BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

H
o
C

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

hi
in

M
h

TỐI ƯU HĨA MƠI TRƯỜNG SINH TỔNG HỢP
ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC TRICHODERMA
KONINGII VÀ TINH SẠCH BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL

ity

C

ity

rs

ve

ni

U

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

of

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ch

Te
og

l
no
Giảng viên hướng dẫn : CN. ĐỖ THỊ TUYẾN

MSSV: 1151110242

y

Sinh viên thực hiện

: TRẦN THỊ YẾN NHI
Lớp: 11DSH03

TP. Hồ Chí Minh, 2015



Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan đây là đề tài nghiên cứu của cá nhân em. Những kết quả và
số liệu trong báo cáo tốt nghiệp được thực hiện tại Viện sinh học nhiệt đới và phịng
thí nghiệm trường Đại học Cơng Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, khơng sao chép bất kỳ
nguồn nào khác. Em hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường về lời cam đoan

H

này.

o

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 02 tháng 08 năm 2015

C
hi

Sinh viên

h

in

M
Trần Thị Yến Nhi

ity


C
ity

rs

ve

ni

U
of
ch

Te
y

og

l
no


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại học Kỹ
Thuật Cơng Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học
– Thực phẩm – Môi trường cùng tất cả quý thầy cô đã tận tình chỉ dạy, truyền đạt
những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt quá trình học tập tại

trường. Đó là những hành trang quý giá giúp em hịa nhập tốt vào xã hội, góp một

H

o

phần sức lực nhỏ bé của mình vào cơng cuộc xây dựng đất nước.

C

Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đỗ Thị Tuyến – người đã tạo

hi

điều kiện tốt nhất, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian

M

nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp.

in

h

Em xin cảm ơn Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. HCM và các anh chị phụ trách

ity

C


phòng các hoạt chất có hoạt tính sinh học đã tạo điều kiện và hướng dẫn em hồn
thành một số thí nghiệm trong quá trình nghiên cứu tại đây.

ni

U

Chân thành cảm ơn các thầy phịng thí nghiệm cơng nghệ sinh học và tất cả

rs

tài này.

ve

các bạn trong phịng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ trong lúc thực hiện đề

ity

Con xin gửi tình thương u và lịng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ, mọi người

of

trong gia đình và những người luôn bên cạnh luôn sẵn sàng ủng hộ, chăm sóc, động

Te

viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con trong mọi bước đường đi.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2015


ch

Sinh viên

y

og

l
no
Trần Thị Yến Nhi


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG................................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH...................................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ....................................................................................x

H

o

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU ..............................................................................................1
Tính cấp thiết của đề tài ..............................................................................1

C


1.1.

hi

Tình hình nghiên cứu ..................................................................................2

M

1.2.

Mục đích nghiên cứu ...................................................................................3

1.4.

Nhiệm vụ nghiên cứu ...................................................................................3

1.5.

Phương pháp nghiên cứu ............................................................................3

1.6.

Các kết quả đạt được của đề tài .................................................................3

1.7.

Kết cấu của đồ án.........................................................................................4

h


in

1.3.

ity

C

rs

ve

ni

U

ity

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................5

of

2.1. Khái quát chung về enzyme ...........................................................................5

Te

2.1.1. Sơ lược về enzyme .....................................................................................5

ch


2.1.2. Tính chất của enzyme................................................................................6

l
no

2.1.2.1. Bản chất sinh học .................................................................................6

y

og

2.1.2.2. Bản chất hóa học ..................................................................................7
2.2. Giới thiệu sơ lược về cellulose........................................................................7
2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme cellulase ..........................................................9
2.3.1. Định nghĩa .................................................................................................9
2.3.2. Phân loại ..................................................................................................10
2.3.3. Tính chất ..................................................................................................10

i


Đồ án tốt nghiệp

2.3.3.1. Tính đặc hiệu......................................................................................10
2.3.3.2. Đặc tính vật lý và hóa học..................................................................10
2.3.3.3. Các chất ức chế ..................................................................................10
2.3.4. Cơ chế tác động của enzyme ...................................................................11
2.3.4.1. Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) ..................11

H

o

2.3.4.2. Cơ chế 1,4-β-D-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14) ..............................11

C

hi

2.3.4.3. Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) ........................12

in

M

2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase .12
2.3.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy .......................................................12

h

ity

C

2.3.5.2. Nhiệt độ nuôi cấy ...............................................................................13
2.3.5.3. pH môi trường ....................................................................................14

U

ve


ni

2.3.5.4. Độ ẩm .................................................................................................14
2.3.5.5. Môi trường khơng khí ........................................................................14

rs

ity

2.3.6. Ứng dụng của enzyme cellulase .............................................................14

of

2.3.6.1. Cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc ...............................14

Te

2.3.6.2. Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật ...................15

ch

2.3.6.3. Thủy phân gỗ và các phế liệu giàu cellulose .....................................15

l
no

2.4. Vi sinh vật tổng hợp cellulase ......................................................................15

og


2.4.1. Nấm sợi ....................................................................................................15

y

2.4.2. Nấm mốc Trichoderma koningii .............................................................16
2.5. Cơ chất cảm ứng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme cellulase .....................17
2.5.1. Bã mía ......................................................................................................17
2.5.2. Cám gạo ...................................................................................................17
2.6. Phương pháp lên men bề mặt ......................................................................19

ii


Đồ án tốt nghiệp

2.7. Giới thiệu sơ lược về phương pháp tách chiết và tinh sạch enzyme ........20
2.8. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase ..................................................22
2.8.1. Xác định hoạt tính exoglucanase ...........................................................23
2.8.2. Xác định hoạt tính endoglucanase .........................................................23
2.9. Sơ lược về sắc ký lọc gel ...............................................................................24

H

o

2.9.1. Bản chất của phương pháp .....................................................................24

C

hi


2.9.2. Đặc tính của gel .......................................................................................25

in

M

2.10. Sơ lược về phân tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide .....26
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................28

h

ity

C

3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...............................................................28
3.2. Vật liệu ...........................................................................................................28

U

ve

ni

3.2.1. Nguồn vi sinh vật .....................................................................................28
3.2.2. Cơ chất .....................................................................................................28

rs


ity

3.2.3. Hóa chất ...................................................................................................28

of

3.3. Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................29

Te

3.3.1. Thiết bị .....................................................................................................29

ch

3.3.2. Dụng cụ ....................................................................................................30

l
no

3.4. Môi trường.....................................................................................................31

og

3.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ........................................................31

y

3.5.1. Phương pháp phân tích độ ẩm cơ chất ..................................................31
3.5.2. Phương pháp tính độ ẩm bổ sung mơi trường nuôi cấy........................32
3.5.3. Nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii..............................................32

3.5.3.1. Cấy giống trên môi trường thạch nghiêng PGA ................................32
3.5.3.2. Nhân giống trên môi trường lúa .........................................................33

iii


Đồ án tốt nghiệp

3.5.3.3. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận cellulase .........................34
3.5.4. Phương pháp mơ tả hình thái T. koningii..............................................35
3.5.5. Xác định trực tiếp số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu
............................................................................................................................36
3.5.6. Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô ................................................36

H

o

3.5.7. Khảo sát khả năng phân hủy cellulose...................................................36

C

3.5.8. Xác định hàm lượng proteintheo phương pháp Bradford ....................37

hi

M

3.5.9. Xác định hoạt tính enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase) ...........40


h

in

3.5.10. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sinh tổng hợp enzyme cellulase ........42

ity

C

3.5.10.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ cơ chất ...............................................43
3.5.10.2. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ban đầu .......................43

U

ni

3.5.10.3.Khảo sát ảnh hưởng của pH ban đầu ................................................44

rs

ve

3.5.10.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng .................................45
3.5.10.5. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy .....................................45

ity

3.5.10.6. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống.................................................45


of

Te

3.5.11. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm .................................................46

ch

3.5.12. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dịch enzyme và dung môi tủa enzyme.47

l
no

3.5.12.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa dịch enzyme và dung môi tủa ..47

og

3.5.12.2. Khảo sát ảnh hưởng của loại dung môi tủa enzyme ........................48

y

3.5.13. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase.........48
3.5.13.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme cellulase ....48
3.5.13.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme cellulase
.........................................................................................................................48
3.5.13.3. Hoạt tính enzyme cellulase của dịch chiết thô .................................48

iv



Đồ án tốt nghiệp

3.5.14. Phương pháp tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel ............49
3.5.14.1. Nguyên tắc .......................................................................................49
3.5.14.2. Hóa chất và dụng cụ .........................................................................49
3.5.14.3. Tiến hành thí nghiệm .......................................................................49
3.5.15. Phương pháp điện di phân tách protein trên gel polyacrylamide .......51

H

o

3.5.16. Phương pháp bố trí và xử lý số liệu......................................................55

C

hi

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................56

in

M

4.1. Khảo sát hình thái đại thể và vi thể của chủng T.koningii ........................56
4.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào phân hủy cellulose trên đĩa thạch ......57

h

ity


C

4.3. Kết quả định lượng mốc giống bằng buồng đếm hồng cầu ......................57
4.4. Kết quả xác định độ ẩm cơ chất ..................................................................58

U

ni

4.5. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme

rs

ve

cellulase trên môi trường lên men bán rắn .......................................................59
4.5.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ BM:CG đến khả năng sinh tổng hợp cellulase ...59

ity

4.5.2. Ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp cellulase

of

............................................................................................................................60

Te

ch


4.5.3. Ảnh hưởng của pH ban đầu khả năng sinh tổng hợp cellulase ...........61

l
no

4.5.4. Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase..............................................................................................................62

og

y

4.5.5. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp

cellulase..............................................................................................................64
4.5.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp cellulase.......65
4.6. Quy hoạch thực nghiệm ...............................................................................66
4.7. Khảo sát tỷ lệ tủa và chọn ra loại dung môi tủa enzyme cellulase tốt nhất
...............................................................................................................................71

v


Đồ án tốt nghiệp

4.7.1. Khảo sát tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme và dung môi ethanol ...........71
4.7.2. Khảo sát tỷ lệ tủa giữa dịch chiết enzyme và dung môi acetone ...........73
4.7.3. Khảo sát chọn ra dung môi tủa enzyme tối ưu ......................................74
4.8. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme cellulase ..75

4.8.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase ...............75

H

o

4.8.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase.......76

C

hi

4.9. Tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc lọc gel...............................................77

M

4.10. Kết quả phân tách hệ cellulase bằng phương pháp điện di trên gel SDS

h

in

– PAGE .................................................................................................................79

ity

C

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..........................................................82
5.1. Kết luận..........................................................................................................82


U

ni

5.2. Kiến nghị........................................................................................................82

PHỤ LỤC

ity

rs

ve

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................83

of
ch

Te
y

og

l
no

vi



Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

H

BM:CG

: Bã mía và cám gạo

CBB

: Coomasie brilliant blue

CMC

: Carboxymethyl cellulose

CMCase

: Carboxymethyl cellulase

DNS

: 3,5-dinitrosalicylic acid

o

DTT


: Dithiothreitol

C

: Enzyme commission number (tiểu ban về enzyme)

FPA

: Filter paper activity (hoạt tính giấy lọc)

hi

EC

: Hydroxyethyl cellulose

HL

h

in

M

HEC

: Hàm lượng protein (mg)

C


: Hoạt tính enzyme (U)

HTR

: Hoạt tính riêng (U/mg)

MT

: Môi trường

MW

: Molecular weight (trọng lượng phân tử)

NĐC

: Nồng độ chuẩn

OD

: Optical density (trị số mật độ quang)

PGA

: Potato glucose agar

ity

HT


ity

rs

ve

ni

U

Sulphate

Polyacrylamide

ch

Electrophoresis

–

Te

Dodecyl

of

SDS – PAGE: Sodium

: Trichoderma koningii


TEMED

: N, N, N’, N’ – Tetramethyl – ethylenediamine

U

: Đơn vị hoạt tính enzyme

VSV

: Vi sinh vật

y

og

vii

l
no

T. koningii

Gel


Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Hàm lượng các chất trong cám gạo .......................................................... 18
Bảng 2.2. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase ................................................ 22
Bảng 3.1. Thành phần các chất trong môi trường Czapek ....................................... 31
Bảng 3.2. Môi trường xác định khả năng sinh enzyme cellulase của vi sinh vật ..... 37
Bảng 3.3. Thí nghiệm dựng đường chuẩn Albumine ............................................... 39

H

o

Bảng 3.4. Thí nghiệm dựng đường chuẩn glucose ................................................... 41

C

Bảng 3.5. Bảng bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính CMCase ................................. 42

hi

Bảng 3.6. Bảng bố trí thí nghiệm tỷ lệ cơ chất ......................................................... 43

M

Bảng 3.7. Bảng bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường ......... 44

in

h

Bảng 3.8. Khảo sát tỷ lệ giữa dung môi tủa và dịch enzyme ................................... 47


ity

C

Bảng 3.9. Thành phần các chất trong gel phân tách ................................................. 53
Bảng 3.10. Thành phần các chất trong gel gom ....................................................... 54

ni

U

Bảng 4.1. Kết quả đo độ ẩm cơ chất BM:CG ........................................................... 59

ve

Bảng 4.2. Các giá trị tối ưu của các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp

rs

cellulase của T. koningii trước quy hoạch thực nghiệm............................................ 66

ity

Bảng 4.3. Mã hóa các biến số ................................................................................... 66

of

Bảng 4.4. Ma trận kế hoạch hóa ............................................................................... 67

Te


Bảng 4.5. Kết quả hoạt tính CMCase theo thực nghiệm và theo phương trình hồi quy
............................................................................................................................................. 68

ch

l
no

Bảng 4.6. Kết quả 𝑏𝑗 và 𝑏𝑖𝑗 ....................................................................................... 69
Bảng 4.7. Giá trị trung bình của 3 thí nghiệm trung tâm.......................................... 69

og

Bảng 4.8. Giá trị hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tối ưu của enzyme cellulase

y

khi tủa bằng dung môi ethanol 960 và dung môi acetone ......................................... 74
Bảng 4.9. Kết quả tinh sạch bằng sắc ký lọc gel ...................................................... 78
Bảng 4.10. Giá trị 𝑅𝑓 và log của các protein trong thang chuẩn .............................. 79
Bảng 4.11. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 2 .................. 81
Bảng 4.12. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 3 .................. 81
Bảng 4.13. Trọng lượng phân tử của các tiểu phần protein của giếng 4 .................. 81

viii


Đồ án tốt nghiệp


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose ................................................................ 7
Hình 2.2. Cấu trúc của enzyme cellulase ................................................................... 9
Hình 2.3. Cơ chế hoạt động của exoglucanase ......................................................... 11
Hình 2.4. Cơ chế hoạt động của endoglucanase ....................................................... 11

H

Hình 2.5. Cơ chế hoạt động của cellobiase .............................................................. 12

o

Hình 2.6. Hình thái nấm Trichoderma koningii ....................................................... 16

C

hi

Hình 2.7. Bã mía ....................................................................................................... 17

M

Hình 2.8. Cám gạo .................................................................................................... 17

h

in

Hình 2.9. Quá trình tách các phân tử bằng sắc ký lọc gel ........................................ 24
Hình 4.1. Nấm mốc T. koningii sau khi ni cấy 2 ngày (hình a) và 4 ngày (hình


C

ity

b)................................................................................................................................ 56

U

Hình 4.2. Nấm mốc T. koningii chụp ở vật kính 40X bằng kính hiển vi (hình c) và

ve

ni

kính hiển vi điện tử (hình d) ...................................................................................... 56
Hình 4.3. Vịng phân giải CMC của nấm mốc T. koningii 18 mm sau 24 giờ (hình

rs

e), 25 mm sau 32 giờ (hình f) và 35 mm sau 48 giờ (hình g) ................................... 57

ity

Hình 4.4. Bào tử nấm T. koningii được quan sát dưới kính hiển vi ......................... 58

of

Hình 4.5. Sắc ký đồ tinh sạch enzyme cellulase ...................................................... 78


ch

Te

Hình 4.6. Kết quả điện di.......................................................................................... 79

y

og

l
no

ix


Đồ án tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các mơi trường ni cấy T.
koningii có tỷ lệ cơ chất BM:CG khác nhau ............................................................. 59
Đồ thị 4.2. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các môi trường nuôi cấy T.
koningii có độ ẩm ban đầu khác nhau ....................................................................... 61

H

Đồ thị 4.3. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các mơi trường ni cấy T.

o


koningii có pH ban đầu khác nhau ............................................................................ 62

C

hi

Đồ thị 4.4. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các mơi trường ni cấy T.

M

koningii có nồng độ dinh dưỡng khác nhau .............................................................. 63

h

in

Đồ thị 4.5. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các mơi trường ni cấy T.
koningii có thời gian ni cấy khác nhau.................................................................. 64

C

ity

Đồ thị 4.6. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein từ các mơi trường ni cấy T.

U

koningii có tỷ lệ giống khác nhau ............................................................................. 65

ve


ni

Đồ thị 4.7. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của các tỷ lệ tủa giữa dịch
chiết enzyme cellulase với dung môi ethanol ........................................................... 72

rs

Đồ thị 4.8. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein của các tỷ lệ tủa giữa dịch

ity

chiết enzyme cellulase với dung mơi acetone ........................................................... 73

of

Đồ thị 4.9. Hoạt tính CMCase và hàm lượng protein tối ưu của enzyme cellulase

Te

khi được tủa bằng dung môi ethanol 96° và dung môi acetone ................................ 74

ch

Đồ thị 4.10. Hoạt tính CMCase của enzyme cellulase ở những pH khác nhau ....... 75

l
no

Đồ thị 4.11. Hoạt tính CMCase của enzyme cellulase ở những nhiệt độ khác nhau76


og

Đồ thị 4.12. Sự tương quan giữa log (trọng lượng phân tử) của những protein trong

y

thang chuẩn với 𝑅𝑓 .................................................................................................... 80

x


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay, cuộc sống hiện đại với sự phát triển vượt bậc của khoa học kỹ thuật,

các ngành khoa học ứng dụng ngày càng được áp dụng nhiều hơn vào thực tế góp
phần giúp cho đời sống con người ngày càng được nâng cao và hồn thiện. Trong đó,

H

ngành cơng nghệ sinh học là có nhiều ứng dụng và nghiên cứu triển vọng, đặc biệt là

o

trong lĩnh vực sản xuất và nghiên cứu về enzyme.


C

hi

Nhân tố quan trọng để thúc đẩy ngành công nghiệp enzyme phát triển là khả

M

năng to lớn của vi sinh vật. Các vi sinh vật có tốc độ phát triển cực kỳ nhanh chóng,

h

in

do đó có khả năng đáp ứng được mọi nhu cầu của con người, đồng thời enzyme do
vi sinh vật tạo ra có hoạt lực cao. Bên cạnh đó, mơi trường ni cấy vi sinh vật cho

C

ity

phép chúng ta có thể tận dụng được các phế thải của các ngành khác.

U

Nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy chế biến thực phẩm thải ra là rất lớn

ve


ni

như: rơm rạ, trấu, bã mía, agar,…Các phế thải này có thành phần chính là cellulose.
Cellulose có thể bị phân hủy bằng phương pháp vật lý và hóa học nhưng việc này rất

rs

phức tạp. Trong khi đó, nếu sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật

ity

bằng công nghệ sinh học để xử lý các chất thải hữu cơ sẽ có nhiều điểm ưu việt hơn

of

kể cả về mặt kỹ thuật, môi trường cũng như về kinh tế.

Te

Hằng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn enzyme

ch

cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ô nhiễm môi trường. Mặt khác, số

l
no

lượng loài vi sinh vật tham gia tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên


og

rất phong phú như nấm mốc, xạ khuẩn, vi khuẩn,…Nấm Trichoderma spp hiện diện

y

gần như trong tất cả các loại đất và trong một số môi trường sống khác với mật độ
cao. Các nhà khoa học phân lập thành công chủng nấm mốc Trichoderma koningii để
tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả và giá thành lại rẻ. Bên cạnh đó,
celluase được ứng dụng rộng rãi trong các ngành và lĩnh vực khác nhau như công
nghiệp, nông nghiệp, y học,…Vì vậy, việc sản xuất được một lượng lớn enzyme
cellulase với chi phí thấp là một điều rất cần thiết. Và để thu nhận được enzyme
cellulase một cách hiệu quả nhất thì ta cần khảo sát các điều kiện, yếu tố ảnh hưởng

1


Đồ án tốt nghiệp

đến môi trường sinh tổng hợp tối ưu của enzyme này nhằm tạo ra sản phẩm sinh học
có giá trị cao trong ứng dụng.
1.2.

Tình hình nghiên cứu
Hiện tại ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về khả năng sinh tổng hợp

enzyme cellulase từ Trichoderma koningii (T. koningii), nhưng trên thế giới đã có
nhiều đề tài nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme của T. koningii.

H

o

Theo Cui Fumian và cộng sự (1995), thí nghiệm khảo sát khả năng sinh tổng

C

hợp enzyme cenllulase đã được thực hiện bằng cách phát triển các giống đột biến trên

hi

môi trường bán rắn bao gồm 3 g bột rơm, 2 g cám lúa mì và 10 ml ammonium sulfate

M

1% trong 250 ml bình ở 280C, 72 giờ tại pH ban đầu là 6,0. Với hiệu suất tổng hợp

in

h

enzyme cellulase là 4880 U/g carboxymethyl cellulose – Na và 480 U/g trên sợi bơng.

ity

C

Hoạt tính enzyme cellulase từ chủng đột biến là gấp 3 lần so với chủng mẹ. Các điều
kiện tối ưu cho hoạt động enzyme trên bông là pH 4,5 – 5,0 và 45 – 500C. Enzyme

ni


U

ổn định ở mức pH 3,5 – 6,5 ở 450C trong 4 giờ. Sau khi ủ men ở 600C trong 1 giờ,

ve

vẫn còn 20% hoạt tính của enzyme cellulase.

rs

Theo Liu Xiao-jie và cộng sự (2003), khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

ity

của T. koningii trên mơi trường bột rơm đã có tác động tốt, trong khi mơi trường

of

(NH4)2SO4 có tác động tiêu cực đến sinh tổng hợp enzyme cellulase. Hoạt tính mạnh

Te

nhất của enzyme carboxymethyl cellulase (CMCase), hoạt tính giấy lọc (FPA) và β –
glucosidase lần lượt là 765,8 U/ml, 155,3 U/ml và 39,54 U/ml, tương ứng với mơi

ch

trường ni cấy tối ưu hóa sau 6 ngày.


l
no

Theo Zou Shui – yang và cộng sự (2011), điều kiện nuôi cấy được tối ưu cho

og

nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme cellulase từ T. koningii đã được thiết lập như sau:

y

tỷ lệ rơm : cám là 3 : 2 (w/w), tỷ lệ dinh dưỡng môi trường là 1:1,5 (w/v), pH ban đầu
là 5,5 và nuôi cấy trong 120 giờ ở 28,50C. Với điều kiện tối ưu trên, hoạt tính giấy
lọc, β – glucosidase và xylanase lần lượt là 13,1 U/g chất khô, 12,2 U/g chất khô và
994,7 U/g chất khô.
Theo Wang S và cộng sự (2013), các gen sản sinh enzyme cellulase và
xylanase của nấm Trichoderma tồn tại dưới dạng sợi carbon catabolite áp trung gian

2


Đồ án tốt nghiệp

bởi các hoạt hóa dị hóa carbon (CRE1). Việc sản xuất enzyme có thể được cải thiện
hơn nữa bằng cách bất hoạt gen CRE1. Việc bất hoạt gene CRE1, dẫn đến thay đổi
biểu hiện gen sinh enzyme cellulase trong nuôi cấy cơ bản trên đường. Kết quả là
hoạt tính giấy lọc, hoạt tính β – 1,4 – exoglucanase, hoạt tính β – 1,4 – edoglucanase
và hoạt tính xylanase đã thay đổi trên lần lượt là 2,1, 1,4, 0,8 và 0,8 lần. Việc can
thiệp vào RNA là một phương pháp khả thi để phân tích các cơ chế quản lý biểu hiện


H

o

gen và cải thiện năng suất sinh enzyme xylanase và enzyme cellulase trong T.

C

koningii.

hi

1.3.

Mục đích nghiên cứu

M

Làm cơ sở nghiên cứu để sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trichoderma

in

h

koningii một cách tối ưu nhất.
Nhiệm vụ nghiên cứu

ity

C


1.4.

Quan sát đại thể và vi thể hình thái của nấm mốc Trichoderma koningii.

-

Thu nhận enzyme cellulase từ việc nuôi cấy nấm mốc Trichoderma koningii
Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase

ity

của Trichoderma koningii.

rs

-

ve

trên môi trường bán rắn.

ni

U

-

Khảo sát tỷ lệ tủa và chọn ra dung môi tủa enzyme cellulase tốt nhất.


-

Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cellulase.

-

Tinh sạch enzyme cellulase bằng sắc ký lọc gel.

-

Phân tách hệ enzyme cellulase bằng phương pháp điện di trên gel SDS – PAGE.

ch

Te

Phương pháp nghiên cứu

l
no

1.5.

of

-

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm.

-


Phương pháp phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm excel 2010 và

y

og

-

stagraphic plus.
1.6.

Các kết quả đạt được của đề tài

-

Thu được enzyme cellulase.

-

Có được các thơng số tối ưu quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase của
Trichoderma koningii.

3


Đồ án tốt nghiệp

-


Bước đầu tạo chế phẩm enzyme cellulase bằng phương pháp kết tủa.

-

Tinh sạch được enzyme cellulase.
Kết cấu của đồ án

1.7.

Đồ án tốt nghiệp gồm 5 chương:
Chương 1: Mở đầu.
Chương 2: Tổng quan tài liệu.

H

o

Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.

C

Chương 4: Kết quả và thảo luận.

hi

Chương 5: Kết luận và kiến nghị.

h

in


M
ity

C
ity

rs

ve

ni

U
of
ch

Te
y

og

l
no

4


Đồ án tốt nghiệp


CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát chung về enzyme
2.1.1. Sơ lược về enzyme (Lê Minh Trí, 2011)
Enzyme hay cịn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme
có trong mọi cơ thể sinh vật, nó khơng những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng

H

hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng

o

ngồi tế bào (invitro). Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi

C

hi

là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học

M

khác.

h

in

Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra
trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay


C

ity

kiềm mạnh,…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp

U

nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng

ve

ni

(370C, áp suất thường, khơng kiềm mạnh hay acid mạnh,…).
Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả

rs

năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một

ity

kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất.

of

Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận


Te

enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể vi sinh vật. Tất cả các tế bào

ch

động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa nhiều enzyme thì hồn toàn khác nhau.

-

Thực vật (hạn chế)

-

Vi sinh vật (phổ biến)

y

Động vật (hạn chế)

og

-

l
no

Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:

Việc khai thác enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu

thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn chế.

5


Đồ án tốt nghiệp

Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau:
-

Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn.

-

Hệ enzyme có vi sinh vật vơ cùng phong phú.

-

Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng
tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàng
trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng mơi trường của vi sinh vật là

H

Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh.

-

C


-

hi

o

rất cao.
Vi sinh vật khơng địi hỏi nghiêm ngặt về mơi trường dinh dưỡng nên có thể

M

tận dụng những phụ phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme và có thể

in

h

dễ dàng điều khiển các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy để có thể thu

-

ity

C

được hiệu suất cao trong sản xuất.
Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hồn tồn có thể thực hiện theo quy mơ cơng

ni


U

nghiệp.

rs

2.1.2.1. Bản chất sinh học

ve

2.1.2. Tính chất của enzyme (Nguyễn Văn Mùi, 2011)

ity

Enzyme được tạo ra bên trong tế bào và chịu sự điều khiển của gen.

of

Phản ứng của enzyme ít hao tốn năng lượng và có khả năng tham gia phản ứng

Te

cả trong và ngồi tế bào. Một gen  một enzyme  một phản ứng.
Enzyme có thể thu nhận dễ dàng từ các nguồn nguyên liệu khác nhau từ sinh

ch

vật, các enzyme thu nhận từ nguồn sinh vật như rau quả thông dụng không có tính

l

no

chất gây độc.

y

nhiệt độ 20 – 450C, 1 atm, pH acid yếu, kiềm yếu hay trung tính.

og

Đa số các enzyme hoạt động xúc tác trong các phản ứng sinh học ở điều kiện
Mỗi enzyme tham gia xúc tác đặc hiệu với một cơ chất nhất định, vận tốc phản
ứng tăng gấp nhiều lần so với chất xúc tác sinh học, vì vậy enzyme cần dùng với
lượng rất nhỏ. Có thể điều chỉnh hay ngừng phản ứng bằng nhiệt độ, pH, …

6


Đồ án tốt nghiệp

2.1.2.2. Bản chất hóa học
Gồm hai nhóm:
-

Nhóm enzyme đơn cấu tử: enzyme chỉ được cấu tạo bởi một thành phần duy
nhất là protein.

-

Nhóm enzyme đa cấu tử: là những loại enzyme mà được cấu tạo bởi hai thành

gồm: một thành phần là protein và thành phần còn lại không phải protein.

H
o

Thành phần này là những chất hữu cơ đặc hiệu có vai trị thúc đẩy q trình

C

xúc tác.

hi

2.2. Giới thiệu sơ lược về cellulose.

M

Hằng năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp ra nhờ

in

h

q trình quang hợp. Trong số này có đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần

ity

C

chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bông và 40 – 50% trong gỗ (Lê

Ngọc Tú và cộng sự, 1982).

ity

rs

ve

ni

U
of
ch

Te
y

og

l
no
Hình 2.1. Cấu trúc chuỗi phân tử cellulose
( />Ligno – cellulose là thành phần cấu trúc chính của cây gỗ và cây thân mềm
(cỏ, rơm rạ) gồm cellulose, hemicellulose và lignin (Hamelinck và cộng sự, 2003).
Cellulose (40 – 60% trọng lượng khô) là polymer thẳng của các đơn vị β-D-1,4-

7


Đồ án tốt nghiệp


glucan. Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen cho thấy, cellulose có cấu tạo
dạng sợi. Các sợi này liên kết lại thành những bó nhỏ gọi là các microfibril có cấu
trúc khơng đồng nhất, có những phần đặc (phần kết tinh) và những phần xốp hơn
(phần vô định) (Lê Ngọc Tú và cộng sự, 1982), (Hamelinck và cộng sự, 2003).
Cellulose là một trong những hợp chất tự nhiên khá bền vững, không tan trong
nước mà chỉ có thể bị phồng lên do hấp thu nước, bị phân hủy khi đun nóng với acid

H

o

hoặc kiềm ở nồng độ khá cao. Cellulose bị thủy phân ở nhiệt độ bình thường hoặc ở

C

nhiệt độ 40 – 500C nhờ các ezyme thủy phân cellulose – được gọi chung là cellulase

hi

(Lê Ngọc Tú và cộng sự, 1982).

M

Trong tế bào thực vật, cellulose liên kết chặt chẽ với hemicellulose (chiếm 20

in

h


– 40% trọng lượng khô), đây là loại heteropolymer chứa nhiều loại monosaccharide

ity

C

như galactose mananose, glucose, xylose, arabinose và các nhóm acetyl; do bản chất
không kết tinh nên hemicellullose tương đối dễ bị thủy phân. Cellulose còn liên kết

ni

U

chặt chẽ với lignin (10 – 25% trọng lượng khô). Đây là thành phần ảnh hưởng rất

ve

nhiều đến sự thủy phân cellulose của enzyme. Chỉ trong một số trường hợp (ví dụ

rs

trong sợi bơng) cellulose tồn tại trong trạng thái một polymer gần tinh khiết (Lê Ngọc

ity

Tú và cộng sự, 1982), (Hamelinck và cộng sự, 2003).

of

Khoảng một nửa hợp chất carbon trong sinh khối trên mặt đất là cellulose. Tất


Te

cả sản phẩm sinh khối sẽ được khống hóa nhờ hệ thống enzyme của vi sinh vật
(VSV). Hệ thống enzyme phân giải cellulose thường chậm và khơng hồn tồn –

ch

cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Các chủng VSV như nấm, xạ khuẩn, vi khuẩn

l
no

có khả năng phân hủy mạnh cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy nhờ cellulase.

og

Việc sử dụng cơ chất lignocellulose để sản xuất các enzyme thủy phân cơ chất

y

này có tiềm năng ứng dụng trong nhiều ngành cơng nghiệp hóa chất, nhiên liệu, thực
phẩm, rượu và bia, thức ăn gia súc, vải sợi, bột giặt, giấy và bột giấy (Hamelinck và
cộng sự, 2003).

8


Đồ án tốt nghiệp


2.3. Giới thiệu sơ lược về enzyme cellulase
2.3.1. Định nghĩa (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013)

H
o
C
hi
h

in

M
ity

C
ni

U
rs

ve

Hình 2.2. Cấu trúc của enzyme cellulase
( />
ity

Cellulase là hệ enzyme xúc tác phản ứng cho q trình chuyển hóa cellulose

of


thành sản phẩm hịa tan. Phức hệ enzyme cellulase là enzyme khá phức tạp. Một mặt,

Te

cellulase tương tự enzyme cảm ứng (mà ở đây cellulose lại là chất cảm ứng chặt chẽ),

ch

mặt khác chịu tác động bởi cơ chế điều khiển bởi sản phẩm cuối và chịu kiểm sốt

l
no

bởi cơ chế dị hóa.

Cellulase có bản chất là protein được cấu tạo từ các đơn vị acid amin, các acid

og

amin này được nối với nhau bởi liên kết peptid -CO-NH-. Cấu trúc không gian

y

cellulose bao gồm một trung tâm xúc tác và một đuôi không gian.

Cấu trúc không gian khoảng 280 – 600 acid amin nhưng chiều dài cellulase
thường khoảng 300 – 450 acid amin và trung tâm xúc tác có khoảng 250 acid amin.
Cellulase là một loại homopolymer của β-D-glucose được nối với nhau qua
liên kết β-D-1,4-glucan. Hệ thống enzyme thủy phân cellulose bao gồm ít nhất 3
enzyme


khác

nhau:

endoglucanase

9

(1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase,


Đồ án tốt nghiệp

EC.3.2.1.4), exoglucanase (1,4-β-D glucan-cellobiohydrolase, EC.3.2.1.91) và βglucosidase (β-D-glucosid glucohydrolase, EC.3.2.1.21). Các enzyme này có tính đặc
hiệu khác nhau và hoạt động hỗ trợ nhau. Đầu tiên, exoglucanase phá vỡ liên kết 1,4β-D glucoside trong phân tử cellobiose và sau cùng β-glucosidase phân cắt cellobiose
thành glucose.
2.3.2. Phân loại

H
o

Theo phân loại của Hội sinh học phân tử và sinh hóa quốc tế (IUBMB –

C

International Union pf Biochemistry and Molecular Biology) hệ thống các enzyme

hi


thủy phân cellulose gồm có endoglucanase có ký hiệu EC 3.2.1.4, exoglucanase có

M

ký hiệu EC 3.2.1.91 và β-glucansidase có ký hiệu EC 3.2.1.21 (Huỳnh Thị Hồng

h

in

Sương, 2013).

2.3.3.1. Tính đặc hiệu

ity

C

2.3.3. Tính chất (Huỳnh Thị Hồng Sương, 2013)

ni

U

Cellulase thủy phân các liên kết 1,4-β-D-glucoside trong cellulose và các β-

ve

D-glucan của ngũ cốc. Người ta cho rằng đầu tiên exoglucanase tác động trên các đầu


rs

chuỗi mới tạo thành để sản xuất chủ yếu là cellulobiose, β-glucosidase thủy phân các

of

2.3.3.2. Đặc tính vật lý và hóa học

ity

gốc β-D-glucose cuối cùng từ các đầu phân tử cellulose.

Te

Theo nghiên cứu, hầu hết các cellulase có pH tối ưu, tính hịa tan và thành
phần acid amin giống nhau. Độ bền nhiệt và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau.

ch

Bên cạnh hoạt tính cellulase, các chế phẩm cellulase thường chứa các hoạt động khác

l
no

của enzyme và các hoạt động này có ảnh hưởng đến đặc tính của chế phẩm.

og

Cenllulase hoạt động ở pH từ 3 – 7, nhưng pH tối ưu trong khoảng 4 – 5. Nhiệt


y

độ tối ưu từ 40 – 500C. Hoạt tính cellulase bị phá huỷ hồn tồn ở 800C trong 10 đến
15 phút.
2.3.3.3. Các chất ức chế
Cellulase bị ức chế bởi chính các sản phẩm phản ứng được tạo ra như glucose,
cellobiose. Thủy phân ức chế cellulase hoàn toàn, trong khi các ion khác nhau như
Mn, Ag, Zn chỉ ức chế nhẹ.

10


Đồ án tốt nghiệp

2.3.4. Cơ chế tác động của enzyme
2.3.4.1. Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) (Nguyễn Hoàng
Phúc và những cộng sự, 2012)
Enzyme này cịn có tên gọi khác như: exoglucanase, cellobiohydrolase, exocellobiohydrolase,

exo-β-1,4-glucan

cellobiohydrolase,

1,4-β-D-glucan

cellobiohydrolase, cellobiosidase, CBH 1, C1 cellulase, avicelase.

H
o


Enzyme này thủy phân liên kết 1,4-β-D-glucoside từ đầu không khử của chuỗi

C

cellulose để tạo thành cellobiose.

hi
h

in

M
ity

C
ve

ni

U

Hình 2.3. Cơ chế hoạt động của exoglucanase
( />2.3.4.2. Cơ chế 1,4-β-D-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14) (Nguyễn Hoàng Phúc và

ity

rs

những cộng sự, 2012)


Enzyme này cịn có tên gọi khác như: Endoglucanase, Endo-1,4-β-D-

of

glucanase, Endo-1,4-β-D-glucanase, β-1,4-endoglucan hydrolase, Carboxymethyl

Te

cellulase, Celludextrinase, Cellulase A, Cellulosin AP, Alkali Cellulase, Cellulase

ch

A3, 9.5 Cellulase, Avicelase, Pancellase SS.

y

og

l
no
Hình 2.4. Cơ chế hoạt động của endoglucanase
( />
11


Đồ án tốt nghiệp

Enzyme này thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucoside giữa mạch của
chuỗi cellulose, lichenin và các β-D-glucan của ngũ cốc.
2.3.4.3. Cơ chế β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) (Nguyễn Hồng Phúc

và những cộng sự, 2012)
Enzyme này có tên gọi khác như là: β-glucosidase, β-D-glucosidase, β-1,6glucosidase, β-glucoside glucohydrolase, p-nitrophenyl β-glucosidase, aryl-β-

H

o

glucosidase, gentiobiase, cellobiase, emulsin, elaterase, arbutinase, amygdalinase,

C

primeverosidase, amygdalase, limarase, salicilinase.

hi

Enzyme này thủy phân gốc β-D-glucoside không khử ở đầu tận cùng để phóng

M

thích ra β-D-glucose.

h

in
ity

C
rs

ve


ni

U
ity

Hình 2.5. Cơ chế hoạt động của cellobiase
( />
of

l
no

 Nguồn carbon (Lương Đức Phẩm, 1998)

ch

2.3.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy

Te

2.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase

Theo lý thuyết sinh tổng hợp cảm ứng, trong môi trường nuôi cấy các vi sinh

og

vật tổng hợp enzyme cellulase nhất thiết phải có cellulose là chất cảm ứng và nguồn

y


carbon.

Những nguồn cellulose có thể là giấy lọc, bông, bột cellulose, lõi ngô, mạt
cưa, bã củ cải, rơm, than bùn. T. lignorum và T. koningii được ni trên mơi trường
có nguồn carbon là giấy lọc cho hoạt tính enzyme cao nhất. Kết quả tương tự như vậy
khi ni Myrothecium verucaria trên mơi trường có giấy lọc và lõi ngô, bã củ cải.
Chất cảm ứng enzyme cellulase cịn là cellobiose octaacetate, cám mì, lactose, salixyl.

12