MỞĐẦU
1. Tínhcấpthiếtcủađề tài
Hiện nay,việc tìm kiếm,phát hiện vàn g h i ê n c ứ u c á c h ợ p
c h ấ t thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao từ nguồn tài nguyên thực vật
phongphú của nước ta là mối quan tâm chung của các ngành Hoá, Sinh,
Y,Dược. Việc khai thác, sử dụng nguồn tài nguyên này trong các
ngànhcơngnghiệpthựcphẩm,dượcphẩmvàmỹphẩmcóhiệu quảkinhtếcao.
TrongvơsốlồithựcvậtởViệtNam,câymethuộcchiTamarinduscủa họ
Đậu (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, các bộ phậncủa cây me đều được
dùng trong cuộc sống quả me mà thành phần hóahọc chủ yếu là
polysaccharide được sử dụng nhiều trong ngành côngnghiệpthực
phẩmvàdược phẩm.
Cho đến thời điểm này tại Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứuvề
mặt hóahọc của các thành phần có trong quảme,do vậy quảm e l à một đối
tượng nghiên cứu có nhiều triển vọng, có ý nghĩa khoa học vàthựctế.
Trên những cơ sở phân tích trên, tác giả và tập thể hướng dẫn
lựachọn đề tài nghiên cứu của luận án là:"Nghiên cứu thành phần hóa
họcvàkhảosáthoạttínhsinhhọccủapolysaccharidetừhạtme(Tamarindu
sindicaL.)Việt Nam".
2. Mục tiêu của luận án:Xác định thành phần hóa học, cấu trúc và
đánhgiáhoạttínhsinhhọccủaTamarindSeedPolysaccharide(TSP)cótrongquả me. Điều chế được
các dẫn xuất sulfate hóa và acetyl hóa có hoạt tínhsinhhọccaohơnTSPtựnhiêntừđó
gópphần
sángt ỏ
ảnh
hưởng
c ủ a mứcđộsulfatehóavàacetylhóađếnhoạttínhsinhhọc.
3. Phương pháp nghiên cứu:Luận án được thực hiện trên cơ sở các
kếtquả nghiên cứu thực nghiệm và hệ thống các phương pháp nghiên cứu
đãđược công bố. Cụ thể, phương pháp sắc ký gel (GPC), phổ hồng
ngoại,phổ khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, tán xạ ánh sáng tĩnh và

động, tánxạ tia X góc nhỏ, kính hiển vi điện tử quét, phương pháp thử
hoạt tínhsinhhọc…
4. Ý nghĩa khoa học của luận án:Lần đầu tiên cấu trúc của TSP từ
quảme được nghiên cứu hoàn chỉnh bao gồm cấu trúc hóah ọ c , c ấ u
t r ú c không gian và cấu trúc bề mặt bằng cách sử dụng các phương
pháp hiệnđại trên thế giới trong nghiên cứu cấu trúc của polymer bao
gồm
phổNMR,phổ khốiESI-MS,ESI-MS/MScác phươngphápt á n xạá nh
sáng
1


tĩnhSLSvàđộngDLS,tánxạtiaXgócnhỏSAXS,xâydựngđượcmơhìnhcấu
trúcphântửcủaTSPdựa trêncấutrúchóahọc.
5. Ý nghĩa thực tiễn của luận án:Đã sulfate hóa và acetyl hóa TSP
tựnhiên để thu đượcmẫu biến tính TSPS và TSPA có hoạtt í n h c a o
h ơ n mẫu tự nhiên (Kết quả nghiên cứu cho thấy dẫn xuất sulfate hóa
làm tăngkhả năng ly giải cục máu đông, khả năng chống đông tụ máu và
hoạt tínhkháng vi sinh vật kiểm định cịn dẫn xuất acetyl hóa làm tăng
khả năngoxyhóasovớimẫuTSPtựnhiên).
6. Cáckếtquảmớicủaluậnánđạtđược:
- Lần đầu tiên cấu trúc của TSP từ quả me được nghiên cứu
hồnchỉnhbaogồmcấutrúchóahọc,cấu trúckhơnggianvàcấutrúcbềmặt
- Đã xây dựng được mơ hình cấu trúc phân tử của TSP dựa trên
cấutrúchóahọc.
- Hoạt tính sinh học và cấu trúc của mẫu TSP và TSPS với các
mứcđộ sulfate hóa khác nhau đã được nghiên cứu để tìm hiểu ảnh hưởng
củasự sulfate hóa lên cấu trúc và hoạt tính sinh học (Đây cũng là một
điểmmớicủaluậnánsovớicác nghiêncứutrongnước ở cùnglĩnhvực).
7. Cấutrúccủa luậnán:

Luận án gồm 132 trang: Đặt vấn đề 2 trang; Chương 1 – Tổng quan18
trang; Chương 2 – Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 17 trang;Chương
3 – Thực nghiệm 18 trang; Chương 4 – Kết quả và thảo luận48trang; Kết
luận và kiến nghị 3 trang; Danh mục đã công bố của luận án 1trang; 122 tài
liệu tham khảo 13 trang; có 30 bảng biểu và 46 hình ảnh vàđồthị.
CHƯƠNG1:TỔNG QUAN
Phần này tổng hợp các nghiên cứu trên thế giới và trong nước về
cácnghiêncứuhóahọcvàhoạttínhsinhhọccủapolysaccharide
CHƯƠNG2:ĐỐITƯỢNGVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
2.1. Đốitượngnghiêncứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là Tamarind Seed
Polysaccharide(TSP) phân lập từ quả me. Quả me được thu hái tại huyện
Thủy Nguyên,Hải Phòng vào tháng 5 năm 2013 và tại huyện Cần Giuộc –
Long An vàotháng7năm2014.
Cây me có tên khoa học là Tamaridus indica.L. thuộc họ đậu
chiTamaridus,lồiT.indica


2.2. Phươngphápnghiêncứu
2.2.1 Phươngphápchiếttách
Chiếttách polysaccharide từquả me bằng các phương phápc h i ế t tách
thông thường, kết hợp các phương pháp tinh chế, làm sạch đồng thờitham
khảo các công bố trên thế giới để đưaram ộ t p h ư ơ n g p h á p c h i ế t tách tối ưu,
phù hợp với đối tượng và mục đích nghiên cứu của luận án[85,86].
2.2.2. Phươngphápxácđịnhcấu trúc
2.2.2.1. Phươngphápsắckýthẩmthấugel(GPC)
Gel Permeation Chromatography (GPC) là một kỹ thuật sắc ký đểphân
tách các phân tử kích thước lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trêncột.
GPC có thể xác định một vài thơng số cấu trúc quan trọng bao gồmtrọng
lượng trung bình Mw,trọng lượng phân tử trung bình số Mn,v à đặc trưng

cơ bản nhất của một polymer là sự phân bố trọng lượng phân tửcủanó
2.2.2.2 PhươngphápphổIR.
Phổ hồng ngoại xác định sự dao động của nguyên tử trong phân tử.Khi
tia hồng ngoại được chiếu qua mẫu, các nhóm ngun tử trong
phântửmẫuhấpthụcáctiấnhsángtạicáctầnsốphùhợpvớisựdaođộngcủ
a ngun tử trong phân tử. Phương pháp này mang đến những thơng
tincấutrúcquantrọngđểxácđịnhvịtrínhómchứctrongphântửpolysaccharide.
2.2.2.3 .PhươngphápphổNMR
Phổ
cộng
hưởng
từhạt
nhân
proton
(1HNMR)củap o l y s a c c h a r i d e có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu
(khơng
có
mặt
của
các
tín
hiệucácoligonucleotide,proteinhaylipid).Phổcũngcóthểchobiếtsốmonosaccharide
thựctừsốcáccộnghưởngprotonanomer,đánhgiátỷlệphân tử của các monosaccharide. Nhiều
nhóm thế có thể được xác địnhhoặc sự có mặt của chúng được dự đốn dựa
vào phổ1D-1H-NMR. Tiếptheo, số lượng chính xác của các monosaccharide
có thể được khẳng địnhchínhxácnhờvàoviệckhảosátvùnganomercủaphổhaichiềudịhạtnhân1H13
C-HSQC.
2.2.2.4. PhươngphápphổMS
Hiện nay phương pháp phổ khối lượng với kỹ thuật phổ khối
nhiềulần(Tandem–

massspectrometers)làcơngcụrấthữuhiệuđểphântích


cấu trúc chuỗi của polysaccharide. Kỹ thuật MALDI-ToF-MS và ESI–MS là
phương pháp hữu hiệu trong việc xác định trọng lượng phân tửxyloglucan
và các dẫn xuất sau khi được thủy phân và enzym hóa, hai
kỹthuậtnàyđềuthu đượcdữliệu nhanhchóngvàcácphânmảnh nhỏ.
2.2.2.5. Phươngpháptánxạánhsáng(LS)vàtánxạtiaXgóc
nhỏ(SAXS)
Hiện nay các phương pháp tán xạ (LS) là rất hữu hiệu để nghiên
cứucấu trúc không gian của phân tử chất tan trong dung dịch. Phương
phápnày dựa vào đường cong tán xạ ta có thể biết được các thơng số cấu
trúcnhư trọnglượng,kíchthướcvàhìnhdạngcủaphântửchấttan.
2.2.3 Phươngphápthửhoạttínhsinhhọc
2.2.3.1 Hoạttínhgâyđộctế bào.
Hoạt tính gây độc tế bào được tiến hành để đánh giá khả năng ức chếsự
pháttriểntếbàoungthưvàkhôngungthưinvitrocủacácmẫuchiết,cũng như để kiểm tra độc tính của
thuốc với các dịng tế bào ung thư vàkhông ung thư. Phép thử này dựa vào
khả năng nhuộm màu của SRB(Sulforhodamine B) bám vào protein của tế
bào đã được cố định bởi acidtrichloroaxetic (TCA). Phép thử tiến hành xác
định hàm lượng protein tếbào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD –
Optical Density) đo đượckhi thành phần protein của tế bào được nhuộm
bằng Sulforhodamine B(SRB).G i á t r ị O D m á y đ o đ ư ợ c t ỉ
l ệ t h u ậ n v ớ i l ư ợ n g S R B g ắ n v ớ i p h â n tử protein, do đó
lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thìgiátrịODcànglớn.
2.2.3.2 Hoạttínhchốngoxyhóa
Những phép thử đo hoạt tính chống oxy hóa có liên quan đến
chuyểnnguntửhydrogenhaychuyểneđộcthân.Cơchếhaiphépthửnàyxảyra đồng thời phụ thuộc
vào cấu trúc của chất chống oxy hóa và pH. Phépthử theo cơ chế chuyển
nguyên

tử
hydrogen
đựa
theo
việc
đo
khả
năngcủachấtchốngoxyhóađểquétnhữnggốctựdobởisựchohydrogen.
Trong phép thử dựa trên cơ chế chuyển e độc thân, phản ứng đượcxác
định bởi sựkhửproton vàkhảnăng ion hóacủan h ó m c h ứ c ( I P ) , phép
thử này phụ thuộc vào pH, pH càng cao thì giá trị IP càng thấp vàtăng sự
khử proton. Những hợp chất có IP45kcal/mol cơ chế phản ứngthường
làchuyển e độc thân.P h ả n ứ n g c h u y ể n e đ ộ c t h â n t h ư ờ n g
c h ậ m và chịu ảnh hưởng âm tính bởi những hợp phần vết, chất nhiễu đặc
biệt làkimloại


2.2.3.3 Hoạttínhkhángvisinhvậtkiểmđịnh
Hoạttính kháng vi sinh vậtkiểm định được thực hiện dựatrênphương
pháp khuếch tán đĩa thạch. Đây là phương pháp thử hoạt tínhkháng vi sinh
vật và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh
hayyếucủacácmẫuthửthơngquađườngkínhkhuếchtán.
Các vi sinh vật kiểm định được tiến hành hoạt hóat r ư ớ c k h i
t i ế n hành thử nghiệm trong môi trường dịch thể đặc biệt. Sau đó được
phalỗng tới nồng độ thích hợp trước khi tiến hành thử nghiệm. Chất
khángsinhsosánhlàAmpicilin,Streptomycin,AmphotericinB hoặcmẫutrắng.
2.2.3.4 Hoạttínhchốngđơngtụmáu
Đơng máu làmột qt r ì n h m á u c h u y ể n t ừ t h ể l ỏ n g
t h à n h t h ể đ ặ c do chuyển fibrinogen thành fibrin khơng hịa tan và
các sợi fibrin này bịtrùng hợp tạo thành mạng lưới giam giữ các thành phần

của máu làm máuđơnglại.Đơngmáuvàchốngđơnglàmộtqtrìnhrấtphứctạp,cảhaihiện tượng này
cùng xảy ra, song song tiến triển, nhưng cuối cùng là đểnhằm cầm máu,
hoặc tránh hiện tượng đông máu tràn lan gây tắc nghẽnmạch máu một khi
đã hình thành đủ. Kết quả đánh giá qua quan sát
trựcquanvàdùngpipethútkiểmtratrạngtháicủamáu.
2.2.3.5 Hoạttínhlygiảicụcmáuđơng
Hình thành cục máu đơng làmộtp h ả n ứ n g t ự n h i ê n đ ể c ơ
t h ể t ự bảo vệ mình. Tuy nhiên, cục máu đông sẽ trở nên rất nguy hiểm
nếu hìnhthành ở bên trong mạch máu. Chúng sẽ di chuyển tới khắp mọi nơi
trongcơ thể, lên não làm tắc mạch máu não gây đột quỵ, đến tim thì làm
hẹpđộng mạch vành gây nhồi máu cơ tim, điều này sẽ thực sự nguy
hiểm,thậm chí là đe dọa tính mạng Kết quả đánh giá là sự thay đổi khối
lượngly giải huyết khối trước và sau các thí nghiệm. Phần trăm ly giải cục
máuđơng tính bằng sự chênh lệch về khối lượng trước và sau ly giải cục
máuđông.
CHƯƠNG 3:THỰCNGHIỆM
3.1. Thuhái, địnhdanhvàxửlýmẫuquảme
3.1.1 Thuháivàđịnh danh
Quả me được thu hái tại vùng Thủy Nguyên, Hải Phòng vào tháng
5năm 2013 và tại Cần Giuộc –Long An vào tháng 12 năm 2014. Cây me(có
tên khoa học làTamarindus indicaL. trong chiTamarindusthuộc
họĐậu(Fabaceae)) được giám định bởi TS. Bạch Thị NhưQ u ỳ n h K h o a KỹthuậtYhọc-TrườngĐạihọcY DượcHảiPhòng.Tiêubảnsố56891


vàsố56891Acủamẫu quảmeđượclưugiữtạiKhoaK ỹ thuậtYhọcTrườngĐạihọcYDượcHảiphòng.
3.1.2 Xửlýmẫu
Quảme sau khi thu hái được rửasạch chấtb ẩ n t h ô d ư ớ i
v ò i n ư ớ c , rồi sấy tại 60-700C trong 48h,sau đó tách bỏ vỏ,t á c h
r i ê n g p h ầ n h ạ t m e và thịt me. Thịt và hạt me được sấy lại tại 60 0C
đến khối lượng không đổi,hạtme được tách bỏ vỏ cứng sau đó được nghiền

nhỏ vàgiữt r o n g b ì n h hútẩm.Thịtvàhạtmeđược dùngđểchiếttáchTSP.
3.2. Xác định thành phần hóa học, chiết tách và tính
chếTamarindSeedPolysaccharide(TSP)
3.2.1.Xác địnhthànhphầnhóa học
Xác
định
hàm
ẩm,protein,chất
béo,l ư ợ n g
tro,
c a c b o n h y d a r a t e v à sợi thô được tiến hành theo phương pháp
AOAC thực hiện 03 lần và lấykếtquảtrungbình.
Hàmẩmđược xác địnhbằngphươngphápkhốilượng.
Chất béo thơ được phân tích bằng cách chiết mẫu bột hạt me khơ
vớietherdầuhỏatrongbìnhchiếtSoxhlet.
Lượngproteinthơ c ó trong m ẫ u đ ư ợ c x á c đị nh bằ ng p h ư ơ n g pháp
micro-KjeldahlđượccảitiếnbởiCoconvàDian.
Phântícht ổ n g c a r b o h y d r a t e đ ư ợ c x á c đ ị n h b ằ n g p h
ươngpháp
phenol-acidsulfuric
Xácđ ị n h l ư ợ n g t r o , s ợ i t h ô : X á c đ ị n h l ư ợ n g s ợ i t h ô t h e o p h ư ơ
ng
phápAOCS-AOAC
Xácđ ị n h ư ợ n g a x i t t ổ n g s ố : L ư ợ n g a x i t t ổ n g đ ư ợ c x á c đ ị n h b ằ n
g
phươngpháptrunghịatheoTiêuchuẩnViệtNamTCVN 4589:1988.
3.2.2 Chiếttáchvà tinhchế
Tiếnhànhkhảosátcácquytrìnhchiếttáchsau:
Dùng lượng ethanol phù hợp cho vào một lượng bộtm e ,
k h u ấ y mạnh để loại màu và các chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp,

qtrìnhnàyđược lậplại3lầnthuđượcbộtme màunâunhạt.
Quytrình1:TheoquytrìnhcủaRupaliSinghvàcộngsự.Quytrình2:
TheoPhaniKumarvàcộngsự
Quytrình3:ChiếttáchTSPtheoquytrìnhcủaRaovàcộngsự
Mẫusa ukhi chiếtt á c h đượcl o ạ i bỏproteintheophươngphápc ủa Oliveir
avàcộngsự.


Sau khi loại protein và lipid mẫu được tiến hành tinh chế bằng
màngthẩm tách MWCO No 68035 SnakeSkin Dialysis Tubing, 10000K
củahãngThermoScientific - USAđểthuđược TSPcóđộsạchcao.
SơđồchiếttáchđượcđưaraởHình3.1

Hình3.1.SơđồchiếttáchTSPtừhạtquảme

3.3. Điềuchế dẫnxuất
3.3.1 Sulfate hóa
Tamarinds e e d p o l y s a c c h r i d e s u l f a t e đ ư ợ c t ổ n g h ợ p t h e o
phương
phápcủaLihongFan,XiaolinChenvàcộngsự.
Bằngcáchthayđổitỷlệtácnhânsulfatehóa( B ả n g 3.2),chúngtơi
thuđượccácmẫu TSPScómứcđộsulfatehóa(DS)khácnhau
Bảng3.1. Kýhiệumẫuvàtỉlệsốmolcác chấttạotácnhânsulfate hóa
STT

Mẫu

nNaHSO3

nNaNO2


1

TSPS1

0.050

0.086

2

TSPS2

0.050

0.059

3

TSPS3

0.050

0.045

4

TSPS4

0.051


0.029

5

TSPS5

0.051

0.016


6

TSPS6

0.050

0.007

Hình3.2. SơđồtổnghợpTSPS

Xácđịnhmứcđộsulfatehóa:XácđịnhhàmlượngsulfatecủaTSPbằng
phươngphápphântíchkhốilượng.
3.3.2 Acetylhóa
Tamarindseedpolysacchride acetylhóađượctổnghợptheophương
pháp củaX i a o - x i a o Liuvàcộngsự theosơđồHình3.3

Hình3.3. SơđồtổnghợpTSPA



Tiến hành tổng hợp TSPA có mức độ acety hóa( D A ) k h á c
n h a u bằng các cho TSP tác dụng với tác nhân acetyl có nồng độ khác
nhau trênBảng3.2.
Bảng3.2. Kýhiệumẫuvànồngđộtácnhânacetylhóa
STT
1
2
3
4
5
6

Mẫu
TSPA1
TSPA2
TSPA3
TSPA4
TSPA5
TSPA6

n(CH3CO)2O
0.011
0.021
0.032
0.042
0.053
0.064

Xác định mức độ acetyl hóa:Xác định hàm lượng acetyl của

TSPbằngphươngphápphântíchthểtíchtheoLuisvàcộngsự
3.4 Xác địnhcấutrúc hóahọc
3.4.1. Xácđịnhthànhphầnđường
Để xác định thành phần đường bằng phương pháp HPLC, mẫu
TSPđược thủy phân hoàn toàn bằng TFA 4M tại nhiệt độ 80 0C trong thời
gian8h. Phân tích trên hệ thống HPLC Shimazu- Nhật Bản với detector RI,
tạiTrungtâmPhântíchvàKiểmđịnh–ViệnCơngnghiệpThựcphẩm.
3.4.2. GPC
GPC đo trên máy HPLC Agilent 1100 tại PTN Phân tích trung
tâm,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP HCM.
Vớiphađộng NaNO30,1N, detectorRI, cột đo TSK G3000-PW,n ồ n g
đ ộ mẫu TSP 4,4% (khối lượng). Các dữ liệu được xử lý bằng phần
mềmJiangshenWorkstation.
3.4.2PhổIR
PhổhồngngoạiFT-IRđượcghitrênmáyFT-IRAffinity-1SShimadzu tại
Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đạihọc Quốc gia Hà
Nội, trong vùng số sóng 4000-400 cm-1. Mẫuđược épviênvớiKBr.
3.4.3. PhổNMR
Phổ NMR được ghi trên máy Bruker Avance III 500MHz tại
Trungtâm các phương pháp phổ ứng dụng -Viện Hóa học, Viện Hàn lâm
KhoahọcvàC ô n g nghệVi ệtN a m . M ẫ u đượcphat r o n g dungm ôi D 2O+ 1
%


CD3COODvớinồngđộ 3mg/ml.DSSđượcsửdụnglàmchấtnộichuẩn,
đoở nhiệtđộ70oCvớikỹthuậtđokhửtínhiệunước.
3.4.4. PhổMS
Để tiến hành đo phổ khối, mẫu TSP được thủy phân trong TFA
2Mtạinhiệtđộ800Ctrongthờigian4hđểtạocácoligosaccharide.
Phổ ESI-MS được ghi trên thiết bị LTQ Orbitrap XL TMcủa

hãngThermo SCIENTIFIC tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học
Tựnhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, với nguồn ion hóa phun mù điện tử
vàkiểuionhóadương.
3.4.5. PhươngphápSEM
ẢnhSEMđượcthựchiệntrênhệthiếtbịFE-SEMS4800(Hitachi)
trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia HàNội.

tại

3.4.6. Phươngpháp LS
Thí nghiệm được tiến hành đo tại mỗi 5° trong dải đo từ 30-150trên
thiết bịSLS-6500 & EDLS-9000 tại Đại học Điện- Truyền
thơngOsaka,NhậtBản.
3.4.7. PhươngpháptánxạtiaXgócnhỏ
Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) được đo trên máy BL10CtạiPhotonFactory, Tsukuba,NhậtBản.
3.5. Đánhgiáhoạttínhsinhhọc
Các hoạttính sinh học thường được tiến hành thửn g h i ệ m
đ ố i v ớ i các polysaccharide tự nhiên và biến tính. Các phương pháp thử
đều tuântheo các qui định chung về thử hoạt tính sinh học như: chuẩn bị
mẫu thử,mẫu đốichứng,ghi,đọckếtquả,tínhtốnnồngđộgây đápứng.
3.5.1 Hoạttínhgâyđộctếbào.
Hoạttínhgâyđộctếbàođượcxácđịnhtại ViệnCơngnghệSinhhọc
– ViệnHànlâmKH&CNViệtNam.
Cácdịng
tế
bào
đượcni
cấy
dưới
dạng

đơn
lớptrongm ơ i trườngnicấyDMEMvớithànhphầnkèmtheogồm2mMLglutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM natri pyruvate, ngoài ra bổ
sung10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO). Tế bào được cấy chuyển sau
3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO 2ở điều kiện 370C, 5%
CO2.Chấtthử(20l)phatrongDMSO10%đượcđưavào cácgiếng(khay 96


giếng) để có nồng độ 150g/ml; 75g/ml; 38g/ml; 19g/ml, tế bàođược cố
định vào đáy giếng bằng TCA, được nhuộm bằng SRB trong 1giờ ở 37 0C,
sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quảvề hàm lượng
màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng540 nm. Xác định
khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử từ đóxác địnhkhảnăngức
chếtếbàotheocơngthức sau:
%ức chếtếbào=100%-% sốngsót
3.5.2 Hoạttínhchốngoxyhóa
Hoạt tính chống oxy hóa tổng và khả năng khử sắt được tiến hành
tạiViệnNghiêncứuvàỨngdụngcôngnghệNhaTrang
Xác định khả năng khử sắt: tiến hành theo phương pháp Zhu và cộngsự
[120]. Lấy 0,2 ml mẫu có nồng độ 6 mg/ml thêm hỗn hợp gồm 0,2 mlđệm
phốt phát pH= 7,2 và 0,2 mL kaliferricyanid 1%. Hỗn hợp được giữở 50 0C
trong 20 phút. Sau đó, thêm tiếp 0,2mL CCl 3COOH 10%. Saucùng, lấy
0,125 ml hỗn hợp trên và 0,125ml nước cất được đặt vào giếng96 lỗ cùng
với 0,02mL FeCl3. Độ hấp thụ củah ỗ n h ợ p t ă n g t ạ i
b ư ớ c sóng655nmchỉrakhảnăngkhửcủahỗnhợp.
Xác định hoạttính oxy hóat ổ n g s ố t h e o p h ư ơ n g p h á p
H u i m i n v à cộng sự [43]. Lấy 0,3 ml mẫu có nồng độ 6 mg/ml thêm
vào 3 ml chấtphản ứng bao gồm (0,6 M acid sulfuric, 28 mM natri
phosphate và 4 mMamoni molybdat). Để phản ứng tại 95 0C trong 3 giờ, để
nguội đo tại bướcsóng695nm.Hoạttínhoxyhóatổngsốtínhtheoaxidascorbic.
Xác định hoạt tính ức chế q trình peroxy hóa lipid màng tế bào:Tách

não chuột (chuột thuần chủng dòng BALB/c) và nghiền đồng thểtrong dung
dịch đệm phosphat (pH 7,4), theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt độ 0-5 0C.Phản ứng bao
gồm 1ml dịch đồng thể thêm vào 0.2ml các nồng độ mẫuthử và 0.8ml đệm
phosphat. Ủ ở 37 0C/15 phút (tự oxy hóa) hoặc ủ ở 37 0Ctrong 5 phút với hệ Fenton
(FeSO40,1 mM: H2O215 mM theo tỉ lệ 1:1).Kết thúc phản ứng bằng 1ml acid
tricloacetic 10%. Li tâm lấy dịch trong.Bổ sung 1ml acid thiobarbituric
0.8% ở 1000C trong 15 phút.Cuối cùnglàm lạnh các ống nghiệm và tiến
hành đo cường độ mầu bằng máy quangphổ ELISA ở bước sóng 532 nm.
Chất
đối
chứng
là
malonyl
dialdehyd(Sigma,USA).Thínghiệmđượclặplại3lần.
3.5.3 Hoạttínhkhángvisinhvậtkiểmđịnh
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành theo phươngpháp
khuyếch tán đĩa thạch tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệNha
trang theo phương pháp của Vanden; Uchechukwu.U; Nehad.M vàcộng sự.
Chất
đối
chứng
là
Cloramphenicol
(10g/đĩa)
đối
với
khuẩnGr(+),T e t r a c y l i n ( 3 0 g/đĩa)v ớ i k h u ẩ n G r ( - ) v à m ẫ u t r ắ n g ( d u
ngmôi



nước).Các chủng vi sinh vậtkiểm định bao gồm :V i k h u ẩ n Gr( - ) :
E . coli (vi khuẩn đại tràng), Pseudomonas aeruginosa (trực khuẩn mủ
xanh),L.mon.Vi khuẩnGr (+): Bacillus cereus (đường ruột),
Streptococcusfaecalis(tiêuhóa),Staphylococcusaureus(tụcầukhuẩn)-Nâm
men:Candidaalbicans(nấmsinhdục).
3.5.4 Hoạttínhchốngđơngtụmáu
Hoạt tính chống đơng tụ máu được tiến hành tại Phòng Thử
nghiệmsinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và
CôngnghệViệtNam.
Hút 10 µl mẫu nghiên cứu hoặc dextrose hoặc nước cất vào
ốngeppendof. Hút 50 µl máu chuột (chuột nhắt trắng dịng BALB/c) vào
cácống eppendof đã có mẫu thử hoặc aspirin hoặc dextrose hoặc nước
cất.Lắc nhẹ và để ở nhiệt độ phòng. Ghi thời giam máu bị đông tụ.
Dextrose(Sigma) được sử dụng làm đối chứng tham khảo.C á c t h í
n g h i ệ m đ ư ợ c lặplại3lần.
3.5.5 Hoạttínhlygiảicụcmáuđơng
Hoạt tính ly giải cục máu đơngin vitrođược tính hành tại PhịngThử
nghiệm sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa họcvà
Công nghệ Việt Nam thực hiện theo phương pháp của Dang, Wang vàcộng
sự.Lấy 0,5 mlmáu từ hốcmắt chuột cho vàomỗie p p e n d o f v ô trùng (đã
cân trước), ủ ở 37°C trong 45 phút. Sau khi hình thành cục máuđơng, hút
loại bỏ hết huyết thanh (không làm ảnh hưởng đến cục máuđông đã hình
thành). Tiến hành cân các ống eppendof có cục máu đôngtrước ly giải để
xác định trọng lượng cục máu đông theo công thức: “khốilượngcụcmáuđôngtrước
ly giải = khối lượng của ống chứa cục máuđộng – khối lượng của ống”. Với mỗi ống
eppendof chứa cục máu đôngđã được cân trước, thêm vào 100 μl mẫul mẫu
TSPS (nồng độ 50 mg/ml) TSP(nồng độ 25 mg/ml). Mẫu đối chứng là 100
μl mẫul DMSO 100%; đối chứngtham khảo là streptokinase (5 IU). Tất cả các
ống đem ủ ở 37°C trong 90phút và quan sát sự ly giải của cục máu đông.
Sau khi ủ, hút loại bỏ chấtlỏng và tiến hành cân ống để xác định khối lượng

cục máu đơng khơng bịlygiải.Phầntrămlygiảicụcmáuđơngtínhbằngsựchênhlệchvềkhốilượng
trước và sau ly giải cục máu đơng. Tiến hành lặp lại thí nghiệm
3lầnvớimáucủahaichuộtcùngloại.


CHƯƠNG4:KẾT QUẢVÀTHẢOLUẬN
4.1.Xácđịnhthànhphầnhóahọccủa hạtvà thịtquả me
Thành phần hóa học của quả me bào gồm cacbonhydrate, protein,chất
béo, lượng tro, sợi thô, axit tổng... các thành phần này bị ảnh hưởngcủa môi
trường phát triển. Kết quả nghiên cứu thành phần chính của
thịtvàhạtmeđược đưa ra trênBảng4.1
Bảng4.1Thànhphầnchínhcủaquảme
Me tại Thủy NgunMetạiCầnGiuộcHảiPhịng
LongAn
Thành phần
Hạtme
Thịtme
Hạtme
Thịtme
11.2
20.6
11.2
22.8
Hàmẩm(%)
Protein(%)

13.0

9.2


18.0

8.9

Chất béo(%)

3.9

0.6

3.1

0.4

Sợithơ(%)

3.0

3.0

4.6

3.7

Tro(%)

2.5

2.4


2.2

3.2

Carbonhydrate(%)
Axit tổng (mg/100g)

66.4

63.7

60.9

60.2

-

9.2

-

11.0

Như vậy, lồi me đang nghiên cứu có hàm lượng protein và hàmlượng
lipid và các thành phần khác là tương đương so với các công bốtrên.Thành
phần polysaccharide chủ yếu trong hạt và thịt me.S o s á n h với kết quả
phân tích hàm lượng polysaccharide trong hạt và thịt quả metrên thế
giới11, 32, 33thì mẫu me thu hái tại Thủy Nguyên - Hải
PhịngvàtạiCầnGiuộc –LongAncóhàmlượngpolysaccharidetươngđương.
4.2Lựachọnquytrìnhchiếttáchvàmẫu nghiêncứu

Kết quả hiệu suất chiết tách của TSP từ hạt và thịt của quả me theo 3quy
trìnhđã nêu trong Phần thực nghiệm được đưa ra trên Bảng 4.2. Kếtquả cho
thấy hàm lượng TSP thu được tương đối cao, với TSP từ hạt
mekhoảng26,2-39,3%wvàtừthịtmelàtừ12,6-17,5%w.

TSPtừ hạtme
TSP từ thịt
quảme
TSPtừ hạtme
TSPtừ thịtquả

Bảng4.2:HiệusuấtchiếttáchTSP(%w)
Theoquy
Theoquy
Theoquy
trình1
trình2
trình3
28,0
39,3
38,7
14,5

17,5

16,8

26,2
12,6


36,0
16,5

35,7
16,2

Ghi chú
Thu hái
tạiThủyNgu
yên,Hải
Phòng
Thuháitại
CầnGiuộc,


me

LongAn

Kếtq u ả p h â n t í c h t h à n h p h ầ n đ ư ờ n g c ủ a T S P
t r o n g t h ị t v à h ạ t m e của mẫu thu hái ở Hải Phòng được đưa ra
trên Bảng 4.3. Kết quả cho thấyTSPtừthịtvàhạt me đềucó thành phần đường
giống nhaub a o g ồ m 3 loại đường glucose, galactose và xylose với tỷ lệ
khác nhau. Kết quả nàycũng thể hiện trên sự giống nhau của phổ 1H-NMR
của 2 mẫu trên (Hình4.1)
Bảng4.3.ThànhphầnđườngcủaTSPchiếttừhạtvàthịtme
Mẫu
TSP (từhạtme)
TSP(từthịtme)


Glucose
1
1

Thành phần đường
(%mol)
Xylose
Galactose
0,22
0,33
0,05
0,17

Hình4.1.Phổ1H-NMRcủamẫuTSPchiếttừhạtmea)từhạtme, b)từthịtme

Trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide, một thông số cầnkiểm
tra là độ đa phân tán và mức độ phân bố trọng lượng phân tử, sắc đồ củaphép
đoGPCcủaTSPthuđượctừhạtvàthịtmeđượcđưaratrênHình 4.2. Sắc đồ GPC cho thấy TSP
chiết tách từ thịt me có mức độ đaphân tán cao khơng thích hợp cho việc
nghiên
cứu
cấu
trúc
do
vậy
chúngtơilựachọnTSPchiếttáchtừhạtlàmđốitượngnghiêncứu củaluậnán.

Hình 4.2.SắcđồGPC của mẫu TSPchiếttừa)hạtme,b)thịtquả me



Thành phần đường của mẫu TSP chiết từ hạt me của 2 mẫu thu háitại 2
vị trí được đưa ra trên Bảng 4.4. Kết quả cho thấy thành phần đườngcủahai
mẫu TSP chiếttách từ hạt me có nguồn gốct ạ i H ả i P h ò n g v à Long
An là gần giống nhau. Do vậy cho các nghiên cứu tiếp theo
chúngtơilựachọnmẫuhạtmethuháitạiHảiPhịng.
Bảng4.4. ThànhphầnđườngcủaTSP
TSP
(chiết
táchtừ
hạt me)

MẫumetạiHảiPhịng
(%mol)
Glucose
Xylose
Galactose
1
0,33
0,22

MẫumetạiLong An
(%mol)
Glucose
Xylose
Galactose
1
0,29
0,20

Phổ1H-NMRcủamẫuTSP tách chiếttừhạtme thuh á i t ạ i H ả i Phòng

bằng 3 quy trình khác nhau được đưa ra trên Hình 4.3. Kết quả chomẫuTSP
theoquytrìnhthấyquytrình1vàquytrình3cóđộsạchcaohơn, kết hợp với kết quả về hiệu suất
chiết
tách
(Bảng
4.2),
quy
trình
3đượcchúngtơilựachọnđểchiếttáchTSPchocácnghiêncứutiếptheo.
4.3. XácđịnhcấutrúccủaTSP
Hiện nay GPC là phương pháp hữu hiệu để xác định trọng lượngphân
tử và sự phân bố trọng lượng phân tử của polymer. Kết quả đo GPCcùng
với kết quả phân tích thành phần đường của mẫu TSP được đưa ratrên
Bảng 4.5. Thành phần đường của TSP từ hạt me thu hái ở ThủyNguyên –
Hải phòng gồm 03 loại đường là glucose, xylose và galactose,với tỷ lệ mol
Glc : Xyl : Gal = 1 : 0,33 : 0,22. Với trọng lượng phân tửmẫu TSP thu được
là 1,16x106 Da, kết quả này tương tự với các cơngtrình đã cơng bố là trọng
lượng
phân
tử
của
TSP
từ
các
nguồn
khác
nhaunằmtrongkhoảngtừ115kDađến2500kDa[32,33,50].
Bảng4.5. TrọnglượngphântửvàthànhphầnđườngcủaTSP
Mẫu
TSP


KếtquảGPC
Mw
Mw/Mn
1,16x106Da
4,46

Thành phần đường
(%mol)
Glucose
Xylose Galacstose
1
0,33
0,22

Phổ IRc ủ a T S P t ừ h ạ t m e ( H ì n h 4 . 5 ) t h ể h i ệ n
d a o đ ộ n g đ ặ c t r ư n g của các nhóm có mặt trong phân tử TSP, dao
động tại 3325 cm-1 thể hiệnđặctrưngdaođộnghóatrịcủanhóm-OH;tạitầnsố1417cm-1và1396cm1 thể hiện đặc trưng dao động δ CH2 trong của glucose và galactose;tại tần
số
1078cm-1thể
hiện
đặc
trưngdao
động(C-O), (C-C)
đặctrưngcủavòngpyranose,tạitầnsố999cm-1thểhiệndaođộng(C-O),
(C-C) trong liên kết C6(H)-O6, tại tần số 943cm-1 thể hiện dao độngnhóm
δ (C-1-H), tại tần số 895 cm-1 thể hiện dao động của vịng □amomeric.KếtquảphântíchphổIRđượcđưaratrênBảng4.6.
Bảng4.6.KếtquảphântíchthànhphầnphổIRcủaTSP



Tầnsố(cm-1)
3325
1417,1396
1078
999
943
895

Nhómđặctrưng
(OH))
δCH)2
(C-O),(C-C)
(C-O),(C-C)
δ (C-1-H))
Vịng

Liênkết
Glucose, galactose
Vịng
C6(H))-O6
-anomeric

Vậy trên phổ IR của mẫu thấy xuất hiện các nhóm dao động đặctrưng
củap o l y s a c c h a r i d e , n h ư c ó
nhóm
dao
động
c ủ a l i ê n k ế t  (OH),δCH
CH 2,(C-O),(C-C)củavòng,(C-O),(C-C)
củaliênkếtC-6-H2-O-6,δ(C-1-H), và dao động củavịng-anomeric,k h ơ n g

t h ấ y c ó n h ó m chức acid. Vậy trong phân tử polysaccharide chỉ có
liên kết glycoside vànhómOHcủacác gốc đường.
Phổ 1H và 13C-NMR của TSP được đưa ra ở Hình 4.6a và b. Phổ1HNMR cho thấy phổ rất phức tạp với độ rộng vạch lớn và trùng chập,điển
hình cho mẫu polymer có cấu trúc phức tạp. Tại vùng anomeric củaphổ1HNMR( t ừ δ4 , 5 6 - 5, 1 1 ppm)v à 1 3 C - N M R ( t ừ δ 101, 4- 10 6, 9
ppm)đềucó4pic.Cáctínhiệutừδ3.39-4.51ppmtrênphổ1H-NMRvàδ 69,077,7ppmtrênphổ13C-NMRlàthuộcvềprotonvàcarbonvịngpyranose. Các pic ở khoảng δ 62,964,2ppm là của carbon ở vị trí C6 củaglucose và galactose và C5 của
xylose . Các phổ thu được khơng có cáctín hiệu của tạp chất vàtín hiệu đặc
trưng của protein tại vùng 6,0-7,0ppm, điều đó chứng tỏ protein đã được
loại khỏi mẫu nghiên cứu [24,25].PhổCOSYcủaTSPđượcđưaraởHình4.7.Trênphổ1H-NMR
chothấycó4tínhiệuởvùnganomerictạiδ5,12;4,93;4,56và4,55ppmđượckýhiệu tương ứng là A, B, C
và D. Sự cộng hưởng từ H1 đến H6 của nhómC, D và H1 đến H5 của nhóm
A, B được gán cho các tín hiệu như đượcchỉ ra trên phổ COSY. Kết hợpvới
kếtq u ả t ừ p h â n t í c h t h à n h p h ầ n đường là TSP gồm 3 loại
đường làglucose,galactose và xylose,c ó t h ể kết luận rằng C và D là
thuộc về glucose và galactose; A và B là thuộc vềxylose.Trên cơ sở độ dịch
chuyển hóa học của proton, độ dịch chuyểnhóa học của tất các cacbon của
các đường A, B, C và D đều được gán dựatrênphổHSQC(Hình4.8).TrênphổHSQC,cáctín
hiệu
của
C1/H1
tại(106,96/4,56ppm);
(105,05/4,55ppm)vàC6/H6tại(64,50/3.75–3,95
ppm) là thuộc về C và D (-glucose và-galactose) và C6 của D tồn tại ởcả2
dạngthamgiavàkhơngthamgialiênkếtglycosidenhưđượcchỉracó 2 tín hiệu tại 69.00/3.95ppm
và65.50/3.75ppm. Tín hiệu củaC 5 / H 5 tại (64.50/3.60 ppm) được gán
cho-xylose.Tín hiệucủaC4( 8 1 . 0 0 ppm) vàcủaC6 (69.50 ppm) củaglucose hoặc-galactose, cũng nhưtínhi ệut ại 82.00ppmcủaC 2 của xyloseđềubịdịchchuyểnvềphía


trường thấp so với các carbon khi không tham gia liên kết glycoside, điềuđó
chứngtỏxylosethamgialiênkếtglycosidetạivịtríC2cịnglucosevà/hoặc galactose tham gia liên kết
tại vị trí C4 hoặc C6. Khi so sánh vềđộ chuyển dịch hóahọcvùng anomeric

củaglucose vàgalactose thìgalactose nằm ở trường thấp hơn, do vậy có thể
kết luận D là glucose,điều này cũng phù hợp vì TSP thuộc về lớp chất
xyloglucan nên glucoselà ở mạch chính sẽ tồn tại ở nhiều trạng thái cả
khơng tham gia liên kếtglycosidevàthamgialiênkếtở các vịtríkhácnhau.
Liên kết glycoside được xác định dựa ra trên phổ HMBC (Hình
4.9).Trên phổ HMBC thể hiện mối tương quan giữa H1 của nhóm B (xylose)và C6 của nhóm D
(glucose), H6 của nhóm D (glucose) và C1 của nhómA (xylose) và B
(xylose). H1 của nhóm D (glucose) và C4 của nhóm D(glucose), H1 của
nhóm C (galactose) và C2 của nhóm A (xylose). Nhưvậy, qua phân tích
phổ NMR kết hợp với phân tích thành phần đường ởtrên có thể kết luận
rằng TSP có mạch chính là (14)--Glucose vớimạchnhánhlàXylosevà-Galactose(12)--Xylosecóliênkết(16)
vớiglucoseởmạchchính.
Bảng4.7.Độdịchchuyểnhóahọc trênphổ1Hvà1 3 CNMRcủaTSP
(125/500MHz, D2O,δppm)
Đặctrưng

C-1/H)1

A
nhóm -xylose

101.50/
5,12

B
nhómcuốikhơng
khử -xylose
C
-Galactose
D

-Glucose

C-2/H)2
82.00/
3.65

C-3/H)-3

C-4/H)-4

72.00/
3,92

74.50/
3.65

C-5/H)5

C-6/H)-6

64.50/
3.60

101.50/
4.93

74-75/
3.55

75.50/

3.72

72.50/
3.60

64.50/
3.60

106.96/
4.56

72.50/
3.60

75.50/
3.70

71-72/
3.90

72-73/
3.60

64.50/
3.75

105.05/
4.55

76.00/

3.40

75.50/
3.67

81.00/
3.60

76.00/
3,80

64.50;69.00/
3.75;3,95

Đểnghiên cứuchuỗi trúccủaTSP chiếttừhạtm e c h ú n g t ô i
t i ế n hành phân tích phổ khối ESI-MS của TSP-oligosacharide thu được
bằngphương pháp thủy phân TSP được nêu trong phần thực nghiệm. Phổ
ESI-MSc ủ a TSPol i gos ac c ha ri de đư ợc đ ư a rat r ê n H ì n h 4 . 1 1 . Pic c ơ s ở t ạ i m/z413là
của[Glc-Glc-Glc-5H2O+H]+1.P i c
tại
mảnhm/z457đươc
g á n cho[Glc[Xyl]-Glc+H]+1hay của nhóm[Glc[Xyl-Gal]+H]+1, pic tại mảnhm/
z615 là của[Glc-Glc-Glc-Glc+H]+1. Pic tại mảnhm/z1011 gán cho[Glc[Xyl]Glc[Xyl]-Glc[Xyl]] - G l c + H ] +1.T í n h i ệ u ở m / z 1 0 7 7 l à c ủ a [ G l c [ X y l ] Glc[Xyl-


Gal]-Glc-Glc]+H]+1và
Glc[Xyl-Gal]+H]+1

pic tại mảnhm/z1224 là của:[Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]-


Phổ ESI-MS/MS của mảnhm/z1224 pic tại mảnhm/z525 đặctrưng
cho nhóm ion[Glc-Glc-Glc-Glc-5H2O+H]+1, pic tại mảnhm/z631 đặctrưngcho
nhóm[Glc-Glc-Glc-Glc-H2O+H]+1,pictại
mảnhm/z661
đặctrưng
cho
nhóm[Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc -3H2O+H]+1, pic tại mảnhm/z833đặc trưng cho
nhóm[Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc+2H2O+H]+1, pic tại mảnhm/z935 đặc
trưng cho nhóm[Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]-Glc[Xyl-Gal]+H]+1, pictại mảnhm/
z1025 đặc trưng cho nhóm[Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]-Glc-Glc -3H2O+H]+1, pic
tại mảnhm/z1157 đặc trưng cho nhóm[Glc[Xyl-Gal]-Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc3H2O+H]+1.
Phổ ESI-MS/MS của mảnh tạim/z1077 đưa ra trên Hình 4.13,
pictại mảnhm/z401 thể hiện củamảnh[Glc[Xyl-Gal] -3H2O+H]+1h o ặ c
c ủ a pic tại mảnh[Glc[Xyl]-Glc] -3H2O+H]+1, pic tại mảnhm/z479 thể hiện
củamảnh[Glc-Glc-Glc-Glc -H2O+H]+1, pic tại mảnhm/z773 thể hiện đặc
trưngcủa mảnh[Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc -5H2O+H]+1, pic tại mảnhm/z879
thểhiện mảnh[Glc[Xyl]-Glc[Xyl-Gal]-Glc] -H2O+H]+1,p i c t ạ i m ả n h m/
z945thể hiện mảnh[Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc[Xyl] -3H2O+H]+1và pic tại
mảnhm/z1011 thể hiện mảnh[Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc+H]+1. Phổ
ESI-MS/MS của mảnhm/z1011 thu được trên Hình 4.14, hình pic tại
mảnhm/z545 được gán cho nhóm[Glc[-Xyl-Gal]-4H2O+H]+1, pic tại
mảnhm/z879đượcgánchonhóm[Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc-Glc-H2O+H]
+1
,pict ạ i mảnhm/z929đ ư ợ c g á n c h o n h ó m [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]Glc-Glc+H]+1,p i c tại mảnhm/z945 được gán cho nhóm [Glc-Glc[Xyl]Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-3H2O+4H]+1, pic tại mảnhm/z992 được gán cho
nhóm[Glc-Glc[-Xyl]-Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-H2O+H]+1.P h ổ E S I - M S / M S m ả
n h m / z 4 5 7 đ ư ợ c đ ư a ratrênHình4.15,vớipictạim ả n h m / z 2 0 0
t h ể h i ệ n đ ặ c t r ư n g c ủ a nhóm[Glc-Glc -6H2O+H]+1,pictạimảnhm/
z309thểh i ệ n đ ặ c t r ư n g nhóm[Glc-Glc -H2O+H]+1,pic tại mảnhm/z337
đặc
trưng

chonhóm[Glc-Glc-Glc-6H2O+3H]+1,pictạimảnhm/
z3 9 7 t h ể h i ệ n đ ặ c t r ư n g nhóm[Glc-Glc-Glc-4H2O+H]+1, tạim/z439
thể hiện đặc trưng nhóm [Glc-Glc-Glc+3H+]+1. Phổ ESI-MS/MS mảnhm/
z413 được đưa ra trên Hình4.16, với pic tại mảnhm/z181 thể hiện đặc
trưng
của
nhóm[Glc+2H]
+1
,pictạimảnhm/z254thểhiệnđặctrưngcủanhóm [ Glc[Xyl]- 3H2O+3H]
+1
,pi ctạimảnhm/z309thểhiệnđặctrưngcủanhóm [Glc-Glc
-H2O+H]+1,pictạimảnhm/z311thểhiệnđặctrưngcủanhóm [Glc[Xyl]+H]+1, pic
tại mảnhm/z386 thể hiện đặc trưng của nhóm[Glc-Glc-Glc-3H2O+3H]+1.
CáckếtquảtừphổESI-MSchophépxácđịnhTSPlàmộtgalactoxyloglucan
có các tập hợp mảnh chính là -Glc-Glc-Glc-, -Glc-Xyl-Glc,-Gl c-Xyl Gal- ... Kếthợpvớikếtq u ả phân tíchNMR,cấutrúc


hóah ọ c c ủ a m o n o m e r c ủ a T S P đ ư ợ c đ ư a r a t r ê n Hì nh 4. 1 6 , t h e o d a n h
phápcủalớpchấtxyloglucan,cấutrúcchuỗicủaTSPcódạngGXL.
Xyl
GlcGlcGlc
GalXyl

Hình 4.16.CấutrúchóahọccủamonomercủaTSP

Theo ảnh SEM của TSP thấy cấu trúc bề mặt là hợp chất cao phân tửcó
dạngvơdịnhhình,kếtquảnàyphùhợpvớicáccơngbốtrướcđâycủaJongilChoi[48].
KếtquảphépđoLSđượctổnghợp trênBảng4.14
Bảng4.14.Kết quảtừphépđoLScủaTSP
Mẫu


dn/dc(ml/g)

Mwx10-5

Mw/Mn

Rg(nm)

Rh(nm)

(=Rg/Rh)

TSP

0.137

11.55

4.36

211.7

229.4

0.92

Giá trịcủa TSP là 0,92 điều đó cho thấy phân tử TSP có dạng hìnhcầu,
đặcđiểmhìnhdạngnàytươngtựnhưpolysaccharidetừhạtđậutương và từ hạt lanh [92,122]. Mơ
phỏng hình dạng của TSP được đưa ratrênHình4.19


Hình4.19. MơphỏnghìnhdạngcủaphântửTSP

Vậy TSPchiết tách từhạtm e l à p o l y s a c c h a r i d e
phân
nhánh
c ó trọnglượng
phân
tửlà1.15x106Da.T r o n g d u n g d ị c h n ư ớ c
p h â n t ử TSPcódạnghìnhcầu.
Cấu trúc khơng gian của TSP ở kích thước cỡ nano được xác địnhbằng
phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS). Kết quả đo SAXS củadung dịch
TSP 0,5% trong nước được biểu diễn qua đường tán xạ và 2biểu đồ Kratky
và Guinier (Hình 4.21 a, b,c). Các dạng biểu đồ là
điểnhìnhcủapolysaccharide trungtính.


Qua biểu đồ Guinier, bán kính từ hồi chuyển Rgc=1,3nm. Đối vớicác
polysaccharide mạch thẳng khơng phân nhánh như carrageenan hayheparin
thì giá trị Rgc khoảng 0,4-0,53nm [106,107], điều này cho thấyTSP có
mạch nhánh tương đối dài, kếtquản à y c ũ n g p h ù h ợ p v ớ i
c ấ u trúc hóa học xác định được theo các phương pháp phổ IR, NMR và
ESI-MS ở trên. Kết quả cho thấy đường tán xạ thu được từ thực nghiệm
vàtính tốn dựa trên mơ hình cấu trúc phân tửl à t r ù n g n h a u .
Đ i ề u đ ó m ộ t lần nữa khẳng định cấu trúc hóa học của TSP là như
được đưa ra trênHình4.16.
Vậycó thểđưa ra nhậnđịnhsauvềTSPchiếttáchtừhạtme
Về cấu trúc hóa học: TSP chiết tách từ quả me thu thập tại huyệnThủy
Nguyên – Hải Phòng là một polysaccharide mạch nhánh với
cấutrúcchuỗidạng GXL, cấu trúchóahọccủap h â n t ử T S P đ ư ợ c

đ ư a r a trênHình4.22.
Xyl
GlcGlcGlc
GalXyl

n

Hình 4.22. Cấu trúc phân tử của
TSPVềcấutrúcbềmặt:TSPlàchấtvơđịnhhìnhVề

cấutrúckhơnggian:TSPcódạnghìnhcầu.
4.4. DẫnxuấtTSPS
Tiếnhànhtạocác dẫnxuấtTSPScóDS từ3,3-26,2%
Phổ IR của TSPS4 (Hình 4.24) thể hiện dao động đặc trưng của
cácnhóm có mặttrong phân tử TSP,d a o đ ộ n g t ạ i 3 3 3 5 c m -1thể
hiện daođộng đặc trưng của nhóm -OH liên kết hydro; dao động tại 1213
cm-1thểhiện dao động đặc trưng của nhóm S=O; tại dao động 824 cm -1thể
hiệndaođộngđặc trưngnhómsulfatetạiC2và/hoặc C3.
Trên phổ13C-NMR của TSPS4 xuất hiện một pic mới tại δ
69.7ppm,chứng tỏ vị trí C6 của galactose hoặc/và glucose bị thế sulfate, độ
chuyểndichhóahọc bịchuyểndịchvềphíatrườngyếu56ppm.Xuấthiệnpictạivùngδ80-84ppmthểhiệnthếsulfatetạivịtríC4,trongkhiđóvớimẫu khơng
sulfate tại vùng δ 74-78 ppm. Kết quả phổ 13C NMR khẳngđịnhnhóm
hydroxyl củaglucose vàgalactose ởvịtrí C6 vàxylosevà/hoặcgalactoseở
vịtríC4củaTSPđãđượcthếbằngnhómsulfate.
Kếtquảđotánxạánhsángcủa2mẫuTSPvàTSPS4đượcđưara
trênbảng4.17.