I.

1
GIỚITHIỆULUẬNÁN

I.1. Đặtvấn đề
Fucoidan là một sulfate polysacarit chỉ có trong thành phần củangành
rong nâu mà khơng có trong thành phần của các lồi thực vật
hayđộngvậtkhác. Fucoida nc ócấ u trúchóahọcphứctạpbởitínhđa dạngcủa
liênkếtglycosidevàkhảnăngphânnhánhvớicácvịtrínhómsulfateđược sắp xếp khơng theo quy luật trên
mạch polymer. Thành phần chínhcủa fucoidan là fucose và sulfate, ngồi ra
chúng
cịn
có
thêm
các
gốcđườngk h á c n h ư g a l a c t o s e , g l u c o s e , m a n o s e , x y l o s e , …
v à đ ô i k h i l à c ả gốcacetyl.Nhờsựđadạngvềcấutrúcmàfucoidansởhữunhiềuhoạttinh sinh học quý
như kháng đông tụ máu, kháng ung thư, kháng viêm,kháng virút, chống oxi
hóa,… với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong cáclĩnh vực mỹ phẩm, thực phẩm
chức năng và dược phẩm. Mặc dù có rấtnhiều cơng trình nghiên cứu nhằm xác
định cấu trúc chi tiết của fucoidan,nhưngcáckếtquảnghiêncứupháthiệnđượctínhquyluậttrongcấu
trúccủa chúng về trật tự liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh và vị trícác
gốc sulfate vẫn cịn rất hạn chế. Mặt khác, mối quan hệ giữa cấu trúcvà hoạt
tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa
đượcsángtỏ.Để gi úpc ho việ cnghiêncứu cơchếtácdụng củaf uc oi da n lêncá
ctếbàosinhvậtvàtiếntớisửdụngfucoidanđểlàmdượcliệuthìviệcxác định chính xác thành phần và cấu
trúc hóa học của fucoidan là điềutiênquyết và đangthuhút sự chú ýcủanhiều nhà
khoahọc trênthế giới.
Ở nước ta hiện tại đã có khoảng 147 lồi rong nâu được phân loại,trong đó
các lồi rong thuộc chiSargassumcó trữ lượng lớn nhất với hơn60 lồi và sản

lượng ước tính đạt tới 10.000 tấn rong khơ/năm. Tuy nhiêncho đến nay ở nước
ta vẫn chưa có một cơng trình nghiên cứu có tính hệthống về thành phần hóa
học, cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidantừrongnâu Việt Nam.
Do vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích thành
phần,cấut r ú c h ó a h ọ c c ủ af u c o i d a n c ó h o ạ t t í n h s i n h h ọ c t ừ m ộ t s
ố l o à i rong nâu ở vịnh Nha Trang” nhằm hoàn chỉnh thêm những
nghiên cứuvề fucoidan của rong nâu Việt Nam theo định hướng tìm kiếm
nhữngnguồn dược liệu mới phục vụ sức khỏe cộng đồng và phát triển
kinh tế xãhội.
I.2. Mục tiêu của luậnán
Nghiên cứu chiết tách và phân đoạn fucoidan từ một số lồi rongnâu Việt
Nam. Phân tích thành phần, xác định đặc điểm cấu trúc và mốiquan hệ giữa cấu
trúcvớihoạttínhsinhhọccủafucoidan.


I.3. Nhữngđónggóp mớicủaluậnán
1/ Việc khử trùng ngưng được thực hiện bằng phương pháp tự thủyphân
(autohydrolysis)sửdụng chính cácnhóm (-SO 3H)của phântửfucoidan làm nguồn
axít để chuyển hóa fucoidan polysacarit về dạngfucoidan oligosacarit dưới điều
kiện rất nhẹ nhàng, nên hạn chế tối đa qtrìnhbẻngắnmạchqmứcvềdạngcácmonomerkhơng
mong
muốn.Nhờvậyđãthuđượccácsảnphẩmfucoidanoligosacaritphùhợpchophântíchkhốiphổ.
2/ Lần đầu tiên tại Việt Nam đã kết hợp cả 02 kỹ thuật phân tích khối phổ
nhiều lần MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS trong phân tích
cấutrúccủapolysacarit.Việckếthợpnàygiúpchúngtanhậnđượcđầyđủhơncácthơngtinvềcơchế
phân
mảnh
các
ion
carbohydrate

trong
phổ
khối,nhờvậyđãchophépgiảiđượcmộtcáchtườngminhcấutrúcphứctạpcủafucoidancónguồn
ngốctừrongnâuViệtNam
3/
LầnđầutiêncấutrúccủaphânđoạnfucoidanSmF3cóhoạttínhgâyđộctếbàoungthưtừron
gS.mcclureiđãđượcthiếtlập.MạchchínhcủafucoidanSmF3gồm→3)-Fucp(4,2SO )-(1→3)-Fucp(4,2SO-)-(1→họa
3

3

tiếtxenvàocácgốc(1→4)-Fucp(3SO- )và(→6)-Galpở
cuối đầukhử.
3
4/ Tất cả các phân đoạn fucoidan từSargassum mcclureiít gây độc tếbào và
ức chế sự hình thành các tế bào ung thư kết tràng DLD-1, chính
vìvậychúnglàcác tác nhân khángungthưtiềmnăng
I.4. Bố cụccủaluậnán
Luậnán gồm 113tr a ng: M ở đ ầ u (02 tr a ng), Nội d un g chínhgồm 98 trang
được
chia
làm
03
chương
gồm:
Chương
1.
Tổng
quan
(33

trang),Chương2 . Đ ố i t ư ơ n g , p h ư ơ n g p h á p n g h i ê n c ứ u v à t h ự c n
g h i ệ m (11trang),Chương3.Kếtquảvàthảoluận(52trang),Kếtluậnvàkiếnnghị (2 trang), Danh mục
các cơng trình cơng bố có liên quan đến luận án(01trang), 143 tàiliệu thamkhảo
(12 trang).
II. NỘI DUNG CỦA LUẬN
ÁNMỞĐẦU
Phần mở đầu đề cập tính thực tiễn, ý nghĩa khoa học, đối
tượngnghiêncứu,mục tiêu và nhiệmvụ của luận án.
CHƯƠNG1.TỔNGQUAN
Giới thiệu sơ lược về phân bố và phân loại rong nâu trên thế giới vàởViệt
Nam
Giới thiệu về fucoidan, tình hình nghiên cứu cấu trúc, hoạt tính sinhhọcvà
ứngdụngcủa fucoidan từrongnâutrên thế giớivàởViệt Nam.
Cácphươngpháp chiết tách và phân tíchcấutrúc củafucoidan.


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨUVÀTHỰC NGHIỆM
2.1. Đốitượngnghiêncứu
Đốitượng được lựa chọn nghiênc ứ u l à 0 8 l o à i r o n g
n â u p h ổ b i ế n và có trữ lượng lớn nhất ở vùng biển vịnh Nha Trang
bao gồm các loàirongSargassum denticapum,Sargassum polycystum,
Sargassum
binderi,Sargassumoligocystum,Sargassumswartzii,Sargassummcclurei,T
urbinaria ornata, Padina australis,các mẫu rong được thu thập,
phânloạivàđịnhdanh bởi chuyên gia phânloàirongbiểnTS.Lê NhưHậu.
2.2. Phươngphápnghiêncứu
2.2.1. Phương pháp chiếttách và phân đoạn tinhc h ế f u c o i d a n t ừ
r o n g nâu: fucoidan được thu nhận bằng cách chiết rong trong dung mơi
axitlỗng( p H: 2 3 ) , s a u đ ó s ử dụ ng p hư ơ n g p h á p s ắ c k ý t r a o đ ổi a n i o n đ ể táchphân

đoạntinh chếfucoidan.
2.2.2. Các phương pháp phân tích thành phần của fucoidan: phương
pháptrắcquang,đođộđụcvàphươngphápsắckýlỏng hiệunăngcao(HPLC).
2.2.3. Cácp h ư ơ n g p h á p p h â n t í c h c ấ u t r ú c c ủ a f u c o i d a n : p h â n t í c h l
i ê n kếtbằngmethylhóa,phântíchphổhồngngoại(IR),phổcộnghưởngtừhạt nhân (1H-NMR,13CNMR), phổ khối nhiều lần Negative-ion tandemESI-MS/MSvà MAILDITOF/MS/MS.
2.2.4. Phươngp h á p t h ử n g h i ệ m h o ạ t t í n h g â y đ ộ c t ế b à o c ủ a f u c
o i d a n : đượcthực hiệntheo phươngphápcủaLikhitwitaywid vàColburn
2.3. Thựcnghiệm
2.3.1. Phươngphápchiếtvà táchphânđoạn fucoidantừrongnâu
Phương pháp chiết fucoidan: Fucoidan được thu nhận bằng cáchchiết
rong trong dung mơi axit HCl lỗng (pH: 2-3) ở 70 oC, trong thờigian 2 giời
(chiết lặp lại 3 lần). Dịch chiết được gom lại và cô đặc bằngmàng siêu lọc
10kDa, dịch chiết sau đó được kết tủa trong cồn 98% hoặcđôngkhô để thu bột
fucoidan.
Phươngp h á p t á c h p h â n đ o ạ n f u c o i d a n :F u c o i d a n s a u
k h i đ ư ợ c phân lập từ rong nâu sẽ được tiến hành tách phân đoạn tinh chế bằng sắckýtrao đổi
aniontrên cột DEAE-cellulose.
2.3.2. Cácphươngpháp phântíchthànhphầncủafucoidan
Phântíchhàmlượngtổngcarbohydrate:đượcthựchiệnbằngphươngpháp
so màuvới phenolvà axitsulfuric đậmđặc, ởλ =490 nm.
Phân tích thành phần đường đơn: được thực hiện bằng sắc ký
lỏnghiệunăngcao(HPLC),saukhifucoidanđượcthủyphânbằngtrifluoroaceti
c axít.


Phân tích hàm lượng sulfate: được thực hiện bằng phương pháp
đođộđục với BaCl2/gelatin,ởbướcsóngλ = 360 nm
Phânt í c h h à m l ư ợ n g a x í t u r o n i c : đ ư ợ c t h ự c h i ệ n b ằ n g
p h ư ơ n g phápso màu vớithuốcthửCarbazol,ởbướcsóngλ=525 nm.
2.3.3. Cácphươngpháp phân tích cấutrúc fucoidan

Phân tích liên kết bằng methyl hóa: fucoidan được methyl hóa bằngmethyl
iodua trong dung mơi dimethylsulfoxide, sau đó tiến hành thủyphân, khử mở vịng và acetylhóa. Sản
phẩm saukhia c e t y l h ó a đ ư ợ c phântíchbằngGC-MS.
Thủy phân tạo oligosacarit-fucoidan sử dụng cho phân tích
khốiphổ: đượctiếnhành bằngphươngpháptựthủyphân(autohydrolysis).
CHƯƠNG3.KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN
3.1. CHIẾTTÁCHVÀPHÂNLẬPFUCOIDANTỪRONGNÂU
Fucoidan từ 08 loài rong nâu thuộc 3 chi rongSargassum,
PadinavàTurbinađã đượcchiết tách vàp h â n t í c h h à m l ư ợ n g ( b ả n g
3.1).
K ế t quảchothấyhàmlượngfucoidandaođộngtừ0,82%
(Sargassumswartzii) đến 2,57 % (Sargassum polycystum), hàm lượng fucoidan
tronghai loài rongPadina australisvàTurbina ornatatương ứng là 1,93 % và1,23
%. Như vậy, ta thấy hàm lượng fucoidan trong các loài rong thuộccác chi khác
nhau là khác nhau và trong cùng một chi (Sargassum) cũngkhơng giống nhau.
Sự
khác
nhau
về
hàm
lượng
fucoidan
trong
các
lồirongcóthểđượcgiảithíchlàdoảnhhưởngcủacácyếutốsinhtrưởng của
rongnhưvị tríđịa lý, thời gian thurongvà cả phươngpháp chiết.
Bảng 3.1. Hàm lượng và thành phần monosacarit của
fucoidantừ08 loài rongnâuViệt Nam
2Stt


Loài rong

Hàmlượng
fucoidan
%*
0,82

Thành phần đường đơn của
fucoidan(%mol)
Fuc
Man
Gal
Xyl
35,8
19,2 32,3
9,9

Glc
2,8
3,4

SO4
%
w/w**

Axítu
ronic
%w/w**

20,40


14,28

22,46

21,54

1

S.swartzii

2

S.oligocystum

1,78

42,3

8,9

38,3

7,1

3

S.denticapum

2,00


40,1

15,9

38,7

5,3

nd

25,69

21,20

4

S.mcclurei

2,37

38,5

4,2

33,1

3,6

20,6


33,15

17,87

5

S.polycystum

2,57

42,4

12,6

23,5

1,3

10,2

25,60

23,74

6

S.binderi

1,13


42,2

10,3

38,0

9,5

nd

21,47

5,35

7

Turbinaornata

1,23

55,8

9,2

24,8

9,0

1,2


25,30

7,50

8

Padina australis

1,93

47,1

2,5

22,3

11,5

16,6

21,90

21,02

* Hàmlượngtínhtheokhốilượng rongkhơđãloạichấtbéo
**Hàmlượngtínhtheokhốilượng của fucoidan;
nd:khơng pháthiệnthấy



3.2. PHÂNTÍCH THÀNHPHẦNHĨAHỌCCỦAFUCOIDAN
Để xác định thành phần hóa học của fucoidan chúng tôi tiến hànhthủy
phân fucoidan thành các monomer trong mơi trường axít. Việc thủyphân hồn
tồn để xác định thành phần các đường đơn của fucoidan trênthực tế rất khó
xảy ra, do đó chúng tơi tiến hành xác định theo tỉ lệ molgiữa các gốc đường đã
được
thủy
phân.
Sắc
ký
đồ
của
các
mẫu
đườngchuẩnđượctrìnhbàytrênhình3.1.Kếtquảphântíchthànhphầnmonosacarit,
hàm lượng sulfate và uronic axít
của các mẫu fucoidanđược trình
bàytrênbảng3.1

Hình3.1. Sắc kýđồ HPLCcủacác mẫu đườngđơnchuẩn
Kết quả bảng 3.1 cho thấy fucose chiếm hàm lượng đáng kể từ35,8-55,8
% trong tất cả các mẫu fucoidan, trong đó cao nhất là
fucoidantừrongTurbinaornata(55,8%)vàthấpnhấtlàfucoidantừrongS.swartzii(35,
8%). Hàm lượng galactose của fucoidan chiết từ các loàirong thuộc
chiSargassumchiếm tỉ lệ gần bằng hàm lượng fucose, ngoạitrừ fucoidan từ
rongS.polycystumcó tỉ lệ fucose:galactose = 2:1. Trongkhi đó, các mẫu fucoidan
từ hai chi rong khác làTurbina ornatavàPadinaaustraliscũnggiống nhưfucoidan
củal o à i r o n g S.polycystumhàm lượng galactose chiếm gần bằng một nửa
so với fucose. Ngoài haithành phần chính là fucose và galactose, tất cả các mẫu
fucoidan của 08lồi rong nghiên cứu đều có chứa các đường đơn khác với hàm

lượng nhỏhơn là mannose (2,5-19,2%), xylose (1,3-11,5%) và glucose (0-20,6%).Hàm lượng các gốc
đường này biến đổi theo từng chi rong và từng loàirong, tuy nhiên trong cùng
chi rong chúng biến đổi không nhiều. Các kếtquả này cũng hồn tồn phù hợp
với
các
cơng
bố
trước
đó
về
sự
đa
dạngcủat h à n h p h ầ n h ó a h ọ c c ủ a f u c o i d a n . B ê n c ạ nh t h à n h p h ầ n l à c á c g ố
c


đường, trong phân tử của fucoidan còn chứa các gốc sulfate vàa x í t uronic.
Hàm lượng sulfate của các mẫu fucoidan khác nhau không nhiều(bảng 3.1), dao
động trong khoảng 20,40-33,15%, trong đó lớn nhất làfucoidan của
rongS.mcclurei(33,15%) và nhỏ nhất là fucoidan từ rongS.swartzii(20,40%),
Do sự phức tạp trong thành phần cũng như cấu trúc, nên việc xácđịnh các
đặc trưng cấu trúc của fucoidan là hết sức khó khăn. Phân đoạntinh chế
fucoidan là một bước quan trọng làm đơn giản hóa việc phân tíchcácđặc
trưngcấu của chúng.
3.3. TÁCHP H Â N Đ O Ạ N V À P H Â N T Í C H T H À N H P H Ầ N C Ủ
A CÁCPHÂNĐOẠN FUCOIDAN
05 loại fucoidan được phân lập từ các loài rongSargassum
swartzii,Sargassum mcclurei, Sargassum polycystum, Sargassum
denticapumvàTurbina ornatađược chúng tơi lựa chọn để tiến hành phân
đoạn và phântích các đặc trưng cấu trúc của chúng. Vì đây là những lồi

rong phổ biến,cótrữ lượnglớn và có khả năngkhaithácởquy mơ côngnghiệp.
Kết quả phân đoạn tinh chế các mẫu fucoidan bằng sắc ký trao đổianion
trên cộtDEAE-cellulose (3,2x32 cm)đ ư ợ c c h ỉ r a t r ê n h ì n h 3 . 2 hình 3.6. Kết quả tách phân đoạn của các mẫu fucoidan cho thấy fucoidantừcác
loài rongS.denticapum, S.polycystumvàS.mcclureiđều thu được03 phân đoạn khác
nhau. Kết quả này cho thấy fucoidan từ mỗi loài rongnày sẽ tồn tại ít nhất 03
kiểu cấu trúc khác nhau. Trong khi đó fucoidan từhai loài rongTurbinaria
ornatavàS.swartziilần lượt thu được 04 và 05phân đoạn khác nhau, như vậy
fucoidan từ hai loài rong này cũng sẽ tồntại ít nhất là 04 và 05 dạng cấu trúc
khác nhau. Tuy nhiên, các phân đoạntương ứng với mỗi loài rong được rửa giải
ra ở các nồng độ muối NaClkhácnhau, như vậy có thể đặc điểm cấu trúccủa
cácphânđ o ạ n t ư ơ n g ứng với mỗi lồi rong sẽ khơng giống nhau. Kết quả
phân tích thành phầnhóahọccủamỗiphânđoạnfucoidantừ05lồirongnghiêncứuởtrên(bảng 3.2-3.6)
cho thấy thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidangiữa các loài rong là
khác nhau và trong cùng một loại rong cũng khácnhau. Tuy
nhiên,chúngđềucóđặcđiểm chunglàh à m l ư ợ n g s u l f a t e trong các phân
đoạn fucoidan tăng dần theo nồng độ rửa giải của muốiNaCl, hàm lượng fucose
và galactose tăng tỉ lệ nghịch với hàm lượng củacác gốc đường khác, đặc biệt
trong phân đoạn SmF3 từ rongS.mcclureichỉ tồn tại hai gốc đường là fucose và
galactose. Như vậy với phần chínhlà fucose, galactose và sulfate fucoidan từ 05
lồi
rong
trên
được
xếp
vàonhómcác
sulfatedgalactofucan,
khácvớicácsulfatefucantừrongơn đới


SdF1


1,4

2

2

0,1
1,5

SdF2

DO,490nm

NaCl,M

1
0,6

1,5

SwF1

0,08

0,8

SwF4 SwF5

0,06


1

NaCl,M

SdF3

1

DO,490nm

SwF2SwF2
SwF3

0,12

1,2

0,04
0,5

0,5
0,02

0,2
0
0,4
0

50


100

150

200

250

300

350

400

0
500

450

0
0

50

100

150

200


250

300

350

400

450

0
500

V, ml
V, ml đoạn fucoidan từ
Hình 3.2. Tách phân
rongS.denticapumbằng sắc ký trao đổi anion
trêncộtDEAE-cellulose

2

2

SmF2

0,25
1,5

SpF3


1

1

A490nm

1,5

1,5

SmF1

0,2

NaCl,M

SpF1
2

A,490nm

0,3

SpF2

2,5

SmF3


0,15

1

NaCl,M

3

Hình 3.3. Tách phân đoạn fucoidan từ
rongS.swartziibằng sắc ký trao đổi anion
trêncộtDEAE-cellulose

0,1
0,5

0,5
0,05

0,5

0
0

100

200

300

400


500

600

0

0
700

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450


0
500

V (ml)

V, ml

Hình 3.4. Tách phân đoạn fucoidan
từrongS.polycystumbằng sắc ký trao
đổianiontrêncột DEAE-cellulose
1,4

2

ToF3

1,2

ToF2
ToF4

1,5

ToF1

0,8

1
0,6


NaCl,N

1

A,490nm

Hình 3.5. Tách phân đoạn fucoidan
từrongS.mcclureibằng sắc ký trao
đổianiontrêncộtDEAE-Macroprep

0,5
0,2
0,4
0

0
600700800

0100200300400500

Hình 3.6. Tách phân đoạn fucoidan từ
rongTurbinariaornatabằng sắc ký trao
đổianiontrên cột DEAE-cellulose

V, ml

Bảng 3.2. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn
fucoidantừrongS.denticapumthuđược bằngsắc kýtrao đổi anion
Phân
đoạnfucoida

n
SdF1-0,5МNaCl

Hàml
ượng
(%)*
17,2

Tổngcarboh
ydrate
(%)*
48,04

23,67

Thànhphầnmonosacarit,
mol%
Fuc Man Gal Xyl
38,6 22,1 24,6 14,7

SdF2-1,0МNaCl

45,7

54,12

27,64

48,6


12,8

28,2

10,4

SdF3-1,5МNaCl

15,3

54,09

39,14

51,9

5,8

33,4

8,9

*:t í n h t h e o khối lượngcủafucoidan

SO24
(%)*


Bảng 3.3. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn
fucoidantừrongS.swartziithu được bằngsắc ký traođổi anion

Phânđoạn
Hàm SO42fucoidantheo
lượng
(%)
nồngđộNaCl
(%)
SwF1-0,5М
2,0
5,6
SwF2-0,8М
20,2
14,6
SwF3-1,0М
33,3
18,4
SwF4-1,2М
26,2
28,0
SwF5-1,5М
16,0
42,3
nd: khôngpháthiện thấy

Thànhphầnmonosacarit,mol%
Fuc

Man

Gal


Xyl

Rham

Glc

nd
49,5
56,0
55,6
57,1

nd
4,7
3,0
3,6
4,0

nd
29,4
28,9
27,9
27,4

nd
2,7
1,9
2,4
0,9


nd
2,7
1,9
3,3
2,0

nd
3,0
3,2
2,8
2,0

Bảng 3.4: Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn
fucoidantừrongS.polycystumthu được bằngsắc kýtrao đổianion
Phânđoạnf
ucoidan
theonồng
độNaCl
SpF1-0,5М
SpF2-1,0М
SpF3-1,5М

Hàm
lượng(
%)

Tổngcarboh
ydrate(%)

SO24

(%)

Thànhphầnmonosacaritcủafucoidan,
%mol
Fuc Man Gal Xyl
Rham Glc

18,3
43,2
21,0

56,43
59,15
54,97

20,11
25,67
33,99

28,0
59,2
68,6

26,7
6,0
nd

12,7
26,6
26,9


11,3
0,2
4,5

13,1
8,0
nd

Bảng 3.5. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn
fucoidantừrongS.mcclureithuđược bằngsắc ký trao đổi anion
Phânđoạnf
ucoidan
theonồng
độN a C l
SmF1-0,8M
SmF2-1,2M
SmF3-1,6M

Hàm
lượng(
%)*

Tổngcarbohy
drate(%)*

SO24
(%)*

Thànhphầnmonosacarit,%mol

Fuc

Man

Gal

Xyl

Gluc

8,4
18,2
10,5

44,65
64,59
55,62

16,8
25,7
35,0

27,2
44,8
58,5

34,0
5,4
nd


19,6
34,1
41,5

6,4
5,3
nd

12,8
10,4
nd

Bảng 3.6. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn
fucoidantừrongTurbinaornatathuđược bằngsắc kýtrao đổi anion
Phân đoạn
fucoidantheonồngđộ
NaCl
ToF1-1,15М
ToF2-1,25М
ToF3-1,50М
ToF4-1,80М

Hàmlư
ợng(%)

SO24
(%)

Thànhphần monosacarit,mol%
Fuc

Man
Gal
Rham

6,6
29,7
10,3
18,4

23,87
43,26
38,75
32.36

71,9
69,6
82,1
75,6

4,5
nd
2,4
2,9

23,6
27,7
9,4
18,8

nd

2,7
6,1
2,7

8,2
nd
nd


Theo các tài liệu đã công bố, fucoidan rong nâu nói chung vàgalactofucan
sulfate hóa nói riêng sở hữu phổ hoạt tính sinh học rất rộngvàđa dạng như
hoạttính kháng ung thư, kháng đông tụm á u , k h á n g v i rút,Do
vậy,trướckhitiếptụcnghiêncứusâuhơnvềcácđặctrưng cấu
trúcc ủ a f u c o i d a n r o n g n â u V i ệ t N a m n h ằ m m ụ c đ í c h ứ n g d ụ n g c h ú n g làm
thực phẩm chắc năng và dược liệu. Chúng tơi tiến hành khảo sát hoạttính ức chế một số dịngtếbào
ungthưngười.
3.4. HOẠTTÍNH SINHHỌCCỦAFUCOIDAN
3.4.1. Hoạttính gây độc tếbào ung thưcủafucoidan
Fucoidan từ 06 lồi rongS.mcclurei(F-Sm), S.polycystum(FSp),S.swartzii(F-Ss),S.denticapum(F-Sd),S.oligocystum(F-So)vàTurbinaria
ornata(F-To) được chúng tơi lựa chọn thử nghiệm hoạt tínhgây độc tế bào trên
05 dịng ung thư của người là ung thư gan (Hep-G2),ung thư màng tim (RD),
ung thư phổi (LU), ung thư ruột kết (DLD-1) vàung thưv ú ( M D A - M B 2 3 1 ) . T h í n g h i ệ m đ ư ợ c t h ự c h i ệ n t ạ i V i ệ n H ó a học
các Hợp chất thiên nhiên-Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam,Viện
Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Nga và Viện Sinh học vàCôngnghệsinhhọcHànQuốc.Kếtquảchothấytấtcảcácm ẫ u fucoidan thử nghiệm đều cho kết quả
dương tính với ít nhất 02 dịng tếbào ung thư, trong đó fucoidan từ
rongS.swartziicho kết quả dương tínhtrên04 dịngtế bàoungthư(bảng3.7 và 3.8).
Bảng 3.7. Hoạt tính gây độc tế bào của
fucoidantừ06 lồi rongnâucủa Việt Nam
Fucoidan
Dịngtế bào ungthưcủangười

Kếtluận
Hep-G2

RD

LU

DLD-1

+

MDA-MB231
nd

F-Sp

+

nd

nd

F-Sm

+

-

nd


nd

+

F-So

+

+

nd

nd

nd

F-Ss

+

+

+

+

-

F-Sd


+

+

nd

nd

-

F-To

+

+

nd

nd

nd

Dươngtính
02dịng
Dươngtính
02dịng
Dươngtính
02dịng
Dươngtính
04dịng

Dươngtính
02dịng
Dươngtính
02dịng


Bảng3.8.Giá trịIC50củacác mẫufucoidancó hoạt tính gâyđộc tếbào
Fucoidan

GiátrịIC50(µg/ml)
Dịngtếbào

Kếtluận

HepG2

RD

LU

DLD-1

MDAMB-231

Chứng(+)

0,25

0,1


0,32

0,1

0,2

F-Sp

4,5

7,1

CXĐ

CXĐ

CXĐ

Dươngtính02 dịng

F-Sm

2,4

20,0

CXĐ

6,5


CXĐ

Dươngtính02 dịng

F-So

18,5

10,4

CXĐ

CXĐ

CXĐ

Dươngtính02 dịng

F-Ss

3,8

16,7

15,5

CXĐ

5,4


Dươngtính04 dịng

F-Sd

8,1

15,4

CXĐ

CXĐ

CXĐ

Dươngtính02 dịng

F-To

12,8

10,9

CXĐ

CXĐ

CXĐ

Dươngtính02 dịng


3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn fucoidan được
phânlậptừrongSargassum swartziivàSargassum mcclurei
Trongs ố 0 6 m ẫ u f u c o i d a n đư ợc t h ử n g h i ê m h oạ t t í n h g â y đ ộ c t ế bàoởt
rên,chúngtôilựachoncácphânđoạncủafucoidantừS.swartziivàS.mcclure
itiếp tục thử nghiệm với dòng tế bào ung thư vú và ung thưruột kết. Kết quả cho
thấy tất cả các phân đoạn thử nghiệm đều cho kếtquả dương tính với các mức
độ ức chế khác nhau (hình 3.7 và 3.8). Nhưvậy có thể thấy hoạt tính sinh học
của fucoidan phụ thuộc vào các yếu tốđặc trưngcấutrúc của fucoidan
Sựứcchếpháttriểntếbào,%

120
100

5 μg/mlg/ml
0,5 μg/mlg/ml

80
60
40
20
0
Đốichứng

SwF1

SwF2

SwF3

SwF4


SwF5

Nồngđộcácphânđoạnfucoidan

Hình 3.7. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú MDA-MB231củacácphân đoạnfucoidantừ rongSargassumswartzii
Đốichứng

SmF1
(100μg/ml)g/ml)

SmF2
(100μg/ml)g/ml)

SmF3
(100μg/ml)g/ml)


SmF3-DS (100 μg/ml)g/ml)

Hình 3.8: Hiệu quả ức chế sự phát triển tế bào ung thư kết tràng DLD1củacácphân đoạnfucoidanđược chiết tách từrongSargassum mcclurei
3.5. ĐẶCTRƯNGCẤUTRÚCCỦACÁC PHÂNĐOẠN FUCOIDAN
3.5.1. Cácđặctrưngcấutrúcthu đượctừphổIR
Các phân đoạn SdF3, SwF5, SpF3, SmF3 và ToF2 từ 05 lồi rongcó hoạt
tính sinh học tốt, đồng thời có thành phần đường đơn giản nhất sovớicácphânđoạn
fucoidan còn lại được lựa chọn để phân tích các đặctrưng cấu trúc. Kết quả phân tích phổ hồng
ngoại của các phân đoạnfucoidan đều thu được những dải hấp thụ chính ở số
sóng từ 1240-1272cm-1cho thấy sự có mặt của nhóm sulfate. Ngồi ra, các dao
độnghấp thụ trong vùng số sóng từ 800-845 cm -1cho biết vị trí của nhómsulfate
trêncác gốc đườngpyrannose(bảng3.9).

Bảng 3.9. Một số vân phổ đặc trưng trong phổ hồng ngoại của
fucoidanđượcchiếttách từmột số loàirongnâuViệt Nam
Mẫu Số sóngdao động
Vịtrí nhómsulfate
đặctrưng(cm-1)
SdF3
847,90
Nhómsulfatechủ yếu ở vị tríC4
SpF3
835,40
Nhómsulfatechủ yếu ở vị tríC4
SwF5
803,77
Nhómsulfatechủ yếu ởvị tríC2
và/hoặcC3
SmF3
839,22
Nhómsulfatechủ yếu ở vị tríC4
ToF2
820,00
Nhómsulfatechủ yếu ởvị tríC2
và/hoặcC3


3.5.2. CácđặctrưngcấutrúcthuđượctừphổNMR
* Phổ13C-NMR:
Giống như nhiều fucoidan rong nâu khác trên thế giới đã đượccông bố,
fucoidan rong nâu ở Việt Nam cũng có phổ 13C-NMR rất phứctạp với nhiều
vùng tín hiệu trùng lặp chồng lấn nhau do trong phân tử
củachúngđượccấutạobởicácgốcđườngfucose(C6H12O5)vàhexose(C6H12O6)khácnha

u, điều này rấtkhó đểg i ả i t h í c h đ ư ợ c m ộ t c á c h đ ầ y đủvềcấutrúccủa
chúng.Tuynhiên,trênphổ13C-NMR của tất cả cácphân đoạn fucoidan đều có những đặc
điểm chung để nhận biết fucoidanthơng qua các tín hiệu của gốc α-L-Fucpđó là
những tín hiệu mạnh xuấthiện trong vùng trường cao 15-18 ppm đặc trưng cho
nhóm metyl (CH3-)và các tín hiệu trong vùng trường thấp 97-102 ppm đặc
trưng cho cacbonα-anomeric (C1) của gốc đường 1→3)-α-L-fucopyranose,
vùng tín hiệu67-86 ppm là vùng của cacbon C2-C5 của vịng pyranoid. Bên
cạnh đó,phổ13C-NMR cũng cho thấy sự có mặt của gốc đường β-DGalactosethơng qua các tín hiệu đặc trưng cho cacbon C6 không liên kết và
cacbonC1 của gốc β-D-Galactose tương ứng ở độ dịch chuyển hóa học
trongvùng 61-62 ppm và 103-104 ppm. Ngồi ra, các tín hiệu ở độ dịch
chuyểnhóa học 20,9 ppm và vùng (173-175 ppm) trên phổ13C-NMR của cácphân đoạn SpF3 và
SwF5 cịn chỉ ra sự có mặt của nhóm O-acetyl trongphântử của hailoại
fucoidannày.

α-L-Fucp-C6

α-L-Fucp C2-C5

α-(1,3)-L-Fucp-C1

β-D-Gal-C6

β-D-Gal-C1

Hình3.11.Phổ13C-NMR củaphânđoạnfucoidanSdF3 từS.denticapum

* Phổcộnghưởngtừhạtnhân1H-NMR:
Phổcộnghưởngtừhạtnhân1H-NMRcủacácpolysacaritn ó i chungvàcủafucoidannói
riêng
đều

hết
sức
phức
tạp,
độ
phân
giải
khơngcaovớirấtnhiềupictrùngchậpvàchenlấnnhau.Vìvậy,rấtkhóđểgiải


thích thỏa đáng tất cả các tín hiệu trên phổ này. Mặc dù vậy, cũng giốngnhư các
loại fucoidan đã được cơng bố trước đó, trên phổ 1H-NMR của cả05phânđoạnfucoidan
SdF3,SpF3,SmF3,SwF5vàToF2đềuxuấthiệnnhững tín hiệu mạnh ở vùng trường cao 1,2-1,8
ppm đặc trưng cho protonH6củanhómmethyl vịngfucosevàcáctínhiệuxuất hiệntrongvùng4,9-5,2
ppm
đặc
trưng
cho
proton
H1
của
vịng
1→3)-α-Lfucopyranose.Bêncạnhđótrênphổ1HNMRcũngxácnhậnsựcómặtcủag ố c galactose thơng qua các tín hiệu ở độ dịch
chuyển hóa học 3,1-3,3 ppm và5,3-5,4 ppm đặc trưng cho proton H6 và H1 của vịng β-DGalactose.Ngồi ra, trên phổ của các phân đoạn SdF3, SwF5, SpF3 và ToF2
cịnxuất hiện nhóm tín hiệu trong vùng 2,1-2,3 ppm cho thấy sự có mặt
củanhómO-acetyl.

C2-C5
β-D-Galp-H1


β-D-Galp-H6

α-(1,3)-L-Fucp-H1

α-L-Fucp-H6

OAc(CH3)

Hình3.12.Phổ1H-NMRcủaphânđoạnfucoidanSdF3 (S.denticapum)

Như vậy, từ kết quả phân tích thành phần hóa học, phổ hồng
ngoạivàp h ổ c ộ n g h ư ở n g t ừ h ạ t n h â n ( 1H-NMRv à 1 3 CNMR)c h o t h ấ y đ ặ c điểm cấu trúc của 05 phân đoạn fucoidan đại diện cho các loài rongS.polycystum,
S.denticapum, S.mcclurei, S.swartziivàTurbinaria ornatathuộc nhóm sulfated
galactofucan có cấu tạo mạch chính chủ yếu là cácgốc 1→3)-α-L-Fucp, gốc βD-Galpcó thể tồn tại ở mạch chính và/hoặc ởmạch nhánh. Chính vì sự phức tạp
trong thành phần cũng như cấu trúcmạch nhánh, nên việc phân tích cấu trúc chi
tiết của fucoidan là vơ cùngkhó khăn. Do vậy, phân đoạn fucoidan SmF3 từ
rongS.mcclureilà phânđoạn có hoạt tính sinh học tốt và có thành phần hóa học
đơn gian nhất sẽđượclựa chọnđểtiếp tục nghiên cứuchitiếthơnvề cấu trúc hóahọc.


3.6. PHÂNTÍCHCẤUTRÚCCỦAPHÂNĐOẠNFUCOIDANSmF3ĐƯ
ỢCCHIẾTTÁCHTỪRONGNÂUSARGASSUMMCCLUREI.
Theo kết quả ở mục 3.3, phân đoạn SmF3 có thành phần chính làfucose,
galactose vàs u l f a t e
(35%),
tỉ
lệ
fucose:galactose
≈ 1 : 0 , 7 1 , n g o à i rakhông chứa thêm các thành phần đường khác (bảng
3.5).P h ổ F T - I R của phân đoạn SmF3 giúp ta nhận biết sự có mặt của nhóm

sulfate thơngqua các tín hiệu ở 1262,73 cm -1(S=O) và 839,22 cm-1(S-C-S) (hình
3.13),ngồirađỉnhhấpthụởsốsóng839,22cm -1cịn cho biết vị trí nhóm thếsulfate trong phân
tử fucoidan SmF3 ởa x i a l ( C 4 ) c h i ế m ư u t h ế . T u y nhiên, dữ liệu
phổ hồng ngoại chỉ cho biết thơng tin nhóm sulfate ở vị tríaxial (C4) hay
equatorial (C2 hoặc C3) của vịng pyranose nói chung màkhơng phân biệt được
nó thuộc vịng fucose hay galactose. Vì vậy, để giảiquyết vấn đề này chúng tơi
sẽ tiến hành phân tích bằng phương pháp phổcộnghưởngtừ hạt nhân vàphổ khối.
Trên phổ13C-NMR (hình 3.14) của fucoidan tự nhiên phân đoạnSmF3 các

S=O

C-O-S

Hình 3.13: Phổ FT-IR của fucoidan- SmF3 từ rong nâu Sargassum mcclurei

tín hiệu mạnh trong vùng trường cao 15,5-17,7 ppm và vùnganomeric 96,0100,4 ppm đặc trưng cho C-1 và C-6 của vịng α-L-fucose. Các tín hiệu ở 102,7 ppm,
61,7v à 6 7 , 0 p p m l ầ n l ư ợ t đ ặ c t r ư n g c h o cacbon C-1, C-6 tự
do và C-6 có liên kết của gốc β-D-galactose. Tổ hợpphức tạp các tín hiệu trong
vùng 67,8-85,0 ppm là của cacbon vịngpyranose C2-C5. Ngồi ra khơng phát
hiện thấy các tín hiệu chứng tỏ sựcómặtcủacácnhómacetatvà
axítu r o n i c trongphân tửfucoidan SmF3.
Sự phức tạp của phổ1H-NMR phân đoạn fucoidan SmF3
cũngtươngtựnhưcácloạifucoidankhácđãcơngbố,nênviệcgiảithíchthỏa


đáng các tín hiệu trên phổ này là điều khơng thể. Tuy nhiên, một phầnthông tin
về đặc trưng cấu trúc của fucoidan vẫn có thể thu nhận được từphổ 1H-NMR
thơng qua các tín hiệu đặc trưng của gốc đường fucose
vàgalactose.Đ ó l à c á c t í n h i ệ u m ạ n h t r o n g v ù n g t r ư ờ n g c a o 1 , 2 1 , 4 p p m củaprotonH6 (nhóm methyl)vàvùng 5,2-5,3ppm thuộcvềprotonH1(αanomeric) của gốc 1→3)-α-L-Fucp,tín hiệu nhỏ hơn ở 5,0 ppm làH1 của gốc
1→4)-α-L-Fucp. Bên cạnh đó, các tín hiệu đặc trưng choproton H6 và H1 của

gốc β-D-galactose được xác nhận thông qua các tínhiệuởđộ dịchchuyển hóahọc
3,7 ppmvà 5,4 ppm.

α-L-Fucp-C6
C2-C5
α-(1,3)-L-Fucp

β-D-Galp-C6

β-D-Galp-C1

Hình3.14: Phổ13C-NMRcủafucoidan-SmF3từrongSargassummcclurei
* Khửsulfate
Khử sulfate được thực hiện nhằm mục đích làm đơn giản hóa
cấutrúccủafucoidanphânđoạnSmF3.Kếtquảđophổ 13C-NMRcủafucoidan
đề
sulfate hóa SmF3-Ds cho thấy tín hiệu đặc trưng của cacbonC6khơngliênkếtcủagốcβ-D-Galactose ở61,7ppmđãtănglênđángkểsovớitrước
khiđượckhửsulfate,điềunàychỉranhómsulfatedcóthểtồntạiởvịtríC-6 của mộtsố gốc galactose.
* Phântích liên kếtbằngphươngphápmethylhóa
Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa của fucoidan SmF3(bảng
3.10) cho thấy chủ yếu là các gốc fucose liên kết 3 (46%), cùng với mộtlượngíthơn
các
gốc
galactose
liên
kết
4
(18%),
fucose
liên

kết
4chiếm12%v à g a l a c t o s e l i ê n k ế t 6 c hỉ c ó 2% . F u c o i d a n S m F 3 c ó c hứ a các
gốc fucose và galactose ở đầu mạch khơng khử nhưng nó chỉ có gốcgalactoseliên kết(1→6)ởcuốimạch
khử.


Việcpháthiện cácgốc3,4-và2,4-di-O-methyl-galactitolc h o thấynhómsulfateở
vịtríC2/C3và/hoặcC4củagốcgalactosevà/hoặcgốcgalactose tồn tạiở mạch nhánh.
Bảng3.10.Phântíchmethylhóacủafucoidanđề sulfatehóa SmF3-DS.
Thànhphầncácgốcđường
mol
Dạngliên kết
(methylated fucitol
%
hoặcgalactitolacetate)
2,3,4-tri-O-methyl-fucitol
5
Fuc1→
2,3-di-O-methyl-fucitol
12
→4Fuc1→
2,4-di-O-methyl-fucitol
46
→3Fuc1→
2,3,4,6-tetra-O-methyl-galactitol 8
Gal1→
2,3,6-tri-O-methyl-galactitol
18
→4Gal1→
2,3,4-tri-O-methyl-galactitol

2
→6Gal1→
3,4-di-O-methyl-galactitol
1
→2,6Gal1→
2,4-di-O-methyl-galactitol
2
→3,6Gal1→
1,2,3,4-tetra-O-methyl-galactitol 6
→6Gal
Nhưv ậ y , b ằ n g c á c p h ư ơ n g p h á p p h â n t í c h h ó a h ọ c v à p h â n t í c h phổ
IR,NMR,đặctrưngcấutrúccủafucoidanSmF3đãđượcxácđịnhnhư sau: mạch chính được tạo nên chủ
yếu bởi gốc α-L-fucose-(1→3),trong thành phần mạch chính và/hoặc mạch
nhánh cịn chứa các gốcα-L-fucose-(1→4); galactose-(1→4) và galactose(1→6). Nhóm sulfate ởvịtríC2 và/hoặcC4 trên gốc đườngfucosevàgalactose.
Để khẳng định lại cấu trúc dự đoán trên và xác định trật tự liên kết giữa
các gốc đường trong phân tử fucoidan SmF3, các oligofucoidanSmF3 sẽ được
phân tích bằng khối phổ nhiều lần (MALDI-TOF/MS/MSvàESI-MS/MS).
*Phổk h ố i c ủ a o l i g o s a c a r i t đ ư ợ c đ i ề u c h ế b ằn g p h ư ơ n g pháp tựt
hủy phânfucoidan SmF3
Hiệu suất của phân đoạn oligosacarit SmF3-AH đạt được là 85% sovới
SmF3.Kếtquảphântíchthànhphầnmonosacaritcủaphânđoạnnàycho thấy hàm lượng (% mol) fucose
chiếm 68,5%, hàm lượng galactosechiếm 31,5%. Kết quả phân tích thành phần
monosacarit của phân đoạntrọng lượng phân tử cao thu được sau thủy phân cho
thấy hàm lượnggalactose giảm xuống (14,7%) và hàm lượng fucose tăng lên
(85,3%). Sovới các kết quả thu được khi phân tích fucoidan từ các loài rong
thuộc bộLaminarialestrong cùng điều kiện tự thủy phân cho thấy trong phân
tửfucoidan SmF3 không chứa các đoạn mạch dài chỉ được tạo nên bởi
cácgốcgalactose.Đểchứngminhchodựđốnnàychúngtơitiếnhànhphân



tích khối phổ nhiều lần với chế độ ion âm (negative-ion tandem MS) của các
đoạn mạch ngắn nhằm xác định trật tự của các liên kết đường
trongphânt ử f u c o i d a n . P h ổ k h ố i c ủ a o l i g o f u c o i d a n S m F 3 A H đ ư ợ c đ o t h e o haiphươngpháplàMALDI-TOF/MS/MSvàESI-MS/MS.

Hình 3.15. Phổ khối MALDI-TOF chế độ ion âm của
fucooligosacaritSmF3từrongS. mcclureinhận được bằngtự
thủyphân
Kết quả đo khối phổ bằng cả hai phương pháp cho thấy tín hiệu lớnnhất là
mảnhởm/z: 243,0 của monosulfated fucose [Fuc(SO 3)]-cùng vớimộttậphợpcácionmảnh
khácnhư(m/z:224,98;387,09;533,14;695,15vàcácmảnhionkhác)vàlượnglớncácmonosulfatedfucooligosacarit(m/z:
389,10; 535,15; 681,16 và 827,13) (bảng 3.11). Tiếp theo lần lượtcác mảnh ion
chính và các mảnh oligosacarit sẽ được phân tích đặc trưngcấu trúc bằng
phương pháp khối phổ nhiều lần MALDI-TOF/MS/MS vàESI-MS/MS. Cơ chế
phân mảnh xảy ra theo quy tắc được đề xuất bởiDomonvà Costello.
Bảng 3.11. Các đặc trưng cấu trúc của một số oligosacarit nhận được
từfucoidanSmF3 của rongS.mcclureibằngtự thủyphân
m/z
MALDI[
M*-Na]243,00
389,10
405,10
491,04

ESI
[M-nNa]n−
243,016
259,012
389,077
405,070
234,0102-


-

182,3233-

-

187,6542-

Thành phần/đặc trưng cấu trúc của
monosacaritvàoligosacarit
−
Fuc(4SO−3), Fuc(2SO− ),Fuc(3SO
)
3
−
−
Gal(4(6)SO 3),Gal(2SO ) 3
[Fuc2(SO3)]−
Gal(2SO−3)-(1,3)-Fuc
Fuc(2SO−3)-(1,3)-Fuc(2 SO− )3
Fuc-(1,3)-Fuc(2,4SO−3)
Fuc(2SO−3)-(1,4)-Fuc(2 SO− )**
3

Fuc(2SO− )-(1,4)-Fuc(2,3
SO− )33
Fuc(2,4SO−3)-(1,3)-Fuc**
Gal(4/6,3SO−3)-(1,3/4)-Fuc(2/3SO− )3
Fuc(2,4SO−3)-(1,4)-Gal(2 SO− )3


3


507,03

242,008

535,15
551,15
653,05
681,16
697,15
783,04
799,03
-

535,136
231,007
236.341
315,0402380,0742388,0702285,0283-

827,13
843,12
859,10
944,97
960,95
989,05
1005,04
1062,79

1090,87
1106,87

460,0942339,0513338,551
541,065

*M:muốinatrisulfateoligosacarit

Gal(2 SO3− )-(1,3)-Fuc(2SO− )3
Gal(2 SO3− )-(1,3)-Fuc(2 SO−3)**
[Fuc3(SO3)]−
[Fuc3(SO3)]3−
Gal(2SO3− )-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc
[Fuc2Gal(SO3)3]3−
[Fuc2Gal(SO3Na)2−Na]−
[Fuc4(SO3)]−
[Fuc3Gal(SO3)]−
[Fuc4(SO3Na)2−Na]−
[Fuc3Gal(SO3Na)2−Na]−
Gal(2SO- )-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc(SO- )-(1,3)-Fuc(SO
)33
3
Gal(4/6,2SO- )-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc(2SO
)33Fuc-(1,4)-Gal(3SO-3)-(1,3)-Fuc(2SO- )-(1,3)-Fuc(2SO
)3
3
[Fuc5(SO3)]−
[Fuc4Gal(SO3)]−
[Fuc3Gal2(SO3)]−
[Fuc4Gal(SO3Na)2-Na]−

[Fuc3Gal2(SO3Na)2-Na][Fuc3Gal2(SO3)3]3−
[Fuc5Gal(SO3)−
[Fuc4Gal2(SO3)]−
[Fuc3Gal2(SO3Na)3-Na][Fuc5Gal(SO3Na)2−Na]−
[Fuc4Gal2(SO3Na)2−Na]−

**Các ionmảnhđặc trưngchokiểuliênkếtcócườngđộthấp

Trên phổ ion-âm ESI-MS/MS của mảnh monosulfated
galactose[GalSO3]-ở m/z 259,02 xuất hiện hai tín hiệu chính có cường độ
mạnhtương đương nhau ở số khối m/z 138,98 ( 0,2X) và m/z 198,99 (0,2A).
Theocông bố của Tissot và cộng sự, vị trí nhóm sulfate ảnh hưởng đến cơ
chếphân mảnh vịng đường. Các tín hiệu ở m/z 138,98 ( 0,2X) và m/z
198,99(0,2A) đặc trưng cho vị trí nhóm sulfate ở C-2 và C-4. Kết quả đo phổ 13CNMR của fucoidan khử sulfate SmF3-DS cho thấy tín hiệu nhóm methylC-6 khơng liên kết của vòng
Galactose tăng lên đáng kể so với fucoidanSmF3 trước khi được khử sulfate,
điều
đó
chứng
tỏ
nhóm
sulfate
có
thểtồnt ạ i ở v ị t r í C 6 c ủ a g ố c đ ư ờ n g n à y . N h ư v ậ y , m ả n h ở m -/ z 2 5 9 , 0 2 tươngứngvới haidạngcấutạolà Gal(4/6SO ) vàGal(2SO ).
3

3

Phổ ESI-MS/MS và MALDI-TOF/MS/MS ở chế độ ion âm củamảnh
fucose monosulfate [FucSO 3]-ở m/z 243,0 (hình 3.16 A,B) cũngxuất hiện các tín
hiệu ở m/z 182,9 (0,2A) vàm / z 1 3 8 , 9 ( 0,2X) cho thấy vịtrí của nhóm sulfate

ở C-4 và C-2 của gốc α-L-Fucp. Tuy nhiên, trên phổMALDI-TOF/MS/MS tín
hiệu
ở
m/z
182,9
cao
hơn
tín
hiệu
ở
m/z
138,9(hình3.16A)chỉrarằnggốcfucoseđượcsulfatehóaởvịtríC-4nhiều


hơnC-2.Nhưvậy,phổMS/MScủamảnhởm/z243,0chothấynólàhỗnhợpcủa hai
monosulfatefucosegồmFuc(4SO- )và Fuc(2 SO- ).
3
3

Hình 3.16. Phổ MALDI-MS/MS của mảnh [FucSO3]-ở số khối 225,0
(A)vàphổ ESI-MS/MS củamảnh [FucSO3]-ởsố khối 243,02 (B)
Trên phổ MALDI-TOF/MS/MS của mảnh [Fuc 2(SO3Na)2-Na]-ởm/z 491,0
(hình 3.17A) xuất hiện tín hiệu của các mảnh ion chính như B 1ở m/z 225,0;Y1ở
m/z 243,0 cùng với các tín hiệu nhỏ hơn gồm 0,2Xoởm/z 138,9;0,2A2ở m/z
329,0và0,2X1ở m/z 386,9. Cho thấy,mảnh[Fuc2(SO3Na)2-Na]-ở m/z 491,0 là hỗn
hợp của hai disacarit như đượctrình bày trong bảng 3.11 và hình 3.17A. Phổ
ESI-MS/MS của mảnh[Fuc2(SO3)3]3−tạim/z182,33 (3.17B) thu được các tín hiệu
của ion Y1’ ởm/z 160,98tương tứng với gốc disulfated fucose ở phía đầu khử,
ion B1ởm/z 225,01 tương ứng với gốc monosulfated fucose ở đầu không khử,
ion0,2Xoở m/z 138,9 tương ứng với gốc sulfate ở vị trí C-2, ion 2,4A2ở m/z181,99

được sinh ra từ sự phân mảnh của gốc fucose ở phía đầu khử đượcsulfatehóaképởvịtrí
C-2vàC-3.Nhưvậy,mảnh[Fuc2(SO3)3]3-tạim/z182,33sẽ cócấutạo như được miêutatrênhình
3.17B.

Hình3.17.PhổMALDI-TOF/MS/MScủa[Fuc2(SO3Na)2-Na]-tạim/z
491,00(A)vàCIDESI-MS/MScủa[Fuc2(SO3)3]3−tạim/z182,33(B)


Tiếpt h e o c h ú n g t ô i n g h i ê n c ứ u đ ặ c t r ư n g c ấ u t r ú c c ủ a c á c m ả n h vớis
ốkhốim/z 405,10và 507,03đâylầnlượtlàcácmảnhdi
sac arit có
chứagalactose[FucGal(SO - )]-và[FucGal(SO - )] 2-(bảng3.11).Kếtquả
3

32

phân tích phổ khối nhiều lần MALDI-TOF/MS/MS của các mảnh ion nàychothấyvị
trí
liên
kết
thích
hợp
nhất
của
các
gốc
galactose
là
điểm
cuốicủađầumạchkhơngkhử.Cáckếtquảnàychỉrarằngcácgốcgalactosecóthể

ởvịtrícuốicùngtrêncácđoạnmạchcócấutạolàcácgốcα-LFucpliên kết 3. Để làm sáng tỏ thêm nhận định trên, chúng tơi tiến
hànhphântíchphổkhốinhiềulầnESI-MS/MScủamảnhion[GalFuc(SO- )] 333
ở số khối m/z 187,65 (Hình3.18)

Hình 3.18. Phổ khối nhiều lần ESI-MS/MS của mảnh
ion[GalFuc(SO- )]333-tại sốkhối m/z 187,65
Trên phổ ESI-MS/MS của mảnh [GalFuc(SO 3)3]3-m/z 187,65 chothấy tín
hiệu mạnh nhất là mảnh ở m/z 159,97 của ionB′1(phông innghiêng để ký hiệu là
ion hỗn hợp và dấu “′” để ký hiệu ion được sulfatehóa kép) tương ứng với gốc
galactose sulfate hóa kép ở phía đầu mạchkhơng khử chiếm đa số (hình 3.18).
Bên cạnh đó, tín hiệu khá cao củamảnh ion 0,2A1ở m/z 182,99 và0,2X1ở m/z
138,97 chỉ ra sự có mặt củagốc fucose khơng khử, được sulfate hóa ở vị trí C-2
và C-4, kết hợp vớitín hiệu ở của mảnh ion 0,3A1ở m/z 168,98 cho thấy nhóm
sulfate
ở
vị
tríC3củagốcgalactosephíađầumạchkhử.Nhưvậy,mảnh[GalFuc(SO 3)3]3-m/z 187,65 là
hỗn hợp của hai disacarit có cấu tạo nhưđượctrình baytrongbảng3.11 và hình
3.18.
KếtquảphântíchphổESI-MS/MScủaiontriplysulfatedtetrasacarit
[Fuc3Gal(SO3)3]3-ởm/z 285,03(Hình 3.19)c h o t h ấ y k h ả năng mảnhnày tồn
tạiítnhất3biến
thể
cấu
trúc(bảng
3.11).L ầ n
đ ầ u tiên,bằngphươngphápphântíchphổkhốinhiềulầnMS/MScủa