BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN TẤN ĐẠT

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ TINH KHIẾT HÓA
CAPTOPRIL DISULFID TỪ CAPTOPRIL

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

CẦN THƠ – 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN TẤN ĐẠT

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ TINH KHIẾT HÓA
CAPTOPRIL DISULFID TỪ CAPTOPRIL

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: DS. LỮ THIỆN PHÚC

CẦN THƠ – 2014

i

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. iii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. vi
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................ 1
Chương 1: TỔNG QUAN ........................................................................................ 2
1.1. CAPTOPRIL ....................................................................................................... 2
1.1.1. Tính chất vật lý................................................................................................. 2
1.1.2. Tính chất hóa học ............................................................................................. 2
1.1.3. Tính chất dược lý ............................................................................................. 3
1.1.4. Kiểm nghiệm captopril ..................................................................................... 3
1.2. CAPTOPRIL DISULFID .................................................................................... 4
1.2.1. Tính chất vật lý................................................................................................. 4
1.2.2. Oxy hóa tạo captopril disulfid .......................................................................... 5
1.2.3. Độc tính ............................................................................................................ 6
1.2.4. Kiểm nghiệm captopril disulfid ....................................................................... 6
1.3. CHẤT CHUẨN ................................................................................................... 9
1.3.1. Định nghĩa, phân loại và độ tinh khiết ............................................................. 9
1.3.2. Đóng gói, bảo quản, sử dụng và độ ổn định .................................................. 10
1.3.3. Thiết lập chất chuẩn ....................................................................................... 10
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 13
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 13
2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................................. 13
2.1.2. Nguyên liệu và chất chuẩn captopril .............................................................. 13
2.1.3. Hóa chất và dung môi .................................................................................... 13
2.1.4. Dụng cụ và thiết bị ......................................................................................... 14

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................................... 15
2.2.1. Nghiên cứu tổng hợp captopril disulfid ......................................................... 15
2.2.2. Nghiên cứu tinh chế captopril disulfid ........................................................... 18
2.2.3. Xác định cấu trúc captopril disulfid ............................................................... 19


ii

2.2.4. Xác định độ tinh khiết trên sắc ký lỏng hiệu năng cao .................................. 19
Chương 3: KẾT QUẢ ............................................................................................ 21
3.1. NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CAPTOPRIL DISULFID .................................. 21
3.1.1. Oxy hóa captopril bằng oxy khơng khí .......................................................... 21
3.1.2. Oxy hóa captopril bằng các tác nhân thông dụng .......................................... 21
3.1.3. Tối ưu hóa qui trình tổng hợp captopril disulfid ............................................ 21
3.2. NGHIÊN CỨU TINH CHẾ CAPTOPRIL DISULFID .................................... 23
3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CAPTOPRIL DISULFID ........................................ 24
3.3.1. Phổ hồng ngoại ............................................................................................... 24
3.3.2. Phổ khối lượng ............................................................................................... 25
3.3.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân .......................................................................... 25
3.4. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT TRÊN SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO . 25
3.4.1. Tính phù hợp hệ thống ................................................................................... 26
3.4.2. Tính đặc hiệu .................................................................................................. 26
3.4.3. Tính tuyến tính ............................................................................................... 29
3.4.4. Độ chính xác trong ngày và khác ngày .......................................................... 29
3.4.5. Độ ổn định của mẫu phân tích ....................................................................... 30
3.4.6. Ứng dụng qui trình ......................................................................................... 31
Chương 4: BÀN LUẬN .......................................................................................... 32
4.1. NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CAPTOPRIL DISULFID .................................. 32
4.1.1. Oxy hóa captopril bằng oxy khơng khí .......................................................... 32
4.1.2. Oxy hóa captopril bằng các tác nhân thơng dụng .......................................... 32

4.1.3. Tối ưu hóa qui trình tổng hợp captopril disulfid ............................................ 39
4.2. NGHIÊN CỨU TINH CHẾ CAPTOPRIL DISULFID .................................... 40
4.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CAPTOPRIL DISULFID ........................................ 40
4.3.1. Phổ hồng ngoại ............................................................................................... 40
4.3.2. Phổ khối lượng ............................................................................................... 41
4.4.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân .......................................................................... 41
4.4. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT TRÊN SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO . 42
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 47
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 48


iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Ý nghĩa

STT

Chữ tắt

Chữ nguyên

1

ACN

Acetonitril

2


As

Asymmetric factor

Hệ số bất đối

3

BP

British Pharmacopoeia

Dược điển Anh

4

BĐM

Bình định mức

5

CP

Captopril

6

CPDS


Captopril disulfid

7

DĐVN

Dược điển Việt Nam

8

HPLC

9

High performance

Sắc ký lỏng

liquid chromatography

hiệu năng cao

IR

Infrared

Hồng ngoại

10


k’

Capacity factor

Hệ số dung lượng

11

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

12

LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lượng

13

MeOH

Methanol

14


MS

Mass spectrometry

Khối phổ

15

N

Number of theoretical plate

Số đĩa lý thuyết

16

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

17

PDA

Photodiode array

Dãy diod quang


18

Rs

Resolution

Độ phân giải

19

RSD%

Relative standard deviation %

Độ lệch chuẩn tương đối

20

S

Peak area

Diện tích đỉnh

21

SKLM

Sắc ký lớp mỏng


22

tR

Retention time

Thời gian lưu

23

USP

United States Pharmacopeia

Dược điển Mỹ

24

UV

Ultraviolet – Visible

Tử ngoại – khả kiến

25

XTB

Giá trị trung bình



iv

DANH MỤC BẢNG
Bảng

Nội dung

Trang

Yêu cầu về độ tinh khiết của chất đối chiếu

10

2.1

Nguyên liệu và chất chuẩn captopril

13

2.2

Hóa chất và dung mơi thí nghiệm

13

2.3

Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm


14

3.1

Kết quả nghiên cứu tổng hợp captopril disulfid

21

3.2

Giá trị khảo sát tối ưu hóa quy trình H2O2

21

3.3

Hiệu suất trung bình thực nghiệm

22

3.4

Kết quả tối ưu hóa quy trình hydroperoxid

22

3.5

Hiệu suất sau ba lần tinh chế


23

3.6

Hiệu suất của quy trình tổng hợp – tinh chế

23

3.7

Tính phù hợp hệ thống

26

3.8

Kết quả tính tuyến tính

29

3.9

Phân tích tính tuyến tính

29

3.10

Độ chính xác trong ngày


30

3.11

Độ chính xác khác ngày

30

3.12

Độ ổn định mẫu ở UV 220 nm

30

3.13

Độ ổn định mẫu ở Maxplot

31

3.14

Độ tinh khiết của quy trình kết tinh nóng

31

3.15

Độ tinh khiết của quy trình kết tinh nguội


31

4.1

Ảnh hưởng của thời gian, pH và tỉ lệ tác nhân đến hiệu suất (1)

39

4.2

Ảnh hưởng của thời gian, pH và tỉ lệ tác nhân đến hiệu suất (2)

40

4.3

So sánh phổ IR của captopril và captopril disulfid

41

4.4

Biện giải cấu trúc captopril và captopril disulfid trên NMR

41

4.5

Điều kiện sắc ký thăm dò – thành phần pha động


42

4.6

Điều kiện sắc ký thăm dò – pH nước acid phosphoric

42

4.7

Kết quả khảo sát pH nước acid phosphoric

44

1


v

Bảng

Nội dung

Trang

4.8

Điều kiện sắc ký thăm dò – tỉ lệ pha động

44


4.9

Kết quả khảo sát tỉ lệ pha động

45

4.10

Điều kiện sắc ký thăm dò – tốc độ dòng

45

4.11

Kết quả khảo sát tốc độ dòng

45

4.12

Điều kiện sắc ký thăm dò – nhiệt độ cột

46

4.13

Kết quả khảo sát nhiệt độ cột

46



vi

DANH MỤC HÌNH
Hình

Nội dung

Trang

3.1

Hình ảnh cảm quan và vi học 10X của captopril disulfid

23

3.2

Độ tinh khiết trên sắc ký lớp mỏng

24

3.3

Phổ hồng ngoại của captopril disulfid

24

3.4


Phổ khối lượng [M]– của captopril disulfid

25

3.5

Phổ 13C – NMR của captopril disulfid

25

3.6

Tính đặc hiệu – UV 220 nm

26

3.7

Tính đặc hiệu – chế độ Max plot

26

3.8

Hình ảnh 3D của đỉnh captopril disulfid

28

3.9


Độ tương đồng phổ UV – Vis của các đỉnh dung môi pha mẫu

27

3.10

Phổ UV – Vis và độ tinh khiết đỉnh captopril disulfid

27

4.1

Ảnh hưởng của thể tích H2O2 30% đến hiệu suất tổng hợp

32

4.2

Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất tổng hợp

33

4.3

Ảnh hưởng của môi trường phản ứng đến hiệu suất tổng hợp

33

4.4


Hiện tượng phản ứng của quy trình FeCl3.

33

4.5

Ảnh hưởng của khối lượng FeCl3.6H2O đến hiệu suất tổng hợp

34

4.6

Ảnh hưởng của thể tích HCl đến hiệu suất quy trình FeCl3

34

4.7

Ảnh hưởng của khối lượng I2 đến hiệu suất tổng hợp

35

4.8

Ảnh hưởng của khối lượng KI đến hiệu suất tổng hợp

35

4.9


Ảnh hưởng của khối lượng KMnO4 đến hiệu suất tổng hợp

36

4.10

Hiện tượng phản ứng của quy trình KMnO4

36

4.11

Ảnh hưởng của thể tích H2SO4 đến hiệu suất quy trình KMnO4

36

4.12

Hiện tượng phản ứng của quy trình K2Cr2O7.

37

4.13

Ảnh hưởng của khối lượng K2Cr2O7 đến hiệu suất tổng hợp

37

4.14


Ảnh hưởng của thể tích H2SO4 đến hiệu suất quy trình K2Cr2O7

37

4.15

Hiệu suất tổng hợp của quy trình có và khơng có EDTA

38

4.16

Hiệu suất dự đốn, ý nghĩa của phương trình và các hệ số.

39


vii

Hình

Nội dung

Trang

4.17

Sắc ký đồ khảo sát pH, thành phần pha động và nhiệt độ cột


43

4.18

Sắc ký đồ khảo sát tỉ lệ pha động và tốc độ dòng

43

4.19

Khảo sát pH nước acid phosphoric và tỉ lệ pha động

44

4.20

Khảo sát tốc độ dòng và nhiệt độ cột

46


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngành dược Việt Nam đang khẳng định được vị thế của mình trên thị trường dược
phẩm trong nước và khu vực, với các nhà máy đạt GMP – WHO sản xuất thuốc phiên
bản generic, trong đó, đáng quan tâm nhất là nhóm kháng sinh, nhóm điều trị đái tháo
đường và thuốc tim mạch.
Nhóm ức chế men chuyển, điển hình là captopril, ln có mặt trong danh mục thuốc
thiết yếu của Bộ Y Tế. Phản ứng tự phát của captopril với oxy khơng khí tạo ra tạp chất

captopril disulfid, ảnh hưởng đến tính hiệu quả và an tồn của thuốc. Hướng dẫn đăng
ký thuốc 2013 [3] của Cục quản lý dược yêu cầu tất cả nguyên liệu, thành phẩm thuốc
phải được giám sát chặt chẽ về tạp chất liên quan. Các dược điển cũng qui định giới
hạn captopril disulfid là chỉ tiêu kiểm nghiệm bắt buộc.
Thực tế, chất chuẩn captopril disulfid khơng có sẵn tại Việt Nam và nguồn chuẩn ngoại
nhập đang được cung ứng với giá rất cao [24], gây khó khăn cho cơng tác đảm bảo chất
lượng thuốc.
Xuất phát từ những lý do trên, nhóm nghiên cứu mong muốn được thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu tổng hợp và tinh khiết hóa captopril disulfid từ captopril” với các
mục tiêu và ý nghĩa như sau:
Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu tổng hợp, tinh chế captopril disulfid từ phản ứng oxy
hóa captopril, hướng đến thiết lập captopril disulfid thành chất chuẩn kiểm nghiệm.
Mục tiêu cụ thể:
Xây dựng qui trình tổng hợp captopril disulfid.
Nghiên cứu tinh chế captopril disulfid.
Xác định cấu trúc sản phẩm bằng phương pháp phổ nghiệm.
Xác định độ tinh khiết sản phẩm trên sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Ý nghĩa khoa học: Góp phần xây dựng và củng cố cơ sở lý thuyết về tổng hợp,
tinh khiết hóa tạp chất chuẩn captopril disulfid tại Việt Nam.
Ý nghĩa thực tiễn: Làm giàu cho ngân hàng tạp chuẩn quốc gia và tạo thuận lợi kinh tế
cho công tác kiểm nghiệm captopril của các cơ quan, xí nghiệp dược phẩm.


2

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. CAPTOPRIL
Tên quốc tế: captopril.
Tên khoa học:

Acid (2S)-1-[(2S)-2-methyl-3-sulfanylpropanoyl]pyrrolidin-2-carboxylic.
Công thức phân tử: C9H15NO3S.
Cấu trúc phân tử:

Khối lượng phân tử: 217,29 g/mol.
Mã ATC: C09AA01.
Mã CAS: 62571-86-2.
1.1.1. Tính chất vật lý [25], [32]
Tinh thể trắng hoặc gần như trắng, vị đắng, mùi lưu huỳnh.
Nhiệt độ nóng chảy: 103 – 104oC.
Độ tan: captopril (CP) dễ tan trong nước, methanol (MeOH), ethyl acetat, cloroform.
1.1.2. Tính chất hóa học
Tính acid: dung dịch CP 2% trong nước có giá trị pH 2,0 – 2,6.
CP có pKa1 3,7 (–COOH), pKa2 9,8 (–SH). [1], [25]
Phản ứng tạo phức: phức chất của CP với một số tác nhân có cực đại hấp thu trong
vùng tử ngoại – khả kiến (UV – Vis), điển hình là phức của CP và niken (II) trong mơi
trường kiềm có cực đại hấp thu ở bước sóng 340 nm. [47]


3

1.1.3. Tính chất dược lý
1.1.3.1. Dược lực học
CP là tác nhân ức chế men chuyển, ngăn chặn sự hình thành Angiotensin II, hạ áp do
làm giảm sức cản ngoại vi. CP giúp giảm tiền tải, tăng cung lượng tim và giảm tỷ lệ tái
phát nhồi máu cơ tim do làm chậm tiến triển xơ vữa động mạch. [2]
CP là tác nhân ức chế leukotrien A4 hydrolase (men xúc tác thủy phân leukotrien A4
tạo thành leukotrien B4). CP ngăn chặn sự hình thành leukotrien B4 (chất khuếch đại
các phản ứng viêm) nên có tiềm năng trong điều trị viêm nhiễm. [9]
CP hứa hẹn sẽ là một dược chất kháng u trong tương lai do có khả năng hoạt hóa sự

chết chương trình của LNM35 và ức chế tế bào tăng sinh Ki-67 trong các thử nghiệm
trên chuột mang tế bào ung thư phổi của người. [31]
1.1.3.2. Dược động học
Thời gian bán hủy của CP khoảng 2 giờ. 75% thuốc được đào thải qua nước tiểu, 50%
dưới dạng khơng chuyển hóa, cịn lại chuyển hóa thành cystein-captopril, Nacetylcystein-captopril, glutathion-captopril, S-methylcaptopril và khoảng 1,5 – 4%
chuyển hóa thành captopril disulfid (CPDS). [28]
1.1.4. Kiểm nghiệm captopril
1.1.4.1. Trong nguyên liệu theo DĐVN IV
Định tính: phổ hấp thụ hồng ngoại của nguyên liệu phải phù hợp với phổ hấp thụ hồng
ngoại của CP chuẩn.
Định lượng: hoà tan 0,15 g nguyên liệu trong 30 ml nước. Chuẩn độ bằng dung dịch
iod 0,05 M, xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế, dùng điện
cực platin. 1 ml dung dịch iod 0,05 M tương đương với 21,73 mg C9H15NO3S. [1]
1.1.4.2. Trong các nghiên cứu
Năm 1998, Anna Gumieniczek và Dorota Kowalczuk [5] nghiên cứu hai phương pháp
định lượng CP trong viên nén: quang phổ UV – Vis ở bước sóng 526 nm dựa trên sự


4

tạo phức CP với tetrazolium và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với pha động là
acetonitril (ACN) – đệm phosphat pH 2,4 (30 : 70).
Năm 2004, Ivanovic và Medenica [21] định lượng đồng thời hydroclorothiazid và CP
trong viên nén với hệ MeOH – nước H3PO4 (45 : 55), pH pha động 3,8.
Năm 2013, Wael Abu Dayyih và Sarah Alsaid [43] thẩm định qui trình định lượng
đồng thời CP, imidapril, lisinopril trong các nguyên liệu và chế phẩm với pha động
ACN – đệm phosphat pH 3 (25 : 75).
Năm 2014, Paulo Roberto Da Silva Ribeiro [29] đã giới thiệu một thiết bị cầm tay có
khả năng định lượng các chế phẩm CP tương đương với phương pháp trong Dược điển
Mỹ (USP). Thiết bị này cấu trúc bởi một điện trở cảm biến ánh sáng và dựa trên sự tạo

phức vàng xanh của CP với amoni molypdat trong H2SO4.
1.2. CAPTOPRIL DISULFID
Tên quốc tế: captopril disulfid.
Tên khoa học: acid (2S,2’S)-1,1’-[disulphanediylbis[(2S)-2-methyl-1-oxopropane-3,1diyl]-bis[pyrrolidin-2-carboxylic].
Công thức phân tử: C18H28N2O6S2.
Cấu trúc phân tử:

Khối lượng phân tử: 432,6 g/mol.
Mã CAS: 64806-05-9.
1.2.1. Tính chất vật lý
Nhiệt độ nóng chảy: 233,5 – 234oC.
Độ tan: CPDS ít tan trong nước, dễ tan trong methanol. [11], [33], [41]


5

1.2.2. Oxy hóa tạo captopril disulfid
Cầu nối disulfid trong cấu tạo của CPDS bắt nguồn từ sự kết hợp giữa hai nhóm thiol
(sulhydryl) thơng qua q trình oxy hóa.
Nghiên cứu của Hellen K. [15] và Julia A. [23] về độ ổn định viên nén CP cho thấy ở
điều kiện 40 ± 2oC, độ ẩm 75 ± 5 %, CP chủ yếu tạo thành CPDS.
Nghiên cứu của Waleed M., Klaus Kümmerer [44] về q trình phân hủy của CP trong
mơi trường nước, vi sinh và ánh sáng cũng cho thấy oxy hóa CP trong nước tạo ra sản
phẩm chủ yếu là CPDS.
Nghiên cứu của Tak Yee Lee, Robert E. Notari [39] về độ ổn định của dung dịch CP ở
pH 6,6 – 8, nhiệt độ 32oC, dưới áp suất oxy riêng phần 90 – 760 mmHg, có và khơng
có Cu2+ cũng cho kết quả tạo thành CPDS.
Nghiên cứu của Armida T., Paola T. [7] về phản ứng giữa CP và Cu2+ cho thấy khi tỉ lệ
Cu2+ và CP là 1 : 1, tủa CPDS sẽ tạo thành. Ở tỉ lệ 0,5 : 1, hình thành phức tan của CP
với Cu+ ở pH 10 và một phức chất khác không tan ở pH 3. Cu+ dễ tạo phức chất bền

với CP nên tác nhân Cu2+ khó ứng dụng trong tổng hợp CPDS.
Nghiên cứu của Antonio L. [6] về qui trình tổng hợp các disulfid với tác nhân là oxy
khơng khí, mơi trường BMIM BF4 và Na2CO3, CP đã tạo sản phẩm CPDS với thời gian
phản ứng là 30 phút, hiệu suất đạt 83%. BMIM BF4 là môi trường chọn lọc tạo CPDS
hiệu suất cao, nhưng là một hóa chất ngoại nhập, kém thông dụng.
Nghiên cứu của Seema S. Badi, Suresh M. Tuwar [35] về động học của phản ứng oxy
hóa CP với tác nhân [Fe(CN)6]3- ở 27oC trong môi trường acid được điều chỉnh bởi
HClO4 và NaClO4, kết quả sản phẩm chính của phản ứng là CPDS.
Nghiên cứu của Nafisur Rahman, Nishat Anwar [26] về ứng dụng định lượng gián tiếp
CP dựa trên phản ứng oxy hóa của Fe3+ và phản ứng tạo phức xanh của Fe2+ với
K3[Fe(CN)6] cũng đề cập sản phẩm oxy hóa tạo thành là CPDS.


6

Nghiên cứu của Schaefer J. P. [34] về sự tương tác in vitro giữa chế phẩm CP 25 mg và
FeSO4 300 mg cho thấy có sự tạo thành phức xanh thoáng qua trong phản ứng giữa
Fe3+ với CP, xuất hiện tủa CPDS trắng được xác minh cấu trúc bằng NMR. Nghiên cứu
cho thấy tiềm năng ứng dụng Fe3+ cho qui trình tổng hợp CPDS.
1.2.3. Độc tính
Lượng lớn CPDS gây vị kim loại, khó chịu, làm giảm khả năng tuân thủ điều trị của
bệnh nhân [23]. Bên cạnh đó, CPDS cịn gây nhiều độc tính cấp, mãn khác. [33]
1.2.3.1. Độc tính cấp
CPDS gây các dấu hiệu độc tính cấp như hạ huyết áp, tăng nhịp tim, suy thận hồi phục,
ngứa, phát ban, rối loạn vị giác, mất bạch cầu, loét miệng, ho, co thắt phế quản, thở
khò khè và sưng hạch bạch huyết. Sốc phản vệ cũng có thể xảy ra. Sưng hạch do CPDS
xảy ra ở lưỡi, môi, mặt, tứ chi và cổ họng có thể đe dọa tính mạng bệnh nhân. [33]
1.2.3.2. Độc tính mãn
Nghiên cứu trên động vật cho thấy CPDS ảnh hưởng đến sự phát triển của thai nhi, có
thể gây sẩy thai hoặc thai chết lưu. CPDS có thể gây rối loạn mãn tính tiết niệu và

collagen mạch máu, gây tăng trưởng các tuyến. [33]
1.2.4. Kiểm nghiệm captopril disulfid
1.2.4.1. Trong nguyên liệu captopril theo DĐVN IV
Tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng.
Pha động: MeOH – H2O – H3PO4 (550 : 450 : 0,5).
Dung dịch thử: hoà tan 50 mg nguyên liệu trong pha động và pha loãng bằng pha động
thành 100 ml.
Dung dịch chuẩn (1): pha loãng 2 ml dung dịch thử thành 100 ml bằng pha động.
Dung dịch chuẩn (2): hoà tan 10 mg nguyên liệu trong pha động, thêm 1 ml dung dịch
iod 0,05 M rồi pha loãng thành 100 ml bằng pha động. Lấy 10 ml dung dịch này cho
vào bình định mức (BĐM) 100 ml, thêm pha động đến vạch.


7

Điều kiện sắc ký:
Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh octadecylsilyl silicagel (10 m).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 220 nm.
Tốc độ dịng: 1 ml/phút.
Thể tích tiêm: 20 l.
Thời gian sắc ký: gấp 3 lần thời gian lưu của captopril.
Xác định tính thích hợp của hệ thống: tiêm dung dịch chuẩn (2). Trên sắc ký đồ của
dung dịch chuẩn (2) có 3 đỉnh. Độ phân giải giữa hai đỉnh cuối ít nhất là 2,0.
Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, diện tích của bất kỳ đỉnh phụ nào khơng được lớn
hơn ½ lần diện tích đỉnh chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (1) (1,0%). Tổng
diện tích của tất cả các đỉnh phụ trừ các đỉnh có diện tích bằng hoặc nhỏ hơn 0,1 lần
diện tích của đỉnh chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (1) (0,2%) và diện tích các
đỉnh có thời gian lưu nhỏ hơn 1,4 phút) khơng được lớn hơn diện tích của đỉnh chính
trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (1) (2,0%). [1]
1.2.4.2. Trong viên nén captopril theo USP 34

Tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng.
Pha động: MeOH – H2O – H3PO4 (550 : 450 : 0,5).
Dung dịch thử: cân chính xác bột viên khoảng 20 viên, tương ứng với 25 mg CP, thêm
25 ml pha động và ly tâm 15 phút. Sử dụng dịch trong ở trên.
Dung dịch chuẩn: CPDS chuẩn 0,05 mg/ml trong pha động.
Điều kiện sắc ký:
Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh octadecylsilyl silicagel (10 m).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 220 nm.
Tốc độ dịng: 1 ml/phút.
Thể tích tiêm: 20 l.


8

Phép thử chỉ có giá trị, khi hệ số phân giải giữa đỉnh CP và đỉnh CPDS trong sắc ký đồ
của dung dịch chuẩn ít nhất là 2 và độ lệch chuẩn tương đối của các lần tiêm lặp lại
dung dịch chuẩn không lớn hơn 2%.
Thời gian lưu tương đối của CP là 0,5 phút và của CPDS là 1,0 phút.
Tính tốn phần trăm CPDS theo cơng thức:
C r
C % = 2500 . u
(1)
W rs
Trong đó:
C là nồng độ của CPDS trong dung dịch chuẩn (mg/ml).
W là hàm lượng CP ghi trên nhãn (mg).
ru, rs là diện tích đỉnh của CPDS trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Phần trăm CPDS tìm thấy trong dung dịch thử khơng được q 3%. [40]
1.2.4.3. Trong viên nén captopril theo BP 2013
Tiến hành bằng phương pháp sắc ký lỏng.

Pha động: Hỗn hợp MeOH – H2O – H3PO4 (550 : 450 : 0,5).
Dung dịch thử: cân chính xác một lượng bột viên tương ứng với 25 mg CP vào ống ly
tâm, thêm 25 ml MeOH và ly tâm 15 phút. Sử dụng dịch trong ở trên.
Dung dịch chuẩn (1): dung dịch CPDS chuẩn 0,003% trong MeOH.
Dung dịch chuẩn (2): pha lỗng 1 thể tích dung dịch thử thành 100 thể tích với dung
dịch chuẩn (1).
Điều kiện sắc ký:
Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) nhồi pha tĩnh octadecylsilyl silicagel (10 m).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 220 nm.
Tốc độ dịng: 1 ml/phút.
Thể tích tiêm: 20 l.
Phép thử chỉ có giá trị, khi hệ số phân giải giữa đỉnh CP và đỉnh CPDS trong sắc ký đồ
thu được của dung dịch chuẩn (2) ít nhất là 2,0.


9

Trong sắc ký đồ thu được của dung dịch thử, diện tích của bất kỳ đỉnh nào tương ứng
với CPDS khơng được lớn hơn diện tích của đỉnh trong sắc ký đồ thu được của dung
dịch chuẩn (1) (3%). [10]
1.2.4.4. Trong các nghiên cứu
Năm 1984, Joel K. [22] nghiên cứu định lượng đồng thời hydroclorothiazid, CP và
CPDS trong viên nén với hệ pha động gradient MeOH – nước acid H3PO4 0,05%.
Năm 1994, Alan F. Casy [4] đã dựa trên kết quả phổ đồ cộng hưởng từ hạt nhân
(NMR), khối phổ (MS) của CP, CPDS và epicaptopril để đề xuất qui trình phát hiện
tạp chất đồng phân và oxy hóa của CP dựa vào phổ 1H 400 MHz, dung môi DMSO.
Năm 2004, Takashi Nishikawa [38] đã thăm dò điều kiện sắc ký phân tích 3 đồng phân
cis – trans, cis – cis, trans – trans CPDS với hệ pha động ACN – đệm phosphat pH 6,8
và nhiệt độ cột thấp hơn 12oC.
Năm 2011, Raquel Nogueira [30] đã thẩm định qui trình định lượng tạp chất liên quan

của nguyên liệu CP với hệ pha động MeOH – nước acid H3PO4, phát hiện 4 tạp chất,
trong đó, CPDS xuất hiện từ dung dịch CP trong HCl 1M, NaOH 1M và H2O2 3%.
1.3. CHẤT CHUẨN
1.3.1. Định nghĩa, phân loại và độ tinh khiết
Chất chuẩn là chất đồng nhất, đã được xác định là đúng, dùng trong các phép thử hoá
học, vật lý và sinh học. Trong các phép thử đó, các tính chất của chất chuẩn được so
sánh với các tính chất của chất cần thử. [1]
Chất chuẩn được phân thành hai cấp độ chính:
Chất chuẩn sơ cấp (chuẩn gốc) là chất chuẩn được mặc nhiên thừa nhận.
Chất chuẩn thứ cấp được thiết lập dựa trên chất chuẩn sơ cấp, gồm chất chuẩn chính
thức (chất chuẩn quốc gia, chất chuẩn khu vực) và chất chuẩn làm việc (chất chuẩn
phịng thí nghiệm, chất chuẩn nhà sản xuất). [45]
Chất chuẩn phải có độ tinh khiết phù hợp với mục đích sử dụng. [42]


10

Bảng 1. Yêu cầu về độ tinh khiết của chất chuẩn [42]
Qui trình

Độ tinh khiết tối thiểu

Định lượng

99,5%

Thử giới hạn

98,0%


Định tính

Qui định riêng

1.3.2. Đóng gói, bảo quản, sử dụng và độ ổn định
Đóng gói chất chuẩn trong buồng khí trơ hoặc chân không. Chất chuẩn được bảo quản
ở nhiệt độ thấp, tránh ẩm, khơng khí và ánh sáng. Trước khi mở bao gói, chất chuẩn
cần một thời gian để đạt tới nhiệt độ phịng thí nghiệm [42], [45].
Độ ổn định rất quan trọng đối với chất chuẩn, do đó phải kiểm tra và đánh giá định kỳ.
Qui trình chung để tái chuẩn hóa gồm: xác định hàm lượng nước, sắc ký lớp mỏng
(SKLM) xác định tạp chất, HPLC định lượng và xác định giới hạn tạp chất liên quan.
1.3.3. Thiết lập chất chuẩn
1.3.3.1. Đánh giá độ sao chép lại của các qui trình phân tích
Áp dụng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA – one way) [16] để
xử lý kết quả phân tích của các phịng thí nghiệm nhằm đánh giá độ tái lặp của qui
trình phân tích.
Với MSbetween là trung bình bình phương giữa các nhóm, MSwithin là trung bình bình
phương trong từng nhóm, n là số phịng thí nghiệm, N là tổng số kết quả của n phịng
thí nghiệm.
Tính tốn giá trị:

Fstatistic =

MSbetween
MSwithin

(2)

Nếu Fstatistic < Fcritical (n – 1; N – n): Phương pháp phân tích có độ sao chép lại.
Nếu Fstatistic > Fcritical (n – 1; N – n): Phương pháp phân tích khơng có độ sao chép lại.



11

1.3.3.2. Đánh giá đồng nhất lọ trong q trình đóng gói
Tiến hành dựa trên hướng dẫn của ISO Guide 35. [19]
Phịng thí nghiệm: khoa thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu.
Lấy mẫu: với N là số lọ đóng được, số lọ được lấy để kiểm tra là
n=

N +1

(3)

Xác định hàm lượng: mỗi lọ kiểm tra 2 lần, thống kê kết quả thu được.
Loại các giá trị bất thường: trắc nghiệm Dixon. [14]
Đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ: Với Sr là độ lệch chuẩn lặp lại, n là số lần lặp lại
của kết quả đo, ubb là độ không đảm bảo đo từ độ đồng nhất giữa các lọ, MSwithin là
trung bình bình phương trong từng nhóm, MSamong là trung bình bình phương giữa các
nhóm,MSwithin là bậc tự do của trung bình bình phương từng nhóm, Sbb là độ lệch chuẩn
của độ đồng nhất giữa các lọ.
Tiêu chuẩn 1: Các lọ được xem là đồng nhất khi
Sr
 ubb
(4)
n
Tiêu chuẩn 2: Thực tế khó đạt được Tiêu chuẩn 1 nên có thể áp dụng cơng thức:
MSwithin
n


ubb =

4

2

(5)

 MSwithin

Khi đó, các lọ được xem là đồng nhất khi thỏa mãn bất đẳng thức:
MSamong − MSwithin
n

 ubb2  Sbb2 +

Sr2
n

(6)

1.3.3.3. Ấn định giá trị công bố chất chuẩn
Tiến hành dựa trên hướng dẫn của ISO 13528 [18].
Phịng thí nghiệm: các phịng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GLP hoặc ISO 17025, trong
đó, có một phịng thí nghiệm có đủ thẩm quyền và ý nghĩa pháp lý ở Việt Nam.
Mỗi phịng thí nghiệm nhận 6 lọ ngẫu nhiên kèm qui trình phân tích, đánh giá lại tính
phù hợp hệ thống và tiến hành định lượng 6 mẫu đã nhận, mỗi mẫu kiểm tra 2 lần.


12


Xác định giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm:
Nhập tập hợp kết quả của các phịng thí nghiệm tham gia, sắp xếp theo thứ tự tăng dần:
x1, x2,…, xi,…, xp (i = 1, 2,...,i,…, p). Với mỗi giá trị xi, tính tốn giá trị xi*:
p: tổng số kết quả
*
( xi  x* −  )
 x −

xi* =  x* + 
( xi  x* +  ) (7)
 x* ( x* −   x  x* +  )
i


xi: giá trị định lượng x tại lần đo i
x*: trung vị của dãy kết quả xi
s* = 1,483[trung vị của  xi - x*]

 = 1,5s*
Tính tốn các giá trị mới:

p

p

x* =

 xi*
i =1


s* = 1,134

 (x
i =1

p

*
i

− x* ) 2
(8)

p −1

Giá trị ấn định x*n được chọn khi giá trị s*n không thay đổi sau n lần tính tốn (lấy 3 số
thập phân). Sử dụng giá trị ấn định x*n để đánh giá kết quả phân tích theo Z – test, chọn
các giá trị phân tích có Z ≤ 2,0 và tính giá trị trung bình.
Xác định độ không đảm bảo đo của giá trị công bố: U x = 1,25

s*
p

(9)


13

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Liên bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, bộ mơn Hóa dược,
bộ mơn Dược liệu, bộ môn Công nghiệp dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược Cần Thơ.
Thời gian: từ 5/9/2013 đến 5/6/2014.
2.1.2. Nguyên liệu và chất chuẩn captopril
Bảng 2.1. Nguyên liệu và chất chuẩn captopril
Xuất xứ

Hàm lượng

Nguyên liệu

Changzhou Pharmaceutical Factory

100,65%

Chất chuẩn

Viện kiểm nghiệm thuốc TP. HCM

98,54%

2.1.3. Hóa chất và dung mơi
Bảng 2.2. Hóa chất và dung mơi thí nghiệm
Hóa chất – dung mơi

Xuất xứ


Chất lượng

1

Acetonitril

Scharlau

99,9%

2

Acid formic

Xilong

99,5%

3

Acid ethylen diamin tetraacetic

Xilong

99%

4

Acid hydroclorid


Merck

37%

5

Acid phosphoric

Merck

85%

6

Acid sulfuric

Xilong

98%

7

Benzen

Xilong

99,5%

8


Buthanol

Xilong

99%

9

Cloroform

Xilong

99%

STT


14

STT

Hóa chất – dung mơi

Xuất xứ

Chất lượng

10

Ethyl acetat


Xilong

99,5%

11

Hydroperoxid 30 %

Xilong

30%

12

Iod

Xilong

99,5%

13

Kali dicromat

Jinhuada

99,8%

14


Kali iodid

QREC

99,5%

15

Kali permanganat

Xilong

99,5%

16

Methanol

Jinhuada

99,5%

17

Methanol

Scharlau

99,99%


18

Sắt (III) clorid hexahydrat

Xilong

99%

2.1.4. Dụng cụ và thiết bị
Bảng 2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm
Dụng cụ – thiết bị

STT

Xuất xứ

Mã hiệu

1

Bình định mức

Isolab

2

Cân phân tích 4 số

Ohaus


Explorer Pro

3

Cân phân tích 5 số

Kern

ABT 220 – 5DM

4

Cột sắc ký

Phenomenex

Gemini NX

5

Hệ thống máy HPLC

L – 2000

Bơm

L – 2130

Bộ phận tiêm mẫu tự động


Hitachi

L – 2200

Buồng điều nhiệt

L – 2300

Đầu dị dãy diod quang

L – 2455

6

Màng lọc 0,45 µm

7

Máy đo điểm chảy

Sartorius stedim
Membrane solutions
Stuart

SMP3


15


STT

Dụng cụ – thiết bị

Xuất xứ

Mã hiệu

Inolab

WTW – pH 720

8

Máy đo pH

9

Máy quang phổ hồng ngoại (IR)

Brucker

Alpha – T

10

Máy quang phổ UV – Vis

Hitachi


U – 2800

11

Máy siêu âm

Elmasonic

S70H

12

Micropipet

Eppendrof

Research plus

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Nghiên cứu tổng hợp captopril disulfid
2.2.1.1. Oxy hóa captopril bằng oxy khơng khí
Hịa tan 1 g CP vào 500 ml các môi trường phản ứng. Sủi không khí vào các dung dịch
với thiết bị sủi chuyên dụng. Môi trường phản ứng: nước cất, đệm phosphat pH 7, đệm
phosphat pH 10, NaOH 0,1M. Nhiệt độ và thời gian: nhiệt độ phòng trong 72 giờ, cách
thủy 60oC trong 8 giờ.
2.2.1.2. Oxy hóa captopril bằng các tác nhân thơng dụng
Qui trình 1: Oxy hóa CP bằng hydroperoxid – Qui trình H2O2
Khảo sát các giá trị x1, X2, X3a, X3b (thay đổi một giá trị, giữ nguyên các giá trị khác):
x1{2; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100}


X2 = 12, X3a = 0, X3b = 0.

X2 {3; 6; 9; 12; 24; 48; 72}

x1 = 10, X3a = 0, X3b = 0.

X3a {0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 40}

x1 = 10, X2 = 9, X3b = 0.

X3b {0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,6; 3,2}

x1 = 10, X2 = 9, X3a = 0.

Với x1 (ml) là thể tích H2O2 30%, X2 (giờ) là thời gian phản ứng, X3 là pH, X3a (ml) là
thể tích HCl và X3b (g) là khối lượng NaOH trong mơi trường phản ứng.
Hịa tan chính xác khoảng 5 g CP vào 100 ml mơi trường phản ứng, siêu âm 5 phút ở
30oC, lọc qua giấy lọc. Mơi trường phản ứng có giá trị pH X3 gồm nước cất, dung dịch
chứa X3a ml HCl đậm đặc hoặc dung dịch chứa X3b g NaOH. Cho x1 ml dung dịch
H2O2 30% vào dung dịch CP, khuấy đều. Để yên X2 giờ.


16

Bố trí thí nghiệm tối ưu hóa qui trình H2O2 với phần mềm JMP, mơ hình Box –
Behnken, thiết lập phương trình bề mặt đáp ứng:
Y = b + a1X1 + a2X2 + a3X3 + a4X1X2 + a5X1X3 + a6X2X3+ a7X12 + a8X22 + a9X32
Với Y là hiệu suất tổng hợp, X1, X2, X3 lần lượt là tỷ lệ phản ứng (thể tích H2O2/khối
lượng CP, đơn vị ml/g), thời gian tổng hợp (giờ) và pH mơi trường.
Qui trình 2: Oxy hóa CP bằng sắt (III) clorid hexahydrat – Qui trình FeCl3

Khảo sát các giá trị x2 (g) và y2 (ml):
x2 {4; 6; 7; 8; 10; 12; 16; 20; 24}

y2 = 10.

y2 {0; 1; 2; 5; 10; 20; 30; 40}

x2 = 8.

Với x2 (g) là khối lượng FeCl3.6H2O và y2 (ml) là thể tích HCl trong mơi trường.
Hịa tan chính xác khoảng 3 g CP vào 80 ml nước cất, siêu âm 5 phút ở 30oC, lọc qua
giấy lọc. Hòa tan chính xác khoảng x2 g FeCl3.6H2O vào 100 ml H2O cất, siêu âm 5
phút ở 30oC. Acid hóa dung dịch CP bằng y2 ml HCl đậm đặc. Cho dung dịch FeCl3
vào dung dịch CP, khoấy đều. Để yên 8 giờ.
Qui trình 3: Oxy hóa CP bằng iod – Qui trình I2
Khảo sát các giá trị x3 (g) và y3 (g):
x3 {1,6; 1,7; 1,8; 2; 3; 4; 5; 6}

y3 = 10.

y3 {5; 10; 15; 20; 25}

x3 = 1,6.

Với x3 (g) là khối lượng I2 và y3 (g) là khối lượng KI.
Hòa tan chính xác khoảng 3 g CP vào 80 ml nước cất, siêu âm 5 phút ở 30 oC, lọc qua
giấy lọc. Hịa tan chính xác khoảng y3 g KI vào 25 ml nước cất. Cân chính xác khoảng
lượng x3 g I2, hòa tan từ từ I2 vào dung dịch KI. Sau đó, cho dung dịch này vào dung
dịch CP, khoấy đều. Để n 8 giờ.
Qui trình 4: Oxy hóa CP bằng kali permanganat – Qui trình KMnO4

Khảo sát các giá trị x4 (g) và y4 (ml):
x4 {2; 2,5; 3; 3,5; 4; 5; 6}

y4 = 15.

y4 {2; 5; 10; 15; 20; 30; 40}

x4 = 3.