VIỆNHÀN LÂM KHOA HỌC VÀCÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌCVIỆN KHOA HỌCVÀ CƠNG NGHỆ
……..….***…………

LÊTẤT THÀNH

NGHIÊNCỨUSÀNGLỌC,PHÂNLẬPVÀNHẬNDẠNGCÁCHO
ẠT CHẤT AXIT BÉO, AXIT
ARACHIDONICVÀPROSTAGLANDINTỪRONGĐỎBIỂN

Chun ngành:Hóa học các hợp chất thiên
nhiênMãsố: 62 44 01 17

TÓMTẮT LUẬNÁN TIẾN SĨHÓA HỌC

HàNội - 2016


Cơngtrìnhđượchồnthànhtại:HọcviệnKhoahọcvàCơngnghệ-ViệnHàn
lâmKhoahọc và Cơng nghệViệtNam

Ngườihướngdẫnkhoahọc1:GS.TS.PhạmQuốcLong
Ngườihướngdẫnkhoahọc2:TSKH.AndreyB.Imbs.

Phảnbiện1:PGS.TS.HồngThanhHương
Phảnbiện2:GS.TS.LãĐìnhMỡi
Phảnbiện3:PGS.TS.TrầnThuHương

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ
tạiPhòng họp tầng 2, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn
lâmKhoa họcvàCơngnghệViệt Nam.

Vàohồi……..giờ……,ngày…… tháng…..năm2016
Cóthểtìmhiểuluậnántại:
- ThưviệnHọcviệnKhoahọcvàCơngnghệ
- ThưviệnQuốcgiaViệtNam
I. GIỚITHIỆULUẬNÁN
1. Tínhcấpthiết
Nhóm các axit béo C20 đa nối đơi, điển hình là axit arachidonic(AA)
và axit eicosapentaenoic (EPA), có vai trị quan trọng nhất trongnhóm chất


lipit của cơ thể động vật bậc cao vì chúng là tiền chất để sinhtổng hợp ra
các eicosanoid là nhóm các phân tử dẫn truyền tín hiệu sinhhọc (cịn gọi là
các hoocmon tổ chức) như các prostaglandin, prostacyclin,leukotrien,
vàthromboxan.
Axit arachidonic là thành phần chính của các phospholipit cấu tạonên
màng của tế bào não, cơ bắp và gan và thường được phân lập từ lipitcủa
gan, trứng của các loài cá biển. AA cũng là thành phần chính trong lipit của
một số lồi rong biển. Axit arachidonic có tác dụng kích hoạt hệenzyme NADPH oxygenase giúp
hoạt hố q trình trao đổi oxi, kích hoạtcác kênhionK +, Ca2+…
Cácprostaglandin(PG)đượchìnhthànhtừcáccácaxitbéoC20đanốiđ
ơiquaqtrìnhchuyểnhốbằngenzymtrongcơthểvàcóchứcnăngsinhhọ c quan t
rọn gđối vớ i động v ật. Chúng là m ột m ắtxíc hquantrọng trongchuỗiphản
ứngmiễndịchcủacơthể,liênquanđếncáchiệntượngquant r ọ n g n h ư v i ê
m t ấ y v à u n g t h ư . C h ú n g c ũ n g t á c đ ộ n g l ê n k h ả n ă n g chịuđựngcủahệcơphẳng,hệ
bàitiết,hệtiêuhóavàhệtuầnhồntrongcơthểsống.Chínhvìvậy,chúngcũngđượcsửdụnglàm
thuốcđểđiềutiếtcácqt r ì n h t h ụ t h a i , m a n g t h a i v à s i n h đ ẻ v à v ìt h ế đ ư ợ c c o
in h ư m ộ t c hấ t hormon.C á c p r o s t a g l a n d i n đ ư ợ c c á c n h à k h o a h ọ c n g h i ê
n c ứ u t ổ n g h ợ p haytìmkiếmtừcácnguồnnguyênliệutựnhiên,đặcbiệtlànguồn
sinhvậtbiểnv à đ ã đ ư ợ c p h á t h i ệ n t r o n g m ộ t s ố l o à i r o n g Đ ỏ b i ể n c ù n g v ớ i
h à m lượngcaocácaxitbéokhơngnođanốiđơi.Vìthếrongđỏbiểnđượcđánhgiálàng

uồnngunliệutựnhiêntiềmnăngđểkhaitháccáchoạtchấtnày.
Trên cơ sở các phân tích nêu trên, chúng tơi đã lựa chọn rong Đỏ
làđối tượng nghiên cứu với đề tài:“Nghiên cứu sàng lọc, phân lập và
nhậndạngc á c h o ạ t c h ấ t a x i t b é o , a x i t a r ac h i d o n i c v à p r o s t a g l a n d i
n t ừ r o n g Đỏbiển”.
2. Mụctiêucủaluậnán
Mục tiêu rộng của luận án là điều tra, khai thác tài nguyên lipit trong
cácloàirong đỏ biển đỏ củaViệtNam.Các mục tiêucụ thể bao gồm:
1


Sàng lọc hóa học, xây dựng ngân hàng dữ liệu về hàm lượng
lipit,thành phần axit béo và prostaglandin trong các mẫu rong đỏ biển đại
diệncho các loài, các địa phương, các điều kiện sinh trưởng, nuôi trồng và
thờikỳt h u h o ạ c h k h á c n h a u . X á c đ ị n h c á c y ế u t ố ả n h h ư ở n g đ ế n s ự t í c h l
ũ y lipitvàcácthànhphầnnêutrên.
- Tìm kiếm các lồi rong Đỏ biển của Việt Nam có tiềm năng thu
nhậncácthànhphầnlipitcógiátrị,đặcbiệtlàcácaxitbéoC20đanốiđơivàcácprostaglandin.
- Thử nghiệm ni trồng một số lồi rong đỏ chọn lọc, trong đó
có:một lồi rong Đỏ có giá trị di thực từ LB Nga; một loài rong Đỏ của
ViệtNam. Xác định động thái hình thành, tích luỹ axit béo và PG của nó
trongqtrìnhni trồng.
- Xây dựng phương pháp phân lập các hoạt chất AA, PG từ các
loàirongĐỏbiển.
3. Nộidungnghiêncứucủaluậnán
- Phântích hàmlượng lipitvà thành phần axitbéo của68 mẫu rong đỏ
ViệtNamvà01mẫurongđỏLBNga.
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành và tích luỹ
lipitvàcácaxit béocủarongĐỏ.
- Sử dụng phương pháp phân tích thành phần chính PCA và

phươngpháp phân tích chùm để xử lý tập dữ liệu về thành phần axit béo
của cácmẫu rong đỏ, tìm các mối quan hệ giữa các mẫu với nhau và với
các thànhphầnaxit béo.
- Sàng lọc các hoạt chất prostaglandin và axit arachidonic trong
cácmẫurongĐỏbiểnthuthậpđược.
- Khảo sát một số điều kiện sinh trưởng và phát triển của lồi rong
câuGracilaria vermiculophyllathu từ vùng biển Viễn Đơng - Liên bang Ngatrong
điều kiện PTN để theo dõi sự biến động hàm lượng các axit béo
vàprostaglandintrongqtrìnhni trồng.
- Phân lập, nhận dạng và chứng minh cấu trúc PGE 2, PGE3và
axitarachidonic từ loài rong Đỏ có tiềm năng thu ở biển Việt Nam và biển
ViễnĐông–LiênBangNga.

2


4. Nhữngđónggópmớicủaluậnán
1. Tập dữ liệu về hàm lượng lipit, thành phần axit béo và
prostaglandincủa 69 mẫu đại diện cho 25 loài thuộc 9 họ rong đỏ
biển của ViệtNam thu ở các địa phương, các điều kiện sinh trưởng,
nuôi trồng vàthời kỳ thu hoạch khác nhau cùng với 01 mẫu rong đỏ
Liên bangNga; Kết quả xác định và đánh giá các nhóm axit béo có
giá trị caothuộc các dãy omega-3, omega-6, các axit béo khơng no
thiết yếuPUFA và HUFA, trong đó lần đầu tiên xác định được axit
C22:6n-3(DHA) có trong5mẫurongđỏ.
2. Kết quả sử dụng phương pháp phân tích PCA và phân tích chùm
xửlý tập số liệu 12 thành phần axit béo chính yếu của 69 mẫu rong
đỏthuđượcchophépphânbiệtkhárõràngcácmẫuthuộc3họGracilariacea
e, Hypneaeceae và Ceraminaceae và mối liên hệ củachúngvới nhau.
3. Phương pháp xác định định tính và định lượng PGE 2từ các lồi

rongĐỏbiển.Từđó đã sàng lọc tìmPGE 2trong 69 mẫu nghiên cứu vàxác
định được 3 lồi rong Câu có hàm lượng PGE 2cao và có
khảnăngkhai tháchoạt chất này.
4. Kết quả khảo sát sự biến động và tích luỹ hàm lượng các axit béo
vàprostaglandincủalồirongGracilariavermiculophyllaLB
Ngatrongq trìnhnitrongphịng thínghiệm ở ViệtNam.
5. Phân lập, nhận dạng và chứng minh được cấu trúc của hoạt
chấtPGE2,PGE3vàAAtừnguyên liệu rongĐỏ biển.
5. Ýnghĩakhoahọcvàthựctiễncủaluậnán
- Luậná n đ ã b ổ s u n g c h o k h o d ữ l i ệ u đ i ề u t r a c ơ b ả n t à i n g u
y ê n HCTNbiểncủaViệtNamcácsốliệuvềhàmlượnglipit,thànhphầncácaxit béo và hàm lượng
prostaglandin của 70 mẫu đại diện cho 25 lồi thuộc9họrongĐỏbiểncủaViệtNam,
cósosánhvới1mẫurongbiểncógiátrịkinhtếcủaLBNga.
- phương pháp phân lập, nhận dạng PGE2, PGE3 và axit
arachidonictrong rong đỏ biển cùng với kết quả nghiên cứu động thái tích
luỹ
các
hoạtchấtn à y l à c ơ s ở k h o a h ọ c c h o v i ệ c s à n g l ọ c v à đ ị n h h ư ớ n g k
h a i t h á c nguồnhoạtchất này từcác nguồn rongbiển ViệtNam.


6. Bốcụccủaluậnán
Luận án gồm 133 trang, trong đó có 37 hình, 15 bảng, 4 biểu đồ.
Bốcục của luận án: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan (36
trang);Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (13 trang),
Chương 3:Thực nghiệm(8trang); Chương4: Kết quả và thảo luận (60
trang);
Kếtluậnvàkiếnnghị(3trang);Tàiliệuthamkhảo(9trang);Ngồiracịncó5
1trangphụlụcvớicáchìnhphổ,kếtquảphântíchTLC,GCvàGC-MS,HPLC, NMR.
II. NỘIDUNGCỦALUẬNÁN

MỞĐẦU
Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối
tượngvànhiệmvụnghiêncứucủaluậnán.
CHƯƠNG1.TỔNGQUAN
Trong phần tổng quan, luận án đã giới thiệu chung lớp chất lipit,
cácaxit béo (đặc biệt là các axit béo có hoạt tính sinh học như axit
arachidonic)và prostaglandin cũng như phương pháp nhận dạng, phân lập lớp chất lipit,axit
béovàcáchợpchất AA, PG.
Luậná n đ ã t ổ n g h ợ p v à đ á n h g i á t i ề m n ă n g n g u y ê n l iệ u r o n g b i ể n
Việt Nam từ một số cơng trình nghiên cứu về rong biển, trong đó tập
trungvàođối tượngrongĐỏbiển.
Việc đánh giá tổng quan tài liệu cho thấy, nguồn hoạt chất axit
béo,đặc biệt là các eicosanoit như prostaglandin có hoạt tính mạnh ở nồng
độthấpvàđãc ón hi ề uứ n gd ụn glàm t h u ố c . Việc tìm ki ế m n g u ồ n ho ạ tchấ
t này từ nguồn nguyên liệu có khả năng tái tạo cao như rong biển có ý
nghĩakhoahọcvàthựctiễn.ĐâycũnglàvấnđềmớitrênthếgiớivàViệtNam.
ỞViệt Nam, nghiên cứu sẽ đóng góp thêm các số liệu điều tra cơbản
về lớp chất lipit và các hoạt chất sinh học từ lớp chất này của đối tượngrong
Đỏ biển. Nghiên cứu cũng có giá trị thực tiễn cao mở ra triển vọngnuôi trồng, khai thác phát triển
nguồn nguồn lợi rong biển phục vụ pháttriểnkinhtếvùngvenbiển.


CHƯƠNG2.ĐỐITƯỢNGVÀPHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
2.1. Đốitượngnghiêncứu
Đối tượng nghiên cứu là 69 mẫu của 9 họ thuộc ngành rong
đỏRhodophyta trong đó họ: Gracilariaceae (47 mẫu của 8 loài),
Hypneaceae(10mẫucủa7loài), Ceramiaceae(4mẫucủa 3loài), Bangiac
eae(2mẫu
của 2 loài), Hylamaniaceae (2 mẫu của 1 lồi), Bonnemaisioniaceae
(1mẫu),Phyllophoraceae(1mẫu),Rhodymeniaceae(1mẫu),Halymeniaceae(1

mẫu).
Vị trí thu mẫu: 68 mẫu thu ở biển Việt Nam từ Quảng Ninh đến
NinhThuận;01 mẫu thu tạivùngbiễn Viễn Đông – Liên bangNga.
2.2. Phươngphápnghiêncứu
2.2.1. Phươngphápthuvàbảoquảnmẫu
Việc thu mẫu ở vùng triều dựa vào quy phạm tạm thời điều tra
tổnghợp biển (phần rong biển) của Uỷ ban KHKT Nhà nước ban hành
năm1981.KhảosátvùngdướitriềudựavàotàiliệuhướngdẫncủaWilkinso
n&Baker 1997bằngthiết bị lặn SCUBA.
Mẫu rong biển sau khi thu (khoảng 2 kg tươi) được rửa sạch
bằngnước mặn sau đó rửa bằng nước ngọt và bảo quản ngay trong nhiệt
độ4OC,sauđóchiađơivàbảoquảnbằngtủlạnhsâuở-20OCvà-47OC.
2.2.2. Phươngphápphânlập,táchchiếtlipit,axitbéo,AA,PG
2.2.2.1. Phươngphápchiếtlipittổng

Chiết lipit tổng bằng phương pháp đặc hiệu Bligh&Dyer, 1959,
sửdụnghệdungmôiCHCl 3:CH 3OHvớitỉlệ1/2(v/v).
2.2.2.2. Phươngpháp phân lập cácaxitbéo,AA,PG

Để phân lập các axit béo, axit arachidonic, prostaglandin từ rong
đỏsửd ụ n g c á c p h ư ơ n g p h á p s ắ c k í l ớ p m ỏ n g ( T L C ) , s ắ c k í l ớ p m ỏ n g đ i
ề u chế,sắckícộtápxuấtthường(CC),sắckílỏnghiệunăngcao(HPLC).


2.2.3. Phươngp h á p x á c đ ị n h t h à n h p h ầ n , h à m l ư ợ n g v à c ấ u t r ú c
c á c axitbéo,AA,PG
2.2.3.1. Cácphươngphápxácđịnhthànhphần,hàmlượngcáchợpchất

Thànhphầnvàhàmlượngaxit
béoxácđịnhtheophươngphápISO/FDIS659:1998,sửdụngGC-FIDvàGC-MS.

Xácđịnhhàmlượngprostaglandin(dạngđãđượcmethylvàsilylhoá)bằngGCMS.
2.2.3.2. Cácphươngpháp nghiêncứu cấutrúccáchợp chất

Sử dụng phương pháp phổ khối lượng ion hoá phun mù điện tử ESIMS, phổ khối bắn phá điện tử EI-MS, phổ khối phân giải cao LCMS-ITTOF, các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều 1H-NMR,13CNMR, DEPT và các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều 1H1
HCOSY, HSQC, HMBC, NOESY.
2.2.4. Phươngphápphântíchcấutửchính
Phương pháp phân tích cấu tử chính (PCA, Principle
ComponentAnalysis) và phân tích chùm (cluster analysis) được sử dụng để
xử lý cácsố liệu đa biến về thành phần các axit béo của các mẫu rong đỏ
nhằm
tìm
racácm ố i t ư ơ n g q u a n c ủ a c h ú n g v ớ i n h a u . P h ầ n m ề m S t a t i s t i c a
- P C A 6 9 đượcsửdụngđểthựchiệnphépphântíchcấutửchínhvàphầnmềmSurfer32đượcsửdụngđểthựchiện
phép phân tích chùm. Các số liệu được xử lýtrước khiphântích bằngphần
mềmMicrosofExcel.
CHƯƠNG3.THỰCNGHIỆM
Cácmẫuđượctiếnhànhnghiêncứutheosơđồchungnhưsau:


3.1. Chiếttáchvàxácđịnhhàmlượnglipittổng
Cân 100 gam mẫu rong biển tươi, nghiền nhỏ bằng máy xay,
chiếtbằng hệ dung môi CHCl 3:CH3OH tỉ lệ 1:2 (100ml CHCl 3: 200ml
CH3OH),siêu âm trong 6 giờ. Bổ sung 100ml CHCl 3, thêm 100ml nước cất,
lắc đều,đợi phân lớp lấy phần dung dịch ở phía dưới, rửa lại bằng nước cất
thêm 2lần sau đó làm khan bằng Na 2SO4. Cô cất loại dung môi thu lipit
tổng(phươngpháp chiếtđược lặp lại3 lần lấy giá trịtrung bình).
3.2. Xácđịnhthànhphầnvàhàmlượngcácaxítbéo
Lấy10mglipittổngđượchịatanvới1mln-hexantronglọnhỏnútkín,bổsung 25ml dung
dịch CH3ONa 30% và lắc kĩ trong 1 phút. Thêm vào
20mgNa2SO4loạisạch,lắckĩvàđemlytâmởchếđộ5000vịng/phúttrong1phút.Dịchtron

g,sạchởphatrênđượctáchriêng,kiểmtratrênsắckíbảnmỏng(TLC).
TiếnhànhphântíchtrênmáysắckíkhíGC,nhậndạngaxitbéobằngphầnmềmchuy
êndụng,tínhtốnchuyểnđổiquagiátrịthờigianlưutươngđươngECL(Equivalent Chain
Length) có sử dụng hệ chấtchuẩn là các axit béo C16:0 và
C18:0.Kếtquảđượctínhtheocơngthức:
2(lgRTx–logT16:0)
lgRT18:0–lgRT16:0
3.3. Sànglọcđịnhtính,địnhlượngprostaglandin
3.3.1. Phântíchđịnhtínhprostaglandin
Lấy 25g rong tươi, nghiền trong nitơ lỏng, bổ sung 50ml nước
cất,khuấy bằng máy khuấy từ trong thời gian 60 phút ở nhiệt độ 5-6 0C. Nhỏ
từtừaxitHClđặc vàkiểm tra chođếnkhipH =2-3,khuấy tiếp60phút.
Chiết bằng etyl axetat 50ml (2 lần), để phân lớp thu phần dịch
phíatrên. Cơ cất chân khơng ở nhiệt độ < 30 0C thu cặn chiết etyl axetat.
Kiểmtra bằng bản mỏng silicagel 60 GF 254với hệ dung môi
dioxan:benzen:axitaxetic (30:50:2), thuốc thử là dung dịch H 2SO4/MeOH
5%, phát hiện địnhtính PGE2có màu vàng nhạt, sử dụng chất chuẩn PGE 2có
độ tinh khiết93%cungcấpbởi hãngsigma.
3.3.2. PhântíchđịnhlượngPGE2trongcácmẫurongĐỏ
Dịch chiết etyl axetat được metyl và silyl hoá và xác định hàm
lượngPGE2bằng GC-MS. Nhận dạng prostaglandin bằng phần mềm chun
dụng,tínhtốnchuyểnđổiquagiátrịthờigianlưutươngđươngECL,sửdụnghệchất
ECL=±16


chuẩn là PGB2vàPGE2. Tính tốn hàm lượng PGE 2có trong 1 g rong tươi(µg/
grongtươi).
3.3.3. Khảo sát sự biến động và tích luỹ prostaglandin và axit béo
trongqtrìnhsinhtrưởngvàpháttriểncủalồirongcâuGracilariavermicul
ophylla của Nga ni trong PTNởViệtNam

Mơ tả chi tiết cách bố trí thí nghiệm theo dõi sự sinh trưởng và
pháttriển của lồi rongG. vermiculophyllani trong phịng thí nghiệm.
Thumẫuvà phân tích đánh giábiến động hàmlượng PG,cácaxitbéo.
3.4. PhânlậpprsotaglandintừrongĐỏ
3.4.1. PhânlậpPGE2từlồirongcâuGracilariavermiculophylla
SơđồphânlậpPGE2gồm
cácbước:Xửlímẫu;Chiếtdịchtổngbằngetylaxetat;Phân lập vàtinh chế PGE2bằng
HPLC điều chế.
 CácdữliệuphổcủaPGE2phânlậpđược:
Hợpchấtphânlậpđượcdạngbột,màuvàng.Điểmnóngchảy65,5–
660C.Rf=0,5(TLC,silica-gel,C6H6:EtOAc1:1,màuvàng,H2SO410%/MeOH).
PhổkhốiESI-MS:m/z=375[M+Na]+.
Phổ1H-NMR(500MHz,CDCl3&CD3OD),ppm:5,62(1H,m,H14);5.58(1H,m,H-13);5,43(1H,m,H-5);5,34(1H,m,H-6);4,06(2H,
m,H-11,H-15);2,70(1H,ddd,J=1.5,7.5,18.0Hz,H-10a);2,42(1H,m,
H-12); 2,35(2H, m,H-7); 2,29(2H, t,J=7,5Hz,H-2); 2,18(1H, m,H-8);
2,17(1H,m,H-10b);2,09(2H,m,H-4);1,67(2H,qd,J=2,0;7,5Hz,H3);1,58(1H,m,H-16a);1,48(1H,m,H-16b);1,30-1,40(6H,m,H-17,H18,H-19)và0,91(3H,t,J=7.0Hz,H-20).
Phổ13C-NMR(125MHz,CDCl3&CD3OD),ppm:2 1 6 , 7 ( C 9 ) ; 177,0( C - 1 ) ; 1 3 7 , 4 ( C - 1 4 ) ; 1 3 1 , 8 ( C - 1 3 ) ; 1 3 1 , 6 ( C - 5 ) ; 1 2 7 , 3 ( C 6);73,4(C15);7 2 , 5 ( C- 1 1 ) ; 5 5, 3 ( C - 8 ) ; 5 3 , 9 ( C- 1 2 ) ; 4 7 , 1 ( C - 1 0 ) ; 3 7, 9 ( C 16);34,1
(C-2);3 2 , 5 ( C - 1 8 ) ; 2 7 , 4 ( C - 4 ) ; 2 6 , 0 ( C - 1 7 ) ; 2 5 , 6 ( C - 3 ) ; 2 5 , 5 ( C 7 ) ; 2 3 , 3 (C-19)và14,3(C-20).
3.4.2. Nhậnb i ế t P G E 3từl o à i r o n g c â u G r a c i l a r i a v e r m i c u l o p h y l l a


Dịch

chiết

etyl

axetat

của


lồi

rong

câu

Liên

bang

NgaGracilariatenuistipitatađược tách thành các phân đoạn trên cột thường.
Phân
5giàuPGE3(pháthiệnbằngTLC)đượcphântíchbằngphươngphápHPLC

đoạn


liênk ế t v ớ i M S / M S p h â n g i ả i c a o t r ê n m á y L C M S - I T T O F c ủ a h ã n g Shimadzu. Chế độ HPLC: cột C18 (100mm x 2,1mm, ID 3m,
Supelco,USA), hệ dung môi MeOH:AcOH:H 2O biến đổi gradient, tốc độ
dòng2ml/phút. Chế độ MS: Mẫu đo được ion hóa bằng phương pháp
APCI(positive-ion mode), quá trình phân mảnh của các ion giả phân tử
được xácđịnh bằngMS/MSdùngkhí Argon đểbắnphá.
3.5. Phânl ậ p , t i n h c h ế t h u n h ậ n a x i t a r a c h i d o n i c t ừ l o à i r o n
gCâu
Gracilariat e n u i s t i p i t a t a
Sơ đồ phân lập AA gồm 4 bước: Chiết lipit tổng; Thuỷ phân lipittổng;
Làm giàu các axit béo không no bằng phương pháp tạo muối vớiLiOH;
PhânlậpvàtinhchếAA.


 Cácdữliệuphổcủahợpchấtphânlậpđược(etylarachidonat)
PhổkhốiEI-MS:m/z=332[M]+
Phổ1H NMR (500 MHz, CDCl 3),δppm: 5,37 (8H, m, H-5, H-6, H-8,H9,H-11,H-12,H-14,vàH-15);4,12(2H,q,J=7,0;14.0Hz,H-21);
2,81(6H,m,H-7,H-10,H-13);2,30(2H,t,J=7,5Hz,H-2);2,10(2H,m,
H-4);2.06(2H,m,H-16);1,70(2H,q,J=7.5Hz,H-3);1.36(2H,m,H19);1,30(4H,m,H-17,H-18);1.27(3H,t,J= 7.0Hz,H-22);0,90 (3H,t,J
=7,0Hz,H-20).
Phổ1 3 CN M R ( 1 2 5 M H z , C D C l 3,),δ p p m : 1 7 3 , 6 ( C - 1 ) ; 1 3 0 , 4 ( C 15);129.0(C-8); 128,8(C-9);128,5(C-11); 128,2(C-12vàC-14);127,9
(C-5);127,5(C-6);60,2(C-21);33,7(C-2);31,5(C-18);29,3(C-17);27,2
(C-16); 26,5(C-4);25,6(C-3,C-7, vàC-10);24,8(C-3);22,5(C-19); 14,2
(C-22);14,0(C-20).
CHƯƠNG4.KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN
4.1. NghiêncứusànglọclipitvàaxitbéocủarongĐỏ
4.1.1. Khảosáthàm lượnglipittổng
Kếtquảxácđịnhhàmlượnglipittổngcủa69mẫurongĐỏ,chúngtơi
chiathành4nhóm:NhómIcóhàmlượnglipit0,2% (nhóm có hàmlượng lipit thấp); Nhóm
II

từ

>0,2

đến0,4%

(nhóm

có

hàm

lượng



lipittrungbình); NhómIIItừ>0,4đến0,6%
(nhómcóhàmlượnglipitcao);


Nhóm IV >0,6% (nhóm có hàm lượng lipit rất cao). Hàm lượng lipit tổngcủa
68 mẫu rong Đỏ ở Việt Nam dao động từ 0,118 đến 0,734% khối lượngtươi
trongđócó14mẫuthuộcnhómI,45mẫuthuộcnhómII,5mẫuthuộcnhóm III và 4 mẫu ở họ rong
Đơng thuộc nhóm IV có 4 mẫu có hàm lượnglipit tổng đạt 0,604-0,734%.
Riêng mẫu rong câu của LB Nga có hàmlượng lipit caonhất,đạt 1,39%khối
lượng tươi.
4.1.2. Khảosátthànhphầnvàhàmlượngcácaxitbéo
4.1.2.1. Thànhphầnvàhàmlượngaxitbéocủarongcâu
Đãxácđịnhđược55loạiaxitbéocómạchcacbontừC12đếnC25.
AxitbéonoSFA:hàmlượngSFAtrungbìnhlà69,886%,daođộngtừ
34,68% (mẫu TAX) đến 84,8% (mẫu N15). 50% số mẫu có hàm
lượngSFAtrongkhoảngtừ66,025%đến75,455% .
PUFA:hàmlượngtrungbìnhlà9,807%daođộngtừ1,06đến49,41%.50%sốm
ẫucóhàmlượngPUFAtrongkhoảngtừ4,9
đến12,43%.T r o n g s ố m ẫ u c ó h à m l ư ợ n g P U F A c a o p h ả i k ể đ ế n m ẫ u T
A X hàmlượngcaonhấtđạt49,41%,mẫuA3là22,52%,mẫuA5là21,33%,mẫuA16là17,86%.
HUFA:hàm lượng trung bình là 7,191%, dao động từ 0 đến
35,53%.ChỉtrừmẫuN15,tấtcảcácmẫuđềuchứaHUFA,mộtsốmẫucóhàmlượng HUFA rất cao
như TAX là 35,53%, T28 là 19,47%, A5 là 18,76%,A16là15,51%,
A3là14,93%.
Omega-3:h à m l ư ợ n g c h ỉ đ ạ t 1 , 5 0 1 % , d a o đ ộ n g t ừ 0 đ ế n 1 8 , 4 4 % .
Thànhphầnomega-3chủ yếulà2 axitbéoC20:5n-3 (eicosapentaenoicaxit
- EPA) và axit C22:5n-3 (Docosapentaenoic acid, DPA). Tuy nhiên,
EPAxuất hiện ở nhiều mẫu hơn và có hàm lượng cao hơn, cá biệt có mẫu

T29hàmlượngEPAlà8,17%tổngaxit béo.
Omega-6:hàm lượng trung bình là 8,174%, dao động từ 0,61%
đến46,34%. Omega-6 cao nhất là mẫu rong Câu Nga đạt 46,34%, gấp > 2
lầnmẫucó hàm lượng caonhấtcủaViệtNam (mẫu A5),đạt21,08%.
Thành phần omega-6 chủ yếu là 3 axit: C18:2n-6, C20:3n-6, C20:4n-6,
trongđóaxitchiếmhàmlượngcaonhấttrongtấtcảcácmẫulàC20:4n-6(axitarachidonic).


Omega-9:Hàm lượng nhóm omega-9 trung bình đạt 10,389%,
daođộng trong khoảng 3,17 đến 19,79%. Trong đó chủ yếu là axit C18:1n9(axitoleic), trungbìnhđạt 9,39%.
Về chỉ số PUFA/SFA:Giá trị trung bình đạt 2,454, dao động từ 0đến
16,12. Theo khuyến cáo của WHO, yêu cầu cho thực phẩm lành là
chỉsốPUFA/SFA >0,4thìcóđến45/47mẫu(chiếm 95,7%)đạtucầu.
Vềchỉsốn3/n6:Giátrịtrungbìnhđạt0,176,daođộngtừ0đến
4,64.Theok h u y ế n c á o c ủ a W H O , t hự c p h ẩ m c ó c hỉ s ố n 3 /
n 6 > 0 , 1 l à t ốt chosứckhoẻconngười.Kếtquảphântíchchothấycó24mẫuđạtucầu,trongđócómộtsốmẫu
cóchỉsốn3/n6caonhư:T29 (2,17), A3 (2,11),A16(1,3), T28(0,93).
4.1.2.2. Thànhp h ầ n v à h à m l ư ợ n g c á c a x i t b é o c ủ a c á c l o à i t h u ộ c
chi
HypneahọrongĐơng
Axitbéono:chiếmhàmlượngcao, trungbìnhlà67,53%,daođộngtừ5
3,52%đến78,44%.
PUFA:Hàm lượng PUFA của họ rong Đơng tương đương với họ rong
Câu. Hàm lượng PUFA trung bình đạt 9,07%, dao động từ 3,88%
đến29,13%.
HUFA:HàmlượngHUFAcủahọrongĐơngthấphơnhọrongCâu.
Hàmlượngtrungbìnhlà6,02%,doađộngtừ1,57%đến22,35%.
Omega-3:Hàm lượng omega-3 của họ rong Đông cao hơn họ rongCâu
xong hàm lượng vẫn thấp, đạt trung bình là 3,1%, dao động từ 0 đến6,78%.
Tiếpt ụ c p h á t h i ệ n 0 2 m ẫ u c ó D H A l à N 2 v à N 1 1 v ớ i h à m l ư ợ n g

tươngứnglà1,07%và2,61%.
Omega-6:Hàm lượng omega-6 của họ rong Đơng thấp hơn họ
rongCâu,đạtgiátrịtrungbìnhlà5,87%,dao độngtừ1,38% đến22,35%.
Haia x i t b é o o m e g a 6 x u ấ t h i ệ n p h ổ b i ế n ở c á c m ẫ u l à C 1 8 : 2 n - 6 (9/10mẫu),
C20:4n6( 8/10mẫu).
Khác với chiGracilaria,họ rong Câu (Gracilariaceae), thành phầnaxit
béo của các mẫu thuộc chiHypnea, họ rong Đơng (Hypneaceae) có sựkhác
biệt rõ rệt giữa các lồi thậm chí cả trong quần chủng lồi như
cácmẫuN6,N10vàN11củalồiH.flegilliformishoặcởcácmẫuN12vàT11


củalồiH.japonica.Vídụ nhưđốivớiAA ởcácmẫuN10 vàN11củalồi
H.flegelliformishàmlượngchỉđạt0,33và0,1%thìởcùnglồilàN6lạilêntớ
i 22,35%.
4.1.2.3. Thành phầnvàhàmlượngcácaxitbéocủa12mẫuthuộc7họ rong
Đỏ Ceramiaceae, Bangiaceae, Hylamaniaceae, Bonnemaisoniaceae,
Phyllophoraceae,R h o d y m e n i a c e a e , H a l y m e n i a c e a e

Biểuđồ4.2.Hàmlượngcáchọaxitbéocủa12mẫuthuộc7họrongĐỏĐã
xác
địnhđược 47axitbéo C12đến C24.
Axitb é o n o : H à m l ư ợ n g S F A t r u n g b ì n h l à 6 5 , 0 5 % , d a o đ ộ n g
từ
40,18%đến76,92%.
PUFA:hàm lượng trung bình là 13,47%, dao động từ 3,35%
đến36,12%.50%sốmẫu trongkhoảng 7,51%đến 12,78%.
HUFA:hàm lư ợ n g tr un gbì nhl à 9, 48%, da ođ ộn gtừ 0 đế n3 0,8%.
50%sốmẫunằmtrongkhoảngtừ2,88%đến11,67%.
Omega-3:Đã phát hiện 9 axit omega-3 mạch cac bon từ C 18đến C22có
hàmlượng trung bình là 3,84%,dao động từ 0 đến 17,67%.

Tiếp tục phát hiện 2 mẫu rong Đỏ có chứa DHA là mẫu N4,
lồiLiagora sp1,hàm lượng đạt 1,82% và mẫu T2, lồiGrateloupia
lithophila,hàmlượngđạt 0,6%tổngaxit béo.
Omega-6:Đãpháthiện10axitomega-3mạchcacbontừC18đếnC23có hàm lượng
trungbìnhlà9,6%%,daođộngtừ2,1%đến18,89%.Thànhphần omega-6 quan trọng nhất là AA
(11/12) mẫu, điển hình là mẫu T2, vàN9 (loàiGrateloupia lithophila)hàm
lượng AAđạt lần lượt là 16,1% là14,45%.


VềchỉsốPUFA/
SFA:Giátrịcủachỉ sốnàythấphơnnhiềus ovớihaihọro n g Câ u v à ron gĐ
ơ n g , tru ng bìn h l à 0, 2 4,d ao độ ng từ 0, 0 4 đ ế n0,9.
Về chỉ số n3/n6:Giá trị trung bình là 0,54, dao động từ 0 đến
2,44.Trong12mẫucó50%sốmẫuđạtmức>0,1là:N4(2,44),CC1(1,67),N9
(0,97),N7(0,6),T12(0,35)vàN1(0,24).
4.1.2.4. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự tích luỹ lipit và
hìnhthànhcác axit béocủarongĐỏ
Chúng tơi tìm hiểu sâu về biến động của sự tích luỹ lipit và axit
béocũng như sự hình thành chúng ở các mẫu đặc trưng cho các họ, các chi
vàcác loàirongĐỏ thuở một số vùngsinh thái trên biển.
 Đúckếtcácyếutốảnhhưởngtrêncơsởsốliệucủacácmẫurong
ĐỏthutạiđảoCồnCỏ-QuảngTrị.
Cồn Cỏ - Quảng Trị đặc trưng của vùng biển miền Trung có khí
hậuchủ yếu là nắng, nóng trong năm. Chúng tơi đã nghiên cứu 11 mẫu của
11loài thuộc 8 họ rong Đỏ (bảng 4.3) là đặc trưng cho các họ rong Đỏ
khácnhautrongmột vùngsinhthái.
Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sinh tổng hợp axit béo khơng
chỉrấtkhácbiệtgiữacácmẫukháchọmàcịnởnhữngcặpmẫucủacáclồicó
quanhệphátsinhsinhvậtgầngũi(cùngchi) nhưN2/N6,N4/N7vàN5/CC2. Minh chứng qua hàm
lượng AA (C20:4n-6) và EPA (C20:5n-3).Chẳng hạn như trong khi ở mẫu

N6 hàm lượng AA rất cao (22,35%) thì ởmẫu N2 lại vằng mặt hoạt chất
này. Tương tự như vậy ở mẫu N7 khôngphát hiện được AA và EPA trong
khi hàm lượng các hoạt chất này ở N4 lầnlượtlà1,7và6,24%tổngaxit béo.
 Đúckếtcácyếutốảnhhưởngtrêncơsởsốliệucủacácmẫurong
ĐỏthutạikhuvựcPhùLong-HảiPhòng
Khu vực Phù Long – Hải Phịng là khu vực điển hình cho vùng
biểnĐơng Bắc, nơi có một mùa đơng lạnh trong năm, tập trung nhiều lồi
thuộcchirongCâu. Chúng tơi thuth ậ p đư ợc 4l oài thuộc c hirongCâ utại k
huvực này. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm lượng lipit của các mẫu ở mứctrung bình và thấp. Về
thành
phần
axit
béo,
chúng
có
3
đặc
trưng
tương
tựnhư8họrongĐỏkhácthutại CồnCỏ-QuảngTrịlà(1)hàmlượngaxit


béo no rất cao, (2) tỷ lệ về hàm lượng axit béo no thấp thì hàm lượng axitbéo
khơng no PUFA và HUFA cao và ngược lại, (3) hàm lượng axit béo
họomega-6 cao hơn omega-3. Các tính chất này phù hợp với các đặc trưngchung của các họ thuộc
ngành rong Đỏcông bố trước đây.
Kếtquảnghiêncứucũngchothấy,trongmộtchirong
câuGracilariac ũ n g c ó s ự b i ế n d ị v ề t h à n h p h ầ n c á c a x i t b é o . V í d ụ t h ấ y r
õ nhấtởmẫuA22(loàiGracilaria gigas)xuất hiện 4 axit mạch dài là C21:0,C22:2n6,C 2 2 : 5 n - 3 , C 2 2 : 6 n - 3 ( D H A ) t r o n g k h i đ ó k h ơ n g p h á t h i ệ n ở 3 loài
cùngthuộcchi rongCâu.

 Đúckếtcácyếutốảnhhưởngtrêncơsởsốliệucủacácmẫurong
Đỏthutạicáctỉnhkhácnhaukhácnhau
Nghiên cứu được tiến hành trên 8 mẫu của cùng loài rong Câu
chỉvàng thu ở 8 tỉnh, thành khác nhau (từ Quảng Ninh đến Bình Thuận) và
1mẫu xuất xứ từ mẫu T28 được nuôi trong PTN của Viện (nhiệt độ
phịngni là 20-220C) để xem xét sự hình thành và tích luỹ axit béo của
cùng 1lồitrongcácđiềukiệnsinh thái khácnhau.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, mặc dù các mẫu rong Câu chỉ vàng
thutrảidàitrên8tỉnhkhácnhaunhưngsựtíchluỹlipitvàaxitbéonokhơngcó
nhiềubiếnđộng.ĐiềuđángchúýnhấtlàaxitC20:4n-6cómặtở8/8mẫu, song hàm lượng rất khác
biệt nhau. Điều này cho thấy mặc dù sự hìnhthànhvàtíchluỹaxitbéonhómaxitbéokhơngno
tuyđượcquyếtđịnhvàobản chất sinh học của lồi song vẫn chịu tác động khơng nhỏ
của điều kiệntựnhiên.
Khi so sánh 2 mẫu rong Câu chỉ vàng (Gracilaria tenuistipitata)thutự
nhiên (mẫu T28) và mẫu nuôi trong PTN, hàm lượng lipit tổng thì khơngthay
đổiđángkểtuynhiênthànhphầncácaxitbéothìbiếnđộngrấtđángchú ý. Mẫu rong ni phát sinh
thêm 5 axit là C15:1n-7, C15:1n-5, C16:1n-9,C17:0vàC20:3n-6.HàmlượngaxitC16:0đặc
trưngchohọaxitbéonocủa mẫu rong thu tự nhiên giảm 23,2% so với tổng axit béo
trong khi đóaxit C20:4n-6 tăng 10,03%. Như vậy có thể nhận định điều kiện
nhiệt độtrong quá trình sinh trưởng của rong ảnh hưởng lớn đến thành phần
và hàmlượngaxitbéotheohướnggiảmaxitbéonovàtăngcácaxitbéokhôngno.


4.1.3. Sử dụng phương pháp PCA và phương pháp phân tích chùm để
xửlýtậpdữliệuvềthànhphầnaxitbéo củacác mẫu rong đỏ
Từ6 9 m ẫ u r o n g Đ ỏ c h ú n g t ô i đ ã x á c đ ị n h đ ư ợ c 1 2 a x i t b é o c h í n h yế
ul à C 1 4 : 0 , C 1 5 : 0 , C 1 6 : 0 , C 1 6 : 1 n - 7 , C 1 8 : 0 , C 1 8 : 1 n 9,C18:1n-7,
C18:2n-6, C20:3n-6, C20:4n-6, C20:5n-3 và C22:0. Các mẫu rong Đỏ
phânbố trên giản đồ 2 chiều như hình 4.1 trong đó thể hiện rõ rệt nhất là các
họGracilariaceae,Hypneaceae, Ceramiaceae.

Hình4.1.KếtquảphântíchPCAcủacáclồirongĐỏ
F2
2.50
Ban2
Hyl1

2.00

Rho

1.50

1.00

0.50

Gra35
Gra31
Gra23 Gra38
Gra1G9r
GG
Gra12GraG2r7a
Gra26
1281
a28
2r4a
ra
GGrara3306
Gra37
Gra42

Gra32
Gra33
Gra10
Gra29
Gra6
GrGar1a325
Gra
Gra40
Gra16
Gra1
3
Gra46

0.00
-0.50

Gra39

GrBa1
a1n1

Gra45
1
Gra22

Cer2
Hyp9

Hyp2


Bon

Hyp1

Hyp6

-2.00

GraNga

Cer1

Cer4

Hyp4

-1.50

Gra20

Cer3

G
Gra14
Gra43
Gra7ra17
Gra34
GrGa2ra9Hy
Gra44
p10Gra5

Gra
4
Gra8
Hyp5

-1.00

Hal

Hyp8
Hyp3

Hyp7
Hyl2

Phy

-2.50
Gra15
-1.50-

1

.

0

0

- 0 . 5 0


0.00
4.00

0.50

1.00

1.50

2.00

2.50

3.00

3.50

F1

Sử dụng phần mềm SURFER 32, chúng tơi biểu diễn biểu đồ phânloại
hình đối với 69 mẫu rong đỏ theo các dữ liệu về thành phần và hàmlượng
cácaxitbéochính yếunhư hình4.2dướiđây.
Hình4.2.Sơđồcâyphânloại69lồirongđỏdựavàothànhphầnvà
hàmlượngcác axit béo chínhyếu.

20

GraNga
Hyl2

Gra15
Ban2
Ban1
Gra11
Phy
Hyl1
Hal
Rho
Hyp2
Gra8
Hyp9
Hyp8
Hyp10
Gra34
Hyp3
Gra44
Hyp6
Hyp4
Hyp1
Hyp7
Hyp5
Bon
Gra23
Gra25
Gra9
Gra7
Gra4
Gra3
Gra38
Gra41

Gra33
Gra40
Gra29
Gra1
Gra10
Gra6
Gra5
Gra2
Gra45
Gra46
Gra42
Gra39
Gra37
Gra21
Gra26
Gra31
Gra32
Gra36
Gra30
Gra28
Gra24
Gra27
Gra19
Gra35
Gra18
Gra43
Gra20
Gra17
Gra12
Gra13

Gra16
Gra14
Gra22
Cer2
Cer1
Cer3
Cer4

LinkageDistance

Tree Diagram for Variables Single Linkage
Euclidean distances
25

15

10


0

4.2. Kếtquảsànglọcprostaglandinvàaxitarachidonictừcáclồirong
đỏthuthậpđược
4.2.1. KếtquảkhảosátđịnhtínhPGE2
Chúngtơiđãtiến hành khảosátđịnh tínhPGE2của cácmẫu rongĐỏ
bằngphươngphápsắckýbảnmỏng(TLC).

Hình4.3.SắckílớpmỏngđịnhtínhPGE2
(a).CácmẫucóvếtPGE2,(b).CácmẫukhơngcóvếtPGE2.
Kết quả phân tích cho thấy có tín hiệu về sự xuất hiện PGE 2ở 39mẫu,

trong đó tín hiệu rõ ràng nhất ở mẫu rong Nga (kí hiệu TAX hay M0)và 38
mẫu rong Đỏ Việt Nam. Tuy nhiên, sự xuất hiện các tín hiệu này rấtkhác
nhau, đa phần các mẫu chỉ xuất hiện tín hiệu dạng vết, chỉ có 4 mẫuxuất hiện
tín hiệu PGE2rõ ràng là cácmẫu T5,A3,A7,A16.
4.2.2. KếtquảkhảosátđịnhlượngPGE2
Kết quả phân tích định lượng PGE 2đã xác định được 15 mẫu
(T5,T22,T 2 8 , A 3 , A 4 , A 5 , A 6 , A7 , A1 6, N 3 , N 6 , N 9 , CC2 , T2 v à TA X ) c
ó
hàm lượng PGE2 từ 0,3 – 21,52µg/g rong tươi. Trong đó hàm lượng
caonhấtl à m ẫ u r o n g C â u N g a T A X ( l o à i G r a c i l a r i a v e r m i c u l o
p h y l l a ),t i ế p theolà2mẫurongCâuViệtNamlàmẫuA16(loàiGracilaria gigas), mẫuT5
(loàiGracilaria tenuistipitata)với hàm lượng lần lượt là 3,6 và 3,4 µg/
grongtươi.
So sánh tương quan giữa hàm lượng PGE 2và AA trong 39 mẫu
rongĐỏ( b ả n g 4 . 6 ) c h o t h ấ y , c á c m ẫ u c ó h à m l ư ợ n g A A c a o t h ì c ó k h ả n ă