ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

ĐỖ THỊ HUYỀN

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT
TỪ CÂY HẬU PHÁC (MAGNOLIA OFFICINALIS)
LÊN DÒNG TẾ BÀO U THẦN KINH ĐỆM C6

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH
KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC

Hà Nội – 2023


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

ĐỖ THỊ HUYỀN

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT
TỪ CÂY HẬU PHÁC (MAGNOLIA OFFICINALIS)
LÊN DÒNG TẾ BÀO U THẦN KINH ĐỆM C6

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH
KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC

Khóa:
QH 2019.Y
Người hướng dẫn: TS. Lê Thị Thuỳ Dương
TS. Phạm Thị Hồng Nhung

Hà Nội – 2023


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến tồn thể các thầy cơ giáo
Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội. Trong suốt thời gian em
học tập và rèn luyện tại trường, thầy cô là những người đã dạy dỗ, truyền đạt
cho em nhiều tri thức quý báu, cũng như nhân cách đạo đức để trở thành một
người công dân tốt. Em cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô, cán bộ phịng Sinh
hố thực vật - Viện Cơng nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi, tận tình
hướng dẫn và hỗ trợ em trong quá trình thực tập, nghiên cứu.
Em xin gửi gửi cảm ơn sâu sắc tới TS. Lê Thị Thuỳ Dương người đã định
hướng ý tưởng nghiên cứu, nhiệt tình hướng dẫn em các thí nghiệm và chỉ dạy
kiến thức chun mơn giúp em hồn thành tốt khố luận. Sự động viên và khích
lệ của cơ đã giúp em có thêm động lực tìm tịi, khám phá, tự tin sáng tạo và
kiên trì với những ý tưởng của mình. Đó là điều may mắn lớn nhất mà em có
được trong những bước đầu của con đường nghiên cứu khoa học.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Phạm Thị Hồng Nhung và các thầy cô
trong Bộ môn Y Dược học cơ sở đã dành nhiều thời gian và tâm huyết, quan
tâm giúp đỡ em. Các thầy cô là tấm gương sáng về tác phong làm việc và lối
sống đạo đức cho em học tập, noi theo. Tiếp đó, em xin gửi lời cảm ơn tới tồn
thể Ban giám hiệu, các thầy cô trong Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc
Gia Hà Nội, Bộ môn Y dược học cơ sở đã tạo điều kiện cho em làm khố luận
tốt nghiệp và giúp đỡ em hồn thành chương trình học tập.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới anh Vũ Mạnh Cường – cán bộ Phịng
Sinh hố Thực vật – Viện Công nghệ sinh học, đã giúp đỡ em rất nhiều trong
quá trình em thực tập và nghiên cứu tại phòng. Cám ơn anh Mạnh, chị Thuỷ,
chị Diệp, Kim Anh đã luôn ở bên cạnh đông viên, khích lệ để em hồn thành
các thí nghiệm và khố luận.

Cuối cùng, con xin cảm ơn bố mẹ, anh chị đã luôn ở bên cạnh con, tin
tưởng, động viên và luôn ủng hộ con thực hiện những mơ ước của mình. Đối
với con, gia đình ln là điểm tựa vững chắc nhất, là động lực để con cố gắng
và phấn đấu trên con đường học tập và nghiên cứu phía trước.
Hà Nội, ngày 22 tháng 5 năm 2023
Đỗ Thị Huyền

i


DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ATP

Adenosine triphosphate

DAPI

Thuốc nhuộm DNA (4′,6-diamidino-2-phenylindole)

DMEM

Môi trường nuôi cấy tế bào (Dulbecco's modified Eagle's medium)

DMSO

Dimethyl sulfoxide

FBS


Huyết thanh thai bò (Fetal Bovine Serum)

GBM

Glioblastomas

MTS

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4sulfophenyl)-2H-tetrazolium

NADH

Nicotinamide adenine dinucleotide

NADPH

Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate

PBS

Phosphate Buffer Saline

ROS

Reactive Oxygen Species

SCCHN

Ung thư biểu mô tế bào vẩy và cổ


ii


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 3.1. Chỉ số tăng sinh A(%) của dòng tế bào C6 sau 72 giờ ủ dịch
chiết .............................................................................................................. 25

iii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình1.1. Một số hình ảnh cây hậu phác ...................................................... 3
Hình 3.1. Mật độ tế bào ở các nồng độ dịch chiết khác nhau sau khi ủ
dịch chiết....................................................................................................... 21
Hình 3.2. Hình ảnh tế bào C6 ủ dịch với dịch chiết ở các nồng độ khác nhau
sau 24 giờ và mẫu đối chứng ........................................................................ 22
Hình 3.3. Hình ảnh tế bào C6 sau khi ủ dịch chiết nồng độ 0, 1, 5 µg/ml ... 23
Hình 3.4. Hình ảnh tế bào C6 sau khi ủ dịch chiết nồng độ 10, 20,
40 µg/ml ........................................................................................................ 24
Hình 3.5. Khả năng tăng sinh của tế bào C6 với dịch chiết ở các nồng độ .. 25
Hình 3.6. Kết quả điện di trên gel đơn tế bào ............................................... 27
Hình 3.7. Tỉ lệ DNA% đi ở các nồng độ dịch chiết khác nhau ................ 28
Hình 3.8. Ty thể và nhân trên kính hiển vi huỳnh quang ............................ 29
Hình 3.9. Cường độ huỳnh quang ty thể sau khi ủ dịch chiết ở các nồng
độ 0, 5, 10, 20 µg/ml trong 24 giờ ................................................................ 31

iv



MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. i
DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................. ii
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU .................................................................. vi
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1.1.

Một số đặc điểm về cây hậu phác .................................................... 3

1.2.

Một số tác dụng của dịch chiết từ cây hậu phác ............................ 4

1.3. Tác dụng chống ung thư của dịch chiết từ tự nhiên ...................... 6
1.3.1. Độc tính tế bào của một số dịch chiết từ tự nhiên ........................... 7
1.3.2. Ảnh hưởng của các dịch chiết lên DNA tế bào ............................... 8
1.3.3. Ảnh hưởng của các dịch chiết tự nhiên lên ty thể của tế bào .......... 9
1.4.

U nguyên bào thần kinh đệm ......................................................... 11

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 14
2.1.

Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 14

2.2.

Hoá chất, dụng cụ, trang biết bị nghiên cứu chính ...................... 14


2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................... 15
2.3.1. Ni cấy dòng tế bào C6 ............................................................... 15
2.3.2. Định lượng tế bào ni cấy ........................................................... 16
2.3.3. Phương pháp thử độc tính tế bào MTS .......................................... 16
2.3.4. Xét nghiệm điện di đơn tế bào....................................................... 18
2.3.5. Phương pháp nhuộm huỳnh quang ty thể ...................................... 19
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ............................................................................... 21
3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự tăng sinh của
dịng tế bào C6 ........................................................................................... 21
3.2.

Khảo sát độc tính của dịch chiết lên dòng tế bào C6 ................... 22

3.3.

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết lên DNA tế bào .. 26

3.4.

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết lên ty thể tế bào . 29

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................ 32
4.1. Ảnh hưởng của dịch chết lên sự tăng sinh dòng tế bào u thần
kinh đệm C6 ............................................................................................... 32
4.2.

Đánh giá độc tính của dịch chiết lên dịng tế bào C6 ................... 33

4.3.


Ảnh hưởng của dịch chiết lên DNA tế bào ................................... 34

4.4.

Ảnh hưởng của dịch chiết lên ty thể tế bào .................................. 35

v


KIẾN NGHỊ .................................................................................................. 39
PHỤ LỤC ...................................................................................................... 44

vi


MỞ ĐẦU
Ung thư là sự nhân lên khơng kiểm sốt của một số tế bào trong cơ thể,
dẫn đến sự hình thành khối u. Đó là ngun nhân gây chết hàng đầu ở các nước
phát triển và đứng thứ hai ở các nước đang phát triển. Theo thống kê của
Globocan năm 2020 tỉ lệ tử vong do ung thư có xu hướng tăng. Trên tồn thế
giới, ước tính có khoảng 19,3 triệu trường hợp ung thư mới và gần 10 triệu
trường hợp tử vong do ung thư vào năm 2020. Gánh nặng ung thư toàn cầu dự
kiến sẽ là 28,4 triệu ca vào năm 2040, tăng 47% so với năm 2020 [2]. Trong đó
u nguyên bào thần kinh đệm được phát triển từ tế bào thần kinh đệm chưa biệt
hoá trong não, 100% là ác tính được WHO xếp vào nhóm u ác tính độ IV và
chiếm tỷ lệ cao nhất trong các loại u não ác tính nguyên phát. Có thể thấy ung
thư là vấn đề lớn đối với nền y học, là yêu cầu cấp thiết cần tìm ra những
phương pháp điều trị giúp giảm bớt gánh nặng ung thư. Mặc dù vậy các phương
pháp điều trị ung thư hiện nay như xạ trị, hóa trị liệu, phẫu thuật, liệu pháp miễn
dịch... vẫn còn nhiều mặt hạn chế như thiếu tính đặc hiệu, gây độc tính, gây

chết các tế bào khỏe mạnh, cũng như tỷ lệ tái phát cao.
Trong hơn một thập kỉ trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của y sinh
học phân tử, người ta đi sâu vào nghiên cứu cơ chế phát sinh ung thư. Ty thể là
một bào quan có vai trị quan trọng trong các q trình chuyển hố năng lượng
khác nhau. Ngồi vai trị then chốt của chúng trong q trình chuyển hố năng
lượng sinh học, chúng cịn kiểm sốt cân bằng nội mơi oxy hố khử, sinh tổng
hợp các đại phân tử và tín hiệu apoptosis liên quan đến quá trình sinh ung thư
cho thấy ty thể là bào quan quan trọng liên quan đến tất cả các giai đoạn sinh
ung thư. Sự mất cân bằng trong nội môi ty thể gây ra sản xuất quá mức các loại
oxy hoá phản ứng, dẫn đến tổn thương DNA, chết theo chương trình, lão hố
và tiến triển ung thư. Với các chức năng quan trọng như vậy, ty thể được các
nhà nghiên cứu quan tâm như một đích trong điều trị ung thư.
Từ nhiều thế kỷ nay, thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dưỡng
cho con người mà còn là những phương thuốc chữa bệnh hết sức quý giá bao
gồm thuốc chống ung thư nói riêng và các bệnh khác nói chung. Trong đó cây
hậu phác là một lồi thực vật ngày càng nhận được nhiều sự quan tâm bởi những
cơng dụng và chức năng của nó. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh khả

1


năng phòng ngừa ung thư và ngăn khối u tăng trưởng của các dịch chiết từ cây
hậu phác với thành phần honokiol cao đối với ung thư da, vú, tuyến tiền liệt và
phổi. Bởi vậy, nghiên cứu tìm ra các hợp chất từ nguồn dược liệu thiên nhiên
có khả năng chữa bệnh ung thư luôn là một hướng nghiên cứu thu hút nhiều
nhà khoa học. Trong nghiên cứu này chúng tôi sẽ tiến hành thực hiện đề tài:
“Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ cây hậu phác (Magnolia officinalis)
lên dòng tế bào u thần kinh đệm C6” với các mục tiêu:
1. Đánh giá độc tính của dịch chiết trên dòng tế bào C6.
2. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết lên DNA của tế bào.

3. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết lên ty thể của tế bào.
Để thực hiện mục tiêu của để tài, chúng tôi tiến hành các nội dung nghiên
cứu như sau:
1. Nuôi cấy tế bào
2. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ cây hậu phác lên sự tăng sinh và
độc tính tế bào;
3. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ cây hậu phác với DNA tế bào;
4. Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết từ cây hậu phác lên sự biểu hiện của
ty thể.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1.

Một số đặc điểm về cây hậu phác
Hậu phác (danh pháp khoa học: Magnolia officinalis Rehd. et Wils)
thuộc họ Mộc Lan, chi Magnolia. Chi Magnolia được phân bố rộng rãi trên
khắp thế giới với trung tâm chính ở Đông Á và Đông Nam Á. Một số loại
thường được sử dụng như Magnolia Officinalis và Magnolia Obovata [3].

B

A

Hình 1.1. Một số hình ảnh cây hậu phác. (A)Cành lá, hoa ; (B) Vỏ cây [1]
Cho đến nay, hơn 250 loại thành phần đã được phân lập từ nón, vỏ cây,
hoa và lá của chi Magnolia [4]. Các nghiên cứu hóa học về vỏ cây hậu phác
(M. officinalis) đã dẫn đến việc phân lập một số hợp chất phenolic chính, đáng

chú ý là các dẫn xuất neolignan magnolol (5,5'-diallyl-2,2'-dihydroxybiphenyl)
và honokiol (5,3' -dallyl-2,4'-dihydroxybiphenyl) được coi là hai hợp chất
phenolic chính trong vỏ cây và là thành phần hoạt động chính [5]. Cũng như
các lignans magnolol và honokiol, các alkaloid là một nhóm các chất chuyển
hóa thứ cấp thú vị của lồi này, chúng tạo ra chủ yếu các alkaloid loại
isoquinoline, phần lớn trong số đó là các dẫn xuất aporphine và
benzylisoquinoline [6]. Các thành phần cụ thể trong vỏ cây và tỷ lệ của các
thành phần đó khác nhau đáng kể tùy thuộc vào địa điểm và thời gian thu hoạch
[7].
Có nhiều phương pháp tách chiết vỏ cây hậu phác để thu dịch chiết với
các nồng độ khác nhau. Quá trình chiết xuất thường được thực hiện bằng cách
sử dụng các dung môi hữu cơ bao gồm methanol, ethanol, n – hexan. Dịch chiết

3


thu được từ mỗi phương pháp sẽ có thành phần và hàm lượng các chất khác
nhau nên tuỳ vào mục đích nghiên cứu dịch chiết sẽ có tác dụng khác nhau.
Nghiên cứu về chiết xuất ethanol của cây hậu phác thu được thành phần phần
honokiol và magnolol lần lượt là 55,4% và 40,1% [4].
Các thành phần hoạt tính sinh học quan trọng chính được phân lập từ M.
officinalis là các neolignans polyphenolic, magnolol và honokiol. Honokiol
được đặt tên theo "Honoki", một tên tiếng Nhật của M. obovata Thunb [8].
Chiết xuất vỏ cây Magnolia có bán trên thị trường dựa trên hàm lượng phenolic
cao của chúng, với honokiol nằm trong khoảng từ 40% đến 90% tổng số
polyphenol. Nhiều nghiên cứu cho thấy Honokiol có tác dụng sinh học và lâm
sàng trên phạm vi rộng mà khơng có độc tính đáng kể. Các nghiên cứu trong
ống nghiệm cho thấy honokiol có khả năng tăng cường các hoạt động điều trị
ung thư bằng cách ức chế thành mạch, thúc đẩy quá trình chết theo chương
trình, cung cấp hoạt động gây độc tế bào trực tiếp, điều chỉnh giảm các con

đường truyền tín hiệu của tế bào ung thư. Honokiol cũng cho thấy tiềm năng
điều trị các đặc tính sinh học khác như chống trầm cảm, chống oxy hoá, chống
huyết khối, chống tạo mạch, chống lo âu,…Hơn nữa, nó cũng đã được phát
hiện là có tác dụng mạnh với nhiều loại vi sinh vật khác nhau bao gồm vi khuẩn,
vi rút và nấm [9]. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu đã tập trung vào
khả năng chống ung thư của honokiol, nhiều nghiên cứu thực nghiệm trên các
mơ hình in vitro và in vivo đã được tiến hành bằng những phương pháp khác
nhau, nhằm nhấn mạnh tiềm năng chống ung thư [3].
1.2.

Một số tác dụng của dịch chiết từ cây hậu phác
Vỏ cây hậu phác đã được sử dụng trong các phương thuốc truyền thống

của châu Á. Các chiết xuất khác nhau có nguồn gốc từ vỏ cây Magnoliae
officinalis cũng được phổ biến rộng rãi trong các sản phẩm bổ sung chế độ ăn
uống với liều khuyến cáo phù hợp với từng loại bệnh. Dịch chiết từ cây hậu
phác có một số cơng dụng chính như rối loạn tiêu hố, điều trị chứng lo âu, hen
suyễn, trầm cảm…[3]. Hơn nữa một số thành phần chính trong dịch chiết có
tác dụng chống oxy hố, chống viêm, chống co thắt, kháng sinh,…Trong đó
các bệnh về đường tiêu hoá rất phổ biến và đa dạng, hậu phác thường được sử
dụng trong y học cổ truyền để điều trị các rối loạn tiêu hoá như vậy, làm giảm

4


đáng kể bệnh loét dạ dày, bệnh tiêu chảy. Các alkaloid có trong thành phần dịch
chiết của vỏ cây có tác dụng chống co thắt khi được sử dụng dưới dạng thuốc
sắc liều cao để làm giảm co thắt tiểu phế quản và co thắt ruột [10]. Vỏ cây M.
officinalis là một trong những loại thuốc thảo dược truyền thống để sử dụng để
điều trị trầm cảm lâm sàng và các rối loạn lo âu. Các thành phần đã được báo

cáo là có tác dụng dược lý đối với hệ thần kinh là-eudesmol, α-và-pinen và
bornyl axetat dưới dạng tinh dầu; magnolol và honokiol ở dạng hợp chất
diphenyl và magnocurarine dưới dạng alkaloid. Nó được chứng minh là có khả
năng ức chế sự hình thành các hóa chất trung gian gây viêm, từ đó giúp làm
giảm tình trạng viêm. Trong nghiên cứu của Joel M. Walker và các cộng sự đã
đánh giá khả năng chống viêm của chiết xuất vỏ cây Magnolia officinalis và
một số dịch chiết khác [11]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chiết xuất M.
officinalis có tác dụng chống oxy hóa tốt, có thể ngăn ngừa peroxid hóa lipid,
trì hỗn lão hóa. Các chiết xuất của magnolia có tác dụng chống oxy hóa chủ
yếu bằng cách nhặt rác gốc tự do (DPPH, OH-), tăng cường hoạt động của các
enzyme chống oxy hóa và ngăn chặn cơ chế peroxid hóa lipid [12]. Theo nghiên
cứu của Yuelan Pang về tác dụng của chiết xuất từ vỏ cây M. officinalis với
thành phần honokiol cao có tác dụng với hoạt động của các enzyme chống oxy
hoá trong huyết tương của chuột. Dịch chiết thô trong nghiên cứu thu được với
độ tinh khiết của honokiol lên đến 80,3%. Kết quả cho thấy chiết xuất honokiol
với liều lượng thích hợp làm tăng hoạt động của cả hệ thống phịng chống oxy
hóa khơng enzyme và enzyme và có tiềm năng sử dụng như một chất chống
oxy hóa tự nhiên [13]. Ngồi ra các dịch chiết từ cây hậu phác cịn có tác dụng
chống ung thư. Đặc biệt các nghiên cứu trong ống nghiệm và mơ hình động vật
đã chỉ ra rằng các thành phần của M.officinali, đặc biệt là neolignans honokiol
có thể nhắm mục tiêu vào nhiều con đường liên quan đến bệnh lý. Đáng chú ý
các nghiên cứu cơ học đã được thực hiện trên honokiol để hỗ trợ phát triển các
chất tương tự tổng hợp và cung cấp các yếu tố cho sự kết hợp hợp lý với hóa
trị hoặc xạ trị thông thường [14]. Một số thành phần của M. officinalis , chủ
yếu là lignans, đã được báo cáo rộng rãi là gây độc tế bào, đây có thể là ưu điểm
cho các hợp chất chống ung thư mới [11].

5



1.3.

Tác dụng chống ung thư của dịch chiết từ tự nhiên

Một số thành phần trong dịch chiết của cây hậu phác được báo cáo rộng
rãi là gây độc tế bào. Ung thư tiến triển thông qua một loạt sai lệch di truyền
và biểu sinh dẫn đến rối loạn điều hòa các con đường truyền tín hiệu tế bào
quan trọng liên quan đến sự tăng trưởng, hành vi ác tính và kháng trị liệu tế bào
[15]. Các dịch chiết từ cây hậu phác có thành phần honokiol cao được nhắm
vào nhiều con đường truyền tín hiệu, bao gồm yếu tố hạt nhân kappa B (NFκB), bộ chuyển đổi tín hiệu và bộ kích hoạt phiên mã 3 (STAT3), yếu tố tăng
trưởng biểu bì (EGFR), đích rapamycin ở động vật có vú (mTOR tham gia tập
trung vào việc kiểm sốt chuyển hóa, tăng trưởng và tăng sinh tế bào) và con
đường chung qua trung gian caspase, điều chỉnh sự khởi đầu và tiến triển của
ung thư. Các yếu tố phiên mã NF-κB và STAT3 kiểm soát sự biểu hiện của một
loạt các gen liên quan đáng kể đến sự phát triển, tăng trưởng và biệt hóa tế bào,
miễn dịch, chuyển hóa, viêm nhiễm và ung thư. Yếu tố tăng trưởng biểu bì
(EGFR) là một glycoprotein có có hoạt tính tyrosine kinase, thường được biểu
hiện quá mức hoặc được khuếch đại trong các loại ung thư khác nhau. Bên cạnh
đó honokiol có thể ngăn chặn sự kích hoạt của mTOR và tín hiệu xi dịng
của nó, dẫn đến cảm ứng chết theo chương trình, bằng cách ức chế các con
đường kinase được điều hịa tín hiệu ngoại bào [16]. Trong thành phần của dịch
chiết, honokiol được nghiên cứu là có thành phần hoạt tính gây độc cao trong
việc gây ra q trình chết theo chương trình [10]. Gần đây, hoạt động của
honokiol được phát hiện có hoạt tính chống khối u bằng cách nhắm mục tiêu
vào con đường chết theo chương trình, là mục tiêu cho các liệu pháp điều trị
ung thư. Honokiol tác động lên các con đường chết theo chương trình ở bệnh
ung thư đã được nghiên cứu bao gồm con đường qua trung gian thụ thể, con
đường qua trung gian ty thể, con đường chung qua trung gian caspase và điều
hịa các protein liên quan đến q trình chết theo chương trình. Ngồi ra dịch
chiết từ cây hậu phác với thành phần honokiol cao còn gây hoại tử tế bào. Bên

cạnh q trình apoptosis, Hono cũng được phát hiện có thể gây hoại tử tế bào
ung thư vú MCF-7 (honokiol ở nồng độ 40 μg /mL) [29]
Dịch chiết từ cây hậu phác tác động đến ung thư bằng nhiều cơ chế khác
nhau như apoptosis, hoại tử tế bào, bắt giữ chu kỳ tế bào. Chẳng hạn như đối

6


với ung thư biểu mô vảy, tế bào ung thư tuyến tiền liệt, ung thư da, q trình dị
hóa Autophagy, hay khả năng ức chế di cư, xâm lấm và hình thành mạch của
tế bào ung thư. Nhưng cơ chế quan trọng nhất, thường xuất hiện trong điều trị
ung thư đó là q trình ức chế sự tăng sinh tế bào, sự thúc đẩy quá trình sản
xuất trong ty thể. Ty thể là dạng bào quan của ROS và các chất oxy khác, có
thể phá hủy DNA hoặc các phân tử khác dẫn đến quá trình apoptosis. Trong
quá trình oxy hóa, các electeron thốt ra khỏi chuỗi vận chuyển electeron của
ty thể, rồi phản ứng với oxi để tạo thành O - [17]. Sau đó chuyển thành
2

hydropeoxid và các loại oxy trong phản ứng khác (ROS). Mức độ ROS nội bào
khơng cân bằng có thể dẫn đến q trình stress oxy hóa, gây tổn thương DNA,
peroxy hóa lipid, cuối cùng gây ra q trình apoptosis [18]. Vì vậy chúng tơi
tiến hành nghiên cứu đánh giá một số ảnh hưởng của dịch chiết từ cây hậu phác
trên dòng tế bào u thần kinh đệm C6.
1.3.1. Độc tính tế bào của một số dịch chiết từ tự nhiên
Độc tính tế bào chỉ đặc tính chung gây độc cho tế bào có thể do kích
thích hố học, tiếp xúc với các tế bào khác, các hoạt chất khác nhau hoặc điều
kiện vật lí, môi trường khác nhau. Một hợp chất gây độc tế bào có thể xảy ra
theo nhiều cách: phá vỡ các mục tiêu hoặc con đường sinh học phân tử cụ thể
(ví dụ như tác dụng đối kháng thụ thể, khích hoạt/ ức chế enzyme) hoặc phá vỡ
bộ máy tổng quát bộ máy tế bào dẫn đến căng thẳng tế bào và gây độc tế bào

[15, 19]. Các quá trình phá vỡ tế bào bao gồm phản ứng protein, DNA hoặc
lipid; sự phá vỡ các tính chất hố lý của protein hoặc màng hoặc quá trình chết
theo chương trình, phản ứng oxy hố, gián đoạn ty thể. Nghiên cứu độc tính tế
bào là một bước khởi đầu hữu ích trong việc xác định các độc tính tiềm tàng
của các dịch chiết từ cây hậu phác. Một số thành phần của M. officinalis đã
được báo cáo là là gây độc tế bào, đây có thể là một manh mối cho các hợp
chất chống ung thư mới để điều trị các tế bào đích ung thư. Nồng độ được sử
dụng trong các nghiên cứu trong ống nghiệm nằm trong khoảng 0 – 150 µM,
đa số ở các khoảng nồng độ này honokiol đã được chứng minh là có ức chế
đáng kể sự tăng sinh tế bào và khả năng sống của tế bào trên các dòng tế bào
ung thư khác nhau. Xu hướng giá trị IC50 của nhiều dòng tế bào ung thư phụ

7


thuộc vào thời gian nên các giá trị IC50 giảm khi thời gian thử nghiệm tăng lên
[20].
Để xác định độc tính của honokiol với các tế bào u nguyên bào thần kinh
Neuro-2A, Juei- Tai Chen và các cộng sự đã tiến hành nuôi cấy và xử lý
honokiol ở các nồng độ khác nhau trong 72 giờ. Hình thái của tế bào được quan
sát dưới kính hiển vi, xét nghiệm 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide (MTT) được tiến hành để xác định nồng độ ức
chế tối đa một nửa (IC50). Kết quả cho thấy sau khi điều trị ở các nồng độ trên
và trong thời gian 72 giờ làm giảm số lượng tế bào và gây co rút tế bào. Phân
tích về khả năng tồn tại của tế bào khi xử lý honokiol là 63,3 µM. Mặt khác tác
giả đã theo dõi sự tiếp xúc của các tế bào thần kinh – 2a ở nồng độ 40 µM
honokiol trong 24, 48 và 72 nhận thấy khả năng sống sót của các tế bào thần
kinh đã giảm lần lượt là 23%, 32% và 44% [21]. Trong một nghiên cứu khác
của Chung- Ching Chio và các cộng sự đã tiến hành kiểm tra độc tính của
honokiol trên dòng tế bào u thần kinh đệm U87- MG ở người và tế bào u thần
kinh đệm GL261 ở chuột. Các tế bào được ủ honokiol ở các nồng độ khác nhau,

xét nghiệm MTT được tiến hành cho kết quả IC50 là 63,8 µM [22].
1.3.2. Ảnh hưởng của các dịch chiết lên DNA tế bào
Bên cạnh việc đánh giá độc tính tế bào của dịch chiết từ cây hậu phác,
độc tính gen là một khía cạnh khác để đánh giá độc tính. Độc tính gen là khả
năng của một hợp chất gây ra thiệt hại hoặc thay đổi vật chất di truyền (DNA
hoặc nhiễm sắc thể). Tổn thương DNA là bất kì sửa đổi nào của DNA làm thay
đổi thuộc tính mã hố của nó do đó ảnh hưởng của việc truyền thơng tin bình
thường. Việc biến đổi cấu trúc tự nhiên của DNA có thể xảy ra thơng qua hai
cơ chế chính: ảnh hưởng tự phát do các nguồn bên trong tế bào gây ra hoặc do
các nguồn bên ngồi như hố chất, chất phóng xạ gây ra [23]. Do đó việc đánh
giá chính xác ảnh hưởng của gen bị tổn thương sẽ là một thơng tin có giá trị để
cân nhắc về tình trạng của tế bào [24]. Trong các bệnh về thần kinh, tổn thương
DNA đã được nhắc đến từ lâu như một đóng góp vào sự khởi phát và tiển triển
của bệnh.
Trong nghiên cứu thử nghiệm của Huanli Xu và các cộng sự về tác dụng
ức chế của lapahol đối với u thần kinh đệm C6 của chuột. Lapachol có một lịch

8


sử lâu dài về hoạt động chống ung thư kéo. Độc tính tế bào của lapachol và các
dẫn xuất của nó đã được đánh giá trong nhiều tế bào khối u, chẳng hạn như tế
bào ung thư thực quản, ung thư biểu mô Ehrlich, ung thư phổi không phải tế
bào nhỏ A549, ung thư tuyến tiền liệt PC-3, các dòng tế bào ung thư ruột kết
và các dòng u thần kinh đệm ở người (U373 và Hs683). Nghiên cứu này đã
đánh giá mức độ gây tổn thương DNA của lapahol trên dịng tế bào C6 bằng
cách đánh giá thơng qua chiều dài đuôi DNA ở các nồng độ khác nhau và cho
thấy mức độ tổn thương DNA tăng theo nồng độ hoá chất được thử [25]. Theo
nghiên cứu của Sung Huyn Choi và các cộng sự, dòng tế bào C2H12 (tế bào
nguyên bào cơ) sau khi được nuôi cấy và xử lý honokiol. Xét nghiệm điện di

đơn tế bào đã được tiến hành để khảo sát mức độ tổn thương DNA của honokiol.
Kết quả cho thấy tương tự như các mẫu đối chứng khơng có ảnh hưởng gì về
DNA, các tế bào được xử lý bằng honokiol chiều dài đuôi đã được phát hiện
cho thấy honokiol có thể gây ra tổn thương DNA và dẫn đến quá trình chết theo
chương trình [26].
1.3.3. Ảnh hưởng của các dịch chiết tự nhiên lên ty thể của tế bào
Ty thể có trong hầu hết các tế bào của con người, đóng vai trị cực kỳ
quan trọng đối với sự sống của mỗi chúng ta. Khác với các cơ quan tế bào khác,
chúng gồm 2 màng gồm một lớp bên trong và một lớp bên ngồi với các chức
năng khác nhau. Trong đó ở màng ngồi các phần tử nhỏ có thể tự do đi qua
màng ngoài phần này bao gồm các protein được gọi là porins, tạo thành các
kênh cho phép protein đi qua. Chúng có màng kép bên trong là những nếp gấp,
được gọi là “cristase”, chứa các protein liên quan đến quá trình chuyển tiếp
điện tử. Màng trong là nơi tạo hầu hết ATP trong ty thể [27]. Ty thể trong y
học được coi như những nhà máy điện của tế bào trong cơ thể. Chúng giúp biến
đổi năng lượng chúng ta lấy trong thức ăn chuyển hoá thành nguồn năng lượng
mà tế bào có thể sử dụng. Vai trị chính của ty thể là sản xuất ATP, thể hiện
qua một lượng lớn protein tại màng. ATP được sử dụng làm nguồn năng lượng
chính cho hầu hết các q trình sinh hóa và sinh lý chẳng hạn như tăng trưởng,
vận động và cân bằng nội mơi. Bên cạnh chức năng chính là tạo năng lượng
ATP cho cơ thể, ty thể cũng có vai trị quan trọng trong cân bằng nội mơi ion,
trong một số con đường trao đổi chất, trong quá trình chết theo chương trình và

9


tế bào chết theo chương trình cũng như trong sản xuất và tiêu thụ ROS. Tất cả
các chức năng này có ý nghĩa trong q trình lão hóa hoặc gây rối loạn ty
thể. Các ảnh hưởng này có thể khiến ty thể tích lũy các thành phần rối loạn
chức năng do chính ty thể tạo ra. Nó có thể được gây ra bởi các lỗi trình tự hoặc

quy định sau đột biến DNA nhân hoặc ty thể là kết quả của một loạt các tác
động bên trong hoặc môi trường bên ngoài chẳng hạn như da tiếp xúc với bức
xạ tia cực tím [28]. Ngồi ra trong q trình phosphoryl hóa oxy hóa
(OXPHOS) tạo ATP thì sản phẩm phụ của quá trình này tạo ra ROS. Trong
GSC, ROS hiện diện ở mức thấp do hệ thống gốc tự do. Hơn nữa, mức độ ROS
thấp có liên quan đến khả năng ác tính của tế bào cao hơn. Các nghiên cứu đã
chỉ ra rằng nồng độ ROS cao có thể ngăn chặn sự tiến triển của ung thư [29].
Do đó việc mất cấu trúc ty thể bình thường, sự ổn định và chức năng trong tế
bào có khả năng dẫn đến sự bất thường của q trình chuyển hố axit béo, gây
lượng ROS cao [60].
Ty thể tham gia vào quá trình điều hồ tăng sinh tế bào và chết theo
chương trình. Đây là hai vai trò quan trọng khác của ty thể trong u thần kinh
đệm [28]. Con đường tăng sinh tế bào là một phần quan trọng của cả con đường
apoptosis bên ngồi và bên trong. Nó được kích hoạt bởi sự gắn kết của các yếu
tố tăng trưởng với thụ thể tyrosine kinase (RTK) tương ứng của chúng được
tìm thấy trên bề mặt tế bào. Các thành phần của con đường tăng sinh cũng bị
ảnh hưởng bất lợi trong u thần kinh đệm, tạo ra một kích thích tăng sinh và
chống apoptotic tổng thể. Sự biểu hiện quá mức của RTK đối với yếu tố tăng
trưởng biểu bì khoảng 20 – 40% trong u thần kinh đệm cấp độ cao và đối với
yếu tố tăng trưởng bắt nguồn từ tiểu cầu (PDGF) trong khoảng 25% trường hợp
[30]. Ty thể cịn có vai trị quan trọng trong q trình chết theo chương trình
của các tế bào thần kinh. Chết theo chương trình là một loạt các phản ứng sinh
hố dẫn đến sự thay đổi về hình thái của tế bào và dẫn đến cái chết của tế bào
đó. Những thay đổi bao gồm việc hình thành những chỗ phồng, tế bào bị mất
phần bất đối xứng và các thành phần gắn lên màng tế bào, tế bào bị co rút và
nhân bị phân chia thành nhiều mảnh và DNA trong nhiễm sắc thể bị xắt nhỏ.
Q trình này có thể được kích hoạt thơng qua con đường apoptosis bên ngồi
và bên trong. Con đường apoptosis bên ngồi được kích hoạt bởi hệ thống miễn

10



dịch sau khi phát hiện các dấu hiệu bề mặt bất thường trên tế bào. Con đường
nội bào được kích hoạt bởi tổn thương trực tiếp đến tế bào do nhiều nguyên
nhân khác nhau bao gồm thiếu oxy, xạ trị, hoá trị, tạo ra ROS và tổn thương
DNA trực tiếp [31].
1.4.

U nguyên bào thần kinh đệm
Theo thống kê của GLOBOCAN ung thư là nguyên nhân dẫn đến tử

vong đứng thứ hai trên toàn thế giới với hơn 10 triệu ca tử vong vào năm 2020.
Trong đó, ung thư não cũng là một căn bệnh rất nguy hiểm gây tỉ lệ tử vong
cao. Theo Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ ước tính có khoảng 22,850 người
trưởng thành (12,630 nam và 10,280 nữ) được chẩn đoán ung thư não hay hệ
thần kinh khác trong năm 2015 [32]. Tỷ lệ mới mắc của u nguyên bào thần kinh
đệm là 2-3/100000 người trưởng thành và chiếm khoảng 52% tất cả các khối u
não nguyên phát. Nhìn chung, u nguyên bào thần kinh đệm chiếm 17% tổng số
u não. Ung thư não từ lâu đã được biết đến là căn bệnh ác tính đe dọa tính mạng
con người. Mặc dù thực tế là tất cả các tổn thương ác tính nội sọ đều được gọi
là u não, nhưng vị trí giải phẫu cụ thể, mức độ xâm lấn và hình thái học dẫn
đến việc phân loại ung thư não thành các loại phụ khác nhau. Hầu hết các khối
u tế bào song song độ I và II là các khối u cấp thấp không ác tính, trong khi các
khối u tế bào song song độ III và IV là các khối u ác tính cao [33]. U tế bào
hình sao độ III được gọi là u tế bào hình sao anaplastic (AAs), trong khi tất cả
các loại u tế bào hình sao độ IV được gọi là u nguyên bào thần kinh đệm (GBM).
Glioblastomas là khối u không đồng nhất và luôn gây chết người. Chúng được
đặc trưng bởi các biến thể di truyền và biểu sinh giữa các tế bào khối u, khiến
cho việc phát triển các liệu pháp tiêu diệt tất cả các tế bào khối u là một thách
thức rất lớn. Ngày này các phương pháp điều trị đầu tay cho bệnh nhân u

nguyên bào thần kinh đệm bao gồm phẫu thuật, sau đó là xạ trị phân đoạn khu
trú với việc sử dụng đồng thời và bổ trợ hoá trị liệu. Tuy nhiên các phương
pháp trị liệu này vẫn còn nhiều rủi ro trong q trình điều trị, có thể khơng điều
trị được hồn tồn di căn hoặc tái phát lại. Với sự phát triển của ngành sinh học
phân tử bước đầu sử dụng phương pháp can thiệp sinh học, dựa vào cơ chế sinh
ung thư trong các u não các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu các phương
pháp khác như can thiệp vào hoạt động của các gen, ức chế sự sinh sản của các

11


tế bào u. Có nhiều nhiều dịng tế bào mơ phỏng GBM của con người và được
sử dụng trong nghiên cứu. Các dịng tế bào có nguồn gốc từ người như U251
và U87, dòng tế bào chuột GL261 và các dòng tế bào chuột 9L/LacZ, F98,
RG2, CNS-1 và C6 [34]. Các dòng tế bào được sử dụng in vitro để cung cấp
các nghiên cứu trị liệu như mơ hình tăng trưởng, xâm lấn, mơ hình tạo mạch và
miễn dịch, cũng như nhiều mục tiêu phân tử và di truyền cho các tác nhân dược
lý mới hơn.
Dòng tế bào C6 được phát triển ở chuột Wistar-Furth trưởng thành vào
cuối những năm 1960 sau khi chuột tiếp xúc nhiều lần với N -Nitroso- N methylurea [35]. Dòng tế bào u thần kinh đệm này bao gồm các tế bào đa hình
với các nhân có hình dạng khác nhau. Các tế bào C6 là các tế bào giống như
trục chính mơ phỏng GBM của con người khi được tiêm vào não của chuột sơ
sinh. Các mơ hình u thần kinh đệm đã được phát triển ở chuột Wistar và thể
hiện các đặc điểm mô học giống như GBM người, chẳng hạn như hoại tử khối
u, đa hình hạt nhân [36]. Mơ hình u thần kinh đệm C6 đã được chứng minh là
thể hiện sự đa dạng của protein, yếu tố tăng trưởng hoặc thụ thể của chúng, tạo
thành mục tiêu cho nghiên cứu khối u. Trong số các mục tiêu phổ biến nhất là
các yếu tố tạo mạch như VEGF và bFGF và các thụ thể của nó là thụ thể của
yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGFR) và thụ thể của yếu tố tăng
trưởng nguyên bào sợi (FGFR) tương ứng. Các mục tiêu phức tạp hơn là IGF

và các thụ thể của nó chịu trách nhiệm cho sự tăng sinh tế bào và ức chế sự chết
của tế bào [37].
Ức chế tăng trưởng khối u là mục tiêu chính của nghiên cứu mơ hình u
thần kinh đệm C6. Một số hoạt chất như ibuprofen, dopamine và aspirin đã
được thử nghiệm trên các mơ hình như vậy, trong đó aspirin làm giảm sự xâm
lấn của u thần kinh đệm [38]. Các mơ hình u thần kinh đệm C6 cũng là một mơ
hình thường được sử dụng cho các liệu pháp thử nghiệm với các hạt nano. Các
phương pháp trị liệu kết hợp cũng đã được thử nghiệm đối với các mô hình u
thần kinh đệm C6. Những sự kết hợp này đã cho thấy sự ức chế tăng trưởng
của tế bào u thần kinh đệm. C6 được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu mơi
trường miễn dịch khối u vì nó sử dụng các chiến lược xâm nhập miễn dịch
tương tự như GBM của con người. Do đó, dịng tế bào C6 cung cấp nhiều

12


nghiên cứu trị liệu bao gồm nghiên cứu mơ hình tăng trưởng và xâm lấn, mơ
hình tạo mạch và miễn dịch, cũng như rất nhiều mục tiêu phân tử và di truyền
cho các tác nhân dược lý mới hơn. Hầu hết các nghiên cứu về u thần kinh đệm
C6 đã tập trung vào việc thử nghiệm nhiều loại tác nhân cho hoạt động tiêu diệt
khối u của chúng. Hơn nữa, các mơ hình u thần kinh đệm chuột C6 cũng đã
được sử dụng rộng rãi để phân tích các đặc điểm của u thần kinh đệm như phát
triển, xâm lấn, di cư và hình thành mạch [39].

13


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Dịch chiết được tách chiết từ cây hậu phác (dịch chiết) và được cung cấp

bởi phòng Sinh hóa thực vật - Viện Cơng nghệ sinh học– Viện Hàn lâm
Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam
- Dịng tế bào u thần kinh đệm C6 do Viện Công nghệ sinh học – Viện
Hàn lâm và khoa học Việt Nam cung cấp.
2.2.

Hoá chất, dụng cụ, trang biết bị nghiên cứu chính
Trang thiết bị thí nghiệm

Các thiết bị và dụng cụ được sử dụng làm thí nghiệm thuộc phịng Sinh
hố thực vật thuộc Viện công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và cơng
nghệ Việt Nam:
-

Tủ an tồn sinh học (ESCO)
Kính hiển vi olympus (Nhật Bản)
Tủ ấm 5% CO2 (Shell Lab)
Máy ly tâm (Thermo Fisher )

- Tủ lạnh 4°C, -20°C (LG)
- Đĩa nuối cấy 6 giếng, 12 giếng, 24 giếng, 48 giếng, 96 giếng (Biologix)
-

Máy ly tâm lạnh (Thermo Fisher)
Kính hiển vi huỳnh quang (Nikon)
Máy khuấy từ (Metrohm)
Hệ thống điện di ngang (Cleaver Scientific )

- Máy đo pH (Metrohm)
- Buồng đếm tế bào (Thomas)

- Máy đọc ELISA (Thermo Fisher)
Dụng cụ thí nghiệm
- Các ống eppendorf 2,0 ml; 1,5 ml
- Các ống falcol 15 ml, 50 ml
- Micropipet và đầu côn phù hợp với các thể tích 0,5 – 10 μl; 10- 100 μl;
100-1000 μl.

14


- Dụng cụ thuỷ tinh: đĩa peptri, cốc có mỏ, bình đựng hố chất
- Lam kính
- Dụng cụ nhựa khác: hộp đựng mẫu, giá để ống
Các dụng cụ đều đạt chuẩn phân tích
Hố chất
- DMEM high glucose (Thermo Fisher)
- FBS (Sigma life science)
- Pennicilin (Pan – Biotech)
- PBS (Glibco)
- Trysin – EDTA (Glibco)
- Blue Trypan (Thermo Fisher)
-

Natri clorua (NaCl)
Glycine
Tris HCl (ICN Biomedicals)
Boric acid
DAPI (Thermo Fisher)

-


Mitotracker Orange CMTMRo ( Thermo Fisher)
DMSO (Prolabo)
Parafomaldehyde (Merck)
CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay

2.3.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Ni cấy dịng tế bào C6
Bước 1: Tế bào được cất giữ trong Nitơ lỏng, đem rã đông ở 37°C. Chuyển
dung dịch chứa tế bào vào ống facol 15 ml đã có chứa mơi trường DMEM, ly
tâm 1500 vòng trong 5 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào.
Bước 2: Tế bào được cấy chuyển vào giếng sau khi được thêm môi trường
DMEM đã được bổ sung huyết thanh bị FBS và penicilin. Đĩa ni cấy tế
bào được phát triển ở 37°C trong mơi trường có 5% CO2. Tê bào được kiểm
tra hằng ngày, thay môi trường 2 ngày/ lần.

15


Bước 3: Thay môi trường nuôi cấy tế bào bằng cách dùng pipet hút hết môi
trường cũ ra, bổ sung thêm PBS 1X để loại bỏ các tế bào chết, rửa tế bào. Sau
đó thêm mơi trường DMEM vào giếng sau đó cất tế bào vào tủ ấm.
Bước 4: Khi tế bào mọc kín 75 – 90 % bề mặt đĩa thì tiến hành cấy chuyển
sang đĩa ni cấy mới hoặc thu tế bào nuôi cấy.
Bước 5: Thu tế bào từ đĩa nuôi cấy bằng cách ủ với dung dịch Trysin – EDTA
0,25% trong 5 phút ở 37°C, 5% CO2. Trung hồ Trysin bằng cách bổ sung mơi
trường ni cấy đầy đủ DMEM, hút dịch vào ống ly tâm, đem ly tâm 1500 vòng

trong 5 phút.
2.3.2. Định lượng tế bào nuôi cấy
Bước 1: Khi tiến hành đếm số lượng tế bào nuôi cấy dùng pipet hút bỏ môi
trường nuôi cấy cũ trong đĩa nuôi cấy, rửa với dung dịch PBS 2 lần. Tách tế
bào trong đĩa với dung dịch Trysin – EDTA 0,25% ử ở 37°C trong 5 phút. Khi
80 – 90 % tế bào trong đĩa co tròn và tách ra khỏi bề mặt ni cấy thì thêm mơi
trường DMEM để bất hoạt Trysin. Cho hết dung dịch vào vào ống eppendorf
ly tâm 1500 vòng trong 5 phút.
Bước 2: Hút 20 ul dịch huyền phù có tế bào vào ống eppendorf 1,5 ml , pha
loãng với dung dịch Trypan Blue 0,4% theo tỉ lệ 1:1 và trộn đều. Phủ buồng
đếm với lamelle và cho 1 giọt huyền phù tế bào vào buồng đếm bằng cách nhỏ
sát vị trí tiếp xúc giữa lamellevà buồng đếm. Nhờ hệ thống mao dẫn mà giọt
huyền phù sẽ tràn đầy buồng đếm.
Bước 3: Đếm số lượng tế bào tại bốn vùng đếm ở bốn góc (ký hiệu là A). Đếm
các tế bào trịn, to, sáng rõ. Đếm 4 vùng rồi tính số lượng tế bào trung bình

!
"

Bước 4: Mật độ tế bào trung bình trong 1 ml môi trường là:
!
"

x 104 x [độ pha lỗng ]

( tế bào/ml)[40]

2.3.3. Phương pháp thử độc tính tế bào MTS
Phương pháp thử độc tính tế bào MTS đựa trên nguyên lý như sau:
MTS([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4sulfophenyl)-2H-tetrazolium) khi có mặt PMS (phenazine methosulfate) sẽ

được tế bào chuyển hoá, tạo ra một sản phẩn formazan tan trong môi trường

16


nuôi cấy tế bào, hấp thụ ánh sáng tối đa ở bước sóng 490 – 500nm. Lượng
formazan tạo ra được định lượng bằng ánh sáng ở bước sóng 490nm bị hấp thụ
và tỉ lệ thuận với lượng tế bào sống trong mơi trường ni cấy đó. Phương pháp
MTS thường được coi là phương pháp MTT 1 bước, có tính tiện lợi cao do chỉ
cần bổ sung thẳng chất vào môi trường ni cấy tế bào mà khơng cần bất kì
bước rửa hay chuẩn bị nào khác.
Phương pháp MTS có ưu điểm là độ nhạy và độ chính xác cao, các bước
thực hiện đơn giản, trong thời gian ngắn, do đó thường sử dụng kiểm tra độc
tính để sàng lọc thuốc với số lượng lớn, trên nhiều nồng độ thuốc khác nhau.
Kết quả thu được cho ra giá trị IC50 ,từ đó đánh giá được độ độc của thuốc cần
nghiên cứu.
Để thực hiện phương pháp này chúng em tiến hành sử dụng dịch chiết ở
các nồng độ khác nhau là nồng độ 1, 5, 10, 20, 40 µg/ml và mẫu đối chứng âm
khơng xử lí chất và xử lí trong 72 giờ.
Quy trình được thực hiện theo các bước sau:
Bước 1: Tế bào được nuôi vào trong đĩa 96 giếng với mật độ 5000 tế bào/ giếng
trong 100 µL mơi trường nuôi cấy với các nồng độ dịch chiết cần thử. Nuôi
trong tủ ấm 37°C, 5% CO2 cho tế bào ổn định trong 24 giờ trước khi tiến hành
ủ thuốc.
Bước 2: Ủ với thuốc thử. Pha dịch chiết trong môi trường nuôi cấy ở các nồng
độ 1, 5, 10, 20, 40 µg/ml sau đó thêm vào các giếng ủ trong 72 giờ ở tủ ấm
37°C, 5% CO2.
Bước 3: Hút bỏ 100 μl môi trường ở mỗi giếng và bổ sung vào 20 μl dung dịch
thuốc thử thêm vào mỗi giếng đã có 100 µL mơi trường và ủ trong 1 - 4 giờ ở
37°C. Ở bước này, dung dịch cần được bọc kín để tránh ánh sáng.

Bước 4: Đo mật độ quang học của dung dịch trong giếng bằng máy Microplate
Reader ở bước sóng 490 nm.
Bước 5: Dùng phần mềm Exel để xử lý số liệu, tính chỉ số IC50 – là giá trị nồng
độ chất thử tại đó chất thử có khả năng gây chết 50% tế bào.
- Chỉ số IC50 của một chất với một dòng tế bào được tính từ nghiệm
phương trình hồi quy biểu diễn tương quan giữa x là nồng độ hoặc log là

17