.

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----š›&š›-----

TRẦN THANH TỊNG

KHẢO SÁT VAI TRỊ CỦA TREC
TRONG DỰ ĐOÁN KẾT CỤC CỦA NGƯỜI BỆNH
GHÉP TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU ĐỒNG LOÀI
TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC

LUẬN VĂN BÁC SĨ NỘI TRÚ

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

.


.

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----š›&š›-----

TRẦN THANH TỊNG

KHẢO SÁT VAI TRỊ CỦA TREC
TRONG DỰ ĐOÁN KẾT CỤC CỦA NGƯỜI BỆNH
GHÉP TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU ĐỒNG LOÀI
TẠI BỆNH VIỆN TRUYỀN MÁU HUYẾT HỌC

NGÀNH: HUYẾT HỌC – TRUYỀN MÁU
MÃ SỐ: NT 62 72 25 01

LUẬN VĂN BÁC SĨ NỘI TRÚ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. BS. PHAN THỊ XINH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022

.


.

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kì cơng trình nào khác.

Tác giả luận văn


TRẦN THANH TÒNG

.


.

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG..................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... vii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ........................................................................................ viii
DANH MỤC SƠ ĐỒ ............................................................................................... ix
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ....................................................................................4
1.1. TREC (T cell Receptor Excision Circle) .............................................................4
1.2. Ghép tế bào gốc tạo máu....................................................................................13
1.3. Các nghiên cứu đánh giá vai trò của TREC sau ghép tế bào gốc ......................20
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................23
2.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................23
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................24
2.3. Phương pháp thu thập và xử lí số liệu ...............................................................27
2.4. Đạo đức trong nghiên cứu..................................................................................32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................34
3.1. Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu ................................................................35
3.2. Trị số TREC .......................................................................................................43
3.3. Mối liên quan giữa TREC với các biến số ghép tế bào gốc đồng loài...............45
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ......................................................................................57

4.1. Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu ................................................................57
4.2. Trị số TREC .......................................................................................................64
4.3. Mối liên quan giữa TREC và các đặc điểm của ghép tế bào gốc ......................67
4.4. Hạn chế của đề tài ..............................................................................................83
KẾT LUẬN ..............................................................................................................84
KIẾN NGHỊ.............................................................................................................86
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ

.


.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1: BẢNG THU THẬP SỐ LIỆU
PHỤ LỤC 2: BẢN THÔNG TIN DÀNH CHO NGƯỜI THAM GIA NGHIÊN CỨU
VÀ CHẤP THUẬN THAM GIA NGHIÊN CỨU
PHỤ LỤC 3: PHÂN ĐỘ MỘT SỐ ĐỘC TÍNH QUAN TRỌNG THEO TIÊU
CỦA VIỆN UNG THƯ QUỐC GIA HOA KỲ, PHIÊN BẢN 4.03
PHỤ LỤC 4: THANG ĐIỂM HCT-CI HIỆU CHỈNH THEO TUỔI
PHỤ LỤC 5: THANG ĐIỂM DRI
PHỤ LỤC 6: PHÂN ĐỘ GVHD CẤP
PHỤ LỤC 7: PHÂN LOẠI GVHD MẠN THEO SEATLE

.


.

i


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
TỪ VIẾT TẮT TIẾNG ANH
TÊN VIẾT TẮT TÊN TIẾNG ANH

TÊN TIẾNG VIỆT

α

Alpha

β

Beta

γ

Gamma

δ

Denta

δRec

delta-Rec

ψJα

psi-Joining-alpha


ATG

Antithymocyte globulin

Bu

Busulfan

CD

Cluster of differentiation

Cụm biệt hố

CMV

Cytomegalo virus

Vi-rút Cytomegalo

CR

Completed response

Đáp ứng hồn tồn

CsA

Cyclosporin A


Cy

Cyclophosphamide

D

Diverse

Vùng đa dạng

DFS

Disease free survival

Thời gian sống không bệnh

DIPSS

The Dynamic International
Prognostic Scoring System

Hệ thống tính điểm tiên lượng
quốc tế thay đổi

DNA

Deoxyribonucleic acid

DRI


Disease risk index

EDTA

Ethylene Diamine
Tetraacetic Acid

FK

Tacrolimus

Flu

Fludarabine

.

Chỉ số nguy cơ bệnh tật


.

ii

TỪ VIẾT TẮT TIẾNG ANH
TÊN VIẾT TẮT TÊN TIẾNG ANH

TÊN TIẾNG VIỆT


GVHD

Graft versus host disease

Bệnh mảnh ghép chống chủ

GvL

Graft versus leukemia

Mảnh ghép chống leukemia
Người cho đồng huyết thống
không phù hợp HLA (nửa
thuận hợp)

Haploidentical
donor

HCT–CI

Hematopoietic cell
Chỉ số bệnh đồng mắc trong
transplantation - comorbidity
ghép tế bào gốc tại máu
index

HLA

Human Leukocyte Antigen


IL

Interleukin

J

Joining

Vùng nối

MAC

Myeloablative conditioning

Điều kiện hoá diệt tuỷ

Mel

Melphalan

MMAD

Mismatched alternative
donor

MMF

Mycophenolate mofetil

MSD


Matched sibling donor

Người cho đồng huyết thống
phù hợp HLA hồn tồn

MUD

Matched unrelated donor

Người cho khơng đồng huyết
thống phù hợp HLA hoàn
toàn

Multiplex

Multiplex

PCR – STR

PCR – Short tandem repeat

PCR đa mồi – lặp lại song
song đoạn ngắn

NK cell

Natural killer cell

Tế bào diệt tự nhiên


NMA

Non-myeloablative

Không diệt tuỷ

NRM

Non-relapse Mortality

Tử vong khơng do tái phát

OS

Overall Survival

Thời gian sống tồn bộ

Ph

Philadelphia

Nhiễm sắc thể Philadelphia

.

Kháng nguyên bạch cầu người

Người cho thay thế không phù

hợp HLA


.

iii

TỪ VIẾT TẮT TIẾNG ANH
TÊN VIẾT TẮT TÊN TIẾNG ANH

TÊN TIẾNG VIỆT

PR

Partial response

Đáp ứng một phần

PT–Cy

Post-Transplant
cyclophosphamide

Cyclophosphamide sau ghép

RA

Refractory anemia

Thiếu máu dai dẳng


RAEB

Refractory anemia with
excess of blasts

Thiếu máu dai dẳng có tăng
quá mức tế bào non

RCMD

Refractory cytopenia with
multilineage dysplasia

Giảm tế bào dai dẳng có rối
loạn nhiều dịng tế bào

RIC

Reduced intensity
conditioning

Điều kiện hoá giảm cường độ

RQ-PCR

Real-time
quantitative polymerase
chain reaction


Phản ứng tổng hợp chuỗi
polymerase định lượng thời
gian thực

RR

Relapse rate

Tỉ lệ tái phát

RT-PCR

Reverse transcription
polymerase chain reaction

Phản ứng tổng hợp chuỗi
polymerase sao chép ngược

RTEs

Recent thymic emigrants

Tế bào vừa di chuyển khỏi
tuyến ức

TBI

Total body irradiation

Tia xạ toàn thân


TCR

T cell receptor

Thụ thể tế bào T

TREC

T cell receptor excision
circle

Vòng cắt thụ thế tế bào T

Treg

T regulatory

Tế bào T điều hoà

TRM

Transplant-related Mortality

Tử vong liên quan ghép

V

Variable


Vùng biến đổi

.


.

iv

TỪ VIẾT TẮT TIẾNG VIỆT
TÊN VIẾT TẮT TÊN TIẾNG VIỆT
BCCDL

Bạch cầu cấp dòng lympho

BCCDT

Bạch cầu cấp dòng tuỷ

BCH

Bạch cầu hạt

BCMDL

Bạch cầu mạn dòng lympho

BCMDT

Bạch cầu mạn dòng tuỷ


BCMDTM

Bạch cầu mạn dòng tuỷ mono

BV TMHH

Bệnh viện Truyền máu Huyết Học

GTBG

Ghép tế bào gốc

LST

Loạn sinh tuỷ

N

Ngày

SGMD

Suy giảm miễn dịch

TBG

Tế bào gốc

TC


Tiểu cầu

.


.

v

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Vị trí các gen TCR trên nhiễm sắc thể ...................................................5
Bảng 1.2. Sự thay đổi trong các phương pháp ước lượng TREC .........................11
Bảng 1.3. Trình tự các đoạn mồi và đoạn dò TREC và β-actin ...........................13
Bảng 1.4. Chỉ định ghép tế bào gốc tạo máu đồng loài ........................................15
Bảng 1.5. Phục hồi miễn dịch sau ghép tế bào gốc đồng loài ..............................16
Bảng 1.6. Các nghiên cứu nước ngoài đánh giá vai trị của TREC ......................20
Bảng 2.1. Phân tích dữ liệu kết quả xét nghiệm TREC ........................................26
Bảng 3.1. Đặc điểm chung người bệnh trước ghép ..............................................35
Bảng 3.2. Đặc điểm người cho tế bào gốc............................................................37
Bảng 3.3. Đặc điểm điều kiện hố, dự phịng GVHD và liều tế bào gốc .............38
Bảng 3.4. Đặc điểm mọc mảnh ghép ....................................................................39
Bảng 3.5. Biến chứng sau N100 sau ghép ............................................................40
Bảng 3.6. Trị số TREC tại các thời điểm N60, N100 và N180 sau ghép .............43
Bảng 3.7. Mối liên quan giữa đặc điểm người bệnh với TREC N60 và N100 ....45
Bảng 3.8. Mối liên quan giữa các đặc điểm của người bệnh với TREC N180 ....46
Bảng 3.9. Mối liên quan giữa kiểu ghép, điều kiện hoá với TREC N60 và N100
..................................................................................................................................47
Bảng 3.10. Mối liên quan giữa kiểu ghép và điều kiện hoá với TREC N180 ......48
Bảng 3.11. Mối liên quan giữa chimerism và trị số TREC tương ứng.................49

Bảng 3.12. Mối liên quan giữa hồi phục TREC và nhiễm trùng ..........................50
Bảng 3.13. Mối liên quan giữa hồi phục TREC và loét niêm mạc miệng ............51
Bảng 3.14. Mối liên quan giữa hồi phục TREC và tái hoạt CMV .......................51

.


.

vi

Bảng 3.15. Mối liên quan giữa hồi phục TREC và GVHD cấp ...........................52
Bảng 3.16. Mối liên quan giữa hồi phục TREC và GVHD mạn ..........................52
Bảng 4.1. Kết quả các nghiên cứu đánh giá TREC sau ghép ...............................66

.


.

vii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Trình tự tái sắp xếp gen TCR .................................................................6
Hình 1.2. Trình tự tái sắp xếp trong locus TCRαδ .................................................8
Hình 1.3. Sự phục hồi tế bào T sau ghép tế bào gốc đồng loài ............................17

.



.

viii

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Chỉ số DRI của người bệnh trước ghép ...........................................36
Biểu đồ 3.2. Điểm HCT-CI hiệu chỉnh theo tuổi của người bệnh trước ghép .....36
Biểu đồ 3.3. Biến chứng trước 100 ngày sau ghép ...............................................40
Biểu đồ 3.4. Biểu đồ Kaplan-Meier ước lượng RR theo thời gian .......................41
Biểu đồ 3.5. Biểu đồ Kaplan-Meier ước lượng tỉ lệ NRM theo thời gian ............41
Biểu đồ 3.6. Biểu đồ Kaplan-Meier biểu diễn tỉ lệ DFS theo thời gian ...............42
Biểu đồ 3.7. Biểu đồ Kaplan-Meier biểu diễn tỉ lệ OS theo thời gian .................42
Biểu đồ 3.8. Biểu đồ Kaplan-Meier ước lượng RR theo thời gian phụ thuộc TREC
N100..........................................................................................................................53
Biểu đồ 3.9. Biểu đồ Kaplan-Meier ước lượng tỉ lệ NRM theo thời gian phụ thuộc
TREC N100 ..............................................................................................................54
Biểu đồ 3.10. Biểu đồ Kaplan-Meier ước lượng tỉ lệ OS theo thời gian phụ thuộc
TREC N100 ..............................................................................................................54
Biểu đồ 3.11. Biểu đồ Kaplan-Meier ước lượng tỉ lệ OS theo thời gian phụ thuộc
TREC N180 ..............................................................................................................55
Biểu đồ 3.12. Biểu đồ Kaplan-Meier ước lượng tỉ lệ DFS theo thời gian phụ thuộc
TREC N100 ..............................................................................................................55
Biểu đồ 3.13. Biểu đồ Kaplan-Meier ước lượng tỉ lệ DFS theo thời gian phụ thuộc
TREC N180 ..............................................................................................................56

.


.


ix

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Chu kì phản ứng RQ-PCR...................................................................26
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tiến hành nghiên cứu .................................................................32
Sơ đồ 3.1. Lưu đồ tóm tắt kết quả nghiên cứu .....................................................34

.


.

1

MỞ ĐẦU
Ghép tế bào gốc (GTBG) tạo máu là phương pháp đã được sử dụng trong hơn 6
thập kỉ qua để điều trị một số bệnh huyết học ác tính và khơng ác tính1. Bên cạnh
những hiệu quả đạt được, GTBG có những biến chứng nghiêm trọng như: thải ghép,
bệnh mảnh ghép chống chủ (GVHD: Graft versus host disease), tái phát, suy giảm
miễn dịch (SGMD) kéo dài với các bệnh nhiễm trùng gây tử vong2,3.
Kết cục lâm sàng của GTBG dựa trên sự phục hồi thành công của hệ miễn dịch,
đặc biệt là sự phục hồi tối ưu của tế bào T. Sự phục hồi nhóm tế bào này sau ghép
xảy ra theo hai con đường khác biệt về không gian và thời gian. Trong những tuần,
những tháng đầu tiên sau ghép, tế bào T có nguồn gốc từ người cho đồng ghép và tế
bào T cịn lại khơng bị phá huỷ bởi phác đồ điều kiện hoá sẽ trải qua quá trình tăng
sinh ngoại vi chủ yếu do sự tác động của các cytokine [interleukin (IL)-15, IL-2, IL7], đây gọi là q trình hồi phục tế bào T khơng phụ thuộc tuyến ức4. Mặc dù con
đường này đóng vai trò như một con đường ngắn để bổ sung nhanh chóng nguồn tế
bào T hầu như khơng cịn ở người bệnh, nhưng khả năng chống lại nhiễm trùng của
nhóm này là khá hạn chế do sự lệch của nhóm thụ thể tế bào T (skewed T cell receptor
repertoire). Sau đó, thế hệ tế bào T ngây thơ (naive) phụ thuộc vào tuyến ức từ tế bào

gốc tạo máu của người cho đóng một vai trị thiết yếu để phục hồi miễn dịch của
người bệnh. Q trình này có thể mất vài tháng đến nhiều năm và chịu trách nhiệm
khôi phục hồn tồn các đặc tính của thụ thể tế bào T (TCR: T cell receptor). Việc
phục hồi thích hợp nhóm tế bào T là điều quan trọng hàng đầu không chỉ để chống
lại nhiễm trùng cơ hội mà còn để thúc đẩy việc kiểm sốt khối u thơng qua hiệu ứng
mảnh ghép chống leukemia (GVL: Graft vernus leukemia)5. Tình trạng SGMD kéo
dài sau ghép vẫn là một trở ngại liên quan đến việc tăng nguy cơ nhiễm trùng, các
khối u ác tính thứ phát, tỉ lệ tái phát và tử vong cao6. Chính vì vậy, sự phục hồi tế bào
T, đặc biệt là qua con đường phụ thuộc tuyến ức, có mối liên quan chặt chẽ đến sự
thành cơng của GTBG.

.


.

2

Trước đây, những nghiên cứu đánh giá sản phẩm tuyến ức đã bị cản trở do thiếu
các dấu ấn trực tiếp phản ánh tế bào vừa di chuyển khỏi tuyến ức (RTEs: Recent
thymic emigrants). Năm 1998, Douek và cộng sự lần đầu tiên báo cáo việc sử dụng
TREC (T cell Receptor Excision Circle) trong nghiên cứu những thay đổi về tần suất
của RTEs theo tuổi7. TREC là các vòng DNA được tạo ra trong quá trình tái sắp xếp
đặc biệt của gen TCR khi tế bào T phân chia và trưởng thành trong tuyến ức. TREC
nằm trong tế bào chất của tế bào T, ổn định, không dễ phân huỷ theo thời gian, khơng
phân chia trong q trình phân bào nguyên phân nên bị pha loãng khi các tế bào T
trưởng thành và tăng sinh ngoại vi8,9.
Các nghiên cứu khảo sát trị số TREC sau GTBG không những cải thiện đáng kể
sự hiểu biết về các cơ chế phục hồi tế bào T cơ bản, mà cịn dự đốn kết cục của cuộc
ghép10. Lewin và cộng sự đã báo cáo mối tương quan chặt chẽ giữa nồng độ TREC

thấp và nhiễm trùng cơ hội trong 6 tháng đầu sau ghép11. Kết quả tương tự đã được
báo cáo bởi Wils, tác giả chỉ ra rằng những người bệnh có TREC phục hồi hiệu quả
ở 6 tháng, 9 tháng và 12 tháng sau ghép có nguy cơ nhiễm trùng cơ hội nặng thấp hơn
3 lần, 4 lần và 9 lần, tương ứng. Ngoài ra, sự phục hồi của TREC sau 6 tháng có thể
dự đốn tỉ lệ tử vong khơng do tái phát (NRM: Non-relapse mortality) và tỉ lệ sống
toàn bộ (OS: Overall survival)12. Tuy nhiên, nghiên cứu của tác giả Mikhael và cộng
sự khơng tìm thấy mối liên quan giữa mức độ TREC ở thời điểm ngày 28 (N28) sau
ghép với biến chứng nhiễm trùng cơ hội và GVHD2. Sairafi và cộng sự báo cáo sự
tương quan chặt chẽ giữa mức TREC cao và giảm tỉ lệ tử vong liên quan ghép (TRM:
Transplant-related mortality)13. Phần lớn các nghiên cứu đánh giá mối liên quan giữa
giá trị TREC và kết cục GTBG đều thực hiện ở nước ngoài. Tại Việt Nam, chúng tơi
chưa ghi nhận các nghiên cứu đánh giá tình trạng hồi phục của quần thể tế bào T
thông qua TREC, cũng như tác động dự đoán của TREC đối với các kết cục sau ghép.
Vì vậy, chúng tơi thực hiện đề tài này với câu hỏi nghiên cứu: “Trị số TREC có vai
trị như thế nào trong dự đốn kết cục của người bệnh GTBG tạo máu đồng loài?”.
Để trả lời câu hỏi trên, chúng tôi đưa ra 2 mục tiêu nghiên cứu:

.


.

3

1.

Xác định trị số TREC của người bệnh sau GTBG tạo máu đồng loài bằng kĩ
thuật RQ-PCR tại các thời điểm N60, N100 và N180.

2.


Xác định sự tương quan giữa trị số TREC và các kết cục của người bệnh sau
GTBG tạo máu đồng loài bao gồm: OS, DFS và các biến chứng.

.


.

4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TREC (T cell Receptor Excision Circle)
1.1.1. Định nghĩa
TREC là các vòng DNA (Deoxyribonucleic acid) ổn định được tạo ra trong quá
trình tái sắp xếp đặc biệt của các gen TCR khi tế bào T phân chia và trưởng thành
trong tuyến ức. TREC nằm trong tế bào chất của tế bào T, ổn định, không dễ phân
huỷ theo thời gian, khơng phân chia trong q trình phân bào nguyên phân nên chúng
sẽ bị pha loãng khi các tế bào T trưởng thành và tăng sinh. Dường như TREC chỉ có
nguồn gốc từ tuyến ức, khơng có nguồn tái sắp xếp TCR ngồi tuyến ức. Bởi vì TREC
là phân đoạn DNA không sao chép, TREC chỉ bị mất khi tế bào chết, pha lỗng qua
q trình phân chia tế bào hoặc cả hai. Vì vậy, số lượng bản sao TREC trên mỗi tế
bào T phản ánh chủ yếu sự sản xuất các tế bào T ngây thơ qua tuyến ức và số lượng
TREC bình thường là một dấu ấn sinh học cho thấy việc sản xuất đầy đủ9,14,15.

1.1.2. Tái sắp xếp TCR
Sự tái sắp xếp các gen TCR trưởng thành từ các đoạn gen trong quá trình phát triển
tế bào T xảy ra tại tuyến ức hình thành hai loại TCR:
- Đa phần (³ 85%) tế bào T máu ngoại vi mang một thụ thể heterodimeric (protein
tạo bởi 2 thành phần khác biệt) được tạo thành từ hai chuỗi alpha (α) và beta (β).

Dạng TCR này còn được gọi là TCR2 hay TCR cổ điển.
- Phần còn lại của tế bào T mang một loại TCR khác tạo thành từ hai chuỗi gamma
(γ) và delta (δ) được gọi là TCR1 hay TCR thay thế. Tuy nhiên, tế bào T biểu hiện
TCR1 có thể chiếm ưu thế trong một số mơ (ví dụ: niêm mạc ruột)16.

.


.

5

Bảng 1.1. Vị trí các gen TCR trên nhiễm sắc thể
Locus

Nhiễm sắc thể

Alpha, delta

14q11

Beta

7q35

Gamma

7p15

Nhiều tế bào T khác nhau có các đặc tính TCR riêng biệt, nhưng chỉ một số lượng

hạn chế của các đoạn gen dịng mầm có thể tạo ra sự đa dạng của các phân tử TCR.
Vùng biến đổi (V: variable) nhận diện kháng nguyên của các phân tử TCR được mã
hóa bởi sự kết hợp của các đoạn gen V, D (diverse) và J (joining) (chuỗi TCRδ và
TCRβ) hoặc các đoạn gen V và J (chuỗi TCRγ và TCRα)8. Trong quá trình sắp xếp,
sự đa dạng về chức năng của các khớp mã hóa có được bằng cách chèn và xóa các
nucleotide. Các exon V-(D-)J với các khớp mã hóa cùng các exon cố định được phiên
mã thành RNA thông tin (mRNA: messenger RNA) và được dịch mã thành protein.
Các đầu tín hiệu cũng được nối lại với nhau và tạo thành các sản phẩm DNA vịng
bên ngồi nhiễm sắc thể, được gọi là TREC14.
Tế bào gốc CD34+ được truyền vào đến khoang tủy xương và biệt hóa thành các
tế bào tiền thân lympho sau đó di chuyển đến tuyến ức. Tại đây, các tế bào tiền thân
lympho này trải qua các bước trưởng thành khác nhau từ tế bào âm tính kép (DN:
double negative, các tế bào đầu dòng thiếu sự biểu hiện của đồng thụ thể CD4 và
CD8) di chuyển thành một quần thể dương tính kép (DP: double positive, tế bào
lympho biểu hiện đồng thụ thể CD4 và CD8) và cuối cùng thoát ra khỏi tuyến ức dưới
dạng tế bào T dương tính đơn CD4+ hoặc CD8+. Trong các bước trưởng thành này,
sự tái tổ hợp V-(D-)J diễn ra cho phép phát triển một nhóm TCR đa dạng dựa trên cả
sự tái sắp xếp chuỗi TCRα và TCRβ.
Các nghiên cứu về sự tái sắp xếp gen TCR trong quần thể tế bào tuyến ức cho thấy
những sự tái sắp xếp này xảy ra một cách có trật tự trong q trình biệt hóa tế bào T,
được xác định về mặt kiểu hình bởi sự biểu hiện của TCR và đồng thụ thể CD4,
CD814.

.


.

6


Hình 1.1. Trình tự tái sắp xếp gen TCR8
Các gen TCRδ tái sắp xếp đầu tiên, khoảng 40% tế bào tuyến ức CD34+ CD1a–
chưa trưởng thành nhất có sự tái sắp xếp gen khơng hồn chỉnh (Dδ2 – Dδ3 và Dδ2
– Jδ1). Sự tái sắp xếp TCRδ bổ sung xảy ra khi các tế bào biệt hóa từ giai đoạn CD34+
CD1a– sang giai đoạn CD34+ CD1a+, thời điểm mà hầu hết các gen TCRγ và TCRβ
vẫn cịn ở cấu hình dòng mầm. Các tế bào tuyến ức CD34+ chưa trưởng thành này
chỉ đại diện cho 1 – 3% tổng số tế bào tuyến ức, cho thấy rằng hầu như tất cả các gen
TCRδ đều được tái sắp xếp trước khi tế bào tuyến ức bắt đầu tăng sinh.
Sự tái sắp xếp gen TCRδ được theo sau bởi sự tái sắp xếp gen TCRγ, vì sự giảm
mạnh tín hiệu dịng mầm của các gen TCRγ đã được quan sát thấy khi tế bào tuyến
ức biệt hoá từ giai đoạn CD34+ CD1a+ thành giai đoạn tế bào chưa trưởng thành
CD4+ đơn độc (CD4+ ISP: immature single positive). Những sự tái sắp xếp TCRγ có
thể được coi là sự tái sắp xếp sớm vì chúng cũng hoạt động trước khi tế bào tuyến ức
tăng sinh.
Sự tái sắp xếp gen TCRβ chưa trưởng thành (Dβ - Dβ và Dβ - Jβ) được bắt đầu
trong quần thể con CD34+ CD1a+. Tuy nhiên, hầu hết các tế bào bắt đầu tái sắp xếp
các gen TCRβ khi chúng chuyển từ giai đoạn CD4+ ISP sang giai đoạn dương tính
kép sớm CD4+ CD8α+ CD8β– (EDP: early double positive). Quá trình chuyển đổi
này dường như là một bước quan trọng trong sự biệt hóa tế bào T ở người, bởi vì

.


.

7

trong giai đoạn EDP, các tế bào được chọn để tái sắp xếp các gen TCRβ của chúng
một cách hiệu quả. Sự chọn lọc xảy ra thơng qua tín hiệu được gọi là phức hợp thụ
thể tiền tế bào T [pre-T cell receptor complex (tạo thành bởi protein TCRβ, gen tiền

Tα và các phân tử CD3)]. Phức hợp thụ thể truyền tín hiệu gây ra sự hoạt động và mở
rộng của các tế bào T. Tuy nhiên, các protein của gen kích hoạt tái tổ hợp (RAG:
recombination-activating gene) được điều hồ giảm xuống (down-regulated), do đó
bảo vệ tế bào T khỏi sự tái sắp xếp17. Sự mở rộng của tập hợp con EDP nhỏ (khoảng
1%) dẫn đến các tế bào tuyến ức dương tính kép (CD4+ CD8α+ CD8β+ hay CD4+
CD8+) ở giai đoạn sau chiếm khoảng 50% tổng số tế bào tuyến ức.
Có rất ít thơng tin về sự tái sắp xếp TCRα trong tuyến ức. Tuy nhiên, các nghiên
cứu về bệnh bạch cầu đã chỉ ra rằng sự tái sắp xếp và phiên mã gen TCRα được tìm
thấy chủ yếu ở TCRαβ+ CD3+ của tế bào T trong bạch cầu cấp dịng lympho. Ngồi
ra, bằng cách sử dụng phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase sao chép ngược (RTPCR: Reverse transcription polymerase chain reaction), các tác giả đã chỉ ra rằng bản
sao TCRα mRNA hiện diện trong tập hợp con CD4+ CD8+ CD27+ CD69+ dương
tính kép trưởng thành hơn và khơng có trong tập hợp con CD4+ CD8α+ CD8β– trước
đó. Những dữ liệu kết hợp này gợi ý rằng việc tái sắp xếp gen TCRα xảy ra trong quá
trình phát triển muộn của tế bào T và sự bộc lộ TCRαβ trên bề mặt tế bào có lẽ được
diễn ra ngay sau sự tái sắp xếp chức năng của TCRα. Các tế bào tuyến ức TCRαβ+
phải chịu sự chọn lọc tích cực trong giai đoạn dương tính kép CD27+ CD69+ và chỉ
trải qua một vài lần phân chia tế bào trước khi chúng trưởng thành thành các tế bào
lympho T dương tính đơn (CD4+ hoặc CD8+) ở máu ngoại vi8,17.

1.1.3. Sự loại bỏ TCRδ tạo TREC
Sự loại bỏ TCRδ là một bước quan trọng trong quá trình trưởng thành của tế bào
T tuyến ức. Các đoạn gen TCRδ nằm xen kẽ với các đoạn gen TCRα dọc theo nhiễm
sắc thể 14q11. Do đó, việc tái sắp xếp các đoạn gen TCRα sẽ loại bỏ gen TCRδ. Thật
vậy, tất cả các tế bào T TCRαβ+ đều có gen TCRδ của chúng bị loại bỏ trên ít nhất
một alen và khoảng 80% trong số các tế bào này bị loại bỏ TCRδ hai alen.

.


.


8

Năm 1988, De Villartay và cộng sự đã xác định được hai thành phần được gọi là
yếu tố loại bỏ TCRδ, delta-Rec (δRec) và psi-joining-alpha (ψJα), nằm bên sườn phần
chính của các đoạn gen TCRδ18. Tần suất cao quan sát được của sự tái sắp xếp δRecψJα khơng có chức năng trong các mẫu tế bào tuyến ức của người, qua đó củng cố
tầm quan trọng của sự tái sắp xếp này. Các nghiên cứu trước đây cho thấy sự tái sắp
xếp δRec-ψJα xảy ra thường xuyên hơn khoảng 2000 lần trong tế bào T TCRαβ+ so
với tế bào T TCRγδ+. Cần lưu ý rằng một số loại tái sắp xếp loại bỏ TCRδ cũng có
thể xảy ra trong tuyến ức, nhưng tái sắp xếp δRec-ψJα cho đến nay là loại tái sắp xếp
nổi bật nhất, xảy ra khoảng 70% tế bào tuyến ức. Tái sắp xếp δRec-ψJα xảy ra muộn
trong q trình biệt hóa tế bào T trong tuyến ức, chủ yếu là sau khi tế bào tuyến ức
phát triển. Sự tái sắp xếp cuối cùng này của locus TCRαδ tạo ra khớp tín hiệu Vα-Jα
TREC, khớp này cũng chứa khớp mã hóa δRec-ψJα. Trong khi các khớp tín hiệu
δRec-ψJα theo định nghĩa đại diện cho các TREC, các khớp mã hóa δRec-ψJα có thể
vẫn tồn tại trên alen TCRαδ không chức năng trong < 5% tế bào T TCRαβ+8,19.

Hình 1.2. Trình tự tái sắp xếp trong locus TCRαδ8

.


.

9

Trẻ sơ sinh bình thường có khoảng 1 TREC cho mỗi 10 tế bào T, phản ánh số
lượng tế bào T ngây thơ chưa được tăng sinh, trong khi trẻ lớn và người lớn có khoảng
1/100 – 1/1000 tế bào T, phản ánh sự tăng sinh tế bào T ngoại vi bằng cách phân bào
nguyên phân. Để nghiên cứu các TREC trong nhóm tế bào T ngoại vi, trước tiên cần

xác định được TREC mục tiêu tối ưu. TREC mục tiêu phải phát hiện được trong mẫu
tế bào liên quan, đại diện cho sản phẩm của tuyến ức và không được pha lỗng trước
khi ra máu ngoại vi. Do đó, các TREC từ sự tái sắp xếp sớm trong các gen TCRδ và
TCRγ là không phù hợp. Poulin và cộng sự trước đó đã sử dụng TCRβ TREC để
nghiên cứu chức năng tuyến ức. Tuy nhiên, sự mở rộng của tế bào tuyến ức trong giai
đoạn EDP dẫn đến các TREC có nguồn gốc từ TCRβ bị pha lỗng mạnh mẽ trong
tuyến ức, do đó nó được phát hiện ở nồng độ thấp hơn về cơ bản so với TREC từ sự
tái sắp xếp gen TCR muộn (tái sắp xếp loại bỏ TCRδ hoặc tái sắp xếp TCRα)20. Ngoài
ra, locus TCRα bao gồm nhiều gen Vα và 61 gen Jα dẫn đến sự đa dạng tổ hợp lớn,
không chỉ đối với các khớp mã hóa mà cịn đối với các khớp tín hiệu. Vì vậy, một
khớp mã hóa Vα-Jα riêng lẻ và khớp tín hiệu liên quan của nó chỉ đại diện cho một
phần nhỏ trong tổng số các tái sắp xếp TCRα. Sự đa dạng tổ hợp Vα-Jα lớn làm cho
locus TCRα không phải là mục tiêu dễ dàng để nghiên cứu các TREC “muộn”.
Sự loại bỏ TCRδ xảy ra muộn, sau giai đoạn mở rộng tế bào tuyến ức, khiến nó trở
thành một ứng cử viên tiềm năng cho phân tích TREC. Sự tái sắp xếp δRec-ψJα
dường như là sự tái sắp xếp loại bỏ TCRδ nổi bật nhất vì các khớp mã hóa và tín hiệu
của nó có thể dễ dàng được phát hiện bằng phân tích Southern blot trong cả tế bào
tuyến ức và máu ngoại vi. Giữa sự loại bỏ TCRδ và sự tái sắp xếp TCRα, sự tăng sinh
của tế bào tuyến ức bị hạn chế. Khi so sánh lượng khớp tín hiệu δRec-ψJα, thước đo
của TREC loại bỏ TCRδ, và số lượng khớp mã hóa δRec-ψJα, thước đo tổng thể của
Vα-Jα TREC, kết quả cho thấy khoảng 3 – 4 lần phân chia tế bào xảy ra giữa loại bỏ
TCRδ và tái sắp xếp TCRα. Điều này ngụ ý rằng TREC của khớp tín hiệu δRec-ψJα
chỉ trải qua một sự pha lỗng nhỏ trong tuyến ức so với TREC từ hầu hết các loại gen
TCR khác. Do đó, kết luận rằng sự tái sắp xếp δRec-ψJα là mục tiêu tối ưu nhất cho
các sản phẩm TREC trong nhóm tế bào T ngoại vi không tăng sinh8,17.

.


.


10

1.1.4. Định lượng TREC
TREC có thể được phát hiện và định lượng bằng cách sử dụng một số phương pháp
dựa trên PCR, chẳng hạn như competitive PCR, xét nghiệm PCR hấp thụ miễn dịch
liên kết với enzym (ELISA-PCR: Enzyme linked immunosorbent assay - PCR) hoặc
phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase định lượng thời gian thực (RQ-PCR: Real-time
quantitative PCR). Trong các nghiên cứu TREC dựa trên PCR trước đây, không thể
phân biệt giữa các khớp mã hóa δRec-ψJα nằm trên một alen trên bộ gen DNA và
khớp tín hiệu Vα-Jα TREC với khớp mã hóa δRec-ψJα. Do đó, khớp tín hiệu δRecψJα là mục tiêu TREC tối ưu21.
Trong những phương pháp được đưa ra thì RQ-PCR được ưa chuộng hơn, vì độ
nhạy và độ chính xác cao, dựa trên việc phát hiện cụ thể các trình tự mục tiêu đã được
cải tiến trong mỗi chu kì PCR. Để đánh giá mức độ TREC thì kĩ thuật RQ-PCR có
độ nhạy với mức độ phát hiện xấp xỉ 1 bản sao TREC trong 100 ng DNA22. Hầu như
khơng cần xử lí sau PCR, điều này làm cho kĩ thuật nhanh chóng, giảm khối lượng
công việc và ngăn ngừa nhiễm chéo các sản phẩm PCR. Phần đóng khung trong Hình
1.2 cho thấy hai mồi và đầu dò mà tác giả đã phát triển để thực hiện RQ-PCR phát
hiện các khớp tín hiệu δRec-ψJα bằng cơng nghệ TaqMan8.
Trong kĩ thuật sử dụng đoạn dị Taqman, hỗn hợp RQ-PCR ngồi các thành phần
cơ bản, cịn chứa hai thành phần quan trọng để đoạn dị có thể phát huỳnh quang khi
có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, đó là: (1) đoạn dị
Taqman, là những oligonucleotides có trình tự bổ sung với một trình tự đặc hiệu trên
DNA đích và trình tự này dài khoảng 24 đến 30 base với đầu 5’ có gắn chất phát
huỳnh quang (gọi là reporter) cịn đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi là
quencher) để hấp phụ được ánh sáng huỳnh quang được phát ra từ reporter; (2)
Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’- 3’ exonuclease để có khả năng thủy giải cắt
bỏ đoạn dò khi đoạn dò này bắt cặp lên sợi khuôn và cản đầu 3’ của mồi khi enzyme
kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung.


.


.

11

Bảng 1.2. Sự thay đổi trong các phương pháp ước lượng TREC23
Phương pháp đo TREC

Nghiên cứu

PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
Semi quantitative PCR

Douek (1998, 2000)

Hybridization probe

Jimenez (2006), Loeffler (2002)

Molecular beacon

Zhang (1999)

TaqMan probe

Hazenberg (2000), Przybylski (2007),
Mensen (2013), Lorenzi (2008),
Sugita (2008), Sairafi (2012)


SYBR Green PCR

Ponchel (2003)

PCR-ELISA

Al-Harthi (2000)
MẪU TẾ BÀO

CD3

Ringhoffer (2013), Jimenez (2006)

CD4/CD8

Sairafi Douek (1998), Fallen (2003),
Sugita (2008)

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi

Przybylski (2007), Douek (2000),
Eyrich (2005)
LOẠI TREC

TREC (khớp tín hiệu δRec-ψJα)

Chủ yếu

Khớp tín hiệuδRec-ψJα/βTREC


Dion (2004), Ferrando-Martinez (2010),
Ringhoffer (2013)

DIỄN GIẢI KẾT QUẢ
TREC/số lượng tế bào

Przybylski (2007)

TREC/mL or μL máu

Lorenzi (2008), Eyrich (2005), Chen (2005)

TREC/μg DNA

Jimenez (2006), Douek (2000)

Số lượng TREC tuyệt đối

Chủ yếu

Tương đối (Delta Ct method)

Uzunel (2014), Sairafi (2012)

.