ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT XUẤT TỪ VỎ
TRÁI CÂY ĐẾN KHẢ NĂNG SẢN XUẤT CAROTENOID CỦA NẤM
MEN RHODOSPORIDIUM PALUDIGENUM

Vũ Thị Uyên

Đà Nẵng, năm 2022


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT XUẤT TỪ VỎ
TRÁI CÂY ĐẾN KHẢ NĂNG SẢN XUẤT CAROTENOID CỦA NẤM
MEN RHODOSPORIDIUM PALUDIGENUM

Ngành: Cơng nghệ sinh học
Khóa: 2018-2022
Sinh viên: Vũ Thị Uyên
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Minh Lý

Đà Nẵng, năm 2022


LỜI CAM ĐOAN

Tơi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực. Đây là kết quả
nghiên cứu của tác giả và chưa từng được công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác trước
đây. Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa học.

Vũ Thị Uyên

i


LỜI CẢM ƠN
Khoá luận tốt nghiệp là một trong những dấu mốc quan trọng trong quá trình học đại
học của tơi. Để hồn thành được kết quả như ngày hơm nay đã có rất nhiều bàn tay nâng
đỡ và dìu dắt tơi.
Với lịng biết ơn sâu sắc nhất, đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô
khoa Sinh – Môi trường, Trường đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã cùng với tri thức
và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng tôi tại giảng đường.
Cảm ơn Khoa đã hỗ trợ máy móc, dụng cụ thiết bị tạo điều kiện tốt nhất cho tơi trong q
trình nghiên cứu và hồn thành khố luận. Và đặc biệt hơn hết tơi xin chân thành cảm ơn
Th.S Lê Thị Mai và TS. Nguyễn Minh Lý đã nhiệt tình dẫn dắt, quan tâm và truyền đạt tận
tình, cho tơi những nền tảng kiến thức, những định hướng nghiên cứu để tơi có thể hồn
thành khố luận một cách tốt nhất.
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn các bạn trong và ngoài lớp đã nhiệt tình giúp đỡ tơi
trong suốt q trình thực hiện khoá luận.
Và cuối cùng con xin được cảm ơn gia đình đã ln u thương, quan tâm, động viên

và là điểm tựa tinh thần cho con.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn!
Đà Nẵng, ngày 21 tháng 5 năm 2022
Sinh viên thực hiện

ii


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................................... 1
2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................................. 2
3. Ý nghĩa của đề tài ............................................................................................................ 2
3.1. Ý nghĩa khoa học .......................................................................................................... 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................................... 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................. 3
1.1. Tổng quan về Carotenoid .............................................................................................. 3
1.1.1. Giới thiệu ................................................................................................................... 3
1.1.2. Phân loại..................................................................................................................... 3
1.1.3. Tính chất của carotenoid ............................................................................................ 4
1.1.4. Hoạt tính sinh học và vai trị của carotenoid ............................................................. 6
1.2. Tổng quan về chủng nấm men Rhodosporidium .......................................................... 6
1.2.1. Phân loại..................................................................................................................... 6
1.2.2. Đặc điểm sinh học ...................................................................................................... 7
1.2.3. Con đường sinh tổng hợp carotenoid bởi nấm men ................................................... 8
1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid của nấm men .... 10
1.2.5. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu ........................................................................ 13
1.2.6. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nấm men để sản xuất carotenoid sử dụng chất nền
là bã thải nông nghiệp trên thế giới và Việt Nam .............................................................. 16
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 19

2.1. Vật liệu ........................................................................................................................ 19
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................... 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 20
2.3.1. Bố trí thí nghiệm ...................................................................................................... 20
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 20
iii


CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .......................................... 26
3.1. Ảnh hưởng của dịch chiết xuất từ các loại vỏ trái cây đến khả năng sản xuất carotenoid
bởi chủng Rhodosporidium paludigenum .......................................................................... 26
3.1.1. Ảnh hưởng của dịch chiết vỏ trái cây thay thế đường D-glucose trong môi trường
Hansen đến khả năng sản xuất carotenoid bởi chủng Rhodosporidium paludigenum. ..... 26
3.1.2. Khảo sát việc thay thế hoàn toàn dịch chiết từ vỏ dứa làm chất nền để sản xuất
carotenoid ........................................................................................................................... 30
3.2. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian đến khả năng sản xuất carotenoid của
Rhodosporidium paludigenum ........................................................................................... 32
3.2.1. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sản xuất carotenoid của Rhodosporidium
paludigenum ....................................................................................................................... 32
3.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sản xuất carotenoid của Rhodosporidium
paludigenum ....................................................................................................................... 34
3.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sản xuất carotenoid của
Rhodosporidium paludigenum ........................................................................................... 36
3.3. Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và kháng khuẩn của carotenoid bởi chủng
Rhodosporidium paludigenum lên men từ dịch chiết vỏ dứa ............................................ 39
3.3.1. Khả năng bắt gốc tự do ABTS ................................................................................. 39
3.3.2. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết carotenoid bởi chủng Rhodosporidium
paludigenum từ dịch vỏ dứa .............................................................................................. 40
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................... 43
1. Kết luận.......................................................................................................................... 43

2. Kiến nghị ........................................................................................................................ 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 44
PHỤ LỤC........................................................................................................................... 50

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ABTS

2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)

DMSO

Dimethyl Sulffoxide

D

Day

GGPP

geranylgeranyl pyrophosphate

N

Ngày

NT


Nghiệm thức

PE

Petroleum Ether

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng

Tên bảng

Trang

3.1

Sinh khối khô, hàm lượng carotenoid của các nghiệm thức từ

26

chủng nấm men Rhodosporidium paludigenum
3.2

Hàm lượng đường khử của các nghiệm thức từ chủng nấm men

27


Rhodosporidium paludigenum
3.3

Sinh khối khô, hàm lượng carotenoid của chủng Rhodosporidium

30

paludigenum ở các nghiệm thức NT5, NT6, NT7
3.4

Sinh khối khô, hàm lượng carotenoid chủng nấm men

33

Rhodosporidium paludigenum ở các mức pH
3.5

Sinh khối khô, hàm lượng carotenoid ở các mức nhiệt độ từ chủng
Rhodosporidium paludigenum

35

3.6

Sinh khối khô, hàm lượng carotenoid ở các mức thời gian ni

36

cấy từ chủng nấm men Rhodosporidium paludigenum
3.7


Hoạt tính kháng oxy hoá của dịch chiết carotenoid từ chủng

39

Rhodosporidium paludigenum
3.8

Hoạt tính kháng oxy hố của dịch chiết carotenoid từ chủng
Rhodosporidium paludigenum

vi

41


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Tên hình vẽ

Hình

Trang

1.1

Một số phân nhóm trong carotenoids

4

1.2


Quá trình tổng hợp beta-carotene, torulene và torularhodin từ

10

acetyl – CoA của Rhodosporidium sp.
2.1

Khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng R. paludigenum

19

2.2

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

20

3.1

Sinh khối, hàm lượng carotenoid của các nghiệm thức từ chủng

28

nấm men R. paludigenum
3.2

Sinh khối thu được của R.paludigenum từ các nghiệm thức

28


3.3

Dịch chiết carotenoid của chủng R. paludigenum ở nghiệm thức

28

3.4

Sinh khối lỏng của R.paludigenum ở NT5, NT6, NT7

31

3.5

Dịch chiết carotenoid của R.paludigenum ở NT5, NT6, NT7

31

3.6

Sinh khối nấm men R. paludigenum thu được ở các mức pH

33

3.7

Dịch chiết carotenoid của chủng R. paludigenum ở các mức pH

33


3.8

Dịch chiết carotenoid của chủng R. paludigenum ở các mức nhiệt

35

độ

vii


3.9

Hàm lượng carotenoid và sinh khối khô ở các mức thời gian nuôi

37

cấy
3.10

Dịch chiết carotenoid của chủng R. paludigenum ở các mức thời

37

gian ni cấy
3.11

Hoạt tính kháng oxy hố của dịch chiết carotenoid từ chủng


39

R. paludigenum
3.12

Sự thay đổi màu ABTS+ của mẫu

40

3.13

Khả năng kháng khuẩn của dịch chiết carotenoid từ R.

41

paludigenum

viii


TĨM TẮT
Carotenoid là họ sắc tố có vai trị quan trọng đối với động vật và con người nhờ khả
năng tăng cường đáp ứng miễn dịch, biến đổi thành vitamin A hay khả năng bắt các gốc
oxy hóa. Các chất tạo màu tự nhiên ngày càng được tìm kiếm nhiều hơn để thay thế các
chất tổng hợp. Nghiên cứu này được thực hiện để khảo sát tiềm năng của vỏ trái cây (cam,
dứa, xoài, chuối, dưa hấu) như một nguồn cacbon để sản xuất carotenoid từ
Rhodosporidium paludigenum. Dịch chiết xuất từ nghiệm thức 5 (vỏ dứa, KH2PO4, MgSO4
.7H2O, peptone) cho hàm lượng carotenoid cao nhất 3720,139 µg/L. Đặc biệt, dịch chiết
từ NT7 (vỏ dứa) có thể thay thế hồn tồn môi trường Hansen, hàm lượng sinh khối khô
và carotenoid là 3,48 ± 0,2 g/L và 4482,355 ± 284,24 µg/L. Đã xác định được điều kiện

lên men là pH = 6, nhiệt độ là 25oC và thời gian nuôi cấy là ngày thứ 6 đạt hàm lượng
carotenoid là 4568,309 ± 85,32 µg/L, 5033,307 ± 62,96 µg/L và 6362,014 ± 538,84 µg/L.
Dịch chiết carotenoid có hoạt tính kháng oxy khá mạnh (93,521 ± 0,31%) và đồng thời có
khả năng kháng vi khuẩn E. Coli, Pseudomonas aeroginosa và Salmonella sp. với đường
kính vịng vô khuẩn lần lượt là 8 ± 0,5 mm, 12 ± 0,5 mm và 11 ± 0,5 mm.
Từ khoá: Carotenoid, Rhodosporidium paludigenum, vỏ trái cây.

ix


MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Carotenoid là một trong những loại sắc tố đóng vai trị quan trọng đối với sức khỏe
con người và động vật. Hiện nay, có hơn 700 dẫn xuất của sắc tố carotenoid. Động vật và
con người khơng có khả năng tổng hợp carotenoid và chế độ ăn uống là nguồn duy nhất bổ
sung carotenoid. Hầu hết các carotenoid thường được phát hiện trong huyết tương người
là α-carotene, β-carotene, lycopene, lutein, zeaxanthin và β-cryptoxanthin. Nhiều thành
phần bữa ăn như rau, trái cây, lòng đỏ trứng, cá, ví dụ: cá hồi và cá hồi và động vật giáp
xác đại diện cho một nguồn tuyệt vời của carotenoid (Trần Thị Huyền Nga, 2010).
Carotenoid rất quan trọng vì chúng có thể được sử dụng làm tiền chất vitamin A,
thuốc nhuộm tự nhiên, chất chống oxy hóa và có thể hoạt động ức chế khối u, chứng tỏ
tiềm năng của chúng đối với ngành dược phẩm, hóa chất, thực phẩm và thức ăn chăn nuôi
(Baker và Guenther, 2004; Frengova và Beshkova, 2009). Các bằng chứng dịch tễ học và
dữ liệu thực nghiệm cho thấy rằng carotenoid trong thực phẩm ức chế sự khởi phát của
nhiều bệnh, chẳng hạn như xơ cứng động mạch, đục thủy tinh thể, đa xơ cứng và ung thư
(Forman và cs, 2004; Frengova và Beshkova, 2009).
Mặc dù đã có nhiều loại carotenoid tự nhiên và tổng hợp, nhưng carotenoid được tổng
hợp từ vi sinh vật đã thu hút nhiều sự chú ý trong những năm gần đây (Agnieszka, K.,
Malgorzata và cs, 2016). Carotenoid phân bố rộng rãi trong vi sinh vật bao gồm vi khuẩn,

nấm men và tảo. Sản xuất thương mại các carotenoid từ vi sinh vật có hiệu quả cao vì
chúng có thể được kiểm sốt dễ dàng trong suốt q trình (De Haan A và cs, 2016). Nấm
men đỏ là một nhóm các lồi nấm men có khả năng tích tụ các sắc tố carotenoid bao gồm
β-caroten, torulene và thorularodin có nhiệm vụ tạo màu cho khuẩn lạc như màu vàng, cam
và đỏ. Rhodotorula sp., Rhodosporidium sp., Phaffia sp. và gần đây là Candida sp. là
những loài nấm men ưu thế nhất có thể tổng hợp hiệu quả các phân tử này với khả năng
sinh trưởng cao (Aksu, Z., Eren và cs, 2005). Trong số các loại nấm men đỏ sản xuất
caroteinoid thì Rhodosporidium sp. được đánh giá cao.

1


Nấm men có thể tổng hợp carotenoid khi được ni cấy trong môi trường thương
mại, chứa nhiều nguồn cacbon tinh chế khác nhau, chẳng hạn như glucose, xylose,
cellobiose, sucrose, glycerol và sorbitol, tuy nhiên loại mơi trường này có chi phí cao. Một
số loại chất nền chi phí thấp hơn đã được nghiên cứu để sản xuất carotenoid bởi nấm men
đỏ, chẳng hạn như nước mía (Bonadio và cs, 2018), váng sữa, mật đường, rượu ngô (Galal
và Ahmed, 2020) và các loại nơng sản chất thải cơng nghiệp khác (Mata-Gómez và cs,
2014). Chất thải từ trái cây là chất nền tiềm năng để sản xuất carotenoid vi sinh vật do chứa
nhiều cacbon và khoáng chất (Tarangini và Mishra, 2014). Hơn nữa, vỏ trái cây cũng chứa
các tiền chất carotenoid bao gồm geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) liên quan đến quá
trình sinh tổng hợp carotenoid theo con đường methyl - D - erythritol - 4 - phosphate (MEP)
(Loto và cs, 2012).
Việt Nam đã có một số cơng trình nghiên cứu về chủng Rhodosporidium sp. sinh tổng
hợp carotenoid nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của chất nền nuôi cấy đến
khả năng sản xuất carotenoid của chủng nấm men Rhodosporidium paludigenum.
Xuất phát từ các cơ sở lý luận và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên
cứu ảnh hưởng của dịch chiết xuất từ vỏ trái cây đến khả năng sản xuất Carotenoid của
nấm men Rhodosporidium paludigenum.
2. Mục tiêu đề tài

Xác định được ảnh hưởng của chất nền đến khả năng sản xuất carotenoid của chủng
Rhodosporidium paludigenum.
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thêm dẫn liệu khoa học về ảnh hưởng của
chất nền đến khả năng sản xuất carotenoid của chủng Rhodosporidium paludigenum.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả đề tài là cơ sở cho việc sản xuất carotenoid từ chủng nấm men
Rhodosporidium paludigenum.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về Carotenoid
1.1.1. Giới thiệu
Carotenoid là nhóm chất màu hồ tan trong lipid tự nhiên, làm cho rau quả có màu
da cam, màu vàng và màu đỏ, được tìm thấy trong thực vật và một số cơ thể sinh vật quang
hợp, thực vật, tảo, nấm mốc, mấn men và vi khuẩn.
Nhóm này gồm từ 65 - 70 chất màu tự nhiên, tiêu biểu là carotene, licopene,
xanthophylls, capsanthin,... Số lượng các carotenoid tìm thấy trong tự nhiên lên đến 600
loại với các màu sắc khác nhau. Carotenoid không phải là tên riêng của một chất nào mà
là tên của một nhóm các hợp chất có cơng thức cấu tạo tương tự nhau và tác dụng bảo vệ
cơ thể cũng tương tự nhau. Cấu trúc cơ bản của các carotenoid là một mạch thẳng, gồm 40
cacbon được cấu thành từ 8 đơn vị isoprenoid chứa 5 cacbon liên kết nhau, đối xứng qua
trung tâm. Điểm nổi bật và đặc biệt trong cấu trúc là hệ thống nối đôi liên hợp, xen kẽ nối
đơn, nối đơn tạo chuỗi polyene.
Carotenoid phần lớn là tecpenoit C40, hoạt động như chất chống oxy hóa bảo vệ màng
lọc O2 và các gốc peroxyl; khả năng chống oxy hóa của chúng là do cấu trúc của chúng.

Các sắc tố carotenoid xuất hiện phổ biến trong hệ thống quang hợp của thực vật bậc cao,
tảo và vi khuẩn quang dưỡng. Mặt khác, ở các sinh vật không quang hợp, carotenoid rất
quan trọng trong việc bảo vệ chống lại các tổn thương do q trình oxy hóa. Do đó, nhiều
vi khuẩn và nấm dựa vào carotenoid để bảo vệ khi phát triển trong điều kiện có nhiều ánh
sáng và khơng khí (Britton G và cs, 1997).
1.1.2. Phân loại
Carotenoid lần đầu tiên được công bố bởi Willstatter vào năm 1907. Ơng đã phân loại
chính xác 2 nhóm chính: carotenes là hydrocacbon như β-carotene và lycopene (C40H56 )
và xanthophylls, bao gồm oxy cùng với hydro và cacbon (C40H56O2). Xanthophylls về cơ
bản là sản phẩm oxy hóa của carotenes, bao gồm lutein, zeaxanthin, canthaxanthin và βcryptoxanthan. Carotenoid có cấu trúc polyene liên hợp cho phép các điện tử trong liên kết
đôi dễ dàng phân định vị trí, làm giảm trạng thái cơ bản của phân tử. Hệ thống cốt lõi của
các liên kết cacbon - cacbon liên hợp này tạo ra các carotenoid chống oxy hoá. Cấu trúc
3


này cũng tạo ra tính ưa béo khiến các sắc tố vừa làm chậm q trình peroxy hóa lipid vừa
ổn định cấu trúc lipid - protein như màng tế bào.
Nói chung, các carotenoid có tên gọi tùy theo sự biến đổi cấu trúc của các vòng bên,
đặc biệt là vị trí liên kết đơi.

Hình 1.1. Một số phân nhóm trong carotenoids
Một số carotenoid của vi sinh vật được tạo ra bởi nấm men được báo cáo là:
● β-carotene (β-β'-carotene) phân tử này đã được sử dụng làm chất tạo màu
thực phẩm hoặc như một chất bổ sung thực phẩm hoạt động như tiền vitamin A, với
nồng độ dao động từ 2 đến 50 ppm. Nó cũng được thêm vào các công thức nước trái
cây và đồ uống (chất nền ưa nước) và những chất khác (chất nền ưa béo) như bơ, bơ
thực vật và pho mát.
● Astaxanthin (3,3′-dihydroxy-β, β-carotene-4,4′-dione) là một sắc tố đỏ gây
ra màu ở động vật không xương sống, cá và chim. Tương tự như vậy, carotenes được
mơ tả trước khi nó được sử dụng như một chất tạo màu để tạo ra màu đỏ hồng điển

hình của cá hồi nuôi, cá hồi và tôm (Johnson EA và cs, 1979; Reynders MB và cs,
1996).
● Canthaxanthin (β-β′-caroten-4, 4’-dione) là một keto-caroten quốc tế được
các ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm quan tâm chủ yếu (Hannibal L và cs,
2000).
1.1.3. Tính chất của carotenoid
1.1.3.1. Tính chất vật lý

4


● Kết tinh ở dạng tinh thể, hình kim, hình khối lăng trụ, đa diện, dạng lá hình thoi. Nhiệt
độ nóng chảy cao: 130 - 220oC.
● Có độ hồ tan cao, khơng tan trong nước. Hồ tan trong chất béo, các dung môi chứa
Clo và các dung môi không phân cực khác làm cho hoa quả có màu da cam, màu
vàng, màu đỏ.
● Màu sắc của carotenoid được tạo ra nhờ sự có mặt của hệ các nối đơi liên hợp trong
phân tử. Phần lớn các nối đơi tạo hình trans. Khả năng hấp thụ sóng mạnh nhất ở
những bước sóng khác nhau của hệ nối đơi liên hợp được sử dụng để phân tích, định
tính cũng như định lượng carotenoid.
● Tính hấp thụ ánh sáng: chuỗi polyne liên hợp đặc trưng cho màu thấy được của
carotenoid. Dựa vào độ quang phổ của nó, người ta thấy khả năng hấp thụ ánh sáng
phụ thuộc vào nối đôi liên hợp, phụ thuộc vào nhóm C9 mạch thẳng hay mạch vịng,
cũng như các nhóm chức gắn trên vịng. Ngồi ra trong mỗi dung mơi hồ tan khác
nhau, khả năng hấp thụ ánh sáng tối đa cũng khác nhau với cùng một loại. Khả năng
hấp thụ ánh sáng mạnh chỉ cần 1 gam cũng thấy bằng mắt thường.
1.1.3.2. Tính chất hố học
● Carotenoid nhạy cảm với oxy và ánh sáng. Khi các tác nhân này bị loại bỏ, carotenoid
trong thực phẩm rất bền, kể cả ở nhiệt độ cao.
● Một trong những đặc điểm của carotenoid là có nhiều nối đơi ln hợp tạo nên những

nhóm mang màu của chúng. Màu của chúng phụ thuộc vào những nhóm mang màu
này.
● Dễ bị oxy hố trong khơng khí, cần bảo quản trong khí trơ, chân khơng. Ở nhiệt độ
thấp nên bao kín tránh ánh sáng mặt trời. Carotenoid khi bị oxy hoá:
❖ Làm giảm chất lượng sản phẩm
❖ Làm thay đổi màu sắc thực phẩm
❖ Tạo ra nhiều chất mùi (hợp chất có mùi thơm như aldehide khơng no
hoặc keton đóng vai trị tạo hương thơm cho trà).
● Rất nhạy cảm với acid và chất oxy hố, bền vững với kiềm. Do có hệ thống nối đơi
liên hợp nên nó dễ bị oxy hố mất màu hoặc đồng phân hoá, hydro hoá tạo màu khác.
5


1.1.4. Hoạt tính sinh học và vai trị của carotenoid
Carotenoid là tiền vitamin A, là chất chống oxy hoá tự nhiên có khả năng bắt giữ oxy
đơn phân tử. Các tính năng chống oxy hóa của các hợp chất này khơng phụ thuộc vào hoạt
tính tiền vitamin A của nó, bởi vì khả năng bắt giữ oxy bằng liên kết đơi của nó. Ngồi các
đặc tính được mơ tả ở trên, carotenoid cũng phát huy tác dụng tốt cho sức khỏe bao gồm:
cải thiện khả năng miễn dịch và giảm nguy cơ mắc các bệnh thối hóa như ung thư, bệnh
tim, đục thủy tinh thể và thối hóa điểm vàng (Palozza P và cs, 2003). Ăn vào có thể ngăn
chặn quá trình hình thành và cháy nắng trên da, nhưng chúng phải được tiêu thụ trong nhiều
tuần để làm tăng nồng độ của chúng trong máu, do đó tăng khả năng bảo vệ.
Carotenoid là hợp chất rất quan trọng đối với sức khỏe con người. Chúng có thể ngăn
ngừa sự thiếu hụt vitamin A, được biết đến như một hợp chất thiết yếu để thúc đẩy tăng
trưởng, phát triển phôi thai và chức năng thị giác. Tính ưa béo của các carotenoid quyết
định sự phân bố dưới tế bào của chúng. Người ta cho rằng carotenoid trong màng có thể
bảo vệ chúng như chất chống oxy hóa. Bên cạnh đó, các carotenoid phân cực có thể điều
chỉnh tính lưu động của màng (Anna M. Kot và cs, 2020). Một trong những chức năng của
chúng có liên quan đến việc bảo vệ tầm nhìn của chúng ta. Sự thiếu hụt carotenoid có thể
dẫn đến mù lịa và đã được xem xét trong các tài liệu, đây là một vấn đề nghiêm trọng đối

với trẻ em, đặc biệt là ở các nước đang phát triển (Anna M. Kot và cs 2020).
1.2. Tổng quan về chủng nấm men Rhodosporidium
1.2.1. Phân loại
Chủng nấm men đỏ Rhodosporidium được Bano phân lập vào năm 1967, chủng nấm
men này còn được gọi là nấm men sinh sắc tố carotenoid bởi vì chúng có khả năng tổng hợp
và tích luỹ một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là β-Carotene, torulene và
torularhodin. Hiện nay, chi Rhodosporidium được phát hiện gồm chín lồi, trong đó các loài
R. babjevae, R. diobovatum, R. kratochvilovae, R. lusitaniae, R. paludigenum, R.
sphaerocarpum và R. toruloides và số chi khác như Cystofilobasidium, Kondoa và
Sakaguchia.
Phân loại:
Giới (Kingdom):

Fungi

Ngành (Division):

Basidiomycota
6


Lớp (Class):

Ustilaginomycetes

Bộ (Order):

Ustilaginates

Họ (Family):


Ustilaginaceae

Chi (Genus):

Rhodosporidium

1.2.2. Đặc điểm sinh học
1.2.2.1. Đặc điểm hình thái
Tế bào nấm men Rhodosporidium có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc vào từng
loài và từng thời điểm sinh trưởng, hình dạng tế bào có thể thay đổi từ hình cầu đến hình
oval đa số có quầng sáng xung quanh tế bào. Tế bào ở dạng đơn bào, kích thước tế bào dao
động trong khoảng 2 - 3 μm chiều rộng và 5 - 10 μm chiều dài. Khuẩn lạc của
Rhodosporidium phát triển nhanh, bề mặt trơn mịn, sáng bóng hoặc có khi hơi mờ đục, ít
khi ghồ ghề hoặc nhớt, mép khuẩn lạc phẳng đều, không có răng cưa. Màu sắc khuẩn lạc
thay đổi từ màu cam nhạt, hồng nhạt đến đỏ cam. Kích thước khuẩn lạc tùy thuộc vào môi
trường dinh dưỡng và thời gian phát triển khuẩn lạc. Quan sát dưới kính hiển vi khơng thấy
có sự hình thành khuẩn ty, một số lồi có sinh khuẩn ty giả trên mơi trường PDA nhưng
rất kém phát triển, hình thành nang bào tử trên mơi trường acetate agar, nang bào tử hình
cầu, mỗi túi bào tử gồm một đến hai nang.
1.2.2.2. Đặc điểm sinh sản
Đa số các loài nấm men thuộc chủng Rhodosporidium sinh sản vơ tính bằng hình thức
nảy chồi: Đầu tiên, nhân tế bào mẹ bắt đầu kéo dài ra và sau đó co lại ở giữa, tế bào mẹ bắt
đầu phát triển một chồi con, một phần nhân chuyển vào chồi con và một phần ở tế bào mẹ,
nguyên sinh chất cũng chuyển sang chồi con, khi chồi con gần bằng chồi mẹ thì nó được
tách ra và sống độc lập, đa số các vị trí nảy chồi khơng cố định trên tế bào mẹ (nảy chồi đa
hướng). Đây là phương pháp sinh sản vơ tính chủ yếu nhất ở nấm men, ngồi ra trong một
số trường hợp vẫn phát hiện hình thức sinh sản hữu tính bằng cách tiếp hợp ở các chủng
nấm men Rhodosporidium.
Tốc độ sinh sản của Rhodosporidium khá nhanh, thời gian để đa số tế bào tăng lên

gấp đơi thường từ 2 đến 6 giờ. Q trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm 4 giai
đoạn:
7


➢ Giai đoạn tiềm sinh
➢ Giai đoạn phát triển hàm mũ
➢ Giai đoạn cân bằng
➢ Giai đoạn suy vong
Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodosporidium trong khoảng 24 - 96 giờ tuỳ lồi,
tuỳ thuộc vào thành phần mơi trường dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy.
1.2.2.3. Đặc điểm sinh hố
Chủng nấm men Rhodosporidium có các đặc điểm sinh hóa như sau:
- Có khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau như glucose, sucrose, lactose,
mannitol, galactose, maltose, arabinose, sorbitol, inositol, glycerol, tinh bột, acid lactic và
acid citric.
- Có khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau như NaNO3, KNO3, NH4Cl và
(NH4)2SO4.
- Phát triển tốt ở nhiệt độ trong khoảng 25oC tới 30oC
- Có chứa sắc tố carotenoid
- Khơng tạo thành hợp chất loại tinh bột
- Không tạo ra acid acetic
- Khả năng sinh tổ hợp sắc tố carotenoid
- Khơng hình thành bào tử và khơng sinh sản hữu tính
- Có hoặc khơng đồng hóa NO3- Có chứa enzyme khử bão hịa (desaturase), đặc biệt có khả năng chuyển hóa acid
oleic thành acid linolenic.
1.2.3. Con đường sinh tổng hợp carotenoid bởi nấm men
Năm 1964, Simpson và cộng sự đã mơ tả một con đường sinh tổng hợp có thể có để
tổng hợp carotenoid. Sau đó, Goodwin (1980) đã sửa đổi các con đường chung để sinh
tổng hợp carotenoid bởi nấm men và kết luận rằng con đường sinh tổng hợp carotenoid

bao gồm ba giai đoạn:
8


Giai đoạn 1: Chu trình Mevalonate
Biến đổi acetyl - CoA thành 3 - hydroxymethyl glutaryl - CoA (HMG-CoA) bởi HMG
- CoA synthase. HMG - CoA chuyển đổi thành hợp chất C6, mevalonic acid (MVA), tiền
chất đặc biệt đầu tiên của con đường sinh tổng hợp terpenoid. MVA trải qua một chuỗi các
phản ứng phosphoryl hóa bởi enzyme MVA kinase đồng thời bị decarboxyl hóa để tạo
thành isopentenyl pyrophosphate (IPP).
Giai đoạn 2: Sinh tổng hợp isoprene
IPP biến đổi đồng phân thành dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) bằng cách gắn
liên tiếp 3 phân tử IPP tạo thành DMAPP. Các phản ứng này được xúc tác bởi prenyl
transferase tạo thành hợp chất C20 geranyl geranyl pyrophotphate (GGPP). Sự trùng hợp 2
phân tử GGPP tạo ra phytoene (hợp chất C40 đầu tiên của quy trình). Cuối cùng của giai
đoạn này, lycopene được hình thành.
Giai đoạn 3: Chuỗi phản ứng carotenoidgenic

9


Đây là giai đoạn tổng hợp carotenoid từ phytoene, phytoene được chuyển thành
lycopene. Lycopene được xem là tiền chất để tổng hợp nên β-carotene và torulene, sau đó
torulene sẽ tham gia q trình khử và oxy hố nhờ sự xúc tác của enzyme oxidase để hình
thành nên torularhodin.

Hình 1.2. Quá trình tổng hợp beta-carotene, torulene và torularhodin từ acetyl - CoA
của Rhodosporidium sp. (Landolfo S và cs 2018)
1.2.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid của nấm men
Ở hầu hết nấm men, sự tích lũy sắc tố carotenoid bắt đầu ở pha tăng trưởng, tăng dần

ở pha ổn định. Môi trường nuôi cấy nấm men để sản xuất carotenoid rất đa dạng. Mỗi yếu
tố mơi trường đều ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men.
Các yếu tố dinh dưỡng (nguồn cacbon, nitơ, vitamin,...) và vật lý (nhiệt độ, pH, oxy,
ánh sáng,...) đều ảnh hưởng đến sự phát triển tế bào và biểu hiện gen carotenogenesis hay
quá trình sinh tổng hợp sắc tố. Sự tác động qua lại giữa các yếu tố dinh dưỡng và vật lý
dường như có sự khác biệt đối với từng chủng.
10


1.2.4.1. Nguồn cacbon
Kết quả lên men sẽ có sự thay đổi nhiều với mỗi chất nền khác nhau. Vì vậy, chọn
đúng cơ chất là rất quan trọng. Điều này phụ thuộc vào cách thức tương tác giữa vi sinh
vật và cơ chất. Nguồn cacbon thích hợp là rất quan trọng cho q trình tổng hợp carotenoid
trong suốt pha khơng tăng trưởng (Ginka I. Frengova và cs 2009). Latha và cộng sự (2005)
khảo sát trên chủng Rhodotorula glutinis cho thấy nguồn cacbon khác nhau sẽ cho lượng
sắc tố khác nhau. Sinh khối và sắc tố thu được cực đại khi nuôi trên môi trường sucrose so
với các nguồn cacbon disaccharide khác (lactose, maltose); cịn với nguồn cacbon là các
đường đơn, thì mơi trường chứa fructose có sản lượng sắc tố cao hơn so với glucose và
galactose, trong khi sinh khối thì có phần thấp hơn glucose và thua kém hẳn so với
galactose. Trên các đường đa, hiệu quả thấp hơn hẳn so với nhóm đường đơn và đường
đơi.
Hơn nữa, nguồn ngun liệu được sử dụng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến giá thành
sản phẩm đầu ra. Làm thế nào không chỉ tăng năng suất sản phẩm mà cịn giảm chi phí sản
xuất luôn là vấn đề được quan tâm trong mọi quy trình kỹ thuật. Trong những năm gần
đây, nguyên liệu thô và phụ phẩm ngành công nghiệp nông nghiệp được đề xuất như nguồn
cacbon chi phí thấp để sản xuất các sản phẩm chuyển hóa vật chất của vi sinh vật, cũng
như giảm thiểu các vấn đề môi trường và năng lượng để xử lý chúng.
1.2.4.2. Nguồn nitơ
Mỗi chủng vi sinh vật khơng chỉ thích hợp với nguồn nitơ khác nhau mà hàm lượng
nitơ sử dụng trong q trình ni cấy cũng khác nhau tùy chủng và mục đích thu nhận sản

phẩm, và trong mối tương quan với hàm lượng và nguồn cacbon sử dụng. Rhodosporidium
và Rhodotorula đều thuộc nhóm vi sinh vật sản xuất nhiều lipid. Nghiên cứu của D.
Somashe và R. Joseph (2000) trong ảnh hưởng của tỉ lệ C/N trong quá trình chuyển đổi
giữa lipid và carotenoid cho thấy hàm lượng carotenoid tích lũy trong tế bào (μg/g sinh
khối khơ) cao hơn nhiều ở mơi trường có tỉ lệ C/N thấp (10:1) so với các môi trường có tỉ
lệ C/N cao (160:1; 40:1). Một nghiên cứu khác là ni cấy có bổ sung Phaffia rhodozyma
cũng cho thấy rằng trong suốt q trình ni cấy, khi tỉ lệ C/N thấp tăng trưởng diễn ra
mạnh hơn so với sự tích lũy astaxanthin. Tỉ lệ tăng trưởng giảm dần đến khi nồng độ tế bào
cao. Chuyển sang tỉ lệ C/N cao, tăng trưởng của tế bào đi vào pha ổn định, lúc này sự tích
lũy astaxanthin diễn ra vượt trội.
11


1.2.4.3. Yếu tố pH
PH đóng vai trị quan trọng đối với quá trình sinh tổng hợp sắc tố ở vi sinh vật. Độ
pH tối ưu thường không giống nhau ở những chủng vi sinh khác nhau. Mỗi chủng vi sinh
vật cố thể tồn tại được ở biên độ pH rộng, nhưng thường chỉ có một vài giá trị pH được
cho là tối ưu để thu nhận sản phẩm mong muốn (Lương Đức Phẩm, 2009).
Sự thay đổi pH và nhiệt độ trong q trình ni có thể là cơng cụ đơn giản và mạnh
mẽ giúp tăng cường lượng astaxanthin trong quá trình sinh trưởng. Bởi cả pH và nhiệt độ
đều ảnh hưởng lớn đến sự tích lũy astaxanthin nội bào, thành phần carotenoid, động học
sinh trưởng tế bào.
1.2.4.4. Nhiệt độ
Nhiệt độ không chỉ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men mà còn ảnh hưởng
tới sinh tổng hợp các sản phẩm phụ và thứ cấp.
Quá trình sinh tổng hợp sắc tố ở nấm men chịu ảnh hưởng lớn bởi nhiệt độ nuôi cấy.
Bởi nhiệt độ là yếu tố quan trọng không chỉ ảnh hưởng đến năng suất tế bào mà cịn ảnh
hưởng đến sự hình thành sản phẩm. Tuy nhiên, nhiệt độ thích hợp cho sự tổng hợp sắc tố
thì tùy thuộc vào từng chủng nấm men. Nhiệt độ ảnh hưởng khác nhau đến từng loại sắc
tố riêng lẻ trong carotenoid tổng. Trong nghiên cứu nuôi cấy Rhodotorula glutinis 48-23T

trong môi trường glucose, thấy rằng ở 25oC, các sắc tố β-carotene, torularhodin và torulene
chiếm 30% carotenoid tổng. Trong khi ở 5oC β-carotene là sắc tố chính chiếm 64%,
torulene và torularhodin chiếm hàm lượng nhỏ. Trong nghiên cứu sinh tổng hợp torulene
và torularhodin ở chủng Phaffia rhodozyma của Polulyakh và cộng sự (1991), kết quả thu
được ở 20oC astaxanthin chiếm 85%, β-carotene chiếm 10%, ở 30oC carotenoid chủng này
sinh tổng hợp có torularhodin (60%), torulene (30%) và β-carotene (10%).
1.2.4.5. Ánh sáng
Ánh sáng là một yếu tố quan trọng cần xem xét trong q trình sản xuất carotenoid
của vi sinh vật; nó giúp cải thiện sự hình thành carotenogenes. Các vi sinh vật cần phải
ngăn mình khỏi ánh sáng để tránh gây ra thiệt hại và quá trình tạo carotenogenes là một cơ
chế quang bảo vệ (Raja R và cs, 2007). Việc sản xuất carotenoid bị ảnh hưởng bởi ánh
sáng trắng và nồng độ carotenoid phụ thuộc vào vi sinh vật. Ngoài ra, sản xuất carotenoid
có liên quan đến sự gia tăng hoạt động của các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng
12


hợp carotenoid. Moliné và cộng sự đã nghiên cứu mối quan hệ giữa carotenoid và
ergosterol và khả năng chống tia cực tím của tế bào ở các chủng R. mucilaginosa và báo
cáo rằng các chủng tăng sắc tố cho thấy khả năng sống sót được nâng cao (250%). Họ cũng
chỉ ra rằng sản xuất torularhodin cao hơn giúp cải thiện khả năng tồn tại của tia UV trong
nấm men. Mặt khác, Yen và Zhang đã đánh giá năng suất β-caroten trong lò phản ứng theo
mẻ với hai đèn LED (điốt phát quang) dẫn đến nồng độ β-caroten là 24,6 μg/g -1; trong khi
khơng có ánh sáng, nồng độ β-caroten được tìm thấy là 14,69 μg/g -1.
1.2.4.6. Các ion và muối khoáng
Các ion và muối kim loại (Ba, Fe, Mg, Ca, Zn và Co) cũng đã được chứng minh là
chất kích thích sản xuất carotenoit bởi R. glutinis (Komemushi S và cs, 1994). Buzzini và
cộng sự báo cáo rằng một số nguyên tố vi lượng đã cho thấy ảnh hưởng có chọn lọc đến
cấu trúc carotenoid trong R. graminis. Trong trường hợp Al3+ và Zn2+, tác dụng kích thích
sản xuất β-carotene và γ-carotene được quan sát thấy, trong khi Zn2+ và Mn2+ cho thấy tác
dụng ức chế sản xuất torulene và torularhodin. Hiệu quả của các nguyên tố vi lượng được

đề cập là do sự hoạt hóa của các enzyme carotenogenic cụ thể.
1.2.5. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
Quá trình chuyển hoá ở nấm men chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau. Trong
quá trình ứng dụng để sản xuất các sản phẩm chuyển hoá từ nấm men, bên cạnh chất lượng
sản phẩm, giá thành đầu ra cũng là một vấn đề được quan tâm nhiều. Trong những năm
gần đây, nguyên liệu thô và phụ phẩm ngành công nghiệp nông nghiệp được đề xuất như
một nguồn cacbon thay thế giá rẻ cho chuyển hoá ở nấm men (Ginka I. Frengova và Dora
M. Beskova, 2009).
Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên thuận lợi cho việc trồng rau và
sản xuất nhiều loại rau quả. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất carotenoid. Bên
cạnh đó, nguồn cacbon cịn được tìm nhiều trong các nguồn ngun liệu rẻ tiền, dễ tìm như
bã cam, chanh; vỏ xồi, vỏ dưa hấu, vỏ chuối và vỏ dứa,... được thải ra trong công nghiệp
chế biến nước ép trái cây. Việc tái sử dụng vừa giúp bảo vệ môi trường vừa mang lại hiệu
quả cao về kinh tế.
1.2.5.1. Vỏ dứa

13


Vỏ dứa là một nguyên liệu thô giàu dưỡng chất như chất xơ khơng hịa tan, pectin,
đường, protein, vitamin, khống chất và các hợp chất phenolic và bromelain, một nhóm
các protease với các ứng dụng khác nhau trong thực phẩm, dệt may, mỹ phẩm,... Myricetin,
axit salicylic, axit tannic, axit trans-cinnamic và axit p-coumaric đã được xác định trong
một loại bột giàu chất xơ từ vỏ dứa là một phần chất thải và những hợp chất này được báo
cáo là chất chống oxy hóa mạnh (Larrauri, J.A. và cs, 1997)
Arsyada và cộng sự báo cáo rằng chiết xuất vỏ dứa có chứa các hợp chất hóa học
như: flavonoid, saponin, tannin, và enzyme bromelain và flavonoid là hàm lượng hợp chất
hóa học cao nhất trong chiết xuất vỏ dứa. Ngoài ra, dứa là một nguồn giàu mangan, giúp
xây dựng và duy trì sức mạnh của xương và nó cũng có nhiều vitamin C. Nó cũng chứa
bromelain, có thể làm giảm sưng, bầm tím, thời gian chữa lành và đau liên quan đến chấn

thương và can thiệp phẫu thuật (Thanish, AS và cs, 2016). Phân tích phytochemical của vỏ
dứa cho thấy, alkaloids, flavonoid và saponin có đặc tính phytochemical cao nhất; và
phenolic, tannin và terpenoit có mặt vừa phải cũng như glycosid và steroid ở dạng vết
(Okoh, ME và cs, 2019). Axit chlorogenic và axit ferulic trong nước chiết xuất từ dứa được
coi là có vai trị quan trọng như chất khử hoặc chất chống oxy hóa.
1.2.5.2. Vỏ cam
Vỏ cam là chất thải có khối lượng lớn và dễ sử dụng nhất trong ngành sản xuất cam.
Người ta ước tính rằng khoảng 20% quả cam là vỏ cam. Do đó, người ta ước tính lượng vỏ
cam tạo ra là 15,1 triệu tấn vào năm 2018. Tài liệu chỉ ra rằng vỏ cam chứa 23% đường,
22% cellulose, 25% pectins và 11% hemicellulose (Gaind, S., 2016). Thành phần hóa học
của vỏ cam chủ yếu được tạo thành từ cellulose, tiếp theo là lignin và sau đó là
hemicellulose. Cellulose là polyme tự nhiên đơn giản nhất để chuyển đổi thành các
monome của nó, giúp cải thiện quá trình lên men.
Vỏ cam là một trong những loại trái cây được tiêu thụ nhiều nhất trên toàn cầu bởi vì
nó có nhiều chất có lợi chẳng hạn như alkaloid, flavonoid, lycopene, vitamin C, pectin và
tanin (Rafsanjani và Putri, 2014). Vỏ cam cũng chứa tiền chất carotenoid bao gồm
geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) liên quan đến sinh tổng hợp carotenoid bằng con
đường MEP (Loto và cs, 2012).
1.2.5.3. Vỏ chuối
14