TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------  ------

BÁO CÁO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
“Phân lập và khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase ở
một vài chủng vi khuẩn”

HÀ NỘI – 2011


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.............................................................................................................................i
MỤC LỤC.................................................................................................................................ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT...............................................................................................iv
DANH MỤC BẢNG..................................................................................................................v
DANH MỤC HÌNH.................................................................................................................vi
TĨM TẮT................................................................................................................................vii
PHẦN I. MỞ ĐẦU....................................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.......................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu của đề tài.........................................................................................................1
1.2.1. Mục tiêu chung........................................................................................................1
1.2.2. Mục tiêu cụ thể.........................................................................................................1
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................................2
2.1. Giới thiệu chung về cellulose và cellulase....................................................................2
2.1.1. Giới thiệu về cellulose..............................................................................................2
2.2.2. Giới thiệu về cellulase..............................................................................................2
2.2. Vi sinh vật sản xuất cellulase........................................................................................5

2.3. Các ứng dụng của cellulase...........................................................................................8
2.3.1. Chất tẩy rửa và công nghiệp dệt may......................................................................8
2.3.2. Công nghiệp giấy và bột giấy...................................................................................8
2.3.3. Trong công nghiệp thực phẩm................................................................................9
2.3.4. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi....................................................9
2.3.5. Nhiên liệu sinh học................................................................................................10
2.3.6. Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh.................................11
2.4. Tình hình nghiên cứu...................................................................................................12
2.4.1. Nghiên cứu trong nước..........................................................................................12
2.4.2. Nghiên cứu trên thế giới........................................................................................13
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.......................................................................14
3.1. Vật liệu..........................................................................................................................14
3.1.1. Đối tượng................................................................................................................14
3.1.2. Thiết bị....................................................................................................................14
3.1.1. Hóa chất.................................................................................................................15

i


3.2. Môi trường....................................................................................................................16
3.3. Các phương pháp nghiên cứu.....................................................................................17
3.3.1. Phân lập vi khuẩn từ dịch nước thải nhà máy giấy.............................................17
3.3.2. Đánh giá đặc điểm hình thái.................................................................................17
3.3.3. Định tính cellulase bằng phương pháp nhuộm Congo đỏ...................................18
3.3.4. Xác định hoạt độ enzyme theo phương pháp Miller............................................18
3.3.5. Thu nhận enzyme...................................................................................................20
3.3.6. Điện di SDS - PAGE.............................................................................................21
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................................23
4.1. Phân lập vi khuẩn từ nguồn nước thải.......................................................................23
4.2. Đặc điểm sinh học của chủng PK 4 – 9......................................................................26

4.3. Hoạt độ enzyme cellulase.............................................................................................27
4.4. Kết quả điện di SDS – PAGE......................................................................................28
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ....................................................................................30
5.1. Kết luận.........................................................................................................................30
5.2. Đề nghị..........................................................................................................................30
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................................31
Tài liệu tiếng Việt................................................................................................................31
Tài liệu tiếng Anh.................................................................................................................32

ii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

APS

Amonium persulphat

Cellulase C1

Enzyme có hoạt tính exocellulase

Cellulase Cx

Enzyme có hoạt tính endocellulase

CMC

Carboxymethyl-cellulose


CMCase

Enzyme carboxymethyl cellulas

Dhalo

Đường kính vịng sáng

DNSA

3,5-Dinitrosalicylic acid

ĐC

Đối chứng

kDa

Kilodalton.

OD

Optical density

pI

Isoelectrics point

SDS


Sodium dodecyl sulfat

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TEMED

Tetramehtylethyenediamine

U

Unit

V

Thể tích

w/v

khối lượng/thể tích

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các vi sinh vật sử dụng trong sản xuất cellulose...................................................7
Bảng 3.1. Tên thiết bị dùng trong đề tài...............................................................................14
Bảng 3.2. Các hóa chất sử dụng trong đề tài........................................................................15
Bảng 3.3. Thành phần môi trường........................................................................................16

Bảng 3.4. Xây dựng đồ thị chuẩn...........................................................................................19
Bảng 3.5. Thành phần gel điện di SDS - PAGE...................................................................22
Bảng 4.1. Lượng đường khử sinh ra theo thời gian.............................................................24
Bảng 4.2. Hoạt tính cellulose ngoại bào của 8 chủng nghiên cứu.......................................25

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Một số hình ảnh về cấu trúc của cellulase..............................................................2
Hình 2.2. Mơ hình enzym cellulase, được sinh tổng hợp bởi T. fusca, (PDB 1JS4)............4
Hình 2.3. Ba loại phản ứng xúc tác bởi cellulase....................................................................5
Hình 3.1. Thu nhận enzyme...................................................................................................21
Hình 4.1. Hình ảnh các mẫu nước thải và dịch ni cấy.....................................................23
Hình 4.2. Đồ thị thể hiện lượng đường khử sinh ra theo thời gian....................................24
Hình 4.3. Hoạt tính cellulase của 8 chủng nghiên cứu.........................................................26
Hình 4.4. Hình ảnh chủng vi khuẩn PK 4 – 9......................................................................27
Hình 4.5. Đồ thị chuẩn glucose..............................................................................................28
Hình 4.6. Hoạt tính cellulase..................................................................................................28
Hình 4.7. Kết quả điện di SDS – PAGE................................................................................29

v


TÓM TẮT
Từ nguồn nước thải nhà máy giấy Phong Khê, Bắc Ninh 8 chủng vi khuẩn có
khả năng phân hủy cellulose đã được phân lập. Hầu hết các chủng đều phát triển tốt
trên mơi trường chọn lọc có agar. Khả năng sản xuất cellulase ngoại bào của các chủng
vi khuẩn được kiểm tra bằng khuếch tán đĩa thạch và nhuộm Congo đỏ. Hoạt độ
cellulase được xác định bằng phương pháp đường khử. Trong số 8 chủng phân lập,

chúng tôi đã chọn được 1 chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân cellulase hiệu quả
nhất (chủng PK 4 – 9). Kiểm tra hoạt độ bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch thu
được đường kính vịng sáng có kích thước 7mm. Hoạt độ cellulase ngoại bào thu được
đạt 792,5218 U/ml dịch nuôi.
Enzyme ngoại bào thu được bằng cách kết tủa phân đoạn dịch nuôi cấy bằng
ethanol (80%). Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy, enzyme cellulase ngoại bào của
chủng vi khuẩn này có kích thước khoảng 32 kDa.
Từ khóa: Nước thải nhà máy giấy, vi khuẩn phân hủy cellulose, hoạt tính
cellulase.

vi


PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hằng năm có khoảng 230 tỉ tấn chất hữu cơ được tạo ra từ q trình quang hợp
ở thực vật, trong đó có khoảng 70 tỉ tấn (30%) cellulose có nguồn gốc từ sản xuất nông
nghiệp, chất thải các nhà máy giấy, đường và dệt may. Cellulose không tan trong
nước và chỉ bị thuỷ phân khi đun nóng với kiềm hay acid hoặc bị thủy phân bởi các
enzyme cellulase (Trần Xuân Nghạch, 2005). Hiện nay, lượng phế, phụ phẩm nông
nghiệp cũng như chất thải từ các nhà máy đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi
trường.
Để giải quyết vấn đề trên, việc phân lập được các chủng vi sinh vật có hoạt tính
phân huỷ cellulose có ý nghĩa rất quan trọng trong việc phát triển các chế phẩm vi sinh
vật để xử lý ô nhiễm mơi trường. Từ u cầu đó, đề tài nghiên cứu“Phân lập và khảo
sát khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào cellulase ở một vài chủng vi khuẩn” đã
được tiến hành nhằm tạo nguồn vi sinh vật ban đầu cho các nghiên cứu ứng dụng sau
này.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu chung

Phân lập và sàng lọc một số chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme celulase
ngoại bào cao, trong đó tập trung vào đối tượng vi khuẩn.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
-

Phân lập được một số chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất cellulase ngoại bào.

-

Mơ tả đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn đã phân lập được.

-

Đánh giá được khả năng sản xuất enzyme ngoại bào bằng các kỹ thuật hóa sinh.

1


PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về cellulose và cellulase
2.1.1. Giới thiệu về cellulose
Cellulose là một polymer hữu cơ phổ biến nhất trong tự nhiên. Hằng năm một
lượng lớn sinh khối cellulose (1,5 x 1012 tấn) được tạo thành chủ yếu từ quá trình
quang hợp (Klemm D và cộng sự, 2002).
Cellulose được cấu tạo từ các gốc β-D glucopyranose được liên kết với nhau
bằng liên kết 1,4 glucoside. Có cơng thức cấu tạo là (C 6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n
trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên
vách tế bào thực vật (Đinh Văn Hùng, Trần Văn Chiến, 2007). Trong gỗ lá kim,
cellulose chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá rộng nó chiếm 43-52% thể tích.


1

Hình 2.1. Một số hình ảnh về cấu trúc của cellulase

2

1. Các mắt xích β-D-Glucose trong cellulose.
2. Hình ảnh ba chiều hợp chất cao phân tử Cellulose: Màu nâu - carbon, màu đỏ -oxy,
màu trắng – hydro.

2.2.2. Giới thiệu về cellulase
Các chất thải có nguồn gốc cellulose được vi sinh vật phân hủy bằng nhiều
enzyme khác nhau. Cellulase thủy phân cellulose (liên kết 1,4 – β- D – glucoside) tạo
ra sản phẩm chính là glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides.

2


Có 3 loại enzyme cellulose chính:
-

Cellobiohydrolase (CBH hoặc 1,4-β-D-glucan cellobioydrolase, EC 3.2.1.91):

Enzym này cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Khối lượng
phân tử của các enzyme thuộc nhóm này trong khoảng 53 - 75 kDa. Các enzyme này
khơng có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa
lý của chúng.
-

Endo-β-1,4-cellulase (EG hoặc endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase, EC


3.2.14) có khối lượng phân tử trong khoảng 42 – 49 kDa. Chúng hoạt động ở nhiệt độ
khá cao và tham gia phân giải liên kết β-1,4 glucosid trong cellulose trong lichenin và
β-D-glucan. Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose.
-

β-glucosidase (BG-EC 3.2.1.21): có khả năng hoạt động ở pH rất rộng (pH 4,4

– 4,8), khối lượng phân tử trong khoảng 50 – 98 kDa, pI = 8,4 và có thể hoạt động ở
nhiệt độ cao. β-glucosidase tham gia phân hủy cellobiose, tạo thành glucose (Nguyễn
Đức Lượng, 2004).
Enzyme thủy phân cellulose có thể được tách thành nhiều thành phần, chẳng
hạn như enzyme cellulase của vi sinh vật có thể bao gồm một hoặc nhiều CBH, một
hoặc nhiều EG và có thể có β-glucosidase. Hệ thống hồn chỉnh bao gồm CBH
celulase, EG và BG phối hợp để chuyển đổi cellulose thành glucose. Các enzyme exocellobiohydrolases và endocellulases cùng hoạt động để thủy phân cellulose thành các
đoạn ngắn oligosaccharides. Các oligosaccharides (chủ yếu là cellobiose) sau đó được
thủy phân để tạo ra glucose bằng β-glucosidase (Bguin P và Henrissat B, 1994).
Celulase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên,
trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một
số loại nấm men. Do ưu điểm về thời gian sinh trưởng, kích thước, hiệu suất sản sinh
enzyme nên vi sinh vật thường được sử dụng để sản xuất các chế phẩm enzyme.
Cellulase được sử dụng trong công nghiệp dệt (Gusakov AV và cộng sự, 2000;
Belghith H và cộng sự, 2001), trong chất tẩy rửa (Maurer KH, 1997; Kottwitz B và
Schambil F, 2005), ngành công nghiệp giấy (Buchert J và cộng sự, 1996), cải thiện
thức ăn chăn nuôi (Lewis GE và cộng sự, 1996), trong công nghiệp thực phẩm các

3


enzyme này chiếm một phần đáng kể của thị trường (Galante YM và cộng sự, 1998).

Sản xuất ethanol sinh học từ cellulose, hemicellulose và lignin (lignocellulosic) sẽ giải
quyết được mối quan tâm về tình trạng thiếu nhiên liệu hóa thạch, cũng như ơ nhiễm
khơng khí do đốt các ngun liệu hóa thạch. Đặc biệt là sử dụng cellulase và
hemicellulase để thủy phân lignocellulosic (Himmel ME và cộng sự, 1999; Zaldivar J
và cộng sự, 2001). Tuy nhiên việc sản xuất ethanol cũng cần chú ý đến hiệu quả kinh
tế (Sheehan J và Himmel M, 1999).
Sản xuất cellulase thương mại đã được thử nghiệm bằng cách nuôi cấy cùng lúc
trên môi trường rắn hoặc ni cấy chìm và ni cấy liên tục. Môi trường được sử dụng
trong nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase có chứa các nguồn cellulose khác
nhau (Person I và cộng sự, 1991; Domingues FC và cộng sự, 2000), hoặc
lignocellulosic (Doppelbauer R và cộng sự,1987; Reczey K và cộng sự, 1996), đặc biệt
trong lên men chất rắn.

Hình 2.2. Mơ hình enzym cellulase, được sinh tổng hợp bởi T. fusca, (PDB
1JS4)

4


Hình 2.3. Ba loại phản ứng xúc tác bởi cellulase
1. Cắt đứt sự tương tác khơng cộng hóa trị trong cấu trúc tinh thể của cellulose
(endocellulase). 2. Thủy phân của các sợi cellulose riêng rẽ để tạo thành các cấu trúc nhỏ hơn
(exocellulase). 3. Thủy phân của disaccharides và tetrasaccharides thành glucose (betaglucosidase).

2.2. Vi sinh vật sản xuất cellulase
Vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose chủ yếu là phân giải carbohydrate
thường không sử dụng protein hay lipid làm nguồn năng lượng cho sự sinh trưởng
(Lynd LR và cộng sự, 2002). Trong số các vi sinh vật phân giải cellulose đáng chú ý
nhất là vi khuẩn Cellulomonas cytophaga (xạ khuẩn). Hầu hết các loại nấm có thể sử
dụng nhiều carbohydrate khác ngoài cellulose (Poulsen OM & Petersen LW, 1988;

Rajoka MI & Malik KA, 1997), trong khi ở các loài sống trong điều kiện kỵ khí thì có
sự lựa chọn về nguồn carbohydrate, cellulose (Ng TK, & Zeikus JG, 1982; Thurston B
và cộng sự, 1993). Khả năng tiết protein ngoại bào lớn là đặc trưng của một số loại
nấm, đặc điểm này được khai thác để sản xuất các cellulase ngoại bào ở quy mô lớn.

5


Nấm Trichoderma reesei đã được sử dụng phổ biến để sản xuất cellulase ngoại bào
(Kumar R và cộng sự, 2008). Hầu hết các nghiên cứu về sinh vật phân giải cellulose
tập trung vào các loài nấm (Trichoderma, Humicola, Penicilium, Aspergillus,
Actinomucor),

vi

khuẩn

Pseudomonas,

Cellulomonas,

Actinomycetes

và

Streptomyces) (Bảng 2.1).
Trong một số loại nấm sử dụng cellulose làm nguồn carbon, chỉ có một vài
chủng có khả năng tiết ra phức hơp các enzyme cellulose có thể ứng dụng trong thực tế
để thuỷ phân cellulose. Bên cạnh T. reesei, một số lồi nấm khác như Penicillium,
Humicola và Aspergillus có khả năng sản xuất cellulase ngoại bào cao (Hayashida S

và cộng sự, 1988; Ong LG và cộng sự, 2004).

6


Bảng 2.1. Các vi sinh vật sử dụng trong sản xuất cellulose
Nhóm chính

Chi
Aspergillus

Lồi
A. niger
A. nidulans
A. oryzae

Nấm

Fusarium

(Tái tổ hợp)
F. solani

Humicola

F. oxysporum
H. insolens

Melanocarpus
Penicillium


H. grisea
M. albomyces
P. brasilianum
P. occitanis

Trichoderma

P. decumbans
T. reesei
T. longibrachiatum

Acidothermus

T. harzianum
A. cellulolyticus
Bacillus sp

Vi khuẩn

Clostridium

Bacillus subtilis
C. acetobutylicum

Pseudomonas
Rhodothermus
Cellulomonas

C. thremocellum

P. cellulosa
R. marinus
C. fimi
C.bioazotea

Streptomyces

C.uda
S. drozdowiczii
S. sp

Xạ khuẩn (Actinomycetes)
Thermononospora

S. lividans
T. fusca
T. curvata

2.3. Các ứng dụng của cellulase
Trong những thập kỷ trở lại đây, một số điều tra ban đầu cho thấy cellulose
được ứng dụng trong ngành công nghiệp thức ăn gia súc, thực phẩm, dệt may, chất tẩy
rửa và công nghiệp giấy (Xia L & Cen P, 1999). Với tình trạng thiếu ngun liệu hố

7


thạch hiện nay người ta đang quan tâm đến việc khai thác các nguồn sinh khối chứa
lignocellulose bằng sử dụng cellulase và các enzyme khác.
2.3.1. Chất tẩy rửa và công nghiệp dệt may
Cellulase, đặc biệt là EG III và CBH I, thường được bổ sung trong các chất tẩy

rửa, giũ hồ vải trong công nghiệp dệt may. Biến thể của EG III, đặc biệt từ T. reesei rất
thích hợp cho việc sử dụng trong chất tẩy rửa (Nielsen JB, 1994; Clarkson KA và
cộng sự, 2000). Cellulase có nguồn gốc từ Humicola có khả năng hoạt động dưới điều
kiện kiềm nhẹ, nhiệt độ cao do đó thường được bổ sung vào bột giặt (Mitchinson C &
Wendt DJ, 2001) và chất tẩy rửa (Uhlig H, 1998).
2.3.2. Công nghiệp giấy và bột giấy
Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, nguyên liệu ban đầu được nghiền
cơ học và xử lý hóa học để các sợi gỗ được tách riêng khỏi nhau chuyển thành bột giấy
chứa các sợi và bột mịn. Trong quy trình sản xuất giấy cần loại bỏ lignin khỏi bột giấy,
cịn cellulose thì được giữ lại. Phương pháp thơng thường là bổ sung dung dịch chlor
hoặc chlor diocide. Đây là một phương pháp tốn kém và thường gây ô nhiễm môi
trường do thành phần chlor tồn dư trong nước thải. Vì thế, trong những năm gần đây
giải pháp mới được đưa ra để thay thế phương pháp truyền thống là sử dụng các chế
phẩm enzyme trong đó có cellulase để xử lý bột giấy.
Cellulase thường được bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm thay đổi
nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng
lượng cho quá trình nghiền cơ học. Đồng thời việc xử lý cellulase trước khi xử lý hóa
chất nghiền bột hóa học sẽ phá vỡ lớp vỏ ngồi của gỗ, tăng khả năng khuếch tán của
hóa chất vào phía trong gỗ và hiệu quả khử lignin (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2004 và
Hồ Sỹ Tráng, 2006). Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy, cellulase được sử dụng để
tẩy mực in bám trên giấy. Kỹ thuật này đã mở ra triển vọng đầy hứa hẹn cho ngành
công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy tái sinh (Howard RL và cộng sự, 2003).
2.3.3. Trong công nghiệp thực phẩm

8


Trong công nghiệp thực phẩm, cellulase được sử dụng trong quá trình chiết và
lọc các loại nước ép trái cây, sản xuất mật hoa và súp đặc và trong chế biến dầu oliu
(Galante YM và cộng sự, 1998). Trong công nghệ sản xuất bia, cellulase được bổ sung

nhằm cải thiện sự tạo mạch nha của lúa mạch (Barbesgaard PO và cộng sự, 1984).
Trong công nghiệp sản xuất rượu vang, màu sắc rượu tạo đạt nhờ sử dụng enzyme
ngoại bào hemicellulase và cellulase (Galante YM và cộng sự, 1998). Cellulase còn
được sử dụng khai thác carotenoid trong sản xuất chất màu thực phẩm (Pajunen E,
1986).
2.3.4. Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi
Thức ăn gia súc, gia cầm được chế biến từ các loại ngũ cốc thường
chứa nhiều cellulose và glucan. Những thành phần này thường khơng được tiêu hóa
triệt để và làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày do đó chúng đã hạn chế sự hấp thu các
chất dinh dưỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật. Bổ sung cellulase
vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên, giải phóng
glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng hấp thu và chuyển
hóa thức ăn (Đặng Thị Thu và cộng sự, 2000).
Omogbenigun và cộng sự (2004) cho thấy, khi xử lý thức ăn cho lợn con 25
ngày tuổi bằng cách bổ sung tổ hợp chế phẩm cellulase và một số enzyme khác
(amylase, invertase, protease, phytase, xylanase) đã nâng cao khả năng tiêu hóa
so với đối chứng là khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme cụ thể như sau: khả năng
tiêu hóa tinh bột tăng 87-94%, các polysaccharide khác tăng 10-18%, phytate
tăng 59-70% (Omogbenigun OF và cộng sự, 2004).
Tiềm năng ứng dụng to lớn của các enzyme thuộc nhóm cellulase trong chăn
nuôi đã thu hút sự quan tâm của nhiều công ty chế biến thức ăn gia súc, gia
cầm. Một số chế phẩm như SSF của Mỹ hiện đang bán tại thị trường Việt Nam là tổ
hợp của 6 loại enzyme: β-cellulase (200 BGU/g), phytase (1000 PU/g), α-amylase
(30 FAU/g), pectinase (4000 AJDU/g), protease (700 HUT/g) và xylanase (100 XU/
g) (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn , 2006).

9


Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong chăn

ni. Chu Thị Thanh Bình và cộng sự (2002) đã nghiên cứu ứng dụng các chủng
nấm men trong chế biến bã thải từ hoa quả giàu chất xơ làm thức ăn cho gia súc
(Chu Thị Thanh Bình và cộng sự, 2002).
2.3.5. Nhiên liệu sinh học
Nghiên cứu sử dụng các chất thải có chứa lignocellulose để sản xuất nhiên liệu
sinh học đang được quan tâm. Các phế liệu có chứa lignocellulose là nguồn nguyên
liệu phong phú nhưng lại bị giới hạn do thiếu các yếu tố cần thiết như enzyme thủy
phân cellulose và các quy trình cơng nghệ. Một ứng dụng tiềm năng khác của cellulase
là việc chuyển đổi nguyên liệu cellulose thành glucose và các đường lên men
khác.Mặc dù các vi sinh vật sản xuất enzyme cellulase có khả năng chuyển đổi sinh
khối tạo thành rượu đã được nghiên cứu (Martin JW, 1978; Kundu S và cộng sự, 1983)
tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào thể hiện được hiệu quả khả thi về mặt kinh tế. Chiến
lược sử dụng hiện tại trong sản xuất ethanol sinh học từ nguồn lignocellulosic một quá
trình gồm nhiều bước nhằm loại bỏ phần dư lượng lignin và hemicellulase, xử lý
cellulase ở 500C thuỷ phân các dư lượng cellulose để tạo ra đường lên men, và cuối
cùng sử dụng lên men vi sinh vật để tạo ra cồn (Sudha Rani K và cộng sự, 1997). Việc
sử dụng các enzyme tinh khiết trong chuyển đổi sinh khối thành ethanol hoặc lên men
các sản phẩm hiện nay chưa đạt hiệu quả kinh tế do chi phí của các enzyme cellulase
thương mại cao, chiến lược hiệu quả vấn đang tiếp tục được nghiên cứu.
Ngoài những ứng dụng phổ biến, cellulase còn được sử dụng trong các công
thức để loại bỏ chất nhờn công nghiệp (Van Zessen E và cộng sự, 2003), nghiên cứu
tạo ra các thế hệ (Wiatr CL, 1990), tạo thể kháng khuẩn chitooligosaccharide có thể
được sử dụng trong bảo quản thực phẩm (Liu W & Zhu WM, 2000), tạo thuốc chống u
bướu (Wu GJ & Tsai GJ, 2004).
2.3.6. Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh
Việc sử dụng enzyme trong xử lý chất thải có ý nghĩa quan trọng trong bảo vệ
mơi trường. Ngồi ra các sản phẩm chuyển hóa từ chất thải có thể sử dụng cho nhiều

10



mục đích khác chẳng hạn như glucose, ethanol (bổ sung tài liệu tham khảo). Trong
những năm gần đây, các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme phân
hủy cellulose đã được ứng dụng để để xử lý rác thải sinh hoạt (bổ sung tài liệu tham
khảo)
Năm 1999, Nguyễn Lan Hương và cộng sự đã phân lập và tuyển chọn được
một số chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể ủ rác
thải đã rút ngắn được chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5-7 ngày. Nhiều chủng vi
khuẩn, xạ khuẩn và nấm đã được nghiên cứu và ứng dụng có hiệu quả trong q trình
xử lý rác thải ở Việt Nam (Nguyễn Lan Hương và cộng sự, 1999).
Nhiều chế phẩm vi sinh chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp cellulase đã
được nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải. Chẳng hạn chế phẩm Micromix 3
khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, giảm một nửa
thời gian lên men so với đối chứng. Đồng thời, lượng mùn tạo thành khi xử lý rác
bằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29% và các chất dinh dưỡng cao hơn 10% so
với đối chứng. Sản phẩm của quá trình xử lý rác thải được phối trộn và bổ sung
thêm một số vi sinh vật có ích cố định đạm tạo thành phân bón vi sinh, được sử
dụng rộng rãi trong nơng nghiệp đã góp phần nâng cao năng suất cây trồng, giảm
thiểu được nguồn và nguy cơ gây ô nhiễm mơi trường (Lý Kim Bảng và cộng sự,
1999).
Ngồi ra, những nghiên cứu ảnh hưởng của cellulase đến nấm gây bệnh
cây trồng như cellulase của Trichoderma harzianum đã được áp dụng để sản xuất
thuốc bảo vệ thực vật sinh học (Cao Cường, Nguyễn Đức Lượng, 2003).

2.4. Tình hình nghiên cứu
2.4.1. Nghiên cứu trong nước

11



Năm 1999, Tăng Thị Chính và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện
lên men và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến khả năng sinh tổng hợp cellulase
của một số chủng vi khuẩn ưa nhiệt được phân lập từ bể ủ rác thải, nhằm tìm ra điều
kiện tối ưu nhất cho khả năng sinh tổng hợp cellulase, ứng dụng vào việc xử lý rác
thải chứa nhiều cellulose. Kết quả cho thấy, các chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả
năng chịu được nhiệt độ 80oC, nhiệt độ lên men tối ưu từ 45oC đến 55oC, pH mơi
trường ban đầu thích hợp nhất khoảng 8,0. Nguồn carbon tốt nhất cho sinh trưởng và
sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn nghiên cứu là glucose và CMC, nguồn
nitrogen là peptone và cao nấm men. Các tác giả cũng đã nghiên cứu động học của quá
trình sinh tổng hợp cellulase và kết quả cho thấy, thời gian tích lũy cao nhất ở 48h lên
men (Tăng Thị Chính và cộng sự, 1999).
Nguyễn Đức Lượng và cộngsự đã tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
cellulase của Actinomyces griseus. Qua nghiên cứu các tác giả thấy rằng khả năng sinh
tổng hợp cellulase của A. griseus rất cao và tối ưu ở 58oC, pH ban đầu là 6,7, độ ẩm
ban đầu là 55% với thời gian nuôi cấy là 72h. Nguồn lignocellulose thích hợp là bã
mía hoặc mùn cưa (Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh, 1990). Phạm Thị Ngọc
Lan và cộng sự cũng đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn được một số chủng xạ
khuẩn ưa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng phân giải cellulose mạnh.
Trong số 195 chủng xạ khuẩn nghiên cứu thì các chủng xạ khuẩn phân lập được từ các
mẫu rơm mục và đất chân đống rơm có khả năng phân giải cellulose và CMC mạnh
nhất (Phạm Thị Ngọc Lan và cộng sự, 1999).
Trong số các loài vi sinh vật, nấm sợi là một trong những đối tượng có khả
năng sinh tổng hợp cellulase cao. Việc tìm ra các chủng nấm sợi có khả năng phân hủy
cellulose cao và tối ưu điều kiện sinh tổng hợp cellulase của chúng đang là vấn đề
được nhiều tác giả quan tâm. Năm 1999, Đặng Minh Hằng đã nghiên cứu tuyển chọn
được hai chủng nấm sợi có khả năng phân giải cellulose cao. Tác giả cũng đã nghiên
cứu và tìm ra được một số điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp cellulase của
hai chủng nấm này (Đặng Minh Hằng , 1999). Hoàng Quốc Khánh và cs đã nghiên
cứu khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm của cellulase từ chủng A. niger NRRL-363.
Qua nghiên cứu, tác giả đã tìm ra được một số thơng tin và điều kiện cơ bản cho sự


12


tổng hợp cellulase của chủng này trên môi trường trấu xay và một số chất thải
công nghiệp như mật rỉ đường (Hoàng Quốc Khánh và cộng sự, 2003).
Bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải cellulose
cao, Lý Kim Bảng và cộng sự đã xây dựng được quy trình cơng nghệ sản xuất chế
phẩm Micromix 3 bổ sung vào bể ủ rác thải. Nghiên cứu cho thấy, khi chế phẩm này
được bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn được 15 ngày ủ, một nửa thời
gian lên men so với bể đối chứng bổ sung chế phẩm VSV-xen. Lượng mùn tạo thành
của bể ủ bổ sung chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29%, và các chất dinh dưỡng cao hơn
10% so với bể đối chứng (Lý Kim Bảng và cộng sự, 1999).
2.4.2. Nghiên cứu trên thế giới
Nuôi cấy vi khuẩn trên mơi trường thạch có thể thủy phân CMC (Carbomethyl
cellulose), trấu, bã mía, và giấy vụn, trong đó CMC cho kết quả thủy phân tốt hơn.
Hiệu suất thủy phân CMC tăng lên khi nồng độ CMC ngày càng tăng từ 5 – 50 g/l.
Khi nồng độ CMC là 10g/l thì sản lượng đường khử và tốc độ sản sinh đường khử chỉ
đạt được lần lượt là 5,531mg/l và 92,9 mg/l/h. Vả lại, việc phân lập vi khuẩn sinh H 2
(mà chủ yếu là dòng Clostridium) đã được sử dụng để biến đổi sự thủy phân cellulose
thành năng lượng H2. Với nồng độ đường khử ban đầu là 0,8 g/l, sản lượng và số
lượng H2 lần lượt khoảng 23,8ml/l và 1,21 mmolH2/g đường khử (0,097 mmol H2/g
cellulose) (Yung-Chung Lo và cộng sự, 2008).
Clostridium josui sp. nov. là vi khuẩn Gram dương, hình que, kị khí bắt
buộc, ưa ấm phát triển tốt nhất ở 45 oC và pH = 7,0, là vi khuẩn tạo bào tử hình trịn
được tìm thấy trong phân. Dịng này thủy phân cellulose nguyên thủy, trấu, và những
nguyên liệu có chứa cellulose khác. Đây là dịng vi khuẩn sản xuất ethanol, acetate,
butyrate, hydrogen, CO2 trong suốt quá trình phát triển trên môi trường cellulose và
cellobiose (Jiraporn Sukhumavasi và cộng sự, 1988).
Chín dịng vi khuẩn phân hủy cellulose được phân lập từ trong nguồn đất, trong

đó có một dịng là Cellolorimicrobium cellulans. Hoạt tính của enzim thủy phân
cellulose (gồm cellulase và xylanase) được sản xuất từ những chủng này hiện diện chính là
những enzim ngoại bào và những sản phẩm enzyme hoạt động độc lập với mơi trường phát
triển có celulose (xylan, trấu và cám) (Yung- Chung Lo và cộng sự, 2009).

13