ĐẠIHỌCTHÁINGUYÊN
TRƢỜNGĐẠIHỌCSƢPHẠM

BÙITHỊHÀ

NGHIÊNCỨUTĂNGCƢỜNGBIỂUHIỆNGENMÃH
ÓA ENZYME DATTHAM GIA TỔNG
HỢPALKALOIDỞCÂYDỪACẠN
(Catharanthusroseus(L.)G.Don)

Chuyên ngành: Di truyền
họcMãsố:9420121

TÓMTẮTLUẬNNTI N SS I N H H Ọ C

THÁINGUYÊN-2017


Cơngtrìnhđượchồnthànhtại:
TRƢỜNGĐẠIHỌCSƢPHẠM–ĐẠIHỌCTHINGUN

Người hướngdẫnkhoahọc:1.PGS.TS.NguyễnThịTâm
2.GS.TS.ChuHồngMậu

Phảnbiện1:…………………………………………………….
Phảnbiện2:…………………………………………………….
Phảnbiện2:…………………………………………………….

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp
TrườngHọptại:TRƢỜNGĐẠIHỌCSƢPHẠM-ĐẠIHỌCTHINGUN
Vào hồi

giờ
phút,ngày tháng năm2017

Cóthểtìmhiều luậnántại:
1. ThưviệnQuốcgiaViệtNam
2. Trungtâmhọc liệu -ĐạihọcTháiNguyên
3. ThưviệnTrườngĐạihọcSư phạm -ĐạihọcTháiNguyên


CCCƠNGTRÌNHCƠNGBỐLIÊNQUANĐNLUẬNN
Cácbài báo
1. BùiThị H à ,H ồ M ạ n h T ư ờ n g , Hoàng Phú H i ệ p , L ê V ă n Sơ n ,Nguyễ
nThịTâm,ChuHồngMậu(2015),“Táchdịngphântửvàthiếtkếvectorchuyển genDATphân lập từ
cây dừa cạn (Catharanthus roseus(L.) G.Don),T A P CHISINHHOC37(2),
pp.236-243.
2. Bùi Thị Hà, Trần Thị Anh, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu
(2015),“Nghiên cứu hệ thống tái sinh đa chồiin vitroở cây dừa cạn
(Catharanthusroseus(L.).G.Don)”,Tạp chí KHĐHQGHN. Khoa học Tự nhiên
và côngnghệ,Tập 31, sô4S , tr56-62.
3. Bùi Thị Hà, Đỗ Huy Hoàng, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu
(2016),“Nghiên cứu quytrình chuyển genởcâydừa cạn (Catharanthus
roseus(L.)
G.Don)”,TạpchíKhoahọcvàCơng nghệ,Tập 157,số12/1
4. Bui Thi Ha, Nguyen Thi Ngoc Lan, Nguyen Thi Tam , Le Van Son,
ChuHoang Mau (2017), “Expression of the gen encoding deacetylvindoline 4O-acetyl transferase (CrDAT) fromCatharanthus roseusin transgenic
tobaccoplants”. (Gửi tạitạpchíKhoahọcQuốc tếđangđợiđăng)

Cáctrìnhtựgen đãđăngký trênNgânhàngGenquốctế
[1].Bui,H.T., Hoang,H.P., Nguyen,T.T. and Chu,M.H
(2015),Catharanthus roseusmRNA for DAT enzyme (DAT gene),

isolate TN1(Pink-purpleflower),GenBank:LN809930.1
[2].Bui,H.T.,Hoang,H.P.,Nguyen,T.T.andChu,M.H(2015),Catharanthus
roseusmRNA
for
DAT
enzyme
(DAT
gene),
isolate
TN2(Whiteflower),GenBank:LN809931.1


1
MỞĐẦU
1. Đặtvấnđề
Hiện nay, loài người trên thế giới đang phải đối mặt với rất nhiều
cănbệnhnguyhiểm,ảnhhưởngnghiêmtrọngtớisứckhỏenhư:Ungthư,AIDS,tiểuđường
,thốihóakhớp,viêmganB,C.Ungthưlàcănbệnhgâytửvonghàngđầutrêntồnthếgiới.Theotổ
chứcYtếThếgiới(WHO)tỉlệngườimắc ung thư năm 2012 là 14 triệu người. Đến năm
2015

đã

có

hơn

90

triệungườimắcungthưvàhàngnămcóhơn8triệungườichếtvìungthư.

Cây dừa cạn (Catharanthus roseus(L.) G. Don) là một trong
nhữngloạicây

dượcliệuquý.Cây

dừacạncókhảnăngsảnxuấtc á c i n d o l alkaloid có dược tính quan trọng
trong sản xuất các loại thuốc chống ungthư, đặc biệt là ung thư máu.
Ngoài ra, cây dừa cạn còn được chỉ dẫn trongđiều trị bệnh bạch cầu
lympho

cấp

và

một

số

bệnh

ung

thư

khác.

Trong

dângian,d ừ a c ạ n đ ư ợ c s ử d ụ n g t r ị c a o h u y ế t á p , b ệ n h t i ể u đ ư ờ n g , đ i ề
u h ị a kinhnguyệt,chữatiêuhóakémvàchữalị,lợitiểukhámạnh,chữabệnhđitiểuđỏ và ít, tẩygiun, chữa

sốtcao.
Trongcâydừacạncóchứa2loạialkaloidlàvinblastinev à vincristine
được sửd ụ n g r ộ n g r ã i t r o n g đ i ề u t r ị b ệ n h u n g t h ư .
V i n b l a s t i n e và vincristine là những chất ức chế mạnh sự phân chia tế
bào và do vậyngăncản sự tăng số lượng tếbào
Hàm lượng vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn hoang dại
rấtthấpchonênđịnhhướngnghiêncứulàmtănghàmlượngalkaloidởcâydừacạn được
quan

tâm

với

việc

sử

dụng

kỹ

thuật

hiện

đại

trong

đó,


xác

định

vàtăngcườngbiểuhiệnenzymechìakhóalàrấtquantrọng.Deacetylvindoline-4-Oacetyltransferase (DAT) là một trong những enzyme chìa khóa trongchuỗi chuyển hóa tổng hợp
alkaloid

ở

cây

dừa

cạn.

Biểu

hiện

mạnh

enzymeDATsẽlàmtăngcácsảnphẩmchuyểnhóathứcấpvàhàmlượngvinblastinevàvinc
ristinetrongdừacạnsẽđượcnângcao.


Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án:“Nghiên cứu
tăngcường biểu hiện gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp
alkaloid ởcâydừa cạn(Catharanthusroseus(L.)G.Don)”.
2. Mụctiêunghiêncứu

Xác định đặc điểm và biểu hiện được gen mã hóa deacetylvindoline-4O-acetyltransferase (CrDAT) phân lập từ cây dừa cạn. Tạo được cây
dừacạnchuyển genCrDATcó hàmlượng alkaloid đượccảithiện.
3. Nộidungnghiêncứu
3.1. Nghiên cứu thu thập thông tin về genCrDAT, thiết kế cặp mồi
PCRnhân bản genCrDAT, khuếch đại, tách dịng và xác định trình tự
genCrDAT.
3.2. Thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa genCrDATvà đánh giá
hoạtđộngcủa vectorchuyển gen trên câythuốc lá.
3.3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh và xây dựng quy trình chuyển gen
thơngquaAgrobacteriumtumafaciensởcâydừa cạn.
3.4. Nghiên cứu chuyển genCrDATvào dừa cạn, phân tích cây chuyển
genvàđánhgiásựbiểuhiệnchứcnăngsinhhọccủagenchuyểnCrDATở câydừa cạn.
4. Nhữngđónggópmớicủaluậnán
Luận án là cơng trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ
thốngtừ phân lập, tách dịng phân tử đến thiết kế vector chuyển gen và
biểu hiệngenCrDATởcâythuốc lá và câydừa cạn,cụ thể là:
1) Đãphânlậpđượcgen CrDATtừ mRNAcủa câydừacạn,genCrDAT
(cDNA)có kíchthước 1320bp, mãhóa4 3 9 amino acid.
2) Xây dựng được quy trình tái sinh, quy trình chuyển gen thơng
quaA.tumefaciensvà tạo được 4 dịng dừa cạn chuyển genCrDATở thế hệ
T1(T1-1; T1-3; T1-6; T1-7) có hàm lượngalkaloidtổng sốtăng từ3 , 1 6
l ầ n đến15,57 lần sovớiđốichứng không chuyển gen.


3) ProteintáitổhợprCrDATđượcbiểuhiệntrêncâythuốclá,câydừacạnchuyểnge
n và kếtquả đượckiểmchứng bằng Westernblotvà ELISA.
5. Ýnghĩakhoa họcvà thựctiễn củađề tàiluậnán
Vềmặtkhoa học
Kết quả nghiên cứu trong luận án góp phần làm sáng tỏ đặc
điểmcấu trúc của genCrDATphân lập từ cây dừa cạn màu hoa hồng tím và

màuhoa trắng thu thập tại Thái Nguyên. Cơ sở khoa học và hiệu quả của
kỹthuật tăng cường biểu hiện gen mã hóa enzyme chìa khóa trong
chuỗichuyển hóa tổng hợp alkaloid nhằm nâng cao hàm lượng alkaloid của
câydừa cạn.
Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học cùng với 2 trình
tựgen công bố trên Ngân hàng gen quốc tế là những tư liệu có giá trị
thamkhảo trongnghiêncứu và giảng dạysinh học và cơng nghệ sinhhọc.
Vềmặtthựctiễn
Cáct r ì n h t ự g e n C r D A T đ ư ợ c p h â n l ậ p , c ấ u t r ú c v e c t o r c h
u y ể n gen,cácdịngcâychuyểngengópphầngiảiquyếtnhữngvấnđềcụthểvềviệc sử dụng kỹ thuật
chuyển gen để cải thiện hàm lượng alkaloid trong câydượcliệunóichungvàcâydừa
cạn nói riêng. Kết quả nghiên cứu đã mở ratriển vọng ứng dụng kỹ thuật biểu hiện mạnh gen mã hóa enzyme vào
việcnâng cao hàmlượng dượcchấttrong câydược liệu.
6. Cấu trúc luận án:Luận án có 120 trang (kể cả tài liệu tham khảo)
đượcchia thành các chương, phần: Mở đầu (03 trang), Chương 1: Tổng
quan tàiliệu (21 trang), Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
(21 trang);Chương 3: Kết quả và thảo luận (49 trang); Kết luận và đề nghị
(01
trang);Cácc ô n g t r ì n h c ô n g b ố l i ê n q u a n đ ế n l u ậ n á n ( 0 1 t r a n g ) ; T à
i l i ệ u t h a m khảo(16trang).Phụlục(4trang).Luậnáncó20bảng,31hìnhvàthamkhảo121 tàiliệu.


Chƣơng1.TỔNGQUANTÀILIỆU
Luận án đã tham khảo 22 tài liệu tiếng Việt; 99tài liệu tiếng Anh
đểtổngkếtcácnộidungcóliênquan,baogồm:( 1 ) Alkaloidởcâydừacạn,(2)Sinhtổnghợp
alkaloid

và

hoạt


động

của

DAT

ở

cây

dừa

cạn,

(

3)

Nghiêncứucảithiệnhàmlượngalkaloidởcâydừacạn.
Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vịng,
cóphảnứngkiềm,thườnggặptrongthựcvậtvàđơikhicótrongđộngvật,thường có dược tính mạnh.
Trong

lĩnh

vực

y


học,

alkaloid

cung

cấp

nhiềuloạithuốc có giá t r ị chữa bệnhca ov à độc đáo.Theo Đỗ TấtLợ i (19
77), câydừacạn(Catharanthusr o s e u s ( L . ) G . D o n . ) h a y
hảiđằng,

d ư ơ n g giác,

bơngdừa,

trườngxnhoalàmộtlồithựcvậttrongc h i Catharanthusthuộc họ La bố ma
(Apocynaceae). Dừa cạn là cây bản địa vàđặchữucủaMadagascar.ỞViệtNam,dừacạnlàcây
hoang dại, phân bốkhắp nơi trong nước. Dừa cạn là nguồn giàu alkaloid thuộc
chủng loạialkaloid terpenoid indole được tách chiết từ ba giống, đó
làroseusvới hoamàu hồng tím,albusvới hoa màu trắngvàng vàocellatusvới
hoam à u trắngđỏ,trongđóhoamàuhồngtímcóhàmlượngvincristinevàvinblas
tinecao nhất.
Trongcâydừacạncókhoảng130loạialkaloid,trongđóvinblastine
vàvincristine làhaihợpchấtquantrọng nhất.Alkaloidcónhânindolđượctìm thấy trong tất cả cácbộ
phận của cây, nhiều nhất trong láv à r ễ . Alkaloid tồn phần có ở lá dừa
cạn với hàm lượng 0,37% - 1,15%, thân0,40%, rễ chính 0,7% - 2,4%, rễ
phụ 0,9% - 3,7%, hoa 0,14% - 0,84%, vỏquả 1,14%, hạt 0,18%. Trong
khoảng 130 loại alkaloid đã được chiết từ câydừa cạn,ngườita đặcbiệtchúý20nhóm
alkaloid dimeric là những nhómcóhoạttính chốngung


thưbao gồmvincristinevà

vinblastine.
DATl à

enzyme

ứng

chìa

khóa

cuối

xúc

tác

cho

phản
cùng

t r o n g chuỗit ổ n g h ợ p v i n d o l i n e t ừ d e a c e t y l v i n d o l i n e ở c â y
dừacạn.TheoSt-


Pierre và cs (1998) protein DAT có khối lượng phân tử là 51 kDa, gồm

9chuỗi polypeptid. GenDATở cây dừa cạn mã hóa cho enzyme acetyl
CoA:deacetylvindoline-4-Oacetyltransferase(DAT)thamgiavàobướccuốicùng trong q trình sinh tổng hợp vindoline.
GenDATcó kích thước1320bp, gồm 439 amino acid, tham gia xúc tác chuỗi
phản ứng cuối cùngtrongquá trình tổnghợp vindoline.
Đểcảithiệnhàmlượngvinblastinevàvincristine,cáchướngnghiên cứu
ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, kỹ thuật chuyểngenđãđượcđề
xuất.Nhiềunghiêncứutheohướngtăngsinhkhốinhưviệcthu nhận huyền phù tế bào nuôi cấy,
nuối cây mơ tế bào thực vật, ni cấytạo dịng rễ tơ để làm tăng hàm lượng
alkaloid,

đặc

biệt

là

vinblastine

vàvincristine.Trongnhữngnăm

gầnđây,ứngdụngkỹ thuật chuyểng e n nhằm tăng hàm lượng alkaloid trong
cây dừa cạn được quan tâm nghiêncứu. Nghiên cứu tạo dòng rễ tơ chuyển
gen ở cây dừa cạn nhờ vi khuẩnAgrobacterium rhizogenscủa Mohsen
Zargar và cs (2010) cho thấy cácdịng cây dừa cạn chuyển gen có hàm
lượng alkaloid tăng đáng kể so vớicác cây không chuyển gen. Kỹ thuật
biểu hiện mạnh một gen mã hóaenzyme chìa khóa trong chuỗi phản ứng
tổng hợp vinblastine và vincristinetrongcâydừa cạn chuyển gencịn
ítđượctập trung nghiên cứu.
Chƣơng2.VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
2.1. VẬTLIỆUNGHIÊNCỨU

Hạt của giống dừa cạn màu hoa hồng tím vàm à u h o a t r ắ n g
thu

t h ậ p tại

tỉnh

Thái

Ngun.

Giống

thuốc

tabacumK326

láNicotinana
có

nguồngốctừViệnKinhtếkỹthuậtthuốclá,doPhịngtếbàoThựcvậtViệnCơngnghệSinhhọccungcấp.
Các chủng vi khuẩn E.Coli(DH5α), chủng A.), chủng A.tumefaciensCV58
doPhịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học Việt
Nam,ViệnHàn lâmKhoa họcvà CôngnghệViệtNamcung cấp.


2.2. HĨACHẤT,THIETBỊVÀĐỊAĐIỂMNGHIÊNCỨU
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được mua từ những hãng nổi
tiếngtrênthếgiớinhưhãngFermentas,BioNeer,Invitrogen,nhưTrizolReagents,kítMaxima®


FirstStrand

cDNASynthesis,..
Các thí nghiệm được thực hiện trên các trang thiết bị hiện đại
củaPhịng cơng nghệ gen, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại
họcThái Nguyênvà Phịng thí nghiệm trọng điểm cơng nghệ gen, Phịng
Cơngnghệ ADN ứng dụng và Phịng cơng nghệ tế bào thực vật thuộc Viện côngnghệ
sinhhọc,ViệnHànlâmKhoahọc và CôngnghệViệtNam.
Luậná n đ ư ợ c h o à n t h à n h t ạ i B ộ m ô n S i n h h ọ c h i ệ n đ ạ i & G i á o
d ụ c sinhhọc,KhoaSinhhọc,TrườngĐạihọcSưphạm–ĐạihọcT h á i Nguyên.
2.3. PHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
Các phương pháp nghiên cứu chia thành 4 nhóm chính: (1)
nhómphương pháp sinh học phân tử, (2) nhóm phương pháp thiết kế
vectorchuyển gen thực vật, (3) nhóm phương pháp tạo cây chuyển gen, (4)
nhómphương phápphântích cây chuyểngen. Các thínghiệm được
tiếnh à n h theo sơđồ tổngqtmơ tả ởhình 2.1.
Phânlập,nghiêncứuđặcđiểmge

Khảo sát điều kiện tối ưu
táisinhin vitrocây dừa cạn

nCrDATc ủ a câydừacạn

từđoạnthânvànáchlámầm

Thiếtkếvector
chuyểngenthựcvậtmangg
enCrDAT

Xâydựngquytrìnhc huyểng

enquanáchlámầmnhờA.tu
mefaciensthơngquachuyể
ngengus

Chuyển cấu trúc mang gen
CrDAT vào cây thuốc lá
Chuyển cấu trúc mang gen
CrDAT vào cây dừa cạn
Phân tích cây thuốc lá chuyển gen ở T0 bằng PCR, Southern blot, Western blot
Phân tích cây dừa cạn chuyển gen CrDAT ở T0, T1

Đánhgiáchứcnăngsinhh
ọccủagenchuyểnở T1

Hình 2.1.Sơđồthínghiệmtổng qt


2.3.1. Cácphƣơngphápsinhhọcphântử
Phân lập genCrDATbằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đãthiết
kế DAT-NcoI-F/DAT-NotI-R. RNA tổng số được tách chiết bằngTrizol
Reagent Kit. cDNA được tổng hợp theo quy trình của nhà sản
xuất.Táchdịngvàgiảitrìnhtựgenquacácbước:i)TinhsạchsảnphẩmPC
R,
ii)GhépnốiđoạngenvàovectortáchdịngpBT;iii)Biếnnạpplasmidtáitổ
hợpvàotếbàokhảbiếnE.coliDH5α), chủng A.; iv) Chọn dịng khuẩn lạc bằngcolony PCR; v)
Tách chiết plasmid và cắt kiểm tra bằngBamHI; vi) Xácđịnh và phân tích
trình tự nucleotide. Kết quả nghiên cứu về các trình tựgen,amino acid
đượcxử lýbằng phần mềmBioEdit,
2.3.2. Phƣơngphápthiếtkếvectorchuyểngenmangcấutrúcchứagen
CrDAT

Vector chuyển gen mang genCrDATđược thiết kế theo hai bước
cơbản (1) Thiết kế cấu trúc độc lậpmanggen chuyểnCrDAT; (2)
Gắnc ấ u trúcchứagenCrDATvào

vectorchuyển

genthực

vậtpBI121

(Hình2.2).
NcoI

NotI
NcoI
2SP,antiABA

35S

CrDAT
pBT – CrDAT

HindIII

CrDAT

cmycKDEL

polyA


pRTRA7/3-CrDAT

RB

nptII

cmyc

KDEL

polyA

pRTRA7/3

HindIII

35S

NotI

MSC
pBI121

GUS

LB

HindIII



RB

nptII

35S

CrDAT

cmyc

KDEL polyALB

pBI121-CrDAT

Hình2.2.Sơđồ thiếtkế vectorchuyểngen pBI121-CrDAT


2.3.3. Chuyển cấu trúc mang genCrDATvào cây thuốc lá:Phương
phápchuyển cấu trúc chứa genCrDATv à o c â y t h u ố c l á t r o n g m ô i
t r ư ờ n g t á i sinhin vitrođược thực hiệntheo Topping (1998).
2.3.4. Tái sinh và chuyển gengusở cây dừa cạn:Hạt dừa cạn rửa sạchdưới
vòi nước, hạt được đưa vào trong box cấy. Sau khi khử trùng, cấy
hạtlênmơitrườngMS(Murashige,Skoog1962).
Sử dụng gen chỉ thịgusđể xây dựng quy trình chuyển gen cho cây
dừacạn. Thông qua chuyển gen gus, mật độ tế bàoA. tumefaciens, nồng
độacetosyringone, thời gian nhiễm khuẩn vànồng độ kanamycin được tối
ưulàmcơ sởchochuyển gen đích vào câydừacạn.
2.3.5. ChuyểngenCrDATvào câydừacạnthôngquaA.tumefaciens
Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyểnCrDATvào cây thuốc
láN.tabacumK326 thông qua vi khuẩnA. tumefaciensvà tạo cây thuốc

láchuyển gen qua hệthốngtáisinh phù hợp theomô tả củaTopping-1998.
Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyểnCrDATvào cây dừa cạn
hoahồng tím nhờ vi khuẩnA. tumefaciens. Quy trình tạo cây dừa cạn
chuyểngenđượcthựchiện dựa trênkếtquả nghiên cứu chuyển gengus.
2.3.6. Phƣơngphápphântíchcâychuyểngen
XácđịnhsựcómặtvàsựhợpnhấtgenchuyểnCrDATvàohệgentếbàochủ của cây thuốc
lávàcâydừacạnchuyểngenbằngPCRvàSothernblot.Các cây chuyển gen dương tính với kết
quả lai Southern được sử dụng chophân tích sự biểu hiện protein tái tổ hợp
CrDAT bằng Western blot. Địnhlượng protein tái tổ hợp rCrDAT được
tiến hành theo phương pháp của Sunvàcs (2006).


Chƣơng3.KETQUẢVÀTHẢOLUẬN
3.1. ĐẶCĐIỂMCỦAGENCrDATPHÂNLẬPTỪCÂY DỪA CẠN
3.1.1. Kếtq u ả táchd ò n g v à x á c đ ị n h t r ì n h t ự n u c l e o t i d e c ủ
a gen
CrDAT
tquk h u chạ i vt chdngcDNA
RNA tổng số được tách chiết từ lá cây dừa cạn TN1, TN2 và
cDNAđược tổng hợp từ RNA tổng số bằng phản ứng phiên mã ngược.
Phản ứngPCR khuếch đại cDNA của genCrDATvới cặp mồi đã thiết
kếDAT-NcoI-F/DAT-NotI-R. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di
trên gelagarose 1% cùng với thang DNA1 k b đ ư ợ c t h ể h i ệ n ở
h ì n h 3 . 1 . K ế t q u ả thu được ở hình 3.1A cho thấy, mẫu dừa cạn
TN1 và TN2 cho sản phẩmPCR với một băng DNA với kích thước ước
tính khoảng 1,3 kb. Các băngđều sáng, rõ nét và khơng có sản phẩm phụ.
Kích thước này phù hợp theotính tốn lý thuyết và tương ứng với kích
thước của đoạn mã hố của genDATởdừa cạn mang mã sốAF053307
trênNgânhànggen.
1


2

3

4

1

M

1,3kb

1,3kb
1,0kb

A

2

3 4

5 6

7 8

9 10 11 12 M

1,0kb


B

Hình 3.1.Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân genCrDAT. A:
Sảnphẩm PCR nhân genCrDAT(cDNA) từ hai mẫu dừa cạn TN1 và TN2.
M:thangDNA1kb;1,2:genCrDAT(cDNA)khuếchđạitừmẫuTN1;3,4:genCrDAT(c
DNA) khuếch đại từ mẫu TN2). B: Sản phẩm colony-PCR từ 12dòng
khuẩn lạc. 1-6: đoạn gen DAT (cDNA) khuếch đại từ khuẩn lạc củamẫu
TN2; 7-12: đoạn gen DAT (cDNA) khuếch đại từ khuẩn lạc của
mẫuTN1.M:thangDNA1kb.


Xcị n h trìnhtựgenCrDAT
KếtquảgiảitrìnhtựnucleotidecủagenCrDAT(cDNA)phânlậptừhaimẫu dừa cạn
TN1 (hoa hồng tím) và TN2 (hoa trắng) cho thấy genCrDATcó kích thước 1320 bp.
GenCrDATphân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1 vàTN2 có độ tương đồng so
với trình tự genDATmang mã số AF053307 là99,5% và 99% là tl ệ
t ư ơ n g đ ồ n g c ủ a t r ì n h t ự g e n CrDATgiữa hai mẫuTN1 và
TN2. Như vậy có thể kết luận rằng, genCrDATphân lập từ mẫudừa cạn
TN1 vàT N 2 đ ã đ ư ợ c t á c h d ò n g t h à n h c ô n g . T r ì n h
t ự n u c l e o i t d e của genCrDATphân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1, TN2
đã được đăng kýtrênNgân hàngGenquốctếvớimã sốLN809930 và
LN809931.
Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn của DAT ở hai mẫu
dừacạn TN1, TN2 và DAT mang mã số AAC99311 trên Ngân
hàngGen(proteinsuydiễntừgenDATmangmãsốAF053307)chothấyproteinDATg
ồm439aminoacidvàcóđộtươngđồngcaosovớiproteinmangmãsốAAC99311 trên Ngân hàng
gen (99,3% và 99,4%); cịn trình tự amino acidsuydiễn của haimẫu TN1 và
TN2 tươngđồng là 97,7%.
3.2. THIETKEV E C T O R C H U Y Ể N G E N V À B I Ể U H I Ệ N
GEN

CrDATTRÊN CÂYTHUỐCLÁ
3.2.1. Thiếtkếvector chuyển gen mangcấu trúcchứagenCrDAT
Trình tự nucleotid genCrDATmàu hoa hồng tím được sử dụng để
thiếtkế vector chuyển gen thực vật thông quaA. tumefaciens. Sử dụng enzymegiới
hạnHindIII xử lý vector pRTRA7/3-CrDATđể thu nhận cấu trúc35SCrDAT-cmyc-KDEL-polyA.Gắn

cấu

trúc35S-CrDAT-cmyc-KDEL-

polyAvào vector chuyển gen pBI121 bằng DNA T4 ligase tạo vector
chuyển genmangcấu trúc chứa genchuyểnCrDAT(pBI121-CrDAT.


Plasmidt á i t ổ h ợ p p B I 1 2 1 - 3 5 S - D A T c m y c đ ư ợ c t á c h ch iết , k i ể m t r a vàbiếnnạpvàoA. tumefaciens.Cấu trúc vector
chuyển

gen

pBI121

–CrDATbao

gồmcác thành phần chínhđược

thểhiệnởhình 3.8A.
1 2 3 M 4 5

RB


nptII

35S

CrDAT cmyc KDEL polyAGUS

LB

6 7 8 9 10

1,5 kb



1,0 kb

pBI121-CrDAT

B

A

Hình 3.8.Sơđ ồ c ấ u t r ú c v e c t o r c h u y ể n g e n p B I 1 2 1 CrDATvà kết quảđiện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR. A: Cấu trúc
vector chuyển genpBI121-CrDAT. LB: bờ trái của T-DNA; RB: bờ phải
của T-DNA;nptII:gen kháng kanamycin; 35S: promoter CaMV35S. B: Kết
quả

kiểm

tra


sảnphẩmcolony-

PCRcácdòngA.tumefacienschứavectorchuyểngenpBI121-DAT.
Các dòngA. tumefacienstái tổ hợp chứa vector chuyển gen pBI12135S-DAT-cmyc được kiểm tra bằng colony-PCR và kết quả phân tích
ngẫunhiên1 0 d ị n g k h u ẩ n l ạ c t h u đ ư ợ c 8 d ò n g d ư ơ n g t í n h v ớ i c
o l o n y - P C R (Hình 3.8B).Các dịngA.tumefacienstái tổ hợp chứa vector chuyển
genpBI121-CrDATđược lưu giữ và sử dụng cho các thí nghiệm chuyển
gentiếptheo.
3.2.2. PhântíchbiểuhiệngenCrDATtrên câythuốcláchuyểngen
Bien nạp cấu trúc chứa gen CrDAT và tạo cây thuốc lá chuyển gen
nhờA.tumefacinens
CácmảnhlácâythuốclágiốngK326c ó k í c h t h ư ớ c k h o ả n g 1c
2

m đượcsửdụnglàmvậtliệunhậngen.T h í n g h i ệ m c h u y ể n g e n CrDAT
vàothuốcláđượctrìnhbàyởhình3.9.


A

B

D

C

E

G


Hình3.9.Hìnhảnhmơtảqtrìnhbiếnnạp,chọnlọcvàtáisinhtạocâythuốcláchuyển
gen. A: Mảnh lá sau khi rửa khuẩn được cấy trên môi trường chọnlọc;B,C:Tái
sinhđachồi;D:Kéodàichồi;E:Tạorễ;G:Racâytrongbầuởđiềukiện nhàlưới.
Bảng 3.3 cho thấy, sau 3 lần biến nạp cấu trúc mang
genCrDATvàocácm ả n h t h u ố c l á ,
kết
quảcó
235/
2 4 9 m ả n h l á s ố n g s ó t s a u 4 t u ầ n , phát sinh 205 chồi và thu
được 186 cây conin vitrosống sót trên mơitrường MS có bổ sung kháng
sinh. Số cây ra bầu đất là1 1 3 c â y v à c ó 6 5 câytrồng tạinhà
lướicóbiểu hiện xanh tốt, mập mạp.
Bảng3.3.KếtquảbiếnnạpcấutrúcmanggenCrDATvàomảnhláthuốclá

Đối chứng
vàthínghiệm

ĐC0*
ĐC1*
Thíngh
iệm
Tổng

Lần1
Lần2
Lần3

Tổng
sốmả

nhlá

30
30
82
90
77
249

Sốmản
hlá
sốngsót
sau4tu
ần

Số
mảnhlá
cảmứng
tạochồi

0
30
79
86
70
235

0
40
68

74
63
205

Số
câyra
rễtrên
mơitrƣờn
gchọnlọ
c
0
25
55
61
52
186

Số
cây
rab
ầu

Số
câytrồn
gtron
gnhàl
ƣới

0
15

34
44
35
113

0
15
22
25
18
65


Phân tích sự có mặt và sự hợp nhất của gen chuyển CrDAT trong hệ
gencâythuốclá chuyển gen
Các dòng cây thuốcláchuyểngen T0saukhi trồngtrongnhàl ư ớ i được4tuần
thìtiếnhànhthuláđểthựchiệnphảnứngPCRvớicặpmồiCrDATF -Xba/CrDATR-Sacđể kiểm tra
sự có mặt của gen chuyểnCrDAT(Hình3.10).
1



2

3 4 5

6

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 M wt


1,5kb
1,0kb

Hình 3.10.Kết quả điện di sản phẩm PCR xác định sự có mặt của
genDATtrong các cây thuốc lá chuyển gen và đốichứng. Từ làn 1 đến làn 19:cácdòng cây thuốc lá
chuyển gen; M: thang DNA 1 kb; wt: cây thuốc lá khơngchuyểngen.
Hình 3.10 cho thấy, trong 19 dịng cây thuốc lá chuyển gen thì có
12dịng cây thuốc lá chuyển gen dương tính với phản ứng PCR là các
dịngT0-1,T 0 - 2 , T 0 - 4 , T 0 - 5 , T 0 - 6 , T 0 - 8 , T 0 - 1 2 , T 0 - 1 3 , T 0 - 1 5 , T 0 16,T0-17,
T0-19 (các dòng ở làn điện di số 1, 2, 4, 5, 6, 8, 12, 13, 15, 16, 17, 19).
Đểkhẳng định gen chuyểnCrDATđã được hợp nhất vào hệ gen cây thuốc
lá,DNA của 9 cây thuốc lá chuyển gen (T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T08,T0-12, T0-13, T0-15) cho kết quả PCR dương tính được lựa chọn
ngẫunhiên để sử dụng phân tích bằng Southern blot. Hình 3.11 cho thấy tất
cả 9dịng thuốc lá chuyển gen cho kết quả lai Southern (T0-1, T0-2, T0-4,
T0-5,T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15), trong đó hai dịng T0-5 và T0-15 cho
2băngD N A ( 2 b ả n c o p y ) , b ả y dòng c ò n l ạ i đ ề u c ó m ộ t b ă n g D N A ở c á
c


kích thước khác nhau. Bảy dịng thuốc lá chuyển gen (T0-1, T0-2, T0-4,T06, T0-8, T0-12, T0-13) cho kết quả lai Southern có một bản copy
đượcsửdụng phân tích Westernblot.
1

2456 8 1 2 1 3 1 5 ( + ) M W T
20
10
7,0
5,0
4,0
3,0

2,0
1,5

Hình 3.11. Kết quả phân tích Southern blot các mẫu thuốc lá chuyển
genCrDAT.M:Marker1kbplus,(+)PlasmidpBI121-CrDATcắtbởiSacI,115:cáccâychuyểngenT0(1:T0-1;2:T0-2;4:T0-4;5:T0-5;6:T0-6;8:T0-8;
12:T0-12;13:T0-13;15:T0-15),wt:câyđốichứngkhơngchuyểngen.
PhântíchsựbiểuhiệnproteintáitổhợpCrDATtrêncâythuốcláchuyểngen
Protein tổng số của 7 dịng thuốc lá chuyển gen T0-1, T0-2, T0-4, T06, T0-8, T0-12, T0-13 xuất hiện 1 băng DNA từ kết quả lai Southern
đượcphân tích điện di SDS-PAGE và chuyển các phân đoạn protein lên
màngnitrocellulosevà thực hiện phản ứng laiWestern.
KếtquảphântíchPCR,SouthernblotvàWesternblotcácdịngcâythuốcláchuyển
genCrDATở thế hệ T0 đã chứng minh gen chuyểnCrDATđã hợp
nhấtvàohệgencủacâythuốclávàgenchuyểnCrDATđãhoạtđộngphiênmãvàdịchmãc
hokếtquảbiểuhiệnproteintáitổhợpCrDAT.
KDaM

(+)T0-1T0-2T0-4T0-6T0-8T0-12T0-13WT

130
100
70
55
40
35

51,5k D a


Hình 3.12.Kết quả phân tích western blot các dịng cây thuốc lá
chuyểngenCrDAT.M: thang protein chuẩn ; (+) đối chứng dương ; T0-1,

T0-2,T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13: các cây chuyển gen; WT: cây đối
chứngkhôngchuyểngen.
3.3. NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ XÂY DỰNG
QUYTRÌNHCHUYỂNGENỞCÂYDỪACẠN
3.3.1. Nicấyinvitrocâydừa cạn
Kết quả nghiên cứu ni cấy in vitro cây dừa cạn cho nhận xét là
khửtrùnghạt dừa cạn bằng cồn 70% trong 1 phút và dung dịch javen 60%
trong15phútchohiệuquảcaonhất.MơitrườngMSbổsungsucrose30g/l;agar8,5g/l; BAP 1,0mg/l và
IBA 0,6mg/l; nước dừa 100ml/l; pH5,8 thích hợpcho sự phát sinh chồi và
sự sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồibên. Môi trường MS bổ
sung sucrose 30g/l; agar 8,5g/l; BAP 0,5mg/l vàIBA 0,4mg/l; nước
dừa1 0 0 m l / l ; p H

5,8,thích

hợp

chosự

phát

s i n h chồi và sinh trưởng chồi từ nách lá mầm.G â y t ổ n t h ư ơ n g
b ằ n g c á c h c h ẻ dọc hoặc dùng mũi dao châm vào đoạn thân mang
mắt chồi bên đều chohiệu quả đa chồi cao. Môi trường tối ưu tạo đa chồi
là cơ sở cho những thínghiệmtiếp theo trong nghiên cứuchuyển genởcâydừa
cạn.
3.3.2. Xâydựngquy trìnhchuyểngen thơngquagenchuyểngus
Tiến

hành


biến

nạp

gengusvào

dừa

cạn

thơng

quaA.tumefaciens.Các mẫu biến nạp sau khi nhiễm khuẩn được nuôi trong
tối 3 ngày vànhuộm X-gluc để xác định hiệu suất chuyển gengus(Hình
3.16).Kết quảchọn lọc sau 2 tuần thu được 84 mẫu tạo chồi (đạt 23,3 %),
sau 4 tuần sốchồi sống sót là 34 mẫu (đạt 9,45%), trong đó có 21 chồi ra
rễ. Khi đưa câyra mơi trường thu được 15 cây sống sót. Lấy ngẫu nhiên lá
và rễ của 15 câyđemnhuộmX-glucđểkiểmtrabiểuhiệncủagengus. Tất cả 15 cây nàyđều
chokếtquảdương tính khixuất hiện màu xanhchàmđặc trưng


C

A

B
B

Hình


A

D

3.16.Kết

quả

biểu

hiện

Hình

3.17.Kết

C

quả

biểu

hiện

tạmthờigengus.A:Lámầmchuyểngen;

gengusởcây dừa cạn chuyểng e n .

B:Đ o ạ n


A : Lá cây chuyển gengus; B:Rễ

thân

chuyển

D

gen;

câychuyển gengus; C: Lá cây

C : Lámầmkhơngchuyểngen;D : Đo

khơngchuyểngen;D:Rễcâykhơng
chuyểngen.

ạnthân khơngchuyển gen
Nhưvậy

thơng

qua

chuyển

geng u s ,

q


trìnhc h u y ể n g e n v à o câydừacạnđượctốiưulà( i ) V ậ t l i ệ u c h u y ể n
g e n l à l á m ầ m ; ( i i ) NồngđộvikhuẩnOD600nm=0 , 8 ;
( i i i ) N ồ n g đ ộ a c e t o s y r i n g o n e l à 100µM;
(iv)Thờigiann h i ễ m k h u ẩ n l à 3 0 p h ú t ;
( v ) N ồ n g đ ộ kanamycinđểchọnlọcchồi chuyểngenl à 5 0 m g / l . Q u y
t r ì n h c h u y ể n geng u s v à o c â y d ừ a c ạ n t h ô n g q u a v i k h u ẩ n A . t u
Chuẩn bị vật liệu chuyển gen

m e f a c i e n s đ ư ợ c t ó m tắtởhình3.18.

Chuẩn bị vi khuẩn
A.tumefaciens

Gieo hạt tạo cây con in vitro
Thu lá mầm 10 ngày tuổimật độ OD600nm = 0,8

Chuyển gen
- Lá mầm được nhiễm khuẩn trong thời gian 30 phút + AS 100 µM
Đồng ni cấy 3 ngày trên môi trường: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 3,9g/l + muối B5 0,3g/l + AS 100µM

Chọn lọc chồi chuyển gen
Chọn lọc chồi trên mơi trường: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim 500 mg/l + kanamycin 50 mg/l

Tái sinh chồi chuyển gen
Chồi sống sót được tái sinh trên mơi trường: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + MES 0,59g/l + muối B5 3g/l + BAP 0,5mg/l + cefotaxim 500 mg/l + kanamycin 50 mg/l

Tạo cây hoàn chỉnh và ra cây
Chồi tái sinh được chuyển sang môi trường ra rễ: MS + sucrose 30g/l + agar 8g/l + BAP 0,5mg/l + IBA 0,4mg/l + kanamycin 50 mg/l.
Đưa cây ra môi trường