KẾTLUẬNVÀĐỀNGHỊ
1.Kếtluận
1.1. Khả năng kháng mọt của 8 giống đậu xanh được đánh giá thông qua
cácchỉ tiêu như khối lượng hạt hao hụt, tỷ lệ nhiễm mọt, hệ số gia tăng quần
thể.Giống đậu xanh Tằm TH có khả năng kháng mọt tốt nhất, chỉ số mẫn cảm
vớimọtC . c h i n e n s i s l à 6 3 4 , 6 3 ; g i ố n g đ ậ u x a n h Đ X 2 2 c ó k h ả n ă n g k h
á n g m ọ t kémnhất,chỉsốmẫncảmvớimọtlà1058,72vàcaohơnởgiốngTằmTH1,67 lần.
1.2. GenVrPDF1phân lập từ cây đậu xanh gồm 356 bp, có cấu trúc phânđoạn,
gồm hai exon và một intron. Đoạn mã hóa của genVrPDF1có
kíchthước228bp, mã hóa 75 amino acid.
1.3. Vector chuyển gen thực vật pBetaPhaso-VrPDF1biểu hiện ở hạt đã
đượcthiết kế thành công và hoạt động tốt trên cây thuốc lá.Gen
chuyểnVrPDF1đãhợpnhấtvàohệgencủacâythuốcláchuyểngenvàđượcditruyềntừthếhệT0 sang thế
hệ T1. Protein tái tổ hợp VrPDF1 có kích thước khoảng 10 kDađược biểu
hiện ở hạt thuốc lá và có khả năng ức chế-amylase của ruột ấutrùngmọt.
1.4. Biến nạp thành công cấu trúc pBetaPhaso-VrPDF1và tạo được dòng
câyđậu xanh chuyển gen ở thế hệ T1 từ giống đậu xanh ĐX22. Xác định
đượcprotein tái tổ hợp VrPDF1 biểu hiện ở hai dòng cây đậu xanh chuyển
gen thếhệ T1 (DX1-3 và DX1-7) có kích thước khoảng 10 kDa. Hiệu suất
chuyển genởgiốngđậuxanhĐX22đạt0,32%.ProteintáitổhợpVrPDF1biểuhiệnứcchế-amylase của
ấu trùng mọt, hiệu suất ức chế-amylase ở hai dòng đậuxanh chuyển gen
DX1-3 và DX1-7 thế hệ T1 tăng 166,40 % và 178,19% sovớicâykhơng
chuyển gen.
2. Đềnghị
Tiếp tục theo dõi, đánh giá hai dịng đậu xanh DX1-3 và DX1-7 ở
cácthếhệtiếptheo,thửnghiệmkhảnăngkhángmọtthơngqualây nhiễmnh
ântạonhằmchọntạodịngđậuxanhchuyểngenổnđịnhvềkhảnăngkhángmọt
cao.

24

MỞĐẦU
1. Đặtvấnđề
Đậux a n h l à m ộ t t r o n g b a c â y đậuđ ỗ c h í n h t r o n g n h ó m cá c c â y đậ
u ănh ạ t , đ ứ n g s a u đ ậ u t ư ơ n g v à l ạ c . H ạ t đ ậ u x a n h l à n g u ồ n t h ự c p h ẩ m g
i à u đạm.Hạtđậuxanhvừacungcấpproteinchoconngười,vừacógiátrịtrong
yh ọ c , v à c ũ n g l à c â y có g i á t r ị t r o n g c ả i t ạ o đ ấ t . V i ệ t N a m l à q u ố c g i a c ó
điềuk i ệ n t ố t đ ể p h á t t r i ể n s ả n x u ấ t n ô n g n g h i ệ p , t u y n h i ê n c ũ n g l à y ế
u t ố thuận lợi cho sâu hại phát sinh, phát triển gây tổn thất nghiêm trọng tới năngsuấtvàphẩm chất của
nơngsản.
Theoước
tính,tổnthấts a u t h u
h o ạ c h khoảngtừ1 0 % 30%s ả n l ư ợ n g cây trồngnông n g h i ệ p . Điều này cóng hĩ a làk h o ả n g 1 0
% - 3 0 % l ư ợ n g l ư ơ n g t h ự c k h ô n g b a o g i ờ đ ư ợ c s ử d ụ n g v à cũnglàtỷlệ
tổn thất của cơng sức và tài chính đầu tư trong sản xuất
nơngnghiệp.Dođó,việc đ á n h giá v à h ạ n c h ế t ổ n t h ấ t sa u t h u h o ạ c h l à cơng t
á c rấtc ó ý n g h ĩ a t r o n g v i ệ c đ ả m bảo l ư ơ n g t h ự c t r o n g đ i ề u k i ệ n h ạ n c h ế d
i ệ n tíchtrồngtrọtvàdânsốđanggiatănghiệnnay.
Đối với nhóm nơng sản là hạt thì một trong những nguyên nhân
chínhgây tổn thất đến số lượng và chất lượng hạt là côn trùng mà chủ yếu là
một
sốthuộcBộcánh cứng (thườnggọilàmọt).Các lồ imọtg ây hạichủyếuch
o đậuđỗlà:mọtđậuxanh(CallosobruchuschinensisL.),mọtđậuđỏ(Callosobruchus
maculatusF.),
mọt
đậu
nành
(Ancanthoscelides
obtectus)…
Trongđ ó , m ọ t đ ậ u x a n h Callosobruchusc h i n e n s i s L.t h u ộ c h ọ Br
uchid,bộColeopteralà loài gây hại chủ yếu cho hạt đậu xanh. Sự tổn hại do

mọt gâyralàrấtlớn,dođócơngtácphịngtrừmọtđậunóichungvàmọtđậuxanhnóiriêngđang là mộtvấn đề
cầnđược quan tâmnghiên cứu.
Hiện nay, đã có một số nghiên cứu bước đầu đánh giá về khả
năngkháng mọt, kháng nấm, kháng virus … trên một số loại cây trồng trong
đó
cóđậuxanh .T h eo các nghiên cứuđ ã cơngbố,đ ặc tí nh kháng mọthạ ihạt c
ủacâytrồngrấtphứctạpvàliên quan đến hoạt động của protein defensin.Defensin thực
vật là nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc trưng bởi cấu trúc gấp cuộnba chiều qua 8
cầu nối disulfide của các cystein. Defensin thực vật hoạt độngmạnh sẽ tổng
hợp protein ức chế, ảnh hưởng đến kênh trao đổi ion, tác
1


độngđếnhoạtđộngcủaα-amylasevàtrypsin, làmsuyyếu visinh vật… Cơchế
gây
độccủadefensinđốivớimọtđậuxanhlàsựcảntrởhoạtđộngphângiảitinh

24

1


DX1-3, DX1-7 ở bảng 3.10 cho thấy hiệu suất hoạt động của-amylase từ
ấutrùng mọt đậu xanh và dịch protein chiết từ cây chuyển gen giảm so với
dịchprotein chiết từ cây khơng chuyển gen, chỉ bằng 33,60% (DX1-3) và
21,81%(DX1-7).Nhưvậy
cóthểthấy
trongnghiêncứunày,proteintáitổhợprVrPDF1 của hai dòng đậu xanh chuyển
gen T1 đã ức chế hoạt động-amylase của ấu trùng mọt đậu xanh. So với cây
không chuyển gen, hiệu suấtức chế-amylase từ ấu trùng mọt đậu xanh của

rVrPDF1 ở dịng đậu xanhchuyểngen DX1-3 tăng 166,40%và
178,19%ởdịngDX1-7 (Hình 3.24).
Defensinởhạtđậuxanhcókhảnăngứcchế-amylasecủamọtđậu
xanh. GenVrPDF1(gen nội tại) mã hóa protein defensin ở đậu xanh có
kíchthước 356 bp, gen chuyểnVrPDF1 có kícht h ư ớ c 2 2 8 b p c ù n g
h o ạ t đ ộ n g phiên mã và dịch mã tổng hợp protein defensin VrPDF1 và
protein VrPDF1đều ức chế hoạt động-amylase của ấu trùng mọt đậu xanh.
Kết quả so sánhhiệu suất ức chế-amylase ở từ ấu trùng mọt đậu xanh của
rVrPDF1 ở dòngđậu xanh chuyển gen DX1-3 tăng 166,40% và 178,19% ở
dịng DX1-7 so vớicây khơng chuyển gen đã chứng minh sự tăng cường biểu
hiện defensin tronghạt bằng ứng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen là biện pháp
nâng cao khả năngkháng mọthạihạtcủacâyđậu xanh.

%

bột của-amylase trong ruột mọt và ngăn chặn sự tiêu hoá tinh bột của mọt,ức
chế sự sinh trưởng phát triển của mọt. Defensin trong hạt đậu xanh có
hàmlượngthấpvàkhácnhaugiữacácgiống,vìthếđểtănghiệuquảứcchếαamylasecủaruộtấutrùngmọt,việcứngdụngcơngnghệgennhằmtăngcườngbiểuhiện,nâng
caohàmlượngdefensintronghạtđượcquantâmnghiêncứu.Xuấtpháttừnhữngcơsởtrên,chú
ngtơilựachọnđềtàicholuậnánlà:“Nghiêncứutạocâyđậuxanhchuyểngencókhảnăngk
hángmọt”.
2. Mụctiêunghiên cứu
(i) Phânt í c h đ ư ợ c đ ặ c đ i ể m c ủ a g e n d e f e n s i n 1 ( VrPDF1)p h â n l ậ p t ừ c
á c giốngđậuxanhViệtNamcó khảnăng kháng mọtkhác nhau.
(ii) Biểuhiệnđượcgendefensin1trêncâythuốcláchuyểngen.
(iii) Tạođượccâyđậuxanhchuyểngenchứagenliênquanđếntínhkhángmọt
CallosobruchuschinensisL.
3. Nộidungnghiên cứu
3.1. Nghiên cứu đánh giá khả năng kháng mọt của một số giống đậu
xanhtrồngphổbiến ởmiền BắcViệtNam.

3.2. Nghiên cứu thơng tin, tách dịng và xác định trình tự
genVrPDF1phânlậpt ừ c â y đậux a n h . P h â n t í c h đ ặ c đ i ể m t r ì nh t ự n u c l e o t i
d e , t r ì n h t ự a m i n o acidsuydiễncủagenVrPDF1phân lập từ giống đậu xanh có khả
năng khángmọttốtnhấtvà giống đậuxanh kháng mọtkémnhất.
3.3. ThiếtkếvectorchuyểngenthựcvậtmanggenVrPDF1vàphântíchhoạt
độngcủavectorchuyểngentrên câythuốc láchuyểngenở thếhệ T0và T1.
3.4. Nghiên cứu chuyển cấu trúc chứa genVrPDF1và tạo cây đậu xanhchuyển
gen. Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp rVrPDF1 ở cây đậu
xanhchuyểngen ởthếhệ T1.
4. Nhữngđónggópmớicủaluậnán

200,0
180,0
160,0
140,0
120,0
100,0
80,0
60,0
40,0
20,0
0,0

178,19
166,40

100

100


33,60 21,81

Luậnánlàcơngtr
ìnhđầutiênởViệ
tNamnghiêncứu
cóhệthốngtừ

H
i
ệ
u
s
u
ấ
t
h
o
ạ
t
đ
ộ

2

23


n
g
c

ủ
a
a
l
p
h
a
-

a
s
e
c
ủ
a
d
ị
n
g
c
â
y
c
h
u
y
ể
n
a
m

y
l
a
s
e
c
ủ
a
d
ị
n
g
c
â
y
c
h
u
y
ể
n

H
i
ệ
u
s
u
ấ
t

ứ
c
c
h
ế
a
l
p
h
a
a
m
y
l

đánhg i á v à p h â n n
hómcácgiốngđậ
uxanhcókhảnăn
gkhángmọtkhá
c

WT

ĐX1-3

ĐX1-7

Hình3 . 2 4 . B i ể u đ ồ s o s á
n h hi ệu s u ấ t h o ạ t đ ộn g 
amylasev à h i ệ u s u ấ t ứ c c

hế-amylase của protein
defensin trong hỗn hợpamylase từ ấu trùng
mọtđậuxanh
và
dịch
protein chiếttừ câychuyển
gen, câykhông chuyển gen.

gent ă n g sovớicâyWT

nhau;p h â n l ậ p , t á c h d ò n g
g e n V r P D F 1 đến t h i ế t k ế
vectorchuyểngen,tạoc
âychuyển gen và phân tích
sựbiểu hiệngenchuyển
VrPDF1, cụ thể là:
1) ĐãphânlậpđượcgenVr
PDF1từDNAhệgencủaha
igiốngđậuxanhcókhảnăng
khángmọtkhácbiệtnhau.G

enVrPDF1cókíchthước356
bpgồm

2

23


Phântíchđịnhtínhhoạtđộcủa-amylasetừấutrùngmọtphângiảicơ

chấttinh bộtđượcthể hiện ởhình3.23.

Hình3.23.Hìnhảnhphântíchđịnhtínhkhảnăngứcchếα-amylaseấutrùngmọtđậu
xanh của protein tái tổ hợp rVrDEF1 từ hạt cây đậu xanh chuyểngen
ĐX22thếhệT1vàhạtcâyđậuxanhĐX22đốichứngkhôngchuyểngen.
3.3.5.ThảoluậnkếtquảtăngcườngbiểuhiệnproteinVrPDF1ởcâyđậu
xanhchuyển gen
Gen chuyển biểu hiện trong cây chuyển gen được kiểm tra dựa trên
kếtquả phân tích hoạt động phiên mã và dịch mã của gen chuyển bằng sử
dụngcác kỹ thuật RT-PCR, Real time RT-PCR, Western blot. Tương tự các
phântích biểu hiện gen của các nghiên cứu trước đây, trong kết quả nghiên
cứu củachúngtơi,proteintáitổhợpVrPDF1đượcbiểuhiệnởcảcâymơhìnhvàcâychuyển gen với kích
thước khoảng 10 kDa. Khác với các nghiên cứu trên,trong phân tích protein
tái tổ hợp ở cây chuyển gen chúng tơi sử dụng kỹ thuậtELISAđểsosánhmứcđộbiểuhiện
proteintáitổhợpgiữacácdịngcâychuyển gen. Theo đó, kết quả phân tích ELISA ở 2 dịng
đậu xanh chuyển genDX1-3 và DX1-7 đã xác định được hàm lượng protein táitổ hợp VrPDF1 ởdịng
DX1-7 cao hơn dịng DX1-3 (Hình 3.22). Như vậy, theo hướng tiếp cậnkhả
năng kháng mọt tương quan với hàm lượng protein defensin VrPDF1 thìkết
quả phân ELISA ở trên có thể dự đoán ở thế hệ đậu xanh chuyển gen T1dịng
DX1-7 có khả năng kháng mọt cao hơn dịng DX1-3. Tuy nhiên, điềunày cần
được kiểm chứng bằng thực nghiệm phân tích hoạt động ức chế-amylase
của protein tái tổ hợp VrPDF1 và so sánh khả năng kháng mọt giữacác dòng
đậu xanh chuyển gen và giữa dòng chuyển gen và cây đối chứngkhông
chuyển gen. Trong kết quả đánh giá hoạt động ức chế-amylase từ
ấutrùngm ọ t đ ậ u x a n h c ủ a p r o t e i n t á i t ổ h ợ p r V r P D F 1 c ủ a h a i d ò n g đ ậ u x
anh
22

1i n t r o n ( 1 2 8 b p ) x e n g i ữ a 2 e x o n ( 2 2 8 b p ) ; c D N A c ủ a g e n V r
P D F 1 c ó 228bp,mãhóa75 amino acid.

2) Protein tái tổ hợp rVrPDF1 được biểu hiện trên cây thuốc lá chuyển gen
vàdịch chiết chứa protein rVrPDF1 từ dịng thuốc lá chuyển gen T1 có khả
năngứcchế-amylase của ruộtấu trùngmọt.
3) Tạo được cây đậu xanh của giống ĐX22 mang gen chuyển VrPDF1 ở
thếhệ T1 và biểu hiện thành công protein tái tổ hợp rVrPDF1. Chứng minh
đượcdịch chiết chứa protein tái tổ hợp rVrPDF1 biểu hiện ức chế-amylase
của ấutrùngmọt,hiệusuấtứcchế-amylase ở hai dịng chuyển gen DX1-3 và DX1-7tăng
166,40%và 178,19%so vớicâykhơng chuyển gen.
5. Ýnghĩakhoahọcvàthựctiễn
5.1. Vềmặtkhoa học
Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của
genVrPDF1phân lập từ các giống đậu xanh Việt Nam có khả năng kháng
mọtkhác nhau. Sự tăng cường biểu hiện protein tái tổ hợp rVrPDF và biểu
hiệnkhả năng ức chế-amylase của ruột ấu trùng mọt của protein này từ
câychuyển gen là những cơ sở khoa học để khẳng định hiệu quả của việc
ứngdụng công nghệ gen nhằm nâng cao khả năng kháng mọt của đậu xanh
nóiriêng và câytrồng thu hạtnóichung.
5.2. Vềmặtthực tiễn
Các trình tự genVrPDF1phân lập được, cấu trúc vector chuyển
genthực vật mang genVrPDF1,các dịng cây chuyển gen ở T1, dịch chiết
chứarVrPDF1 có khả năng ức chế-amylase của ruột ấu trùng mọt đã góp
phầngiảiquyếtnhữngvấnđềcụthểvềviệcứng dụngkỹthuậtchuyểngentro
ngcảithiệnkhảnăngkhángmọtcủacâyđậuxanh,mởratriểnvọngứngdụngcông nghệ sinh học hiện đại
vào thực tiễn chọn giống cây trồng thu hạt ở ViệtNam.
6. Cấu trúc của luận án:Luận án có 119 trang (kể cả tài liệu tham
khảo)đượcchiathànhcácchương,phần:Mởđầu(4trang),Chương1:Tổng
quantàiliệu(31trang);Chương2:Vậtliệuvàphươngphápnghiêncứu(22trang);Chương 3: Kết quả và
thảo luận (42 trang); Kết luận và đề nghị (1 trang); Cáccơng trình cơng bố
liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (18trang).Luận án có
21bảng,31 hình và thamkhảo 158 tàiliệu.


3


Chương1.TỔNGQUANTÀILIỆU
Luận án đã tham khảo và tổng kết 158 tài liệu, trong đó có 27 tài
liệutiếng Việt, 126 tài liệu tiếng Anh và 5 địa chỉ trang web về 3 vấn đề cơ
bảnliên quan, như: (1) Đặc điểm của mọt hại đậu xanh và sự thiệt hại của mọt
gâyra cho đậu xanh; (2) Defensin thực vật; (3) Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen vàbiểuhiện gen
defensinthựcvậtởmộtsố loàithuộc chiVigna.
Đậuxanhlàcâythựcphẩmngắnngàygiátrịkinhtếcao,dễcanhtác,là
nguồn thực phẩm chứa đầy thành phần dinh dưỡng cho con người và
vậtni.Hiệnnay,đậuxanh đóngvaitrị quantrọng sauđậutươ ngvàlạc, b
ởi

3.3.4.Kiểmtrahoạtđộngứcchếα-amylaseamylasetừấutrùngmọtcủaprotein
táitổ hợprVrPDF1 ởthế hệ T1
Dịch chiết protein từ hạt đậu xanh của hai dòng chuyển gen DX13,DX1-7 ở thế hệ T1 đã kiểm tra sự biểu hiện protein defensin tái tổ hợp
bằngWestern blot và ELISA và dịch chiết protein từ hạt của cây không
chuyển genWTđượcsửdụngthửnghiệmkiểmtrakhảnăngứcchế-amylase của ấutrùng mọtđậu
xanh. Kếtquảđược thểhiệnởbảng3.10.
Bảng 3.10.Hoạt độ của-amylasetừ ấu trùng mọt đậu xanh trong các mẫu ủvới
dịchchiếtproteintừhạtcủacácdịngđậuxanhchuyểngenT1vàtừhạtcâykhơng chuyển gen
vậylànhómcâytrồngđượcưutiênkhuyếnkhích sảnxuất. Nhằmnângcao
Mẫu
ĐC
năngsuất,sảnlượngđậu x
anh,nhiềucơngtrìnhtậpt
rung nghiêncứu,chọntạov
à đ ư a r a các giống c ó chất

lượng,chốngchịuđiềuk
i ện b ấ t l ợ i v à p h ù hợpvớim
ọivùngđấtcanhtác.

4

Ch
ỉcó
α-amylase
a
m
yla
set
ừấ
u

21

Hỗnhợpα-amylase
amylasetừấu
tr
ù
ng
m
ọt
đậ
ux
trùng
an
hv

àd
ịc
h
pr
otei
n
chi
ết
từ
các
dị
ng
câ


y chuyển
gen

Sâubệnhlàngunnhântrựctiếpảnhhưởngtớinăngsuấtvàbảoquản
DX1-3
sauthuhoạchcáclồicâylấy
H
9,47±0,29
6,19±
hạtnhưđậuxanh,đậutương,
0,09
…,làmgiảmchất
lượngvàg iát rị thương ph
2,08±0,06
1,35±

ẩm củasảnphẩm, tr ongđ
0,05
ócómọt hạiđậu xanh.

Mọt
gây
hại
đậu
xanh(Callosobruchus
chinensisL.)khơng những
gây hạitrong kho dự trữ mà
chúng cịn lan truyền và
gây hại cả ở ngoài đồng
ruộng.Mọt đậu xanh gây
hại trên các loại đậu: đậu
xanh, đậu tằm, đậu đũa, đậu
HàLan, đậu đen trong đó
hại nặng nhất là đậu xanh
với tỷ lệ hại 100% (Bùi
CơngHiển, 1995). Sự thiệt hại do chúng
gâyralàrấtlớn,dođócơngtácphịngtrừsâu
mọt đậu nói chung và mọt
đậu xanh nói riêng đang là
một vấn đề cấp thiếtcần được

(ĐVHĐ/mg)

chế, ảnh hưởng đến chức
năng kênhion, tác động đến
hoạt động của α-amylase và

trypsin, làm suy yếu vi sinh
vật(Cavalho et al., 2011). Cơ
chế gây độc của defensin đối
với
côn
trùng
ở
hạtđậux a n h đượcmô t ả n h ư
l à s ự c ả n trở e nz ym e p h â n g
iảit i n h b ộ t , l à m cho

Bảng 3.10 cho thấy
hoạt độ của-amylase
trong thí nghiệm chỉ cóamylase từ ấu trùng mọt
và cơ chất tinh bột là 9,47
(ĐVHĐ/mg), trong khó
đóhoạt độ của-amylase trong
hỗn hợp-amylase từ ấu
trùng mọt đậu xanh vàdịch
protein chiết từ cây khơng
chuyển gen là 6,19
(ĐVHĐ/mg). Đối với
haidịng cây chuyển gen,
hoạt độ của-amylase
trong hỗn hợp-amylase từ
ấutrùng mọt đậu xanh và
dịch protein chiết từ dòng
cây chuyển gen DX1-3
là2,08 (ĐVHĐ/mg), từ
dòng DX1-7 là 1,35

(ĐVHĐ/mg). Như vậy có
thể thấy,dịch chiết protein
từ cây chuyển gen và cây
khơng chuyển gen đều có
hiệntượng làm giảm hoạt
độ-amylase so với thí
nghiệm chỉ có-amylase từ
ấutrùng mọt và cơ chất
tinh bột. Kêt quả phân tích
cho thấy hỗn hợpamylasetừ ấu trùng mọt
đậu xanh và dịch protein
chiết từ hai dịng cây

quantâmnghiêncứu.Trongnhữngnămquacó
nhiều cơng trìnhnghiên cứu chọn
tạo các loại cây trồng có khả
năng kháng các loại cơn
trùng,nấm và virus. Các
nghiên cứu đều thống nhất
rằng đặc tính kháng mọt hại
hạtcủa
câytrồngrấtphức
tạpvàliên
quanđến
hoạtđộngcủaproteindefensin.
Defensin thực vật là
nhóm chuỗi peptide nhỏ đặc
trưng bởi cấu trúc gấpcuộn ba
chiều qua tám cầu nối
disulfide của các cystein.

Defensin thực vậthoạt động
mạnh sẽ tổng hợp protein ức
4

21


chuyển gen(DX1-3 và
DX1-7) có hoạt độamylase thấp hơn ở cây
khơng chuyển gen.Điều
này
chothấy
proteintáitổhợprVrPDF
1tronghaid ò n g đ ậ u
x a n h chuyểngen
ởthếhệ
T1
cókhả
năngứcchế-amylase
từấutrùng mọt.

4

21


và cây WT không xuất hiện băng protein. Kết quả phân tích Western blot
đãchứng minh protein tái tổ hợp rVrPDF1 đã được biểu hiện thành cơng trên
haidịng đậu xanh chuyển gen DX1-3 và DX1-7 có nguồn gốc từ giống đậu
xanhĐX22. Như vậy có thể nhận xét rằng, gen chuyểnVrPDF1đã di truyền

quasinhsảnhữutínhtừthếhệT0sangT1,hoạtđộngổnđịnhvàbiểuhiệnởcảha
ithế hệ câychuyển gen.

Hình3.21.Kếtquảphân tíchWesternblottừ3dịngđậu xanhchuyển gen thếhệT1

mọt khơng thể tồn tại được. Khi mọt ăn hạt đậu xanh, defensin đã ức chế
hoạtđộng của α-amylase, do đó ngăn chặn sự tiêu hóa tinh bột, kìm hãm sự
sinhtrưởng,pháttriểnvà dần mọt sẽ chết(Henrik etal.,2009;Liu etal., 2006).
Trong những năm gần đây đã có một số nghiên cứu về cấu trúc và
hoạttínhsinhhọccủadefensinthựcvật,đềxuấtứngdụngtrongcơngnghệsinhhọctrongngh
iêncứuchứcnăngcủagendefensinvànângcaokhảnăngkhángmọtởcâyđậuxanh(Cavalhoetal.,
2009,2011;Dosetal., 2010;Henriketal.,2009; Tavars et al, 2008). Defensin thực vật biểu
hiện ở nhiều cơ quan khácnhau của cây và tạo ra tuyến phòng vệ đầu tiên
trước các đối tượng sâu bệnh.Mặc dù sự tác động giữa defensin thực vật và
nhiều đối tượng sâu bệnh cịnchưa được hiểu rõ, nhưng những defensin có
thể được sử dụng để tạo ra câytrồng biến đổi gen, giúp cải thiện khả năng
chống
chịu
mọt.
Chuyển
gendefensinởđậuxanhlàbiệnphápcơngnghệlàmtănghàmlượngdefensinnhằmtăng cường
khảnăngứcchếα-amylasecủaấutrùngmọt,từđónângcaokhảnăngkhángmọtởđậuxanh.

vàcâyđốichứngkhơngchuyển gen.

Chương2
Hàm lượng protein tái tổ hợp rVrPDF1 trong hạt của hai dòng DX13và DX1-7 ở thế hệ T1được phân tích bằng ELISA, kết quả được thể hiện ởhình
3.22. Biểu đồ cho thấy hai dịng đậu xanh chuyển gen tổng hợp rVrPDF1 với
hàm lượng protein dao động từ 6,23 µg/mg đến 9,26 µg/mg. Dịng DX17làh à m l ư ợ n g p r o t e i n r V r P D F 1 c a o h ơ n p r o t e i n r V r P D F 1 c ủ a d ò n g
D X 1 - 3 . Kết quả này đã chứng minh rằng ở hai dịng đậu xanh chuyển gen, proteinVrPDF1được tăng

cường biểu hiện.

Hình 3.22.Kết quả phân tích ELISA xác định hàm lượng protein tái tổ
hợpVrPDF1 của ba dòng đậu xanh chuyển gen (DX1-3, DX1-4, DX1-7) và cây
đốichứng khơngchuyểngen(WT).
20

VẬTLIỆUVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
2.1. VẬTLIỆU NGHIÊN CỨU
Sửdụnghạt8giốngđậuxanh,trongđó6giống(TằmTH,ĐX11,ĐX22,ĐXVN5,ĐX
VN6,ĐX14)doTrungtâmnghiêncứuvàpháttriểnđậuđỗ,ViệnCâyLươngthựcvàThự
cphẩm,ViệnKhoahọcNơngnghiệpViệtNamcungcấp,haigiống(ĐX17,V123)doViệnn
ghiêncứuNgơĐanPhượngcungcấp.GiốngthuốcláK326doPhịngCơngnghệtếbàothựcvật,ViệnCơng
nghệsinhhọc,ViệnHànlâmKhoahọcvàcơngnghệViệtNamcungcấp.
Các chủng vi khuẩnE. coliDH5α vàA. tumefaciensCV58 do phịngCơng
nghệ tế bào thực vật của Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
KhoahọcvàCơng
nghệ
Việt
Nam
cungcấp.Cácloạivector:Vectortáchd ị n g pBT, vector pBeta-Phaseolin và vector pDON201SLHEPdoPhịngCơngnghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn
lâm Khoa học vàCôngnghệViệtNamcung cấp.
2.2. HOÁCHẤT,THIẾTBỊVÀĐỊAĐIỂMNGHIÊNCỨU

5


Hoá chất, các bộ KIT được mua tại các hãng nổi tiếng Thế giới
nhưBio-Neer, Fermentas, Invitrogen...; Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng
mọtcủa 8 giống đậu xanh nghiên cứu được thực hiện tại phịng thí nghiệm

củaTrungtâmCơngnghệsinhhọc,TrườngĐạihọcNơngLâmBắcGiang.C á c thínghiệm
phânlậpgen,thiếtkếvectorchuyểngenvàocâythuốclávàphântíchcâychuyểngenđượctiếnhànhtạiphịngCơngnghệADN
ứngdụng,phịngCơng nghệ Tế bào thực vật - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn
lâm Khoahọc và Cơng nghệ Việt Nam. Thí nghiệm chuyển gen vào cây đậu
xanh đượctiến hành tại phòng thí nghiệm Cơng nghệ tế bào thực vật, Khoa
Sinh học,trườngĐạihọcSưphạm-ĐạihọcTháiNgun.
2.3. PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU
2.3.1. Phương pháp đánh giá kháng mọt của các giống đậu xanh
nghiêncứu
Phương pháp lây nhiễm mọt nhân tạo theo Tomooka và cs (1992),
HàQuangHùng (2005).
2.3.2. Phươngphápphânlập,táchdịngvàxácđịnhtrìnhtựnucleotide
KỹthuậttáchdịnggenđượcthựchiệntheoSammbrookvàcs(2001).
Trình tự nucleotide củagen VrPDF1 được xác định trên máy
đọct r ì n h tự nucleotide tự động ABI PRISM@ 3100 Advant Genetic
Analyzer (AppliedBiosystem) sửdụng bộ hố chất sinh chuẩn BigDye®
Terminator v3.1 CycleSequencing.
2.3.3. Thiếtkế vector chuyển gen
(1) Tạo cấu trúc độc lập mang gen chuyển pDON201-SLHEP-VrPDF1;
(2)Gắn cấu trúc mang gen chuyểnVrPDF1vào vector chuyển gen thực
vậtpBetaphaso-VrPDF1.
2.3.4. PhươngpháptạocâychuyểngennhờvikhuẩnA.tumefaciens
Tạo cây thuốc lá chuyển gen: Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông
quaA.tumefaciensđược tiến hànhtheo phương phápcủa Topping (1998).
Tạo cây đậu xanh chuyển gen: Phương pháp chuyển gen thông qua nách
lámầm nhờA. tumefaciensđược tiến hành dựa trên nghiên cứu của Sonia và
cs(2007) và tham khảo hệ thống tái sinh phục vụ chuyển gen vào đậu xanh
củaNguyễn Thị Luyện(2009), Chu Hoàng Mậu (2010) và Nguyễn Vũ
ThanhThanh(2012).


HiệusuấtchuyểngenVrPDF1ởgiaiđoạnnàyđượcxácđịnhđạt0,79%(5/630
=0,79%).
Sử dụng Southern blot kiểm tra kết quả gắn gen
chuyểnVrPDF1vàohệg e n c ủ a t ế b à o c h ủ . N ă m d ò n g đ ậ u x a n h c h u y ể n g e n
T 0 d ư ơ n g t í n h v ớ i PCR DX0-1, DX0-3, DX0-4, DX0-7, DX0-8 và cây đối chứng không chuyểngen
WT đã được sử dụng để phân tích Southern blot, kết quả thể hiện ở hình3.20.

6

19

KbM ( + ) W T 1 2 3 4 5

10,0
7,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,5

Hình 3.20.Kết quả phân tích Southern blot của DNA tổng số các cây đậu
xanhchuyển genVrPDF1với đoạn dònptIIđ ư ợ c đ á n h d ấ u b ằ n g
b i o t i n . M : M a r k e r 1kb, (-):cây đậu xanh ĐX22 khơng chuyển gen;
DX0-1,
DX0-3,
DX0-4,
DX0-7vàDX0-8:
cácdịngđậuxanhchuyểngenT0dươngtínhvớiPCR


Như vậy, những bằng chứng về sự có mặt và dung hợp của
genchuyển trong hệ gen của các cây chuyển gen ở thế hệ T0 bằng PCR
vàSouthern blot chính là kết quả bước đầu tạo cơ sở cho sự thành cơng của
quytrình chuyển genVrPDF1vào cây đậu xanh. Các dịng cây đậu xanh
chuyểngen được chăm sóc và ưu tiên phát triển phục vụ những phân tích tiếp
theo vềkhả năng hoạt động và biểu hiện mạnh của gen chuyểnVrPDF1trong
câychuyển gen.
3.3.3.PhântíchsựbiểuhiệncủagenchuyểnVrPDF1trongcácdịngcây
đậuxanh chuyển genT1
Kết quả lai Western phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp từ hạt của
3dòng cây đậu xanh chuyển gen và cây WT trên hình 3.21 cho thấy, trên
mànglaixuấthiệnbăngmàuởvịtríkíchthướckhoảnggần10kDaở2dịngcâ
yđậuxanhchuyểngen(DX1-3,DX1-7)ởthếhệT1.DịngchuyểngenDX1-4


2.3.5.Nhómphươngphápphân tíchcây chuyểngen
KiểmtrasựcómặtcủagenchuyểnbằngkỹthuậtPCR.Phântíchcây
đậux a n h c h u y ể n g e n b ằ n g
Đối
T S
S S S Số
SouthernblotởthếhệT0
ch ổ ố
ố ố ố câ
đượct h ự c h i ệ n t h e o
ứn n m
c c c ys
0
gv g ẫ
h h â ốn

SouthernEM(1975).Phântích
àt
biểuhiệnproteintáitổhợpVrP
s u
ồ ồ y g
DF1tronghạt
hí
ố tạ
i i s só
câychuyểngenởthếhệT1bằn
ng m oc
k r ố ttr
gphươngphápđiệndiprotein
hi
theoLaemmli
ẫ h
é a n on
ệ
u ồi
o r g gn
m
ễ t hà
r
ê
n
gi
á
dài
thể(1970)vàWesternblot.ĐịnhlượngproteinVrPD
lưới

ELISAtheophươngphápcủaSunvàcs(2006).

Bảng 3.9.Kết quả biến nạp cấu trúc pPhaso-dest-VrPDF1 vào giống đậu
xanhĐX22

ĐC0*
ĐC1*

30
30

0
30

0
45

0
25

0
10

0
10
Thínghiệm

630

247


107

46

*

Ghi chú: ĐC0 lá mầm đậu
xanh khơng chuyển gen được
cấy trên mơi trường táisinh có
bổ sung kháng sinh; ĐC1*lá
mầm đậu xanh không chuyển
gen được cấytrên môi
trườngtáisinhkhôngbổsung
khángsinh

3.3.2. Xác định sự có mặt và
sự dung hợp của gen
chuyểnVrPDF1tronghệ
gencâyđậuxanhchuyển gen
Để kiểm tra sự có
mặt
của
gen
chuyểnVrPDF1trong hệ gen
18

7

35


23
của
cácdịngcây đậuxanh đư ợc c
huyển gen, th ự ch i ệ n phảnứ
ngPCRvớ i cặp mồ i đặc
hiệu,kếtquảt h ể hiệnởhình 3.19.

F


Chương3

Chỉs ố m ẫ n c ả m
mọtđượcxácđịnhth
ôngquacácchỉtiêu:
k h ố i lượngđ ậ u x a n h h a o
hụt,tỷlệnhiễmmọtv
àhệsốgiatăngquầnth
ể m ọ t . Giống có chỉ số mẫn cảm
mọtnhỏthìkhảnăngkhángmọtcaovà
ngược lại.Kếtquả
được
thểhiện qua bảng 3.1.

KẾTQUẢVÀTHẢ
OLUẬN
3.1. ĐÁNH
GIÁKHẢNĂNGKHÁ
NG

MỌT
VÀ
PHÂNLẬPGENVrPD
F1
CỦACÂYĐẬUXANH
3.1.1. Khảnăngkhángmọtc
ủacácgiốngđậuxanh
M (+)
nghiêncứu

0,5kb
0,25kb


~
0
,
3
5
k
b

~
0
,
2
5
k
b


(-) 1

2

3

4

56

7

Giống TằmTH ĐX11 ĐX22 ĐXVN5 ĐXVN6 ĐX14 ĐX17 V123
ểngenT0đượckýhiệulàDX0Chỉsố
1;DX0-3,DX0-4,DX0mẫnc
634,63 828,89 1058,71 760,35 792,55 961,54 902,88 687,76
ảm
7,DX0-8.
mọt

Bảng 3.1 cho thấy,
giống đậu xanh Tằm TH có
chỉ số mẫn cảm mọtthấp nhất
(634,63) và giống ĐX22 có
chỉ số mẫn cảm mọt cao nhất
(1058,72).Kết hợp các các kết quả phân
tích trên có thể nhận thấy giống đậu xanh
TằmTH có khả năng kháng
mọt tốt nhất và giống ĐX22
kháng mọt

kém
nhất.
Lựachọn2giống nàyđể tiếp tục
phân lập, tách dònggen.

8

Bảng 3.1. Kết quả đánh giá khả năng
kháng mọt của
các giống đậu
xanh
quacácthờigiann
hiễmmọt

khơng chuyểngen;1-8:
dịngcâyđậuxanhđược
chuyểngenVrPDF1

Hình 3.19.Kết quả điện
dikiểm trasản phẩm PCR
nhân
genV r P D F 1 t ừ
c á c dòng cây đậu xanh
được chuyển gen ở thế hệ
T0 bằng cặp mồiVrPDF1HinIII-F/VrPDF1-SalI-R.M:
thang DNA chuẩn 1 kb; (+):
đối
chứng
dương
là

plasmidpBT-VrPDF1;
(-)
sản phẩm PCR nhân
genVrPDF1cây đậu xanh

các

Kếtquảtrênđãchỉrarằ
ng,tronghệgencủacâyđậuxan
hchuyểngentươngứng
vớilànđiệndisố1,3,4,7,8đãcóm
ặtcủagenchuyểnVrPDF1.Tro
ng630mẫubiếnnạpthuđược5c
âyđậuxanhT0dươngtínhvớiP
CRvà5dịngcâyđậuxanhchuy
18

7


3.1.2.
ĐX22

KhuếchđạivàtáchdònggenVrPDF1từgiốngđậuxanhTằmTHvà

Lựa chọn hạt của giống Tằm TH (kháng mọt tốt nhất) và giống
ĐX22(kháng mọt kém nhất) làm đối tượng để phân tích đặc điểm của
genVrPDF1.RNA tổng số, DNA tổng số được tách từ mầm hạt đậu xanh và
được kiểm trabằngđiệnditrên gelagarose.Kếtquảđược thể hiệnởhình 3.2.
1


2

3

4 M

5

6

7 8

3.3.T Ạ O C Â Y Đ Ậ U X A N H C H U Y Ể N G E N V À B I Ể U H I Ệ N P R O T E I
N
TÁITỔHỢP rVrPDF1 ỞGIỐNGĐẬUXANHĐX22

3.1.1.ChuyểncấutrúcpPhaso-amylasedest-amylaseVrPDF1vàtạocâyđậuxanhchuyểngen
Chuyển cấu trúc pBetaPhaso-dest-VrPDF1vào giống đậu xanh
ĐX22được thực hiện nhờA.tumefacienslây nhiễm qua nách lá mầm. Kết quả
đượcthểhiệnởhình 3.18 và bảng3.9.

12M34

A

B

F


G

C

E
0,5 kb
cDNA

~

Gen
0,22 kb
DNA)

b

Hình
3.2.Kết
quả điện di
kiểm
tra
sảnphẩm PCR
nhân
genVrPDF1của
haigiống
đậu
xanh Tằm TH
và
ĐX22
(M:Thang DNA

chuẩn 1 kb
plus;
1,
3:
sảnphẩm PCR
nhân từ mRNA
và DNAhệgen

8

~0,35kb

của Tằm TH ; 2, 4:sản phẩm PCRnhân từmRNA vàDNA
hệgencủaĐX22).

17


H
ì
n
h
3
.
3
.
K
ế
t
q

u
ả
đ
i
ệ
n
d
i
k
i
ể
m
t
r
a
s
ả
n
p
h
ẩ
m

;
c
o
l
o
n
y

P
C
R
n
h
â
n

l
ạ
c

1
,

E
.

2
,

c
o
l
i

5
,

D

H
5

.
(
M
:

g
e
n
V
r
P
D
F
1
t
ừ

6
:
c
á
c
d
ị
n
g


T
h
a
n
g

k
h
u
ẩ
n

c
á
c

D
N
A

l
ạ
c

d
ị
n
g

c

h
u
ẩ
n

c
h
ứ
a

k
h
u
ẩ
n

1
k
b
8

v
e
c
t
o
17


r

m
a
n
g
c
D
N
A
v
à
D
N
A
g
e
n
V
r
P
D
F
1
c
ủ
a
g
i
ố
n
g

T
ằ
m

T
H
;
3
,

P
D
F
1

m
a
n
g

6
4
,
7
,

c
ủ
a


c
D
N
A
v
à

8
:
c
á
c

D
N
A
V
r

d
ị
n
g
k
h
u
ẩ
n
l
ạ

c

K

g
i
ố
n
g
Đ
X
2L
2
)

M

N

Hình 3.2 cho thấy,
băng DNA có kích thước
khoảng 0,25 kb và 0,35
kbđúngnhưtínhtốnlýthuyếtvềkíchthước
cDNA và kích thước của
genVrPDF1.Sản phẩmPCR
đư ợ c tách khỏi bảngel,ti n
h sạchvàgắn trực ti ếp vào
vectortáchdịngpBT,sauđóđượcnhândịng
trong tế bàoE. coliDH5.Tiến
hành chọn dòng bằng phản

ứng colony-PCR trực tiếp từ
khuẩn lạc. Kếtquả điện di
cho thấy sản phẩm colonyPCR xuất hiện một băng
DNA có kíchthước khoảng
0,22 kb và 0,35 kb đúng như
tính tốn lý thuyết (Hình

c
h
ứ
a
v
e
c
t
o
r
8

J

I

H

O

3.3). Kếtquả ởhình3.3 cũng
cho
thấy

kếtquảchọndịngthànhcơng
vàcácd ị n g khuẩnl ạ c d ư ơ n
gtínhvớiPCRđượcsửdụ
ngtáchchiếtplasmidtáit
ổ h ợ p phụcvụ việc xác định
trình tựnucleotide.

17


Hình 3.18.Hình ảnh
q trình biến nạp cấu
trúc
pBetaPhasoVrPDF1quamơ nách lá
mầm và tái sinh cây
đậu
xanh
chuyển
gen.A:
Hạt
đậu
xanhĐX22; B: Khử
trùng hạt bằng khí clo;
C: Gieo hạt trên môi
trường GM; D:Nảy mầm
hạtsau3ngày;E:lámầmvànáchlá
mầm làm nguyên liệu biếnnạp;
F: Nhiễm khuẩn trong
30 phút; G: Đồng nuôi
cấy trên CCM; H:

Cảmứng tạo chồi trên
SIM 1; I: Sau 2 tuần
trên SIM 1; J: Cảm ứng
tạo chồi 2tuần trên SIM
2; K: Chọn lọc và kéo
dài chồi trên SEM; L:
Ra rễ; M: Câyragiá
thể;NO:Câytrồngtrongchậuở
điều kiện nhà lưới

8

17


10

8,57

8
5,69

5,35

6
3,57
4
2
0


0
WT

T1-7

T1-8

T1-10

T1-11

Hình 3.16.Biểu đồ so sánh hàm lượng protein rVrPDF1 tái tổ hợp (g/mg
proteintổngsố)giữacácdịngthuốcláchuyểngen.WT:câythuốclákhơngchuyểngen,T1-7, T1-8, T1-10, T111: bốn dịng thuốc lá chuyển gen. Các số liệu trên mỗi cộtbiểu đồ là hàm lượng protein
rVrPDF1(g/mg protein tổng số). Thanh đứng trênmỗicột biểuđồlà sai số chuẩn.

3.1.3.Đặc điểmcủa genVrPDF1phânlậptừhaigiốngđậuxanhTằmTH
và ĐX22
Đặcđiểmcủađoạn mãhóathuộc genVrPDF1phân lập từmRNA
Kếtquảđọctrìnhtựnucleotidecho thấy:ĐoạncDNAgenVrPDF
1có 228 nucleotide và bằng BLAST trong NCBI cho thấy: So với trình tự genPDF1mang mã số
AB020613.1 với genVrPDF1phân lập từ mRNA củagiống Tằm TH và DX22
có độ tương đồng tương ứng là99% và 96% (Hình3.4). Trình tự nucleotide
của genVrPDF1(cDNA) phân lập từ mRNA của haigiống đậu xanh Tằm THv à
Đ X 2 2 đ ã đ ư ợ c đ ă n g k ý t r ê n n g â n h à n g g e n v ớ i mã
số
LN913082.1
và
LN913083.1.
So
với

AB020613.1
genVrPDF1củaTằmTHcó5vịtrínucleotide
saikhác
và
ĐX22c ó 8
vịtrínucleotide .

Thửnghiệmhoạtđộngứcchếα-amylasecủaproteintáitổhợprVrPDF1
Đểp h â n t í c h c h ứ c n ă n g s i n h h ọ c c ủ a p r o t e i n t á i t ổ h ợ p r V r
D E F 1 tronghạtcủacácdòngthuốcláchuyểngenởthếhệT1.Dịchchiếtchứaenzyme-amylase của ấu
trùng mọt đậu xanh được ủ với dịch chiết protein từhạtcácdịngcâychuyểngenvàdịchchiết
proteintừhạtcâyđốichứngkhơngchuyển gen để kiểm tra ảnh hưởng của protein tái tổ hợp
rVrDEF1 đến hoạtđộngcủa-amylasephân giảitinh bột,kếtquảđượctrình
bàyởhình3.17.

WT

120
100

100,00

80
60
40
20

32,1229,40
19,24


0

16

9

27,95

T1-7

T1-8

T1-10T1-11


giống
Tằm
TH và ĐX22
với
protein
suy diễn từ
AB020613.1
trênNgânhàng
Gen, kếtquả
được
thể
hiệnởhình3.5.

Hình
ốAB020613

rình
ênGenBank
cleotide
Tiếp
ủa
tục phân tích,
PDF1
so sánh trình
NA)
tự
amino
iống
acid suy diễn
anh
Tằm
từ
trình
22
tựcDNA của
mang

ế
t

H
o
ạ
t

Hình3.17.Biểuđồsosánh

kếtquảthửnghiệmhoạtđộngứcc
hếcủarVrPDF1
đốivới-amylasetừấutrùng
mọtđậuxanh.

Kếtquả biểu
hiệngenởcâythuốc
lá mơhình thành
cơnglà cơsở để
chúngtơitiến hànhchuyểncấu
trúcvàocâyđậuxanh.

Hình3.5.Trìnhtựaminoacid
suydiễntừgenVrPDF1củah
aigiốngđậuxanhTằmTH,
ĐX22
vàđoạntrìnhtựmangmãsốAB02
0613.

p
r
o
t
e
i
n

đ
ộ


c
ủ
a

c
ủ
a

a
l
p
h
a
a
m
y
l
a
s
e

c
â
y
c
h
u
y
ể
n

g
e
n
s
o
v
ớ
i
k
h
i
ủ
v
ớ
i
d
ị
c
h
c
h
i
ế
t
p
r
o
t
e
i

n
c
ủ
a
c
â
y
đ
ố
i
c
h
ứ
n
g

t
ừ

ấ
u

t
r
ù
n
g

m
ọ

t

k
h
i
ủ

v
ớ
i
d
ị
c
h

c
h
i

16

9


Từh ì n h 3 . 5 c h o t h ấ y , p r o t e i n V r P D F 1 g ồ m 7 5 a m i n o a c i d v
à c ó đ ộ tươngđồngcao.SovớiproteinmangmãsốAB020613thìtrìnhtựaminoacidsuydiễncủagiốngTằmTHcóđộ
tương đồng 96%, của mẫu ĐX22 có độtương đồng 92%; cịn trình tự amino acid suy
diễnVrPDF1của hai giống đậuxanhtương đồng là 88%.
Trình tự genVrPDF1(cDNA) phân lập từ mRNA của giống Tằm
THkháng mọt tốt nhất được sử dụng để thiết kế vector chuyển

genVrPDF1nhằmmụcđíchnângcaokhảnăngkháng mọt của câyđậu xanh.
ĐặcđiểmcủagenVrPDF1phân lậptừDNAtổng số
KếtquảgiảitrìnhtựnucleotidecủagenVrPDF1phânlậptừDNAt ổ n g sốcủagiốngđ
ậuxanhTằmTHvàĐX22chothấy:GenVrPDF1cókíchthước356nucleotidevàbằngBL
ASTtrongNCBIđộtươngđồngcủagenVrPDF1sovớigenPDF1mang
mã
số
AB020613.1 trên GenBank từ 95% đến 99%. Việc sosánh trình tự
genVrPDF1phân lập từ DNA và từ cDNA ở hai giống đậu
xanhTằmTHvàĐX22chophépxácđịnhđượcđặcđiểmcấutrúccủagen.

vào cây thuốc lá và gen chuyểnVrPDF1đã được hợp nhất vào hệ gen câythuốc
lá.
3.2.4. Phân tích sự biểu hiện protein VrPDF1 tái tổ hợp trên cây thuốc
láchuyển genở thế hệT1
Trong 7 dòng thuốc lá chuyển gen cho kết quả lai Southern có 5
câychuyển gen thu được hạt. Hạt của các cây T0 chính là thế hệ cây chuyển
genT1 và các dịng thuốc lá chuyển gen T0 thu được hạt ký hiệu là T1-4, T17,T1-8, T1-10, T1-11. Sử dụng 5 dòng thuốc lá chuyển gen T1 và cây đối
chứngkhông chuyển gen để phân tích sự biểu hiện protein VrPDF1 tái tổ hợp tronghạt. Kếtquả thểhiện
quahình 3.15.
MW T T 1 - 4 T 1 - 7

25kDa
15kDa

Kết quả so sánh trình tự nucleotide của genVrPDF1phân lập từ DNA
hệgen và genVrPDF1phân lập từ mRNA đã khẳng định genVrPDF1đã phânlập
thành công từ hệ gen hai giống đậu xanh Tằm TH và ĐX22. Hai trình tựgen
VrPDF1 của giống Tằm TH và ĐX22 đã được công bố trên Ngân
hàngGenvớicác mã số LT797533, LT797534.

3.1.4.Thảoluậnvềcấu trúccủa proteindefensin
Kết quả so sánh vùng chức năng của VrPDF1 giữa giống đậu
xanhkháng mọt tốt và kháng mọt kém khơng thấy có sự thay đổi ở các cầu
nốidisunfidegiữa4 cặp Cyst r o n g vùng chức năngcủa defeinsin(Hình 3 .7
)vàcấutrúc khơng giangiữahaiprotein VrPDF1 khơng có sựkhác nhau.
L1

L2

L3

L4

T1-8T 1 - 1 0 T 1 - 1 1

35kDa

10kDa



Hình3.15.Kết quảlai Westerncủaproteinhạt từmột sốdòngthuốcl á chuyển
gen thế hệ T1 với kháng thể cmyc. M: thang protein chuẩn từ 10 đến180
kDa; WT: protein cây thuốc lá đối chứng (không chuyển gen); T1-4, T1-7,
T1-8, T1-10, T1-11: protein của các dòng cây thuốc lá chuyển gen
dươngtínhvớilaiSouthern.
Hình 3.15 cho thấy, trên màng lai nitrocellulose xuất hiện băng màu
ởvị trí kích thước khoảng gần 10 kDa ở 4 dòng cây thuốc lá chuyển gen (T17,T1-8, T1-10, T1-11)ởthếhệT1.
Đểđ á n h g i á m ứ c đ ộ b i ể u h i ệ n p r o t e i n t á i t ổ h ơ p s ử d ụ n g k ỹ t h
uật


L5L6L 7

ELISA,k ế t q u ả đ ư ợ c t h ể hiệnở b i ể u đồ t r ê n hình3 .16 .T rênh ình3. 16 c ác
c

dịngthuốclá chuyển gen có hàm lượngproteinrVrPDF1 dao động từ3 ,57
TamTHDX22

10


g
/
m
15


gproteintổng
mgprotein

einVrPDF1cao nhất(8,57g/mgprotein
tổngsố).
a

d
l
ư
ợ
n

g
p
r
o
t

10

b

H
ì
n
h
3
.
7
.
S
ơ
đ
ồ
c
á
c
c
ầ
u
n
ố

i
d
i
s
u
l
f
i
d
e
g
i
ữ
a
c
á
c
c
ặ
p
C
y
15