VIỆNHÀNLÂMKHOAHỌCVÀ CÔNGNGHỆVIỆTNAM

VIỆNCÔNGNGHỆSINHHỌC

ĐỖHẢI LANI LAN

ẾTKẾVÀCHUYỂNGEN
AGPoptTỔNGHỢPNHÂNTẠO
VÀOCÂYSẮN(ManihotesculentaCrantz)

LUẬNNÁNTIẾNNSĨSINHHỌCC

HÀNỘI,2017I,2017


VIỆNNHÀNLÂMKHOAHỌC VÀCÔNGNGHỆ VIỆTC VÀCÔNGNGHỆN VIỆNTNAM
VIỆNNCÔNGNGHỆNSINHHỌCC

ĐỗHải Lan

NGHIÊNCỨUTHIẾTKẾVÀCHUYỂNGEN
AGPoptTỔNGHỢPNHÂNTẠO
VÀOCÂYSẮN(ManihotesculentaCrantz)

Chuyênngành: Sinh lýhọccthựccvậtt
Mãsố:62420112
LUẬNNÁNTIẾNNSĨSINHHỌCC

NGƯỜIIHƯỚNGNGDẪN KHOAN KHOAHỌC VÀCƠNGNGHỆ VIỆTC:

1.GS.TS.LêTrầnBìnhnBình

ViệnnC ơ n g nghện sinhhọcc
2.PGS.TS.LêVănSơnn
ViệnnC ơ n g nghện sinhhọcc

HàNội,i,2017


1

LỜICẢMƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình và PGS. TS.
LêVăn Sơn, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
ViệtNam là người thầy tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi
trongsuốtqtrìnhnghiêncứuthựchiệnvàhồnthànhluậnánnày.
Tơi xin cảm ơn lãnh đạo và tập thể cán bộ Phịng Cơng nghệ tế bào thực
vật,Phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Phịng Thí nghiệm trọng diểm cơng nghệ
gen,Ban Lãnh đạo, PhịngQuản lý tổng hợp, bộp h ậ n Q u ả n l ý đ à o t ạ o
s a u đ ạ i h ọ c , Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi về mọimặt, hỗ trợ tôi thực hiện các thủ tục cần thiết để tơi có thể hồn
thành chương trìnhhọctậpvànghiêncứucủaNghiêncứusinh.
Tơi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của TS. Hoàng Văn An
vàNCS. Võ Thị Xuân Kiều, College of Life Science, Kyung Hee University,
HànQuốctrongqtrìnhtơi thựchiệnluậnán.
Tơi nhận được sự tạo điều kiện giúp đỡ về mọi mặt từ Ban Giám hiệu,
BanChủ nhiệm khoa Sinh - Hóa, Phịng Tổ chức cán bộ, Phòng Đào tạo sau đại
học,Trường Đại học Tây Bắc trong suốt q trình thực hiện luận án. Tơi xin trân
trọngcảmơn.
Tơi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân, đồng
nghiệpđãlnđộngviênvàkhíchlệtơitrongthờigianqua.
HàNội,t h á n g 11năm2 0 1 7

Tácgiảluậnán

ĐỗHảiLan


LỜICAMĐOAN
Tơixincamđoan:
Đây là cơng trình nghiên cứu của tơi, được thực hiện dưới sự hướng
dẫnkhoahọccủaGS.TS.LêTrầnBìnhvàPGS.TS.LêVănSơn.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần
đãđược công bố trêncáctạp chíkhoa học chuyênngànhvớis ự đ ồ n g ý v à
c h o phép của các đồng tác giả khác. Phần cịn lại chưa được ai cơng bố trong
bất kỳcơngtrìnhnào khác.
HàNội,ngày

tháng11n ă m 2 0 1 7
Tácgiảluậnán

ĐỗHảiLan


MỤCLỤC
Nộidung

Trang

MỞĐẦU .................................................................................................

1


CHƢƠNG 1.TỔNGQUANVẤNĐỀNGHIÊNCỨU..........................

5

1.1.Giớithiệuchungvềcâysắn..................................................................

5

1.1.1.Đặc điểmthựcvậthọc....................................................................

5

1.1.2.Vaitrịvàgiátrịkinhtế..................................................................

6

1.1.3.Tìnhhìnhpháttriểncâysắn ...........................................................

8

1.2.Nghiêncứuni cấyinvitrovàhệ thốngchuyểngenởcâysắn...

10

1.2.1.Nghiêncứuchọn tạogiốngsắntheo phươngpháp truyềnthống....

10

1.2.2.Nghiêncứuni cấyinvitrovàtáisinh cây...................................


11

1.2.3.Cácnghiêncứuquytrìnhchuyểngen ở câysắn.............................

15

1.2.4.Tạocâysắnchuyểngentăngcườnghàmlượngtinhbột.................

18

1.3.Tinh bộtvàqtrìnhtạotinhbộtởcâycócủ..............................

23

1.3.1.Giớithiệuvềtinhbột......................................................................

23

1.3.2.Cơ chếtổnghợp tinhbột................................................................

24

1.3.3.Cácenzimvàgenliênquantíchlũytinhbột.................................

26

1.4.Gentổnghợpbiểuhiệntrongthựcvật.........................................

31


CHƢƠNG2.VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU......

35

2.1.Vậtliệunghiêncứu..........................................................................

35

2.2.Phƣơngphápnghiêncứu................................................................

36

2.2.1.Cácphươngphápliênquanđếnnicấymơ,táisinhcâysắnvà
chuyểngen.....................................................................................

37

2.2.2.Cácphươngphápliênquanđếntổnghợpgenvàthiếtkếvector
manggennhântạomãhóaenzymeAGPasephụcvụchochuyển
gen..........................................................................................
2.2.3.C á c phương phápliênquanđế n phânt í c h c á c d ò n g c â y chuyể
n

42
49


gen..................................................................................................
2.2.4.Phươngpháptínhtốnvàxửlýsốliệu .....................................


52

CHƢƠNG3.KẾTQUẢNGHIÊNCỨU........................................

53

3.1.Kếtquảxây dựngquy trìnhni cấyvàtáisinhcâysắn............

53

3.1.1.Kếtquảđánhgiá khảnăngtạophơi soma...................................

54

3.1.2.Kết quảđánhgiá
khảnăngtáisinhcủaphơisoma. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.Kếtquảtốiƣuhóaquytrìnhchuyểngenchỉthịgusvàocâysắn

58
62

3.2.1.TốiưuchủngvikhuẩnA.tumefaciensvàvectorchuyểngenvào
câysắn ............................................................................................

62

3.2.2.TốiưuvậtliệuvàphươngpháplâynhiễmvikhuẩnA.tumefaciens
vàocâysắn..................................................................................................

64


3.2.3.TốiưuthờiđiểmlâynhiễmvàmậtđộvikhuẩnA.tumefaciens
chochuyển genvàomảnhlá mầmcâysắn KM94........................
3.2.4.Tốiư u n ồ n g đ ộ ( A S ) v à t h ờ i g i a n l â y n h i ễ m v i k h u
ẩnA.

66
66

tumefaciens....................................................................................
3.2.5.Tốiưuthờigianđồngnuôicấy. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
..........
3.2.6.Tốiưuloạikhángsinhvàngưỡngchọnlọc.............................
69
3.2.7.PhântíchcâysắnKM94/pCB-gus...........................................

72

3.3.Kếtquảthiếtkếvectormang gen mãhóaAGPase......................

73

3.3.1.Tổnghợp gennhântạo mãhóaAGPase........................................

73

3.3.2.Thiết kếvectortáitổhợpchứacấutrúcgenAGPopt....................

77


3.3.3.Tạoc h ủ n g v i k h u ẩ n A . t u m e f a c i e n s t á i t ổ h ợ p c
hứavector

79

pBI121/AGPoptđãthiếtkế..............................................................
3.3.4.Đánhgiásự biểu hiệncủagenAGPopttrongcâythuốc lá.........

80

3.4.ChuyểngenAGPoptvàocâysắn...............................................

88

3.4.1.B i ế n n ạ p g e n A G P o p t v à o c â y s ắ n K M 9 4 n h ờ A . t u m e f a
ciens

88

CV58/pGV2260...............................................................................
3.4.2.PhântíchcâysắnchuyểngenKM94/AGPopt............................

90

CHƢƠNG4.BÀNLUẬNKẾTQUẢNGHIÊNCỨU.......................

93


4.1.Nuôi cấy mô vàtáisinhcây sắnphụcvụchuyểngen..................


93

4.2.Chuyểngenchỉthịchọnlọcgusvàocâysắn..................................

99

4.3.T ổ n g h ợ p g e n n h â n t ạ o A G P o p t m ã h ó a e n z y m e A G P a s
evà

103

thiếtkếvectorpBI121/AGPopt......................................................
4.4.ChuyểngenAGPoptvàocâysắn KM94 ......................................

108

KẾTLUẬNVÀKIẾNNGHỊ................................................................

111

DANHMỤCCÁCCƠNGTRÌNHCƠNGBỐKẾTQUẢNGHIÊN
CỨUCỦAĐỀTÀILUẬNÁN.......................................................

112

SUMMARY.............................................................................................

113


TÀILIỆUTHAMKHẢO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
........................
PHỤLỤC.................................................................................................

117


DANHMỤCBẢNG
STT
Bảng1.1.

Tênbảng

Trang

Danhmục5loạicâychiếmkimngạchxuấtkhẩucaotrong
ngànhnơngnghiệp 2015.......................................................

7

Bảng1.2.

Diệntích,năngsuất,sảnlượngsắnnăm2016.....................

9

Bảng3.1.

Ảnhh ư ở n g c ủ a 2 , 4 D , p i c l o r a m và N A A l ê n t ỉ l ệ t ạ o p h ô i
somatừ6loại vậtliệucủa2giống sắnKM140vàKM94....


Bảng3.2.

56

Ảnhh ư ở n g c ủ a n ồ n g đ ộ p i c l o r a m t ớ i s ự h ì n h t h à n h
p h ô i somat ừ đ ỉ n h c h ồ i v à l á n o n c ủ a h a i g i ố n g s ắ n K M
94và

Bảng3.3.

58

KM140nuôicấyinvitro................................................
Ảnh hưởng củaBAPvàIBAlên khảnăngtạochồicủaphôi
somat ừ l á n o n v à đ ỉ n h c h ồ i c ủ a 2 g i ố n g s ắ n K M 1 4 0 v
à KM94............................................................................

Bảng3.4.

Ảnhh ư ở n g c ủ a n ồ n g đ ộ B A P đ ế n q u á t r ì n h t ạ o c h ồ i
từ

Bảng3.5.

phôisomasau4tuầnnuôicấy............................................
Khảnăngtạorễcủa chồi....................................................

Bảng3.6.


ẢnhhưởngcủacácchủngvikhuẩnA.tumefaciens,vecto

59
60
61

rvàloạivậtliệulâynhiễmđếnhiệuquảhiệuquảchuyểngen
gusvàocâysắnKM94 vàKM140.......................................
Bảng3.7.

63

Ảnhhưởngcủaphươngphápvàcácloạivậtliệulâynhiễmđếnh
iệuquảchuyểngengusvàocủacâysắnKM94và
KM140..............................................................................

Bảng3.8.

Ảnhhưởngcủamậtđộvikhuẩn vàthờiđiểmlâynhiễmđến
hiệuquảchuyểngengusvàolámầmcâysắnKM94..........

Bảng3.9.

67

Ảnhhưởngcủathờigianđồngnuôicấy vànồngđộASđến
hiệuquảchuyểngengusvàolámầmcâysắnKM94..........

Bảng3.11.


66

Ảnhhưởng củanồng độASvàthời gianlâynhiễmđếnhiệu
quảchuyểngengusvàolámầmcâysắnKM94..................

Bảng3.10.

65

68

Ảnhhưởngngưỡngchọnlọccủakanamycin,neomycinvà 70


paromomycinlênhiệuquảchuyểngengusvàolámầmcây
sắnKM94..........................................................................
Bảng3.12. HiệuquảchuyểngenAGPoptvàocâythuốcláK326.........

81

Bảng3.13. Hàm lượng tinh bột trong lá của cây thuốc lá
K326/pBI121/AGPopt.........................................................
Bảng3.14. Khản ă n g t ạ o t ạ o c h ồ i v à r a r ễ c ủ a c á c m ẫ u s ắ n K
M94
/AGPopt.............................................................................

87
90



DANHMỤCHÌNH
STT

Tênhình

Trang

Hình1.1.

Diệntíchtrồngsắn phântheovùngkinhtế..........................

8

Hình1.2.

Cơcấusửdụngsắnở ViệtNam...........................................

10

Hình1.3.

Sơđồcácbướctái sinhởcâysắn.....................................

12

Hình1.4.

Sơđồbốnhệthốngchuyểngenvàocâysắn..........................

16


Hình1.5.

Cácphảnứng sinhtổnghợptinhbột.....................................

26

Hình1.6.

Cácenzimthamgiasinhtổnghợptinhbột............................

19

Hình1.7.

CấutrúccủaenzimAGPase...................................................

24

Hình2.1.

Sơđồthínghiệm....................................................................

36

Hình2.2.

Sơđồcác bướcthiếtkếvectorpBI121/AGPopt...................

42


Hình2.3.

SơđồtổnghợpvectorpBI121/AGPopt...............................

47

Hình2.4.

Sơđồcácbước táchchiếtenzimAGPase............................

51

Hình3.1.

Hìnhảnhminhhọacácbướcchuẩnbị,tạovậtliệukhởiđầu
phụcvụtái sinhcâysắn.........................................................

53

Hình3.2.

Cácloạivậtliệuchonicấymơvàtáisinhcâysắn...........

54

Hình3.3.

Hìnhảnhmẫuqua cácgiaiđoạntái sinhcâysắnkhácnhau


62

Hình3.4.

KếtquảnhuộmX-gluc vớicácloạivật liệu lâynhiễm.......

64

Hình3.5.

Sốl ư ợ n g c â y KM94/pCBgusđ ư ợ c t ạ o t h à n h t r ê n m ơ i

Hình3.6.

trườngchọnlọc vớicáckhángsinhcónồngđộkhácnhau...
Kếtquảđiệndisản phẩ m PCRnhâ n genn p t I I từ các dịng
sắnchuyển gen...............................................................

Hình3.7.

73

Kết quảsosánhtrình tự nucleotidecủa genAGPoptvàglgC
ởE.coliK12..................................................................

Hình3.8.

72

75


Hình3.8.Kếtquảsosánhtrìnhtựproteinsuydiễntừg e n
AGPoptv ớ i glgC(E.coliK12).........................................

76

Hình3.9.

Sơđồcấutrúcgen AGPopttổnghợpnhân tạo......................

77

Hình3.10.

Kếtq u ả đ i ệ n d i s ả n p h ẩ m p h ả n ứ n g c ắ t v e c t o r p B I 1 2 1 v
à
78
pUCIDT/AGPoptbằngXbaIvàSacI................................


Hình3.11. KếtquảđiệndisảnphẩmtinhsạchvectorpBI121vàAGPopt(A);
điện

di

sản

phẩm

colony-PCR


genAGPoptvớicặpmồiđặchiệuG336F/G336KDELRtừve
79

ctor
pBI121/AGPopt(B)..........................................................
Hình3.12. KếtquảđiệndisảnphẩmcolonyPCRgenAGPoptvớicặpmồiđặchiệuG336FG336KDELR......
..............................
quả
Hình3.13. Kết

sau

79

khibiếnnạp

vectorpBI121/AGPoptvàoA.tumefaciensvà điệ n dis ả n phẩ
mcolonyPCRge nA G P op t từcácdịngkhuẩnlạcA.tumefaciensCV5

80

8/
pGV2260.........................................................................
Hình3.14. HìnhảnhminhhọamộtsốbướcchuyểngenAGPoptbằng
A.tumefaciens CV58/PGV2260vàocâythuốclá................

81

Hình3.15. KếtquảđiệndisảnphẩmPCRgenAGPoptcácdịngthuốclá

chuyểngen..............................................................................
Hình3.16. Kếtq u ả l a i S o u t h e r n c á c m ẫ u t h u ố c l á
c h u y ể n g e n

82
83

AGPopt...........................................................................
Hình3.17. KếtquảlaiWesternkiểmtrasựbiểuhiệncủagenAGPopt
trongcácdịngthuốclá manggenAGPopt..........................
Hình3.18. Hoạtt í n h e n z i m AGPaset r o n g l á c á c d ò n g t h u ố c l á m a n
g
genAGPoptvàdịngcâykhơngchuyểngen..........................
Hình3.19. Hìnhả n h m i n h h ọ a k ế t q u ả t á i s i n h c â y t ừ p h ô i s o
ma

85
86

89

chuyểngenA G P o p t củagiốngsắnKM94..........................
Hình3.20. Kếtquả điệndisảnphẩmPCRnhân gen mã hóanptIItừ các
dịngcâysắnKM94chuyểngen............................................

91

Hình3.21. KếtquảđiệndisảnphẩmPCRgenAGPoptởcácdịngcâysắnK
M94chuyểngenAGPoptbằngcặpmồiđặchiệu
G336F/G336KDELR......................................................


92


DANHMỤC CÁC TỪVÀCHỮ VIẾTTẮT

Viếttắt

Viếtđầyđủ

2,4D

2,4-Dichlorophenoxyaceticacid

AM

Apical meristem

AS

Acetosyringone(3,5-dimethoxy-4-hydrroxyacetophenone)

BAP

6-benzylaminopurin

bp

basepair


CaMV

Cauliflowermosaic virus

CBM

CupressusBasalMedium

CIM

Callusinduction medium

CMML

CassavamaturationmediumbyLietal.(1996)

COM

Callusorganogenicmedium

DNA

Deoxyribonucleicacid

dNTP

deoxyribonucleotidetriphosphate

EDTA


Ethylenediaminnetetraaceticacid

FEC

Friableembryogeniccallus

gus

β-1,4-glucuronidase

ILL

Immatureleaflobe

kb

Kilobase

LB

Luriabertani

LUC

Luciferase

MS

MurashigeandSkoogmedium


NAA

1-naphthaleneaceticacid

nptII

neomycinphosphotransferaseII

OD

Opticaldensity-Mậtđộquang

PCR

Polymerase chainreaction

RNA

Ribonucleicacid

SCV

Stablecell volume

TPT

Triosephosphate/phosphatetranslocator


v/p


Vòng/phút

WT

Wildtype

YEB

YeastExtractBeef


1

MỞĐẦU
1. Tínhcấpthiết của đềtài
Cây sắn (Manihot esculentaCrantz) là cây có củ được trồng ở vùng cận
nhiệtđới của Châu Phi, Châu Á và Châu Mỹ, đáp ứng nhu cầu lương thực cho 800
triệungười (Paul et al., 2016). Củ sắn có hàm lượng chất khơ chiếm 30 - 60%
(FAO,2013) trong đó 80% là tinh bột, được sử dụng chủ yếu làm lương thực, thức
ăn chănnuôi,côngnghiệptinhbột,đường,nhiênliệusinhhọc(Abraham, 1996). Sản phẩmtừ sắn đã trở
thành mặt hàng xuất khẩu có giá trị ở nước ta, đạt kim ngạch xuất khẩu1,32tỷUSDtrong
năm2015.Trongtầmnhìnchiếnlượcđếnnăm2020,BộNơngnghiệp và Phát triển nơng thơn (Bộ NN và
PTNT) đã xếp cây sắn cùng với lúa vàngô đượcưu tiênpháttriển,do vậy, diện tích
trồngsắnđếnnay đã đạt hơn570nghìn ha, tuy nhiên, năng suất sắn của Việt Nam chỉ
đạt 19,15 tấn ha ở mức trungbìnhcủathếgiới(BộNNvàPTNT,2016).
Để phát triển cây sắn bền vững, cần thiết phải cải tạo giống sắn nhằm
khôngchỉ thu được lợi nhuận cao mà cịn duy trì được độ phì nhiêu của đất. Hiện
nay,trong côngtác chọntạo giống cây trồng, công nghệ gencó ứng dụngc ơ n g
n g h ệ nuôi cấy mô, tế bào đã trở thành công cụ hiệu quả để cải biến di truyền của

nhữngcây có hạn chế trong sinh sản hữu tính và được nhân giống vơ tính là chủ yếu
nhưcâysắn.Trênthếgiới,nghiêncứutạocâysắnchuyểngenđãđượcbắtđầutừthập
kỷ90củathếkỷtrướcvàđếnnayđãcónhiềuthànhtựu(Beeching,2013),đặcbiệttrong hướng cải tiến chất lượng
củ như giảm hàm lượng cyanogen (Fregene, 2002;Taylor et al., 2004), giảm tỷ lệ
amylose trong tinh bột (Fregene, 2002), tăng hàmlượng protein, β-caroten (Morillo
et al., 2012; Ovalle et al., 2016), sắt, vitamin(Fregene, 2002; Taylor et al., 2004;
Sayre et al., 2011; Li et al., 2015; Narayananetal.,2016),tăngtinhbột(Ihemereetal.,2006)…Việcứng
dụngcôngnghệchuyểngen nhằm tác động vào các gen tham gia quá trình tổng hợp thủy
phân tinh bột đểtăng khả năng tích lũy tinh bột ở cơ quan dự trữ hướng đến nâng
cao

năng

suất

câycócủ

nghiêncứuđúngđắnvàđangthuhút

nóichung

và

câysắnnóiriênglà

hướng


đượcsựquantâmcủanhiềunhànghiêncứu.
Trong sinh tổng hợp tinh bột, ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase)

làenzim điều hồ q trình tổng hợp tinh bột ở bước chuyển glucose-1phosphatethànhA D P glucose,nguyênliệuđểtạothànhtinhbột(Buchananetal.,2002
) . Trong quá trình nghiên cứu, người ta đã phát hiện ra AGPase là sản phẩm đơn gencủa genglgCcủa vi
khuẩnE.coli, có hoạt tính cao hơn hàng trăm lần so với ở thựcvật (Iglesias et al.,
1993).Khi AGPaseE. colimang đột biến điểm G336D thay thếglycin ở vị trí 336
bằng axit aspartic có thể hoạt động hiệu quả mà khơng cần chấthoạthóafructose1,6-bisphosphate,cóáilựccaohơnvớicơchất(ATPvàGlucose-1phosphate)vàgiảmáilựcvớichấtứcchếAMP(Ihemereetal.,2006).Vì vậy, ni cấy
mơ tái sinh cây sắn, tổng hợp gen nhân tạoAGPoptmã hóaAGPase với mã di truyền phù hợp với
thực vật nhưng có ưu điểm của AGPase ở vikhuẩn và mang đột biến mong muốn,
đánh giá sự biểu hiện của gen tổng hợp trêncây mơ hình đóng vai trị vơ cùng quan
trọng trong chuyển gen tổng hợp nhân tạovào cây sắn góp phần tạo tiền đề cho cải
biến năng suất và chất lượng một số giốngsắnđangđượctrồngphổbiếnởnướcta.
Vớinhữnglídotrên,chúngtơilựachọnđềtài:―NghiêncứuthiếtếvchuyểngenAGPopttổng
hợpnhântạov ocâysắn( Manihote s c u l e n t a Crantz)‖.
2. Mụctiêunghiêncứu
Thiết kế và đánh giá hoạt động trên cây mô hình của vector mang gen mã
hóaAGPase đã được tối ưu khả năng biểu hiện trong thực vật(AGPopt)và triển
khaichuyển genAGPoptvào cây sắn thơng qua qui trình tái sinh và chuyển gen
vàogiốngsắnđangđượccanhtáctạiViệtNam.
3. Phạmvinghiêncứu
Về sinh lý học thực vật nghiên cứu hoàn thiện các điều kiện nuôi cấy mô
tếbào, điều kiện tạo phôi soma và tái sinh cây từ phôi soma phục việc chuyển gen
ởcâysắn.


Về sinh học phân tử tập trung khai thác nguồn dữ liệu gen liên quan
đếnAGPase, đề xuất tối ưu hóa mã di truyền cho phù hợp với thực vật và bổ sung
độtbiếnvàotrìnhtự gennhântạođểgiatănghiệuquảsinhtổnghợptinhbột.
Về kỹ thuật di truyền tập trung thiết kế vector chuyển gen mang gen tổng
hợpnhân tạo, tiến hành kiểm tra hoạt động của vector và gen chuyển trên đối
tượngthuốclá mơ hình, đồngthời hồ nthiệnqui trình chuyểngen và tiếnhành c
huyển genởcâysắn.

4. Nộidungnghiêncứu
(1) Nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh cây sắn thơng qua phương pháp
tạophơisoma.
(2) NghiêncứutốiưuhóaquytrìnhchuyểngengusvàocâysắnthơngquavikhuẩnA
.tumerfaciens.
(3) Nghiênc ứ u t h i ế t k ế c ấ u t r ú c , v e c t o r m a n g g e n A G P o p t v à đ á n h g i
á s ự biểuhiệncủa genAGPopttrêncâythuốclá.
(4) Nghiên cứuchuyển genAGPoptvàocâysắn.
5. Đónggópmớicủaluậnán
Lần đầu tiên quy trình ni cấy mơ, tái sinh qua phơi soma trên cây sắn ở
ViệtNamđượcnghiêncứuhồnthiện.
Gen mã hóa AGPase ở vi khuẩnE. colicó hoạt tính xúc tác tạo ngun liệucho
tổng hợp tinh bột được cải biến phù hợp biểu hiện trong hệ thống thực vật, tạođột
biến (AGPopt) nâng cao hoạt tính enzim và được chuyển vào vector biểu
hiệnthựcvậtthíchhợpphụcvụcơngtácchuyểngen.
Quy trình chuyển gen chỉ thịgusđã được xây dựng thành công trên cây
sắnKM94thơngquavikhuẩnA.tumefaciens.
Bước đầu xác định sự có mặt của gen nhân tạoAGPoptmã hóa AGPase
trongcâysắn KM94.
Ýnghĩah o a h ọ c vt h ự c tiễn
LuậnánlàcơngtrìnhđầutiênởViệtNamcơngbốquytrìnhtáisinhinvitro
thơngquaphơisoma của mộtsốgiốngs ắn hiệ n đangđượccanhtácởViệt Nam.


Các kết quả đạt được trong nghiên cứu này là cơ sở cho các ứng dụng nhân
nhanhcác giống sắn mới chất lượng, bảo tồn nguồn gen có giá trị cũng như phục vụ
cơngtácchuyểngen.
Quy trình chuyển genchỉ thịgusvào cây sắnt h ô n g q u a A. tumefacienslà
cơsở khoa học để cải tiến giống sắn; đồng thời đây là mô hình để nghiên cứu
chứcnănggenởcâytrồng.

Kết quả biến đổi, tổng hợp nhân tạo gen mã hóa AGPase (AGPopt), thiết
kếvector biểu hiện thực vật và chuyển gen này vào cây thuốc lá là cơ sở khoa học
choviệctạoracácgiốngsắncaosản.
Bước đầu xác định được sự có mặt của genAGPopttrong cây sắn chuyển
gen,làcơsởchocácxácđịnhtiếptheovềbiểuhiệncủagenAGPopttrongcâysắn.


CHƢƠNG1
TỔNGQUANVẤNĐỀNGHIÊNCỨU
1.1. Giớithiệuchungvềcâysắn
1.1.1. Đặcđiểmthựcvậthọc
Câysắn(ManihotesculentaCrantz)
(ITIS,2012),thuộclồiManihotesculenta,chiManihot,tơngManihoteae,phânhọC r o t
o n o i d e a e , h ọ Euphorbiaceae,b ộ M a l p i g h i a l e s ( t ê n k h á c : k h o a i m ì ,
c a s s a v a , t a p i o c a . . . ) . T r o n g chiM a n i h o t c ó k h o ả n g 9 8 l o à i n h ư n g
c h ỉ c ó M a n i h o t e s c u l e n t a C r a n t z l à l o à i đóngvaitrịquantrọngtrongnơ
ngnghiệp(O EC D , 2014).
Cây sắn có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới của châu Mỹ La tinh và được
trồngcách đây khoảng 5.000 năm. Trung tâm phát sinh cây sắn được giả thiết tại
vùngĐông Bắc của Brazil thuộc lưu vực sông Amazon (OECD, 2014). Theo Hoàng
Kimvà Phạm Văn Biên (1995), cây sắn được du nhập vàoViệt Namkhoảng giữa thế
kỷXVIII, hiện chưa có tài liệu chắc chắn về nơi trồng và năm trồng đầu tiên. Hiện
tại,sắn được trồng trên 100 nước của vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, tập trung nhiều
ởchâuPhi,châuÁvàNamMỹ(OECD,2014).
Sắn có 98 lồi hoang dại nhưng được chia thành hai nhóm chính: sắn ngọt
vàsắn đắng(OECD, 2014).Sắnlà câyđabội thể phứctạp, dị hợp, bộ nhiễmsắc thể 2n
= 36, thể tam bội và tứ bội có số nhiễm sắc thể tương ứng 54 và 72 (OECD,
2014).Sắn có khả năng chịu đựng trong điều kiện sống bất lợi như khí hậu khơ hạn,
đấtgiàu hay nghèo dinh dưỡng, địi hỏi tối thiểu lượng phân bón, thuốc trừ sâu và
nước.CâysắnlàthựcvậttrunggiangiữaC3vàC4(Saithongetal.,2013;Zhangetal.,2016). Nhiệt độ tối ưu cho

quang hợp của các cây trồng trên đồng ruộng là 35 oCnhưng phạm vi quang hợp tối
ưu

từ

25

đến

45oC

(El-Sharkawy

et

al.,

2012).

Vì

vậy,câysắnthích

nghivớiđiềukiệnkhíhậunhiệtđới.
Thân cây sắn có tính chất thân gỗ, có thể mọc cao từ 2 - 4 m, là bộ phận
chínhđể làm giống trong sản xuất. Tại mỗi mắt là một điểm sinh trưởng của chồi
nách, tạiđâysẽpháttriểnthànhcànhbênhoặcthâncâymớisaukhitrồng.Sốlượngthùycủa


lá trưởng thành tương đối ổn định đối với một giống sắn. Sắn có hoa đơn tính,

cảhoacáivàhoa đực cùngnằ mtrênm ột chùm hoa,saukhi hoacáiđư ợ c thụphấ n
,bầunhụycáipháttriểnthành quả(OECD,2014).
Rễ củ được hình thành do sự phân hóa hình thành của rễ con và sựp h ì n h
t o của rễ (phần rễ mọc ngang). Củ có thể dài tới 1m (trung bình từ 30 - 60cm),
đườngkính củ có thể lên đến 14cm (trung bình từ 3 - 7cm). 3 tuần sau khi trồng đã
thấyxuất hiện tầng thứ cấp thể hiện sự phân hóa hình thành củ sắn. Tốc độ lớn của
củchiathành 3giai đoạn:
Giai đoạn 1: 2 - 3 tháng đầu sau khi hình thành củ, tốc độ lớn của củ
chậm.Giaiđoạn2: Từthángthứ 6 - 8tốcđộ lớncủacủrấtnhanh.
Giai đoạn 3: Sau giai đoạn 2 đến thu hoạch, tốc độ lớn của củ giảm
dần(OECD,2014)
Dinh dưỡng, độc tố:Củ sắn tươi có tỷ lệ chất khơ 20%; trong đó tinh
bộtchiếm80%;chấtprotein,béo,xơ,trotrong100gđượctươngứnglà0,8-2,5g,0,2
- 0,3 g, 1,1 - 1,7 g, 0,6 - 0,9 g; chất muối khoáng vàvitamintrong 100 g củ sắn là18,8
-22,5mgCa, 22,5-25,4mgP,0,02mgB1,0,02mgB2, 0,5mgPP.Trong củ
sắn, hàm lượng cácacid aminkhông đươc cân đối, thừa arginin nhưng lại thiếu
cácacid amin chứalưu huỳnh. Thành phần dinh dưỡng khác biệt tùy từng giống,
vụtrồng, số tháng thu hoạch sau khi trồng và kỹ thuật phân tích (Wheatley và
Chuzel,1993). Giá trị dinh dưỡng của sắn cịn được đánh giá qua hàm lượng
carotenoid tíchlũytrongcủ(Carvalhoet al.,2016).
Trong lá và củ sắn ngoài các chất dinh dưỡng cũng chứa một lượng độc
tố(HCN) đáng kể. Cácgiống sắn ngọt có80- 1 1 0 m g H C N k g l á t ư ơ i v à
2 0 - 3 0 mg kg củ tươi. Các giống sắn đắng chứa 160 - 240 mg HCN kg lá tươi và
60 - 150mg kg củ tươi. Tuỳ theo giống, vỏ củ, lõi củ, thịt củ, điều kiện đất đai, chế
độ canhtác, thời gian thu hoạch mà hàm lượng HCN có khác nhau (Wheatley and
Chuzel,1993).
1.1.2. Vai trịvà giátrị kinhtếcủacâysắn
Sắncónhiềucơngdụngtrongchếbiếncơngnghiệp,thứcăngiasúcvàlương



thực,thựcphẩm.
Củ sắn dùng để làm thực phẩm như ăn tươi, chế biến sắn lát khơ, tinh bột
sắn,làmthứcăngiasúc,bánhkẹo,đườngglucosetinhthể,mạchnhagiàumaltose,
mìănliền,bún,miến,hạttrânchâu(tapioca), phụ gia thực phẩm,bột ngọt...(Salvadoret al., 2014).
Lá sắn ngọt là loại rau xanh giàu đạm rất bổ dưỡng và để nuôi cá, nuôitằm. Lá sắn
đắng ủ chua hoặc phơi khô để làm bột lá sắn dùng chăn ni lợn, gà,trâu,bị,dêv.v...
Sắn là một mặt hàng quan trọng trong ngành công nghiệp chủ yếu là do
tinhbột của nó được sử dụng trong việc sản xuất các mặt hàng khác nhau. Tinh bột
sắncó nhiệt độ hồ hóa thấp nên dễ dàng chuyển hóa thành các đường đơn giản
nhưsorbitol, mannitol và maltol, là nguyên liệu để sản xuất kem đánh răng, mỹ
phẩm,dầu

sơn,

ascorbic

acid,

polyester,

polyethylene

nhựa

(Ren,

1996),maltodextrin,lysine,a c i d c i t r i c ,s i r o g l u c o s e , h ồ v ả i , h ồ g i ấ y , c o l e n d e r ,
p h ủ g i ấ y , b ì a c á c t ô n g , phụg i a d ư ợ c p h ẩ m ,s ả n x u ấ t m à n g p h ủ s i n h h ọ c ,c h ấ t
g i ữ ẩ m ( A b r a h a m , 1 9 9 6 ) . Đặc biệt, tinh bột sắn là nguồn nguyên liệu chủ yếu cho quá trình lên men để
sảnxuấtetanol,nhiênliệusinhhọc.

Cây sắn đã mang lại hàng tỷ USD giá trị xuất nhập khẩu và thương mại
cũngnhư tạo ra hàng triệu việc làm và thu nhập cho người nông dân, doanh nghiệp
ởnhiềuquốcgia.
Năm 2015, cây sắn vẫn chiếm kim ngạch xuất khẩu cao trong ngành
nôngnghiệp, cụ thể: đứng thứ 4 sau cây lúa, cà phê và cây điều về sản lượng và
kimngạchxuấtkhẩu(bảng1.1).
Bảng1.1.Danhmục5loạicâychiếmi m ngạchxuấth ẩ u caotrong ngnhnơng
nghiệp2015(Nguồn:Hiệphộisắn ViệtNam,2016)
STT

Loạicây

Sảnlƣợng(nghìntấn)

Kimngạchxuấtkhẩu(tỷUSD)

1
2
3
4
5

Lúa
Càphê
Điều
Sắn
Tiêu

6.590
1.340

328,8
4.110
132,6

2,8
2,67
2,4
1,32
1,26