BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

HỒ NHẬT BẢO HUÂN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
CAFFEIN TRONG NƯỚC TĂNG LỰC
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
VỚI ĐẦU DÒ DÃY DIOD QUANG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
DS. NGUYỄN THỊ TƯỜNG VI

Cần Thơ - 2014


LỜI CÁM ƠN
Lời đầu tiên em xin gửi lời cám ơn chân thành và sâu sắc nhất đến cô hướng
dẫn khoa học – Ds. Nguyễn Thị Tường Vi. Cô đã truyền đạt nhiều kiến thức hữu ích
và hướng dẫn, động viên rất tận tình cũng như chia sẻ, định hướng giải quyết mọi khó
khăn cho em trong suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài.
Em xin gửi lời cám ơn đến q thầy cơ trong liên bộ mơn Hóa phân tích –
Kiểm nghiệm – Độc chất, đặc biệt là thầy Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, thầy Lữ Thiện
Phúc, cô Dương Thị Trúc Ly, cơ Nguyễn Thị Bích Thủy và cơ Nguyễn Thị Đặng
luôn hướng dẫn, giúp đỡ tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp em hồn thành tốt đề
tài.

Mình cũng xin cám ơn các bạn lớp Dược K35 đã giúp đỡ mình rất nhiều trong
quá trình thực hiện đề tài.
Con xin cám ơn ba mẹ đã luôn quan tâm ủng hộ, làm chỗ dựa tinh thần vững
chắc nhất cho con.


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những kết quả thực hiện trong luận văn này là trung thực,
hoàn toàn của riêng tôi thực hiện và chưa từng được đăng trong bất kỳ cơng trình
nào.

Sinh viên

Hồ Nhật Bảo Hn


i

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cám ơn
Lời cam đoan
Mục lục . ....................................................................................................................... i
Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt ....................................................................... iv
Danh mục các bảng . .................................................................................................. vi
Danh mục các hình, sơ đồ và đồ thị ........................................................................ viii
Đặt vấn đề. ...................................................................................................................1
Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................3

1.1 Tổng quan về caffein .........................................................................................3
1.1.1 Cơng thức cấu tạo.......................................................................................3
1.1.2 Tính chất lý hóa ..........................................................................................3
1.1.3 Định tính, định lượng caffein được quy định trong DĐVN.......................3
1.2 Vai trò của caffein trong nước tăng lực ............................................................4
1.3 Tác dụng của caffein lên sức khỏe con người ...................................................4
1.3.1 Cơ chế tác động của caffein .......................................................................4
1.3.2 Sự chuyển hóa của caffein .........................................................................6
1.3.3 Tác động của caffein ..................................................................................6
1.3.4 Ngộ độc caffein ..........................................................................................7
1.3.5 Nghiện caffein ............................................................................................8
1.4 Một số quy định về caffein trong nước tăng lực trên thế giới ..........................8
1.5 Một số nghiên cứu về định lượng caffein trong nước tăng lực .........................9
1.6 Phương pháp HPLC ........................................................................................10
1.7 Thẩm định quy trình bằng phương pháp HPLC..............................................10
1.7.1 Tính đặc hiệu ............................................................................................11


ii

1.7.2 Tính tuyến tính và miền giá trị .................................................................11
1.7.3 Độ chính xác ............................................................................................12
1.7.4 Độ đúng ....................................................................................................12
Chương 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................14
2.1 Đối tượng nghiên cứu......................................................................................14
2.2 Địa điểm, thiết bị và dung mơi hóa chất nghiên cứu ......................................15
2.2.1 Địa điểm nghiên cứu ................................................................................15
2.2.2 Chất chuẩn ................................................................................................15
2.2.3 Dung môi và thiết bị .................................................................................15
2.3 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................15

2.3.1 Xử lý mẫu .................................................................................................16
2.3.2 Thăm dò điều kiện sắc ký tối ưu ..............................................................16
2.3.3 Xác định tính tương thích hệ thống của quy trình định lượng .................17
2.3.4 Thẩm định quy trình định lượng ..............................................................18
2.3.5 Xác định hàm lượng caffein trong sản phẩm nước tăng lực. ...................20
Chương 3 – KẾT QUẢ .............................................................................................22
3.1 Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu .........................................................22
3.2 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống. ...................................................24
3.3 Kết quả thẩm định quy trình............................................................................27
3.3.1 Kết quả tính đặc hiệu của caffein trong mẫu thử Red Bull ......................27
3.3.2 Kết quả tính đặc hiệu của caffein trong mẫu thử Number One. ..............28
3.3.3 Tính tuyến tính và miền giá trị .................................................................29
3.3.4 Độ chính xác ............................................................................................31
3.3.5 Độ đúng ....................................................................................................33
3.3.6 Kết quả thực hiện giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ..................36
3.4 Áp dụng quy trình định lượng .........................................................................37
3.4.1 Áp dụng quy trình vào các lơ của Red Bull và Number One ..................37
3.4.2 Áp dụng quy trình vào lơ của 2 sản phẩm Sting dâu và 247 ...................38
Chương 4 – BÀN LUẬN ..........................................................................................43


iii

4.1 Điều kiện sắc ký tối ưu....................................................................................43
4.2 Tính tương thích hệ thống ...............................................................................46
4.3 Thẩm định quy trình định lượng .....................................................................46
4.3.1 Tính đặc hiệu ............................................................................................46
4.3.2 Tính tuyến tính .........................................................................................46
4.3.3 Độ chính xác ............................................................................................47
4.3.4 Độ đúng ....................................................................................................48

4.3.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ..............................................48
4.4 Áp dụng quy trình định lượng .........................................................................49
KẾT LUẬN ...............................................................................................................53
KIẾN NGHỊ ..............................................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC PHỤ LỤC


iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
STT

Chữ tắt, ký hiệu

Chữ nguyên

Ý nghĩa

1

ACN

Acetonitril

2

As

Asymmetry


Hệ số bất đối

3

cAMP

Adenosin Monophosphat

Adenosin

cyclic

monophosphat vòng

4

CĐ

Chuẩn độ

5

DSM

Diagnostic and Statistical

Hướng dẫn chẩn

Manual of Mental Disorders


đoán và thống kê
các dạng rối loạn
tâm thần

6

FAO

Food and Agriculture

Tổ chức Lượng thực

Organization

và Nông nghiệp
Liên Hợp Quốc

7

FDA

Food and Drug

Cục quản lý Dược

Administration

phẩm và Thực phẩm
của Mỹ


8

HPLC

High Performance Liquyd

Sắc ký lỏng hiệu

Chromatography

năng cao

9

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

10

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lượng

11


N

Number of theoretical plates

Số đĩa lý thuyết

12

Ppm

Parts per million

Một phần triệu

13

RS

Resolution

Độ phân giải

14

S

Area

Diện tích đỉnh

(đơn vị: mAU.phút)

15

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn


v

16

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương
đối

17

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

18


TR

Retention time

Thời gian lưu của
pic (đơn vị: phút)

19

TT

Thuốc thử

20

TT/BYT

Thông tư Bộ Y Tế

21

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế
giới


vi


DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1 Một số nghiên cứu về định lượng caffein trong nước uống bằng ..................9
phương pháp HPLC.....................................................................................................9
Bảng 2.1 Các sản phẩm để xây dựng và thẩm định quy trình định lượng ................14
Bảng 2.2 Các sản phẩm để áp dụng quy trình định lượng ........................................14
Bảng 2.3 Các hóa chất, dung môi dự kiến được dùng ..............................................15
Bảng 2.4 Các thiết bị dự kiến được dùng ..................................................................15
Bảng 2.5 Các hệ pha động dự kiến thăm dò điều kiện sắc ký tối ưu ........................17
Bảng 3.1 Tỉ lệ dung môi ACN và nước của hệ pha động gradient (2) .....................23
Bảng 3.2 Kết quả tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn ...................................25
Bảng 3.3 Kết quả tính tương thích hệ thống trên mẫu thử Red Bull ........................25
Bảng 3.4 Kết quả tính tương thích hệ thống trên mẫu thử Number One ..................26
Bảng 3.5 Diện tích đỉnh trung bình của caffein của mẫu chuẩn ở 5 nồng độ ...........30
Bảng 3.6 Kết quả độ chính xác của caffein trong mẫu thử Red Bull........................31
Bảng 3.7 Kết quả độ chính xác của caffein trong mẫu thử Number One .................32
Bảng 3.8 Kết quả độ đúng của caffein trong mẫu thử Red Bull ...............................33
Bảng 3.9 Kết quả độ đúng của caffein trong mẫu thử Number One.........................35
Bảng 3.10 Hàm lượng caffein trong các lô sản phẩm định lượng của Red Bull và
Number One ..............................................................................................................38
Bảng 3.11 Hàm lượng caffein của lô C1226K sản phẩm Sting dâu .........................40
Bảng 3.12 Hàm lượng caffein của lô 11A sản phẩm 247 .........................................42
Bảng 4.1 Các thông số của pic caffein với hệ gradient (1) trên mẫu thử Red Bull ..44
Bảng 4.2 Hệ pha động của điều kiện sắc ký tối ưu ...................................................45
Bảng 4.3 Các thông số trong kiểm định phương trình hồi quy .................................47
Bảng 4.4 Hàm lượng caffeine trong các sản phẩm đã định lượng ............................50



vii

Bảng 4.5 Số lượng sản phẩm nước tăng lực tiêu thụ hằng ngày theo khuyến cáo của
Bộ Y Tế Canada ........................................................................................................51
Bảng 4.6 Số lượng sản phẩm nước tăng lực tiêu thụ hằng ngày theo khuyến cáo của
FDA ...........................................................................................................................52


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo caffein ............................................................................3
Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo của caffein và adenosin ..................................................5
Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống HPLC ................................................................................10
Hình 3.1 Phổ UV của mẫu chuẩn caffein..................................................................22
Hình 3.2 Kết quả chồng các sắc ký đồ các hệ isocratic (1), (2), (3), (4), (5) ............22
trên mẫu thử Red Bull ...............................................................................................22
Hình 3.3 Sắc ký đồ của mũi thứ nhất (1) và mũi tiếp theo (2) của hệ gradient (1)
trên mẫu thử Red Bull ...............................................................................................23
Hình 3.4 Sắc ký đồ của mẫu thử Red Bull (1) và Number One (2) của hệ pha động
gradient (2) ................................................................................................................24
Hình 3.5 Các sắc ký đồ của tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn ...................25
Hình 3.6 Các sắc ký đồ của tính tương thích hệ thống trên mẫu thử Red Bull ........26
Hình 3.7 Các sắc ký đồ của tính tương thích hệ thống mẫu thử Number One .........26
Hình 3.8 Các sắc ký đồ của mẫu pha động (1), mẫu trắng (2), mẫu chuẩn (3), mẫu
thử (4) và mẫu thử thêm chuẩn (5) ............................................................................27
Hình 3.9 Các phổ UV mẫu thử Red Bull và mẫu chuẩn ...........................................27
Hình 3.10 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic caffein trong mẫu thử Red Bull .........28
Hình 3.11 Các sắc ký đồ của mẫu pha động (1), mẫu trắng (2), mẫu chuẩn (3), mẫu

thử (4) và mẫu thử thêm chuẩn (5) ............................................................................28
Hình 3.12 Phổ UV mẫu thử Number One và mẫu chuẩn .........................................29
Hình 3.13 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic caffein trong mẫu thử Number One ..29
Hình 3.14 Các sắc ký đồ của mẫu chuẩn caffein ở nồng độ 10 ppm (1), 50 ppm (2),
100 ppm (3), 150 ppm (4) và 200 ppm (5) ................................................................30
Hình 3.15 Đường tuyến tính của caffein trong khoảng nồng độ 10 – 200 ppm .......31
Hình 3.16 Các sắc ký đồ của 6 mẫu thử Red Bull ....................................................32
Hình 3.17 Các sắc ký đồ của 6 mẫu thử Number One ..............................................33


ix

Hình 3.18 Các sắc ký đồ của mẫu thử Redbull (1), mẫu thử thêm 80% chuẩn (2),
100% chuẩn (3) và 120% chuẩn (4) ..........................................................................34
Hình 3.19 Các sắc ký đồ của mẫu thử Number One (1), mẫu thử thêm 80% chuẩn
(2), 100% chuẩn (3) và 120% chuẩn (4) ...................................................................36
Hình 3.20 Các sắc ký đồ của mẫu trắng (1), chuẩn caffein nồng độ 0,2 ppm (2), ...36
Hình 3.21 Các sắc ký đồ của 3 mẫu thử của 3 lô 064B0 (1), 049B0 (2) và .............37
138B0 (3)...................................................................................................................37
Hình 3.22 Các sắc ký đồ của 3 mẫu thử của 3 lô P38 (1), P59 (2) và R50 (3) .........37
Hình 3.23 Các sắc ký đồ của mẫu pha động (1), mẫu trắng (2), mẫu chuẩn (3), mẫu
thử (4) và mẫu thử thêm chuẩn (5) ............................................................................38
Hình 3.24 So sánh phổ UV mẫu thử Sting dâu so với mẫu chuẩn ............................39
Hình 3.25 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic caffein trong mẫu thử Sting dâu ........39
Hình 3.26 Các sắc ký đồ của mẫu pha động (1), mẫu trắng (2), mẫu chuẩn (3), mẫu
thử (4) và mẫu thử thêm chuẩn (5) ............................................................................40
Hình 3.27 So sánh phổ UV mẫu thử 247 so với mẫu chuẩn .....................................41
Hình 3.28 Kết quả kiểm tra độ tinh khiết pic caffein trong mẫu thử 247 .................41
Hình 4.1 Chân pic caffein ở hệ pha động isocratic (2) trên mẫu thử Red Bull ........44
Hình 4.2 Sắc ký đồ của mẫu trắng (1), mẫu chuẩn nồng độ 0,2 ppm (2) .................48

Hình 4.3 Các sắc ký đồ của mẫu của lô đã thẩm định 345B0 (1), lô định lượng
049B0 (2), 064B0 (3) và 138B0 (4) ..........................................................................49
Hình 4.4 Các sắc ký đồ của mẫu của lô đã thẩm định P58 (1), lô định lượng P38 (2),
P59 (3) và R50 (4) .....................................................................................................49


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, nước tăng lực được sử dụng rất phổ biến. Do đó, địi hỏi cần phải có
sự kiểm soát chặt chẽ các thành phần phụ gia và hàm lượng của các thành phần này
trong sản phẩm để đảm bảo sức khỏe cho người sử dụng. Thành phần chung đa số
của các sản phẩm này bao gồm caffein, các loại vitamin, hương liệu, chất tạo màu,
chất bảo quản, các chất mang năng lượng như các acid amin, đường. Trong đó,
caffein chủ yếu được thêm vào nước tăng lực để làm tăng kích thích thần kinh và
thể chất hơn là một thành phần để làm tăng hương liệu cho sản phẩm theo như lời
giải thích của các nhà sản xuất [19].
Các cơ quan y tế ở Mỹ, Canada và Châu Âu đều ra khuyến cáo đối với lượng
caffein tiêu thụ trong các loại nước tăng lực do lo ngại về vấn đề sức khỏe đối với
người sử dụng [21], [33], [35]. Vào tháng 03/2013, một nhóm gồm 18 các bác sĩ,
các nhà nghiên cứu và các chuyên gia y tế cơng cộng ở Mỹ u cầu FDA có hành
động đối với các nhà sản xuất về các sản phẩm nước tăng lực dành cho thanh thiếu
niên, trẻ em từ rủi ro có thể tiêu thụ một lượng lớn caffein từ các sản phẩm này [8].
Cũng ở Mỹ, trong một bản báo cáo từ năm 2007 đến năm 2011 số ca cấp cứu phải
nhập viện có liên quan đến nước tăng tực tăng từ 10068 lên 20783 trường hợp với
các triệu chứng do sử dụng caffein quá mức như lo âu, đau đầu, rối loạn nhịp tim và
đau tim [16].
Tuy nhiên, ở Việt Nam, tính đến tháng 06/2014, tài liệu quy chuẩn kỹ thuật
quốc gia về an toàn thực phẩm vẫn chưa có chỉ tiêu về hàm lượng caffein trong các
loại nước uống [3], [4] và TCVN về cà phê chưa áp dụng cho định lượng caffein

trong nước uống đóng chai [1].
Do đó, xây dựng một quy trình định lượng caffein trong các sản phẩm nước
tăng lực được xem như là rất cần thiết để làm cơ sở cho việc kiểm định hàm lượng
caffein trong các sản phẩm nhằm đảm bảo sức khỏe cho người sử dụng.


2

Chính vì vậy chúng tơi đã tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng caffein trong nước tăng lực bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang”.
Với mục tiêu:
Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng caffein trong nước tăng lực bằng
kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang.
Để thực hiện mục tiêu trên, chúng tơi tiến hành cụ thể:
1. Thăm dị điều kiện sắc ký tối ưu.
2. Thẩm định quy trình định lượng caffein trong nước tăng lực bằng kỹ thuật
sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò dãy diod quang theo hướng dẫn của FDA
2012.
3. Định lượng hàm lượng caffein có trong một số lô của một số sản phẩm đang
lưu hành trên thị trường quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ.
Ý nghĩa khoa học
Góp phần làm cơ sở xây dựng một chỉ tiêu về hàm lượng caffein trong nước
tăng lực trong quy chuẩn kỹ thuật quốc gia.
Góp phần làm cơ sở xây dựng một quy trình định lượng caffein trong nước
tăng lực áp dụng trong TCVN.
Ý nghĩa thực tiễn
Áp dụng quy trình định lượng này để xác định hàm lượng caffein trong nước
tăng lực để đảm bảo sức khỏe cho người sử dụng.
Góp phần nâng cao tính an tồn của các sản phẩm nước tăng lực có trên thị

trường hiện nay.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về caffein
1.1.1 Công thức cấu tạo [2]

Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo caffein
C8H10N4O2 (dạng khan). Phân tử lượng: 194,2
C8H10N4O2.H2O (dạng ngậm một phân tử nước). Phân tử lượng: 212,2
Caffein là 1,3,7-trimethyl-3,7-dihydro-1H-purin-2,6-dion, phải chứa từ
98,5% đến 101,5% C8H10N4O2, tính theo chế phẩm đã làm khơ.
1.1.2 Tính chất lý hóa [2]
Tinh thể trắng, mịn, hay bột kết tinh trắng. Vụn nát ngồi khơng khí khơ, đun
nóng ở 100 oC caffein sẽ mất nước và thăng hoa ở khoảng 200 oC. Dung dịch
caffein có phản ứng trung tính với giấy quỳ. Dễ tan trong nước sơi, cloroform, hơi
tan trong nước, khó tan trong ethanol và ether, tan trong các dung dịch acid và trong
các dung dịch đậm đặc của benzoat hay salicylat kiềm.
1.1.3 Định tính, định lượng caffein được quy định trong DĐVN [2]
1.1.3.1 Định tính caffein
Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau:
Nhóm I: A, B, E
Nhóm II: B, C, D, E
A. Phổ hồng ngoại phải phù hợp với phổ hồng ngoại của caffein chuẩn . Xác
định trên chế phẩm đã làm khô.



4

B. Điểm chảy: 234 – 239 oC.
Xác định trên chế phẩm đã làm khô.
C. Cho 0,05 ml dung dịch iod - iodid (TT) vào 2 ml dung dịch bão hoà
caffein. Dung dịch vẫn trong. Thêm 0,1 ml dung dịch acid hydrocloric lỗng (TT).
Có tủa nâu xuất hiện, tủa này tan khi trung hoà bằng dung dịch natri hydroxyd 2 M
(TT).
D. Cho phản ứng của nhóm xanthin.
E. Chế phẩm đáp ứng phép thử mất khối lượng do làm khô.
1.1.3.2 Định lượng caffein
Cân chính xác khoảng 150 mg chế phẩm đã làm khơ. Hồ tan trong 15 ml
anhydrid acetic (TT) và 20 ml benzen (TT). Cho thêm vài giọt dung dịch tím tinh
thể (TT). Chuẩn độ bằng dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) cho đến khi dung dịch
chuyển sang màu vàng. Có thể xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ
đo điện thế.
1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) tương đương với 19,42 mg
C8H10N4O2.
1.2 Vai trò của caffein trong nước tăng lực
Theo “Danh mục tiêu chuẩn chung cho phụ gia thực phẩm” của Ủy Ban các
vấn đề về an toàn thực phẩm của FAO và WHO, caffein là một loại phụ gia cho
nước loại tăng lực có ga và khơng có ga [12].
Một nghiên cứu chỉ ra rằng việc các nhà sản xuất nước tăng lực thêm caffein
vào các sản phẩm này để làm tăng kích thích thần kinh cũng như thể chất, gây cảm
giác tỉnh táo, sảng khối cho người sử dụng, từ đó hấp dẫn người tiêu dùng sử dụng
các sản phẩm này thường xuyên [19].
1.3 Tác dụng của caffein lên sức khỏe con người
1.3.1 Cơ chế tác động của caffein
Trong cơ thể, caffein tác động thơng qua một số cơ chế, nhưng tác động
chính của caffein là ức chế cạnh tranh không chọn lọc với adenosin trên thụ thể của

adenosin.


5

Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo của caffein và adenosin
Adenosin được tìm thấy trong tất cả các phần của cơ thể, là một thành phần
của adenosin triphosphat (ATP) có vai trị trong giải phóng năng lượng và tổng hợp
RNA, nhưng trong não adenosin chỉ có chức năng bổ trợ. Có bằng chứng cho thấy
adenosin bảo vệ não bằng cách ức chế hoạt động thần kinh và tăng lưu lượng máu
qua các thụ thể nằm trên cơ trơn mạch máu. Mức adenosin trong não được tăng lên
bởi xuất hiện nhiều dạng chuyển hóa bắt buộc khi thiếu oxy và gián đoạn lưu lượng
máu [9],[32].
Ngồi ra, adenosin cịn liên quan đến việc kiểm sốt chu kỳ ngủ - thức. Sự
tích lũy của adenosin là một nguyên nhân chính của cảm giác buồn ngủ sau hoạt
động thần kinh kéo dài. Tác động gây ra cảm giác buồn ngủ là tác động trung gian
giữa tác động ức chế các tế bào thần kinh kiểm sốt sự tỉnh táo thơng qua các thụ
thể A1 ( thông qua tác động ngăn chặn tái hấp thu canxi) và tác động kích hoạt các
tế bào thần kinh kiểm sốt sự buồn ngủ thơng qua các thụ thể A2A (các tế bào này
cũng đóng vai trị quan trọng trong việc kiểm sốt hành vi) [27],[32],[34].
Caffein dạng phân tử có thể tan tốt trong nước và lipid, nên caffein qua được
hàng rào máu não. Khi qua được hàng rào máu não, caffein tác động như một chất
đối vận không chọn lọc lên thụ thể của adenosin (nói cách khác, tác nhân này làm
giảm tác dụng của adenosin). Các phân tử caffein có cấu trúc tương tự như
adenosin, và có khả năng liên kết với các thụ thể adenosin trên bề mặt của tế bào mà
khơng hoạt hóa các thụ thể này, do đó caffein hoạt động như một chất ức chế cạnh
tranh [18].


6


1.3.2 Sự chuyển hóa của caffein [26]
Caffein từ các loại đồ uống được hấp thụ bởi ruột non nhanh chóng, với 99%
lượng caffein được hấp thu trong vòng 45 phút sau khi uống, sau đó được phân phối
tới tất cả các mô của cơ thể. Nồng độ caffein trong máu đạt đến đỉnh sau từ 15 –
120 phút sau khi được hấp thu. Thời gian bán thải của caffein sau khi hấp thụ vào
máu trong khoảng 1,5 – 9 giờ, ở người khỏe mạnh khoảng 5 giờ. Caffein vào máu
được chuyển hóa trong gan bởi hệ thống enzym cytochrom oxidas P450, đặc biệt,
bởi isozym CYP1A2, tạo thành 3 chất dimethylxanthin đều có những tác động lên
cơ thể:
- Paraxanthin: Là chất chuyển hóa chủ yếu (70 - 80%). Tăng phân giải lipid,
tăng nồng độ glycerol và acid béo tự do trong huyết tương.
- Theobromin: làm giãn các mạch máu và tăng lượng nước tiểu.
- Theophyllin: Nới lỏng cơ trơn của phế quản, và được sử dụng để điều trị
bệnh hen suyễn.
Các chất chuyển hóa lại tiếp tục chuyển hóa nhiều lần nữa và sau đó được
bài tiết trong nước tiểu
1.3.3 Tác động của caffein
Trên hệ thần kinh: caffein là một chất kích thích hệ thống thần kinh trung
ương, cải thiện tâm trạng và có tác dụng giảm đau. Caffein cịn là một chất bảo vệ
thần kinh, chống lại các triệu chứng của bệnh Parkinson [28]. Caffein tạo ra sự tỉnh
táo, giúp cho suy nghĩ nhanh và rõ ràng, tăng cường sự tập trung và phối hợp của cơ
thể tốt hơn. Liều lượng cần để tạo ra những ảnh hưởng này tùy thuộc vào khả năng
dung nhận của mỗi cơ thể, tác dụng bắt đầu chưa đầy sau 1 giờ sau khi uống và
thường biến mất sau 5 giờ [11].
Trên hệ tuần hồn: caffein kích thích làm tim đập nhanh, mạnh, tăng lưu
lượng tim và lưu lượng mạch vành. Do đó, người bị cao huyết áp không nên sử
dụng nhiều caffein. Cơ chế của sự tăng huyết áp của caffein có thể do sự chẹn các
thụ thể của adenosin và sự ức chế các men phosphodiesteras [29].



7

Trên hệ hơ hấp: kích thích trung tâm hơ hấp, làm giãn phế quản và giãn mạch
phổi [13].
Trên hệ tiêu hố: caffein ức chế các men phosphodiesteras, làm tăng tích tụ
các phân tử cAMP trong tế bào. Do đó, làm tăng tiết dịch ruột non. Với hàm lượng
caffein trong khoảng 75 – 300 mg, sự tiết dịch này có thể kéo dài đến 15 phút có thể
gây tiêu chảy [37].
Trên cơ trơn: caffein có tác dụng giãn cơ trơn mạch máu, mạch vành, cơ trơn
phế quản và cơ trơn tiêu hoá. Đặc biệt, tác dụng giãn cơ trơn càng rõ khi đang ở
trạng thái co thắt [20].
Trên thận: tiêu thụ caffein với lượng trên 250 mg gây ra tác động lợi tiểu cấp
tính, lượng caffein bình thường trong các loại thực phẩm dưới 250 mg thì khơng
gây ra tác dụng lợi tiểu. Với người sử dụng caffein lâu dài thì tác động lợi tiểu ngày
càng giảm [24].
Caffein còn tăng hoạt động của cơ vân, tăng chuyển hoá do ngăn cản phân
huỷ các phân tử cAMP do ức chế cạnh tranh với các men phosphodiesteras. Nồng
độ các phân tử cAMP tăng sẽ thúc đẩy các phản ứng làm tăng canxi nội bào, tăng
hoạt động của cơ tim, tăng chuyển hoá, tăng phân huỷ lipid, tăng glucose máu [17],
[18].
Tiêu thụ một lượng lớn caffein – thường là nhiều hơn 250 mg mỗi ngày – có
thể dẫn đến một tình trạng gọi là caffeinism. Triệu chứng caffeinism bao gồm sự
nghiện caffein và những biểu hiện khó chịu về trể trạng và tinh thần như căng
thẳng, bồn chồn, khó chịu trong người, mất ngủ, đau đầu và tim đập nhanh sau khi
sử dụng caffein [32].
1.3.4 Ngộ độc caffein
Sử dụng caffein quá liều có thể dẫn đến trạng thái kích thích thần kinh trung
ương quá mức gọi là ngộ độc caffein. Hội chứng này xảy ra sau khi uống một lượng
lớn caffein, triệu chứng xảy ra giống như quá liều các chất kích thích khác: bồn

chồn, lo âu, kích động, mất ngủ, mặt đỏ bừng, tiểu nhiều, rối loạn tiêu hóa, co giật
cơ bắp, nhịp tim nhanh [10].


8

Liều gây độc trên người của caffein phụ thuộc vào sự nhạy cảm của cá nhân.
Liều gây chết trên người ước tính vào khoảng 150 mg đến 200 mg cho mỗi kg trọng
lượng cơ thể. Tuy nhiên, chỉ với lượng caffein vào khoảng 480 mg là đủ để có thể
gây ra hiện tượng ngộ độc caffein trên lâm sàng [11].
Điều trị caffein chủ yếu là điều trị nâng đỡ cho bệnh nhân, điều trị các triệu
chứng ngay lập tức, nếu bệnh nhân có nồng độ quá cao caffein trong máu thì phải
thẩm phân phúc mạc, chạy thận nhân tạo hoặc lọc máu [16].
1.3.5 Nghiện caffein
Sử dụng caffein lâu ngày sẽ dẫn đến phụ thuộc caffein về tâm lý và thể chất.
Khi ngưng sử dụng đột ngột sẽ dẫn đến các triệu chứng cai nghiện caffein bao gồm:
nhức đầu, khó chịu, khơng có khả năng tập trung, buồn ngủ, mất ngủ và đau dạ dày,
đau khớp xương có thể xuất hiện trong vòng 12 đến 24 giờ sau khi ngưng uống
caffein, xuất hiện nhiều nhất sau 48 giờ và thường kéo dài 2 – 9 ngày [23].
Nghiện caffein được phân loại là một dạng rối loạn tâm thần trong DSM – 5 bởi
Hiệp hội Tâm thần Hoa Kỳ [15].
1.4 Một số quy định về caffein trong nước tăng lực trên thế giới
Ở Mỹ, FDA khuyến cáo lượng caffein tiêu thụ trong một ngày đối với một
người khỏe mạnh tối đa là 400 mg [35].
Ủy Ban Châu Âu quy định, những sản phẩm có hàm lượng caffein từ 150 mg/l
trở lên, phải dán nhãn “Hàm lượng caffein cao. Không nên dùng cho trẻ em, phụ nữ
mang thai hoặc cho con bú” [33].
Bộ Y Tế Canada cũng có quy định hàm lượng caffein trong nước tăng lực.
Theo đó, hàm lượng tối đa trong một sản phẩm nước tăng lực có ga là 200 ppm,
trong sản phẩm nước tăng lực khơng có ga là 150 ppm [21]. Cơ quan này cũng

khuyến cáo về lượng caffein sử dụng hằng ngày ở từng đối tượng để đảm bảo an
toàn, cụ thể [22]:
- Với người trên 13 tuổi: lượng caffein sử dụng hằng ngày nên ít hơn 2,5
mg/kg trọng lượng cơ thể.


9

- Với trẻ em, lượng caffein tối đa sử dụng khuyến cáo cụ thể theo độ tuổi như
sau:
+ Từ 4 – 6 tuổi: 45 mg/ngày.
+ Từ 7 – 9 tuổi: 62,5 mg/ngày.
+ Từ 10 – 12 tuổi: 85 mg/ngày.
- Phụ nữ chuẩn bị hoặc đang mang thai, cho con bú: ít hơn 300 mg/ngày. Phụ
nữ mang thai tiêu thụ quá nhiều caffein sẽ có nguy cơ bị sẩy thai cao hơn và sinh
con cân nặng bé hơn so với không tiêu thụ caffein.
1.5 Một số nghiên cứu về định lượng caffein trong nước tăng lực
Bảng 1 Một số nghiên cứu về định lượng caffein trong nước uống bằng
phương pháp HPLC
Nhóm tác giả

Điều kiện thực nghiệm

Kết quả

Violeta Nour, Ion Trandafir, Mira Đầu dò: PDA.

TR = 7,323 phút.

Elena


Tỷ lệ phục hồi

Ionică

Romania [36].

thực

hiện

tại Bước sóng: 217 nm.

Cột DS HYPERSIL C18, của phương pháp
250 × 4,6 mm × 5 μm,

là 99,25%.

Nhiệt độ cột: 200C.
Pha động: KH2PO4:ACN
tỷ lệ 88:12, pH = 4,3.
Thể tích tiêm: 5 μL.
Tốc độ dòng 1 ml/phút.
Mei Musa Ali , Mawahib Eisa , Đầu dò: UV.

TR = 7,347 phút.

Mohammed Idrees Taha thực hiện Bước sóng: 270 nm.

Tỷ lệ phục hồi


tại Soudan [25].

Cột Shim-pack VP-ODS của phương pháp
250mm x 4,6 mm.

từ

99%

Pha động: methanol: nước 105%.
với tỷ lệ là 30:70.
Thể tích tiêm: 20 μL
Tốc độ dòng: 1,3 ml/phút.

đến


10

1.6 Phương pháp HPLC [6]
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp tách trong đó pha động là một
chất lỏng, còn pha tĩnh là một chất rắn, hoặc là một chất lỏng phủ trên một chất rắn
đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng
dựa trên các cơ chế phân bố, hấp phụ, trao đổi ion hoặc rây phân tử.
Chất phân tích sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bằng đầu dò. Việc lựa
chọn đầu dò để sử dụng dựa trên tính chất lý hóa của chất cần được phân tích như:
khả năng hấp thụ UV – Vis, huỳnh quang,… Đầu dị PDA là đầu dị thơng dụng
nhất trong phương pháp HPLC. Đầu dò PDA cung cấp phổ UV – Vis của các chất
phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và

định dạnh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ của pic sắc ký với phổ của một
ngân hàng dữ liệu hoặc với phổ của một chất chuẩn.

Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống HPLC
1.7 Thẩm định quy trình bằng phương pháp HPLC [7],[14]
Thẩm định quy trình định lượng là q trình thiết lập các thơng số đặc trưng
của phương pháp để chứng minh rằng phường đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến.
Theo “Hướng dẫn cho việc thẩm định các phương pháp hóa học cho chương
trình thực phẩm của FDA” ban hành năm 2012, các chỉ tiêu cần được thẩm định
trong quy trình bao gồm:
- Tính đặc hiệu.


11

- Tính tuyến tính và miền giá trị.
- Độ chính xác.
- Độ đúng.
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
1.7.1 Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu hay tính chọn lọc của một quy trình phân tích là khả năng cho
phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà khơng bị ảnh hưởng bởi
sự có mặt của các chất khác (tạp chất, sản phẩm phân hủy,…) có trong mẫu thử.
Nếu sử dụng kỹ thuật HPLC với đầu dò PDA hoặc khối phổ sẽ giúp tránh
nhầm lẫn các hợp chất khác trong mẫu có cấu trúc tương tự với hợp chất cần định
lượng và có lợi trong việc chứng minh rằng pic sắc ký không phải là pic của hai
thành phần trở lên.
1.7.2 Tính tuyến tính và miền giá trị
1.7.2.1 Tính tuyến tính của quy trình phân tích
Là khả năng suy ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn

sự phụ thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được là diện tích đỉnh (y) và đồng
độ (x) (hay có thể trực tiếp tính tốn dựa vào tương quan tỷ lệ giữa diện tích đỉnh
(y) và nồng độ (x)).
Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng bình phương của hệ số tương quan
R2. Để kháo sát tính tuyến tính, tiến hành sắc ký tối thiểu 5 mẫu chuẩn với nồng độ
khác nhau, có giá trị trong khoảng từ 40% - 140% so với nồng độ chất phân tích, đo
và xác định diện tích đỉnh tại từng nồng độ khảo sát. Thiết lập phương trình hồi quy
và vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữ diện tích đỉnh và nồng độ chất có trong 5
mẫu chuẩn.
Sử dụng “phân tích hồi quy” với trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ
số trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của
phương trình hồi quy.


12

1.7.2.2 Miền giá trị của quy trình phân tích
Là khoảng giữa nồng độ cao và nồng độ thấp của chất cần phân tích có trong
mẫu thử, với bất kỳ nồng độ trong khoảng này đều có thể đáp ứng về độ chính xác,
độ đúng và tính chất tuyến tính của phương pháp.
Miền giá trị được biểu thị bằng một khoảng nồng độ mà ở khoảng nồng độ
này vẫn còn phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ.
1.7.3 Độ chính xác
Độ chính xác thể hiện mức độ dao động của các kết quả đo lường riêng biệt
so với giá trị trung bình. Độ chính xác bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên.
Đại lượng đặc trưng cho độ chính xác là độ lệch chuẩn tương đối (RSD%).
Tùy thuộc vào loại phân tích, RSD% có thể thay đổi từ 2% đến 20%. Giá trị RSD%
càng nhỏ, quy trình có độ chính xác càng cao.
1.7.4 Độ đúng
Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm

thấy với giá trị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã được
làm đồng nhất trong cùng điều kiện xác định. Độ đúng bị ảnh hưởng bởi sai số hệ
thống.
Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi, tỷ lệ này được xác định
theo công thức:
Y

X tt
 100 (1)
X lt

Với :
Y là tỉ lệ hồi phục của phương pháp định lượng (%).
Xlt là lượng chuẩn thêm vào ban đầu.
Xtt là lượng chuẩn tìm thấy được khi tiến hành sắc ký.
Tỷ lệ phục hồi phụ thuộc vào mẫu phân tích, quy trình xử lý mẫu và nồng độ
chất phân tích. Tỷ lệ phục hồi càng gần 100%, quy trình phục hồi có độ đúng càng
cao.


13

Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu
thử ở tối thiểu 3 nồng độ thuộc miền giá trị của quy trình phân tích.
1.7.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
1.7.5.1 Giới hạn phát hiện
Giới hạn phát hiện của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất
cần phân tích trong mẫu cịn có thể phát hiện được nhưng khơng nhất thiết phải xác
định chính xác hàm lượng.
1.7.5.2 Giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng của một quy trình phân tích là lượng thấp nhất của chất
cần thử có trong mẫu thử cịn có thể xác định được với độ đúng và độ chính xác
thích hợp.