VIỆNHÀNLÂM
KHOAHỌCVÀCƠNGNGHỆVIỆTNAMHỌCVIỆNKHOAHỌC
VÀCƠNGNGHỆ
……………………….

NGUYỄNTHỊLIỄU

NGHIÊNCỨUTHÀNHPHẦNHĨAHỌC,HOẠT
TÍNHSINHHỌCVÀĐADẠNGNGUỒNGENDI
TRUYỀNCỦAMỘTSỐLỒILÁKIMỞTÂYNG
UN,VIỆTNAM
Chunngành:Hóahữucơ
Mãsố:62440114

LUẬNÁNTIẾNSĨ HĨAHỌC
Ngườihướngdẫnkhoahọc:
1. GS.TSKH.TrầnVănSung
2. PGS.TS.ĐinhThị Phịng

HÀNỘI -2017


LỜICAMĐOAN
Tôixin c a m đoanđ â y làc ôn g trìnhnghiênc ứ u c ủ a riêng tơidướisựh ư ớ n g dẫn
củaGS.TSKH.TrầnVănSungvà PGS.TS.ĐinhThịPhịng.
Cácsốliệuvàkếtquảnghiêncứunêutrongluậnánlàtrungthực,đượcđồngtácgiảchophépsửdụ
ngvàchưatừngđượccơngbốtrongbấtkỳmộtcơngtrìnhnàokhác.
Tácgiả

NguyễnThịLiễu

LỜICẢMƠN
Luậnán được hồnthànhtại phịng Tổng hợp hữucơ –ViệnH ó a

học

v à phòng Phân loại học thực nghiệmv à Đ a d ạ n g n g u ồ n g e n - B ả o t à n g
T h i ê n n h i ê n ViệtNamthuộc ViệnKhoahọcvàCơngnghệViệtNam.
Tơixinbày

tỏlịngbiếtơnsâusắcđếnGS.TSKH.TrầnVănS u n g v à PGS.TS.

Đinh Thị Phịng người thầy, cơ đãhướng dẫn và tận tình giúp đỡ tơi
trongqtrìnhthựchiệnvàhồnthànhluậnán.
Xin cảm ơn các cơ chú, anh chịphịng Tổng hợp Hữu cơ – Viện Hóa học
vàphịng Phân loại học thực nghiệm và Đa dạng nguồn gen - Bảo tàng Thiên nhiên
ViệtNam đãchỉbảovàgiúp đỡtôitrongthờigian tôitiếnhànhthựcnghiệm tạiđây.
Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học, Bảo tàng Thiên nhiên Việt
NamvàHọcviện K ho a học vàCôngnghệđãtạo đ iề uk iệ nt hu ậ n lợi trongq trìn
ht ơ i họctập,nghiêncứuvà hồnthànhluận án.
Xin cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Thủ Đô Hà nội đã tạo điều
kiệnthuậnlợivàgiúpđỡtơiđượcđihọcvàcóthờigianhồnthànhluậnán.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đối với sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn
bèvàđồngnghiệptrongsuốtqtrìnhnghiêncứuvàhồnthànhluậnánnày.
Xintrântrọngcảmơn!
Tácgiả

NguyễnThịLiễu



MỤCLỤC
MỞĐẦU.......................................................................................................................1
CHƯƠNG1.TỔNGQUAN...........................................................................................3
1.1. Tổngquanvề3lồilákimnghiêncứu.......................................................................3
1.1.1. Đặcđiểmthựcvậtvàtìnhtrạng bảotồn............................................................3
1.1.2. Tìnhh ì n h n g h i ê n c ứ u t h à n h p h ầ n h ó a h ọ c v à h o ạ t t í n h s i n h h ọ c c ủ a
cáclồitrongchiCephalotaxus,DacrydiumvàNageia...........................................9
1.2. ỨngdụngkĩthuậtphântíchISSRvàSSRtrongnghiêncứuđadạngditruyềnởthựcvật
27
1.2.1. KỹthuậtISSR(InterSimpleSequenceRepeat)..............................................27
1.2.2. KỹthuậtSSR(SimpleSequenceRepeat)......................................................27
1.2.3. Mộtsốthànhtựuvềnghiêncứuđadạngnguồngenditruyềncủamột
sốlồithuộcchiCephalotaxus,DacrydiumvàNageia...........................................28
CHƯƠNG2.THỰCNGHIỆM....................................................................................32
2.1. Ngunliệuthựcvật.............................................................................................32
2.1.1. Nghiêncứuthànhphầnhóahọc.....................................................................32
2.1.2. Nghiêncứuđadạngnguồngenditruyền.........................................................32
2.2. Hóachất vàthiếtbị...............................................................................................33
2.2.1. Nghiêncứuthànhphầnhóahọc.....................................................................33
2.2.2. Nghiêncứuđadạngnguồngenditruyền.........................................................34
2. 3.Chiếttáchcácchấttừ3lồilákimnghiêncứu..........................................................34
2.3.1. Phươngphápnghiêncứu...............................................................................34
2.3.2. Phânlập,tinhchếcácchấttừ3lồilákim........................................................35
2.4. Hoạttínhsinhhọc..................................................................................................53
2.4.1. Phươngphápnghiêncứuhoạttínhchốngoxihóa..........................................53
2.4.2. Phươngphápnghiêncứuhoạttínhgâyđộctếbào[63-67]..............................54
2.5. Nghiêncứuđadạngnguồn genditruyền..............................................................56
2.5.1. Các cặpmồiISSRvàSSR...............................................................................56
2.5.2. Phươngphápnghiêncứu...............................................................................56
CHƯƠNG3.KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN.................................................................58



3.1. Thànhphầnhóahọcvàhoạttínhsinhhọc...............................................................58
3.1.1. Hoạttínhsinhhọccủacácdịchchiết...............................................................58
3.1.2. Xác địnhc ấ u t r ú c h ó a h ọ c c ủ a c á c c h ấ t s ạ c h t á c h đ ư ợ c
t ừ 3 l o à i l á kim...............................................................................................59
3.1.3. Hoạt tínhsinhhọccủacácchấtsạchphânlậptừ3lồilákim.........................117
3.2. Đadạngditruyềnnguồngencủabalồilákimnghiêncứu....................................125
3.2.1. Đadạngditruyền.........................................................................................126
3.2.2. Câyphátsinhchủngloạicủa3lồilákim......................................................126
KẾTLUẬNVÀKIẾNNGHỊ.....................................................................................132
NHỮNGĐĨNGGĨPMỚICỦALUẬNÁN.............................................................135
DANHM Ụ C C Á C C Ơ N G T R Ì N H C Ơ N G B Ố L I Ê N Q U A N Đ Ế N L U Ậ N
ÁN.............................................................................................................................136
TÀILIỆUTHAMKHẢO..........................................................................................137


DANHMỤCCÁCKÍHIỆU,CÁCCHỮVIẾTTẮT
1

H-NMR
ProtonNuclearMagneticResonan
ceS p e c t r o c o p y

13

C-NMR

DEPT


HMBC
HSQC
COSY

Carbon-13NuclearMagnetic
ResonanceSpectrocopy
DistortionlessEnhancementby
PolarisationTransfer
HeteronuclearMultipleBond
Coherence
HeteronuclearSingleQuantum
Coherence
CorrelationSpectrocopy
PhổtươngtácprotonMS

Phổcộnghưởngtừhạtnhânpr
oton
Phổcộnghưởngtừhạtnhâncar
bon
PhổDEPTPhổ
HMBC
PhổHSQC

MassSpectrocopy

Phổkhốilượng
ESI-MS

ElectronSprayIonizationMass
Spectrocopy


Phổkhốiionhóa
bằngphunmùđiệntử
Phổkhốiphângiảicaoionhóabằn

HR-ESI-MS
HighR e s o l u t i o n ElectronSpray
Ionization-MassSpectrocopy
NuclearOverhauserEffect
NOESY
Spectrocopy
ISSR
InterSimpleSequenceRepeat
InfraredS p e c t r o c o p y
IC50

gphunmùđiệntử
PhổNOSEY

LặplạitrìnhtựđơngiảnởgiữaIR
Phổhồngngoại
Nồng độứcchếcóhiệulực50%
cáthể

Inhibitoryc o n c e n t r a t i o n 50%
ED50

Effectivedose

50%cáthểKB Humanepidermiccarcinoma

HepG2

Nồngđộcóhiệuquả
Ungthưbiểu mơ

Humanhepatocellularcarcinoma
UngthưganởngườiLu-1
Humanlungcarcinoma

Ungthưphổi

MCF-7

Humanbreastcarcinoma

Ungthưvú

SW626

Humanovarianadenocarcinoma
UngthưbuồngtrứngSW480
Humancolonadenocarcinoma

ởngườiHL-60

Ungthưđạitràng

Humanpromyeloccyticleukemia Ungbạchcầucấptính



SK-Mel2

Humanmalignantmelanoma

Ungthưhắctố

P388

Ungthưbạchcầuởchuột

HT-29

Ungthưtuyếngiápởnamgiới


COLO-205

Ungthưruộtkết

CTPT

Cơngthứcphântử

STT
ISSR

Sốthứtự
Lặplạitrìnhtựđơngiảnởgiữa

SSR

TLTK

InterSimpleSequenceRepeat
SimpleSequenceRepeat

Lặplạitrìnhtựnucleotideđơngiản
Tàiliệuthamkhảo

EtOAc

Ethylacetat

MeOH

Methanol

DMSO

Dimethylsunfoxid

PIC

PolymorphicInformation

Content
DNA
Deoxyribonucleicacid
deoxyribonucleicPCR

Hàmlượngthơngtinđahình

Axit
PolymeraseChainReaction

PhảnứngchuỗipolymeraseVU

Vulnerable

NT

Nearthreatened

Sắpbịđedọa

d

Doublet

Đơi

s

Singlet

Đơn

m

Multiplet

Phứchợp


br

Broad

Rộng

J(Hz)
δ(ppm) p pm)
RP18

chemicalshiftinpartspermillion

Sẽnguycấp

Hằngsốtương tác
Độchuyểndịchhóahọctính
bằngphầntriệu
SilicagelphađảoRP-18


DANHMỤCBẢNG
Bảng1.1.

CácloàithựcvậtthuộcchiCephalotaxus...................................................4

Bảng1.2.

CácloàithựcvậtthuộcchiDacrydium........................................................5


Bảng1.3.

Cáckiểukhung carboncủa cáchợpchấtalkaloidđượcphânlập từ
chiCephalotaxus.....................................................................................10

Bảng1.4.
Cáca l k a l o i d k h u n g h o m o e r y t h r i n e p h â n l ậ p t ừ m ộ t s ố l o à i t h u ộ c
chiCephalotaxus.....................................................................................16
Bảng1.5.
.................................................................................................................
BảnggiátrịIC50t h ử hoạttínhgâyđộctếbàođốivới2dịngtếbàoL1210vàKBc
ủacáca l k a l o i d p h â n l ậ p t ừ l á c ủ a l o à i C . harringtoniavar.na
na[15][20]..............................................................................................25
Bảng2.1.

Nguồngốcvàkýhiệucủa cácmẫuthuộc 3loài lá
kimd ù n g t r o n g nghiêncứuđadạngditruyềnnguồngen.....................32

Bảng2.2.

Hàmlượng%cáccaochiếtsovới mẫukhơcâyHồngđàngiả...................42

Bảng2.3.

Hàmlượng%cáccaochiếtsovới mẫukhơcâyKimgiaonúi đất...............46

Bảng3.1.

Kếtq u ả t h ử h o ạ t t í n h c h ố n g o x i h ó a c ủ a c á c
d ị c h c h i ế t t ừ l o à i K i m giaonúiđất..........................................58


Bảng3.2.

Kếtquảthửhoạttínhg â y đ ộ c t ế
b à o c ủ a d ị c h c h i ế t H T E t ổ n g v à dịchc h i ế t HĐEvới4dòngtế
bàoungthư................................................................................................58

Bảng3.3.

Dữliệuphổ1 H-NMRv à 1 3 CNMRc ủ a h ợ p chấtD T 1 vàCephalotaxine..........................................60

Bảng3.4.

Dữl i ệ u p h ổ 1 H-NMRv à 1 3 C-NMRc ủ a D T 2 v à C e p h a l o t a x i n e - N-oxide....................................................................................................63

Bảng3.5.

Dữ

liệu

phổ1 H-NMRv à 13 C-NMRc ủ a DT3vàDeoxyharringtonine

66
Bảng3.6.

Dữliệuphổ1H-NMRvà13C-NMRcủaDT4vàNordeoxyharringtonine...........68

Bảng3.7.


Dữ liệu phổ1H NMRv à 1 3 C NMR
củaDT5.1,DT5.2vàIsoharringtonine........................................................72

Bảng3.8.

Dữl i ệ u p h ổ 1 H-NMRv à 1 3 C-NMRc ủ a c á c c h ấ t D T 6 , D T 7 v à 3 epi-schellhammericine.............................................................................77


Bảng3.9.

Dữliệuphổ 1 Hvà 13C-NMRcủahợpchấtDT8vàH a r r i n g t o n o l i d e
79


Bảng3.10.D ữ liệuphổ 1 Hvà 13C-NMRcủaHĐ1vàLamberticacid............................83
Bảng3.11.D ữ liệuphổNMRcủa HĐ2,S a l v i n o l o n e [ 1 0 6 ] vàMontbretol
.....................................................................................................................................87
Bảng3 . 1 2 . D ữ l i ệ u p h ổ 1 HNMR,1 3 CNMR,H M B C , N O E S Y c ủ a H Đ 2 đ o trongCDCl 3........88
Bảng3.13.D ữ liệuphổ 1 Hvà 13C-NMRcủaHĐ4và PonasteroneA..........................92
Bảng3.14.D ữ liệuphổ1 Hvà13C-NMRcủahợpchấtHĐ5

và 20-

hyđroxyecdysone.....................................................................................95
Bảng3.15.D ữ liệuphổ 1 H-NMRvà 13C-NMRcủa HĐ6vàajugasteroneC.................98
Bảng3.16.D ữ liệuphổ 1 H-NMRvà 13C-NMRcủaKG1vàAmentoflavone..............100
Bảng3.17.S ố liệuphổ1HNMRvà 13CNMRcủacácchấtKG1,KG2,KG3.................103
Bảng3.18.D ữ liệuphổNMRcủa KG4và 3β-hydroxytotarol..............................105
Bảng3.19.D ữ liệuphổNMRcủa KG5vàtotarol-19-carboxylicacid......................107
Bảng3.20.D ữ liệuphổ 1 H-NMRvà 13C-NMRcủaKG6vàFerruginol......................109

Bảng3.21.D ữ liệuphổNMRcủaKG7vàSugiol.......................................................112
Bảng3.22.K ế t quảthửnghiệmhoạttínhchốngoxihóacủachấtDT4........................117
Bảng 3.23.Kếtq u ả t h ử h o ạ t t í n h c h ố n g o x i h ó a c ủ a c á c c h ấ t
s ạ c h p h â n l ậ p t ừ loàiKimgiaonúi đất..........................................117
Bảng3.24.Kếtquả t h ử h o ạ t t í n h g â y đ ộ c t ế b à o c ủ a D T 4 v ớ i 4dịngt
ế
bàoungthư.............................................................................................118
Bảng3.25.Kết quảthửhoạttínhgây độctế bàocủac á c c h ấ t
p h â n l ậ p t ừ l o à i Hồngđàngiả......................................................118
Bảng3.26.HoạttínhgâyđộctếbàocủacácchấtKG1,KG4,KG5,KG8vàKG9...................119
Bảng3.27.Tổngkếtcáchợpchấtphânlậpđượctừ3lồilákimnghiêncứu............................121
Bảng3.28.Mộtsốthơngsốditruyềncủa3lồilákimphântíchtổhợpvớihai
chỉthịISSRvàSSR.................................................................................126


DANHMỤCHÌNH
Hình1.1.

CâyĐ ỉ n h t ù n g (ppm) C.m a n n i i )T à

Nung,LâmĐồng

và

m ẫ u t i ê u bản......................................................................................4
Hình1.2.

CâyHồngđàngiả(ppm)D.elatum)ởLâmĐồngvàmẫutiêubản............................6

Hình1.3.


CâyKimgiaonúiđất(ppm)N.wallichiana)ởLâmĐồngvàmẫutiêubản......................8

Hình 1.4.

Cáchợpchấtcephalotaxinekhơngcó mạchnhánhtại C-3............................12

Hình1.5.

CáchợpchấtharringtoninephânlậptừchiCephalotaxus..............................14

Hình1.6.

CáchợpchấtalkaloidkhungDrupacinephân lậptừchiCephalotaxus............15

Hình1.7.

Cấutrúccáchợpchấthomoerythrinaalkaloid..............................................16

Hình1.8.
Cách ợ p c h ấ t f l a v o n o i d p h â n l ậ p t ừ m ộ t s ố l o à i t h u ộ c c h i
Cephalotaxus.........................................................................................19
Hình1.9.

Cáchợpchất
diterpenoidvànorditerpenphânl ậ p t ừ m ộ t s ố l o à i thuộcchiCephalota
xus..........................................................................................................21

Hình1.10.


Cấutrúccủamột sốhợpchấtphânlậptừlồiC.mannii...................................22

Hình1.11.

CáchợpchấttừmộtsốlồithuộcchiDacrydium...........................................23

Hình1.12.

KỹthuậtISSRvàSSR[53].........................................................................28

Hình 2.1.

Sơđồchiếtalkaloidtổngtừ lávàcànhcủaĐỉnhtùng.....................................36

Hình2.2.

SơđồphânlậpcácchấttừcặnalkaloidtổngcủalávàcànhĐỉnhtùng......................37

Hình 2.3.

SơđồphânlậpcácchấttừvỏĐỉnh tùng......................................................38

Hình2.4.

Sơđồchiết từmẫuthânvàcànhHồngđàngiả..............................................42

Hình2.5.

Sơ đồ phânlậpcác chất từdịchchiết
EtOAcm ẫ u t h â n v à c à n h Hồngđàngiả.........................................43


Hình2.6.

Sơđồchiết từmẫulávàcànhKimgiaonúiđất...............................................47

Hình 2.7.

Sơđồphânlậpcácchấttừcaochiếtn-hexanelávàcành Kimgiao
núiđất.....................................................................................................47

Hình2.8.

SơđồphânlậpcácchấttừcaochiếtMeOHlávàcànhKimgiaonúiđất.......48

Hình2.9.

SơđồphânlậpcácchấttừdịchchiếtEtOAclávà cànhKimgiaonúiđất........50

Hình3.1.

Phổ1H-NMRcủahợpchấtDT1.................................................................61

Hình3.2.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtDT1...................................................61

Hình3.3.

Phổ1H-NMRcủahợpchấtDT2.................................................................64



Hình3.4.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtDT2...................................................64

Hình3.5.

Phổ1H-NMRgiãncủahợpchấtDT3...........................................................67

Hình3.6.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtDT3...................................................67

Hình3.7.

Phổ1H-NMRcủahợpchấtDT4.................................................................69

Hình3.8.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtDT4...................................................70

Hình3.9.

PhổkhốiphângiảicaoHR-ESI-MScủaDT5.1vàDT5.2..............................73

Hình3.10.

Phổ1H-NMRcủaDT5.1vàDT5.2..............................................................73

Hình3.11.


Phổ1H-NMRgiãncủaDT5.1vàDT5.2........................................................74

Hình3.12.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủaDT5.1vàDT5.2................................................74

Hình3.13.

Phổ1H-NMRgiãncủahợpchấtDT6...........................................................76

Hình3.14.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtDT6...................................................76

Hình3.15.

Phổ1H-NMRgiãncủahợpchấtDT7...........................................................78

Hình3.16.

Phổ1H-NMRgiãncủahợpchấtDT8...........................................................80

Hình3.17.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtDT8....................................................80

Hình3.18.

Phổ1H-NMRcủahợpchấtHĐ1..................................................................84


Hình3.19.

Phổ1H-NMRgiãncủahợpchấtHĐ1..........................................................84

Hình3.20.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtHĐ1....................................................85

Hình3.21.

Phổ1H-NMRcủahợpchấtHĐ2đotrongCDCl3.................................................................. 89

Hình3.22.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtHĐ2đotrongCDCl3........................................ 89

Hình3.23.

PhổHMBCcủahợpchấtHĐ2đotrongCDCl3....................................................................... 90

Hình3.24.

PhổNOESYcủaHĐ2trongCDCl3................................................................................................. 90

Hình3.25.

Phổ1H-NMRcủahợpchấtHĐ4..................................................................93

Hình3.26.


Phổ1H-NMRgiãncủahợpchấtHĐ4..........................................................94

Hình3.27.

Phổ13C-NMRvàphổDEPTcủahợpchấtHĐ4............................................94

Hình3.28.

Phổ1H-NMRcủahợpchấtHĐ5..................................................................96

Hình3.29.

Phổ1H-NMRgiãncủahợpchấtHĐ5..........................................................96

Hình3.30.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtHĐ5....................................................97

Hình3.31.

Phổ1H-NMRcủahợpchấtHĐ6..................................................................98

Hình3.32.

Phổ1H-NMRgiãncủahợpchấtHĐ6..........................................................99

Hình3.33.

Phổ1H-NMRcủaKG1............................................................................101


Hình3.34.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtKG1..................................................102

Hình3.35.

Phổ1H-NMRgiãncủahợpchấtKG4........................................................106


Hình3.36.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủaKG4.............................................................106

Hình3.37.

Phổ1H-NMRcủahợpchấtKG5...............................................................108

Hình3.38.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtKG5................................................108

Hình3.39.

Phổ1H-NMRgiãncủahợpchấtKG6........................................................110

Hình3.40.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtKG6................................................111


Hình3.41.

Phổ1H-NMRcủaKG7............................................................................112

Hình3.42.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtKG7................................................113

Hình3.43.

Phổ1H-NMRgiãnvùngtrườngcaocủaKG8.............................................114

Hình3.44.

Phổ1H-NMRgiãnvùngtrườngthấpcủaKG8............................................114

Hình3.45.

Phổ13C-NMRvàDEPTcủahợpchấtKG8................................................115

Hình3.46.

BiểuđồhìnhcâytínhtheophươngphápcủaJacccardvàkiểuphânnhóm
UPGMA thể hiệnmối quan hệ di truyền của 34 mẫu Đỉnh
tùngphântíchvớichỉthịISSRvàSSR(ppm)Ghichú:a:mẫuởHiệpAn,b:mẫu
ởTàNung).............................................................................................127

Hình 3.47.Biểu đồ hình cây tính theo phương pháp của Jacccard vàkiểu
phânnhóm UPGMA thể hiện mối quan hệ di truyền của 70 mẫu
Hồngđàn giả phân tích với chỉ thị ISSR và SSR (ppm)Ghi chú: a: mẫu

ở

SơnLang,AYunvàKonChưRăng(ppm)GiaLai);

b:

mẫuởHịaSơn(ppm)Đ ắk
Lắk);c:mẫuởĐaChais(ppm)LâmĐồng);d:mẫuởXãHiếu(ppm)KonTum)128
Hình 3.48.Biểu đồ hình cây tính theophương pháp của Jacccard và kiểu
phânnhómUPGMAthểhiệnmốiquanhệditruyềncủa70mẫuKimgiaonúiđ
ấtvớichỉthịISSRvàSSR(ppm)Ghichú:a:mẫuthuởAYun,b:mẫuthuởHịaSơn,
c:mẫuthuởĐaChais,d:mẫuthuởTàNung,e:mẫu
thuởXãHiếu..........................................................................................129


MỞĐẦU
Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ để chữa bệnh. Ngày nay với
sựphát triển của khoa học kĩ thuật, việc nghiên cứu các hoạt chất có nguồn gốc
thiênnhiên nhằm mục đích dẫn đường cho việc tổng hợpthuốc đã và đang diễn ra
mạnhmẽ. Các hợpchất thiênnhiêncócấut r ú c

hóa

học

lí

thúvà

hoạt


t í n h s i n h h ọ c đ a dạng đã thu hút sự quan tâm của các nhà khoa học nhằm tìm
ra các loại thuốc có giátrị trong điều trị bệnh cho con người, đặc biệt là các bệnh nan
y. Trong các loài thựcvật có giá trị trong y học phải kể đến các loài cây lá kim
(ppm)Conifer). Các loài này lànguồn nguyênliệuchứa các hợpchất tựnhiêncó hoạt tính
sinh học caov í d ụ c á c hợpchấttaxolđượcphânlậptừlồithơngđỏPacific(ppm)Taxus brevifolia), Hoa Kỳ
đãtạotiềnđề choviệc nghiêncứuv à s ả n x u ấ t t h u ố c P a c l i t a x e l c h ố n g
u n g t h ư v ú (ppm)Davidet al., 2000) hay hợp chất homoharringtonine được phân lập từ
nhiều loàitrong chiCephalotaxusđược phát triển thành thuốc omacetaxine
mepesuccinate sửdụngtrongđiềutrịbệnhbạchcầumãntính.
Khí hậu Việt Nam phân hóa đa dạng theo địa hình, có 4 miền là khí hậu
miềnBắc, miền Nam, khí hậu Đơng Trường Sơn và khí hậu biển Đơng. Đặc điểm địa
hìnhvàthờitiếtđóđãtạoramộtthảmthựcvậtvơcùngđadạngphongphú.Cáclồicâylá
kimlànhữnglồicâyquantrọngcảvềsinhthái,kinhtếvàvănhóatạinhiềuđịaphương như Lâm Đồng, KomTum,
Gia Lai, … Các lồi lá kim khơng chỉ giữ vai trịquan trọng trong các hệ sinh thái
rừng trên các vùng núi cao mà cịn là nguồn ngunliệu chính trong nhiều ngành
cơng nghiệp (ppm)cơng nghiệp sơn, xây dựng, cơng nghiệpchất béo, hóa mỹ phẩm, dược
phẩm…), đặc biệt một số lồi cịn được dùng trong cácbài thuốc dân tộc. Theo số
liệu thống kê của Nguyễn Tiến Hiệp và cộng sự (ppm)2005),trong số 34 loài lá kim ở Việt
Nam có tới 15 lồi ở Tây Ngun (ppm)chiếm 44,11%). Vìthế mà Tây Ngun được coi
là

“cái

nơi”

của

lồi


lákimcót í n h

đa

dạng

vào

h à n g thứhaicủaViệtNam,đặcbiệtlàtạiĐắkLắk,KonTumvàLâmĐồng.
Đỉnh tùng (ppm)Cephalotaxus mannii), Hoàng đàn giả (ppm)Dacrydium elatum) và
Kimgiao núi đất (ppm)Nageia wallichiana) là những lồi cây lá kim có giá trị kinh tế của
khuvựcTâyNgun,ViệtNam.Tuynhiên,chotớinaylồiK im giaonúiđấtvẫnchưa

1


được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cả trong và ngồi
nước,trong khi Đỉnh tùng mới chỉ được nghiên cứu hạn chế tại một số nước như
TrungQuốc, Nhật Bản và chưa được nghiên cứu tại Việt Nam, Hồng đàn giả mới
chỉ

cónghiêncứuthành

phầnhóahọc

qua

tinh

của


dầulá.Vìvậy

việc

nghiêncứut h à n h phầnhóahọcvàhoạttínhsinhhọccủabalồilákimtrêncónhiềutriểnvọngtìmrachất có cấu trúc
mới và có hoạt tính sinh học lý thú làm tiền đề cho việc nghiên cứu,phát triển thuốc
chữa bệnh góp phần nâng cao giá trị nguồn tài nguyên sẵn có ở vùngTây
Nguyên.Kết hợp với kết quả nghiên cứu về đa dạng nguồn gen di truyền tạo cơsở
khoa học vững chắc cho việc khai thác, phát triển bền vững và bảo tồn các lồi cây lá
kimtạikhuvựcTâyNgun,ViệtNam.Xuấtpháttừcáccơsởkhoahọcnêutrênchúng tơi lựa chọn đề tài “Nghiên
cứu

thành

phần

hóa

học,

hoạt

tính

sinh

học

vàđadạngnguồngenditruyềncủamộtsốlồilákimởTây Ngun,ViệtNam”

 Mụctiêunghiêncứucủa luậnán
- Nghiêncứuthànhphần hóa học và hoạt tínhsinhh ọ c

của

3lồi

lá

k i m : Đỉnh tùng (ppm)Cephalotaxus mannii), Hoàng đàn giả (ppm)Dacrydium elatum) và Kim
giaonúi đất (ppm)Nageiaw a l l i c h i a n a ) nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh
học caovàcó cấutrúc hóahọclíthú.
- Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền của 3 loài lá kim trên cơ sở
phântích hai chỉ thị ISSR và SSR nhằm cung cấp thơng tin khoa học có giá trị giúp
chocơngtác bảo tồncáclồi lá kim – một loài cây quantrọng của vùngT â y
N g u y ê n , ViệtNam.
 Nộidungluậnán
1. Phân lập các hợp chất từ bộ phận lá, thân cành và vỏ của 3 loài Đỉnh
tùng(ppm)Cephalotaxus mannii), Hoàng đàn giả (ppm)Dacrydium elatum) và Kim giao núi
đất(ppm)Nageiawallichiana)bằngphươngphápsắckýcột.
2. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các
phươngpháp phổIR,MS,1D-NMR, 2D-NMR.
3. Thửhoạt

tính

chốngoxihóavàhoạttínhgâyđộctếbàocủacácdịchchiếtvàcácchấtsạchphânlậpđược.
4. Đánhg i á t í n h đ a dạngnguồng e n d i truyền c ủ a 3l o à i lá kimnghiên c ứ u



bằng2loạichỉthịISSRvà SSR.

CHƯƠNG1.TỔNGQUAN
1.1. Tổngquanvề3lồilákim nghiêncứu
1.1.1. Đặcđiểmthựcvật vàtìnhtrạngbảotồn.
CáclồilákimthuộclớpThơng(ppm)Pinopsida),t r o n g n g à n h T h ô n g (ppm)Pinophyt
a). Trên thế giới cho đếnnay đã thống kê được khoảng 630l o à i t h u ộ c 6 8 chi
và 8 họ [1]. Chúng rất đa dạng về hình thái, kích thước và các đặc tính sinh thái(ppm)cây
thân bò,bụi nhỏ, cây gỗ nhỏ hoặc cây gỗ lớn hay rất lớn). Điển hình lồi gỗkhổng lồ
như Cụ Tùng (ppm)Sequoia gigantea) ở vùng núi Sierra Nevada (ppm)Hoa Kỳ) cóchiều cao tới
142 m với tuổi thọ đạt 3000 - 4000 năm, hay lồi Ngân Hạnh (ppm)Ginkgobiloba) ở Sơn
Đơng, Trung Quốc cao tới 25 m với chu vi thân đạt tới 16 m.
Nhưngtrongđócũngcólồilại

đượctrồnglàmcây

cảnhnhưThanhtùng(ppm)Junipruschinensis), Tùngxà(ppm) Juniperus squamata), Thơng la
hán(ppm) Podocarpus chinensis),…ởTrungQuốc,NhậtBảnvàViệtNam[2].
Tại ViệtNam, đã phát hiệnv à x á c đ ị n h

được

khoảng

34loài

t h u ộ c 5 h ọ trong lớp Thơng (ppm)Pinopsida). Trong số đó 15 lồi được tìm thấy ở
khu vực TâyNguyên (ppm)gồm các tỉnh Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lăk, Đắc Nơng và Lâm
Đồng) đó là:Đỉnh tùng (ppm)Cephalotaxus mannii), Pơ mu, Bách xanh núi đất, Thông
nước, Du samnúi đất,Thông đà lạt,Thông ba lá,T h ô n g h a i l á , T h ô n g l á

d ẹ t , T h ô n g l ơ n g g à , Hồng đàn giả (ppm)Dacrydium elatum), Kimg i a o n ú i
đ ấ t (ppm) Nageia wallichiana), Thôngtre lá dài, Dẻ tùng nam và Thơng đỏ nam. Các
lồi này đều có giá trị kinh tế và ứngdụngtrongyhọc[3][4].
1.1.1.1. Đỉnhtùng(Cephalotaxusmannii)
Đỉnhtùng:TênkhoahọcCephalotaxusmanniiHook.f(ppm)Taxaceae)
Năm 1995 tác giả K. E. Tripp đã xác định chiCephalotaxuscó mười lồi
[5].Đến năm 1999 các tác giả L. Fu, N. Li và R. R. Mill đã xác định thêm một lồi
làC.latifoliaCheng

and

Fu

[6].

Như

vậy

hiện

nay

trên

thế

giới

chiCephalotaxusđượccơngnhậngồm11lồi.ỞViệtNamcó2lồilàC.manniivàC.oliver

i[7].


Bảng1.1.CáclồithựcvậtthuộcchiCephalotaxus
STT
1
2
3
4
5
6

Tênkhoahọc
C.fortuneHooker
C.griffithiiHooker
C.hainanensisLi
C.harringtonia(Fobers)Koch
C.koreanaNakai
C.lanceolataFeng

STT
7
8
9
10
11

Tênkhoahọc
C.latifoliaCheng andFu
C.manniiHooker

C.oliveriMasters
C.sinensis(RehderandWilson)Li
C.wilsonianaHayata

 Mơ tả hình thái: Cây gỗ nhỏ, thường xanh,c â y t r ư ở n g t h à n h c ó
t h ể c a o t ừ 10 - 15 m. Thân tròn, vỏ trơn nhẵn (ppm)vỏ non có màu đỏ, vỏ già bong
thành mảng màutrắng).C à n h m ả n h , m ọ c đ ố i v à x ò e n g a n g . L á
m ọ c x o ắ n ố c , x ế p t h à n h 2 d ã y , h ì n h dải, dài 2- 4cm,rộng 0,20,4cm,thẳng hay hơi congở g ầ n đ ầ u , ở m ặ t d ư ớ i c ó 2 dảilỗkhímàutrắng.Mùara
nóntháng3-5,mùaquảchíntháng8-10nămsau.Đỉnh tùng tái sinh bằng hạt tốt, mọc rải rác trên các
sườn và đỉnh núi đất và núi đávôivớiđộicaotừ 600-1400m [7].
 Phân bố: Trên thế giới Đỉnh tùngphân bố ở khu vực Nam và Đông Nam
Ábao gồm: Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Bắc Myanmar, Bắc
TháiLan. Tại Việt Nam lồi này được ghi nhận có ở Lào Cai, Hà Giang, Sơn La,
CaoBằng, Hịa Bình, Hà Nội (ppm)Ba Vì), Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Kon Tum, Gia
Lai,Lâm Đồng vàThanh Hóa[7].

Hình1.1.CâyĐỉnhtùng(ppm)C.mannii)TàNung,LâmĐồngvàmẫutiêubản
(ppm)nguồnBảotàngThiên nhiênViệtNam)


 Cơng dụng: Gỗ Đỉnh tùng có chất lượng cao, chịu mối mọt, được sử
dụnglàm đồ gỗ cao cấp, đồ mỹ nghệ và cán công cụ. Vỏ cây được dùng chữa sốt tại
đảoHải Nam, Trung Quốc. Nó cịn được sử dụng làm cây cảnh do các cây có hình
dángđẹpvàđộcđáo[7].
 Đánh giá tình trạng bảo tồn: Trong sách Đỏ Việt Nam (ppm)2007) [8], loài
Đỉnhtùng được đánhgiá là sẽ nguy cấpVUA1,c,d,B1+2b,c. Trong danhl ụ c
đ ỏ c ủ a IUCN năm 2012, loài này được xếp VU A1d ở phạmv i t o à n c ầ u .
C ă n c ứ v à o c á c dẫn liệu thu thập được qua khảo sát, nghiên cứu ở các điểm còn
rừng nguyên sinh ởhầu khắp nước ta trong nhiều năm qua và đối chiếu với tiêu
chuẩn của các thứ hạngtrong Danh lục đỏ của IUCN nhận thấy loài Đỉnh tùng đáp

ứng được các tiêu chuẩnVU A4a,c,d, B1,2a,b, C(ppm)sự suy giảm quần thể trong quá
khứ, hiện tại và dự đoántương lai nhiều nhất > 30%, EOO < 20.000 km 2, AOO <
2.000 km2,, số lượng tiểuquần thể ≤ 20);tuy nhiênsốlượng cáthể trưởng thành
ướct í n h ≤ 2 . 5 0 0 , t h u ộ c khungENchứkhơngphảiVU)[3][4].
1.1.1.2. Hồngđàngiả(Dacrydiumelatum)
Hồng đàn giả cịn có các tên gọi khác Hồng tùng, Bạch đàn, tên khoa học
làDacrydium elatumWall.ex Hook (ppm)Podocarpaceae) [7]. ChiDacrydiumlà một
chitươngđốilớn,hiệnnaychinàygồm 21 lồiđãđượcxácđịnh [9].ỞViệtNam theotácgiảPhạm
Hồng Hộchỉtìmthấy1lồilàD.elatum[7].
Bảng1.2.CáclồithựcvậtthuộcchiDacrydium
STT
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

Tênkhoahọc
D.araucarioides
D.balansae
D.beccarii
D.comosum
D.cornwallianum
D.cupressium

D.elatum
D.ericoides
D.gibbsiae
D.gracile
D.guillauminii

STT
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21

Tênkhoahọc
D.leptophyllum
D.lycopodioides
D.magnum
D.medium
D.nausoriense
D.nidulum
D.novoguineense
D.pectinatum
D.spathoides
D.xanthandrum



 Mơ tả hình thái: Cây gỗ mọc đứng với thân ít cành nhánh, các cành
mọchướng lêntạo thành tán hình vòm nhỏ, chiều caot ớ i 3 0 m v ớ i đ ư ờ n g
k í n h n g a n g ngực tới 0,8 m. Cây mọc trongrừng nguyênsinhr ậ m t h ư ờ n g
x a n h h ỗ n g i a o n h i ệ t đới gió mùa núi thấp, đơi khi ở vùng đất thấp hoặc núi
trung bình trên các sườn núi(ppm)nhiệt độ trung bình năm khoảng 16-22 oC, lượng mưa
trên 1700 mm) trên cả đấtphong hóa từgranit hoặc các đá silicat khác cũng nhưt r ê n
các

động

núi

đá

vôi

k ế t tinhtrắngbịbàomịnmạnh.Gặpchủyếuởđộcao7002000mtrênmặtbiển,hoặccókhixuốnggầnmựcnướcbiểnnhưKiênGiang(ppm)đảoPhúQuốc,nơicónhiệtđộtrung
bình năm2 6 oC, lượng mưa nămt r ê n 3 0 0 0 m m ) . T r ê n t h ế g i ớ i , l o à i
n à y c h ỉ hạn chế ở các vùng núi có độ cao trên 1000 m trên mặt biển. Ở các vùng
núi thấp vàtrung bình lồi này mọc cùng với Thơng lá dẹt (ppm)Pinus krempfii), Thông đà
lạt

(ppm)Pinusdalatensis),Thông

trelá

dài

(ppm)Podocarpus


neriifolius),Pơm u (ppm) Fokieniah o d g i n s i i )vàThôngnàng(ppm)Dacrycarpusimbricatus)
[7].
 Phân bố: Trên thế giới lồi Hồng đàn giả được tìm thấy ở Myanmar,
TháiLan, Lào, Campuchia, Malaysia, Indonesia. Ở Việt Nam loài này phân bố rộng
khắptừ Hà Giang, Lai Châu, Tuyên Quang, xuống dọc dải Trường Sơn, từ Bắc (ppm)Hà
Tĩnh)qua Trung (ppm)từ Quảng Bình, Kon Tum đến Gia Lai) đến Nam (ppm)Đắk Lắk, Lâm
Đồng,KhánhHịavàNinhThuận)vàkếtthúcởNamĐơngDương (ppm)KiênGiang)[7].

Hình1.2.CâyHồng đàngiả(ppm)D.elatum)ởLâmĐồngvàmẫutiêubản