chiều cao của mỗi peak cho thấy sự liên quan với số lượng bản sao tương đối
của trình tự DNA bổ sung với probe khi so sánh với chiều cao của probe trong các
mẫu DNA tham chiếu khác nhau. Nếu bệnh nhân bị đột biến mất đoạn cả 4 gen α
globin thì khơng có hiện tượng lai probe, khơng tạo thành đoạn dị hồn chỉnh và

15