BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ

BÙI THANH NGÂN TẠO

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG
CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG LÁ CÂY SẦU ĐÂU ĂN LÁ
AZADIRACHTA INDICA

LUẬN VĂN CHUYÊN KHOA CẤP I

CẦN THƠ – 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ

BÙI THANH NGÂN TẠO

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG
CHẤT ĐÁNH DẤU TRONG LÁ CÂY SẦU ĐÂU ĂN LÁ
AZADIRACHTA INDICA
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm Thuốc và Độc chất
Mã số: 60.72.04.10.CK

LUẬN VĂN CHUYÊN KHOA CẤP I
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS.DS. Nguyễn Thị Ngọc Vân

CẦN THƠ - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn này được đảm bảo tính trung thực và chưa từng được
ai cơng bố trong bất kì cơng trình nghiên cứu khác.
Cần Thơ, ngày 26 tháng 10 năm 2018

Bùi Thanh Ngân Tạo


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS.DS Nguyễn Thị Ngọc Vân
trong thời gian qua đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh
nghiệm quý báu, động viên, khích lệ tinh thần và hướng dẫn tôi giải quyết
những vấn đề gặp phải trong q trình nghiên cứu để có thể hồn thành luận
văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn đến quý thầy cô và các anh chị tại Liên bộ
mơn Hóa Phân Tích - Kiểm Nghiệm - Độc chất, Liên Bộ môn Dược liệu Dược cổ truyền – Thực vật đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất trong thời gian
học tập và thực hiện luận văn tại bộ mơn.
Để có thể hồn thành tốt luận văn này, không thể không kể đến các anh
chị em cùng làm luận văn của lớp CKI và Cao học Kiểm nghiệm Thuốc –
Độc chất, các em sinh viên Dược K38, Dược K39. Cảm ơn các anh chị em vì
đã quan tâm, giúp đỡ tơi vượt qua khó khăn, thử thách và hồn thành nghiên
cứu này.



MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng, hình vẽ, đồ thị, sơ đồ
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
1.1. Cây sầu đâu ................................................................................................ 3
1.1.1. Tên khoa học ................................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm cây sầu đâu...................................................................... 3
1.1.3. Bộ phận dùng, nơi sống, thu hái và chế biến .................................. 4
1.2. Lá sầu đâu................................................................................................... 4
1.2.1. Thành phần hóa học ........................................................................ 5
1.2.2. Tác dụng sinh học của lá sầu đâu .................................................. 12
1.3. Vai trò cuả chất đánh dấu trong kiểm soát chất lượng dược liệu ............ 13
1.3.1. Định nghĩa chất đánh dấu.............................................................. 13
1.3.2. Vai trò của chất đánh dấu .............................................................. 13
1.4. Các phương pháp chiết xuất thường sử dụng trong dược liệu ................. 13
1.4.1. Định nghĩa về hòa tan chiết xuất ................................................... 13
1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình hịa tan chiết xuất ................ 14
1.4.3. Các phương pháp chiết xuất dược liệu [1],[2] .............................. 14
1.4.4. Một số phương pháp công bố về chiết xuất hoạt chất trong lá sầu
đâu ........................................................................................................... 17
1.5. Tổng quan về chất đánh dấu rutin trong lá sầu đâu ................................. 18

1.5.1. Tính chất vật lý.............................................................................. 18
1.5.2. Các phương pháp định lượng rutin trong dược liệu ...................... 19
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 23
2.1. Đối tượng ................................................................................................. 23


2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................... 23
2.1.2. Tiêu chuẩn chọn mẫu: ................................................................... 23
2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ: ....................................................................... 23
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu: .................................................................... 23
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 23
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm............................. 23
2.2.2. Cỡ mẫu: ......................................................................................... 23
2.2.3. Phương pháp chọn mẫu: ................................................................ 24
2.2.4. Nội dung nghiên cứu: .................................................................... 24
CHƢƠNG 3. K T QUẢ ............................................................................... 35
3.1. Khảo sát các điều kiện chiết xuất chất đánh dấu rutin trong lá sầu đâu .. 35
3.1.1. Điều kiện sắc ký ............................................................................ 35
3.1.2. Khảo sát các điều kiện chiết xuất rutin trong lá sầu đâu ............... 37
3.2. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng chất đánh dấu rutin trong
dịch chiết lá sầu đâu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 42
3.2.1. Tính tương thích hệ thống ............................................................. 42
3.2.2. Tính đặc hiệu ................................................................................. 43
3.2.3. Tính tuyến tính, miền giá trị.......................................................... 46
3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) ............... 47
3.2.5. Độ chính xác ................................................................................. 49
3.2.6. Độ đúng ......................................................................................... 50
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................. 52
4.1. Điều kiện chiết xuất chất đánh dấu rutin trong lá sầu đâu ....................... 52
4.2.Thẩm định quy trình định lượng rutin bằng phương pháp HPLC ............ 59

K T LUẬN .................................................................................................... 66
KI N NGHỊ ................................................................................................... 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VI T TẮT
STT

Chữ tắt, ký
hiệu

1

AOAC

2

Chữ nguyên

Ý nghĩa

Association of Official
Analytical Chemists

Hiệp hội hóa học phân
tích quốc tế

As


Asymmetry

Hệ số bất đối

3

EtOAc

Ethyl acetat

4

HPLC

High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng
Chromatography
cao

5

ICH

International conference
harmonisation

Hiệp hội đồng thuận
quốc tế

International Union of
Pure and Applied

Chemistry

Tên quốc tế

6

IUPAC

7

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

8

LOQ

Limit of Quantification

Giới hạn định lượng

9

PDA

Photo Diode Array


Đầu dò dãy diod quang

10

Rs

Resolution

Độ phân giải

11

RSD

Relative Standard
Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

12

SKĐ

Sắc ký đồ

13

tR

14


UV-vis

Retention time

Thời gian lưu của pic

Ultravilet-Visible

Tử ngoại – Khả kiến


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng
1.1
1.2
1.3

Tên bảng
Một số phương pháp chiết xuất dùng trong các nghiên cứu trên
đối tượng lá sầu đâu
Một số nghiên cứu định lượng rutin trong 1 số dược liệu khác
Một số nghiên cứu trong nước và trên thế giới về lá cây sầu đâu

Trang
18
20
21

2.1


Chất chuẩn – Hóa chất – Thuốc thử

24

2.2

Trang thiết bị

25

2.3

T lệ pha động được khảo sát

26

2.4

Khảo sát dung mơi chiết

27

2.5

Khảo sát thể tích dung mơi chiết

28

2.6


Khảo sát thời gian chiết

28

2.7

Khảo sát nhiệt độ chiết

29

2.8

Khảo sát số lần chiết

29

2.9

Khảo sát tính tuyến tính và miền giá giá trị của rutin

32

3.1

Các thông số sắc ký trên mẫu chuẩn và mẫu thử rutin với các
điều kiện pha động đã khảo sát tại bước sóng 254nm

37


3.2

Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu chuẩn rutin và
mẫu thử (n=6)

42

3.3

Độ tinh khiết trên mẫu chuẩn và mẫu thử rutin

44

3.4

Kết quả phân tích tính tuyến tính

46

3.5

Kết quả khảo sát LOD, LOQ của rutin

47

3.6

Kết quả khảo sát độ chính xác trong ngày (n = 6)

49


3.7

Kết quả độ chính xác liên ngày của phương pháp

50

3.8

Kết quả thẩm định độ đúng của quy trình định lượng rutin trong
dịch chiết lá sầu đâu (n=9)

50


DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Tên đồ thị

Đồ thị
3.1
3.2

3.3

Đồ thị biễu diễn diện tích pic theo bước sóng
Đồ thị biễu diễn thời gian lưu theo tỉ lệ pha động trên
mẫu chuẩn
Đồ thị biễu diện tích pic theo dung mơi chiết trên mẫu
thử


Trang
35
36

38

3.4

Đồ thị biễu diện tích pic theo thể tích dung mơi chiết

38

3.5

Đồ thị biễu diện tích pic theo thời gian chiết

39

3.6

Đồ thị biễu diện tích pic theo nhiệt độ chiết

40

3.7

Đồ thị biễu diện tích pic theo số lần chiết

40


3.8

Đồ thị biễu diễn đường hồi qui tuyến tính giữa diện tích
pic và nồng độ của rutin

46

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ
3.1

Tên sơ đồ
Sơ đồ quy trình chiết tối ưu cho mẫu thử

Trang
41


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Cây Sầu đâu

3


1.2

Lá sầu đâu

4

1.3

Cấu trúc của azadirachtin, salanin và nimbin

5

1.4

Cấu trúc hóa học của quercetin

7

1.5

Các hợp chất cô lập từ cao ethyl acetate của lá sầu đâu

1.6

Cấu trúc của AT1 = Nimbin

11

1.7


Cấu trúc của 6 – deacetylnimbin và nimbandiol

11

1.8

Cấu trúc của rutin

19

3.1

Chồng SKĐ mẫu thử rutin ở bước sóng 225, 254, 300,
358nm

3.2

9 - 10

35

Chồng các sắc ký đồ tính tương thích hệ thống trên mẫu
chuẩn

42

3.3

Chồng các sắc ký đồ tính tương thích hệ thống trên mẫu thử


43

3.4

Chồng các sắc ký đồ dung môi pha mẫu (1), dung môi pha
động (2), mẫu thử (3), mẫu chuẩn (4), mẫu thử thêm chuẩn
(5) ở điều kiện sắc ký tối ưu

43

3.5

Phổ 3D của mẫu thử

44

3.6

Tương đồng phổ UV giữa chuẩn và thử của rutin

45

3.7

Sắc ký đồ của rutin tại nồng độ LOD và LOQ

48

3.8


Chồng sắc ký đồ của 6 mẫu thử trong ngày

49

3.9

Sắc ký đồ của mẫu chuẩn, mẫu thử của 3 nồng độ
80%(1), 100%(2),120%(3)

51


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Sầu đâu là một trong những cây được trồng nhiều ở An Giang, đặc biệt
là ở các huyện Tri Tôn, Châu Phú và một số tỉnh Nam bộ. Đây là loại cây có
rất nhiều tác dụng, được tơn vinh là “cây dược phẩm trong làng” ở Ấn Độ.
Cây thuốc này được người dân Ấn Độ và các nước dùng với các tác dụng như
kháng khuẩn, kháng viêm, trị loét, trị tiểu đường, đau dạ dày, kháng khối u,
diệt muỗi, trị sốt rét,….[1818],[2727]. Các nhà khoa học cũng nghiên cứu rất
nhiều về loại cây này và các báo cáo đều cho thấy sầu đâu có rất nhiều tác
dụng. Về tác dụng hạ đường huyết, chống oxy hóa, dịch chiết từ lá sầu đâu
cho thấy có tác dụng rõ ràng trên nhiều mơ hình nghiên cứu
[121212],[13],[28],[47].
Hiện nay, tiêu chuẩn cơ sở của nhiều thành phẩm có nguồn gốc từ dược
liệu được xây dựng dựa trên việc định lượng hỗn hợp tồn phần mà khơng
định lượng được các hoạt chất chính đặc trưng (chất đánh dấu), do thiếu chất
chuẩn đối chiếu. Thị trường dược liệu ngày một gia tăng, nhưng chất lượng

dược liệu thì rất khó phân biệt thật giả.
Với tiến bộ của các phương pháp kiểm nghiệm hiện đại như các
phương pháp sắc ký, đặc biệt là sắc ký lỏng hiệu năng cao có sử dụng các chất
chuẩn, việc kiểm nghiệm dược liệu thực hiện một cách dễ dàng và chính xác
hơn. Chất chuẩn hết sức quan trọng trong kiểm nghiệm chất lượng dược liệu,
đông dược, thực phẩm chức năng. Việc sử dụng các loại thuốc thảo dược theo
cách cổ truyền hay từ các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày
càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học. Chế phẩm thảo
dược dù chỉ có một loại dược liệu nhưng lại là hỗn hợp của nhiều hợp chất
khác nhau. Vì vậy, việc xây dựng quy trình định lượng chất đánh dấu từ
nguồn dược liệu có sẵn tại địa phương nhằm góp phần thuận lợi cho công tác
kiểm tra đánh giá chất lượng của dược liệu là rất cần thiết.


2

Từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây dựng
quy trình định lượng chất đánh dấu trong lá cây Sầu đâu ăn lá Azadirachta
indica” với hai mục tiêu cụ thể như sau:
1- Khảo sát các điều kiện chiết xuất chất đánh dấu rutin trong lá cây
sầu đâu.
2- Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng chất đánh dấu rutin trong
dịch chiết lá sầu đâu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).


3

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây sầu đâu

1.1.1. Tên khoa học
Cây sầu đâu có tên khoa học là Azadirachta indica A. Juss còn gọi là
Melia indica (A. Juss), Melia azadirachta L.

1.1.2. Đặc điểm cây sầu đâu

Hình 1.1. Cây sầu đâu
Cây to cao từ 10-15 m, ở điều kiện thích hợp có thể cao hơn. Lá kép
hình lơng chim lẻ, mọc so le, gồm 6-7 đơi chét lá mọc đối, hình mác, dài 3-8
cm, rộng 2-3 cm, phiên lệch, nhẵn, đầu nhọn, mép khía răng (lá non có mép
ngun). Cụm hoa mọc ở kẽ lá, ngắn hơn lá, gồm nhiều hoa kết thành những
xim nhỏ, hoa màu trắng giống hoa xoan, thơm, dài 5-6 mm, rộng khoảng 8-11
mm, mặt ngồi có lơng, tràng năm cánh thn hẹp, uốn cong, phình ở gốc, hơi
thắt lại ở đầu. Quả hạch (hình bầu dục) dài khoảng 2 cm chứa một hạt, nhân


4

hạt màu trắng, vị đắng. Rễ gồm có rễ cọc ngắn và nhiều rễ bên mọc khá
dài.[1], [8],[1818].
1.1.3. Bộ phận dùng, nơi sống, thu hái và chế biến
Bộ phận dùng: vỏ thân, vỏ rễ, lá, hoa, quả, hạt.
Nơi sống, thu hái và chế biến:
Cây sầu đâu mọc nhiều ở các vùng Tri Tôn, Châu Đốc, Tịnh Biên, An
Phú,…(An Giang), Hà Tiên (Kiên Giang)... Gỏi sầu đâu được biết đến là món
ăn của người Campuchia, dùng như một món rau trong bữa cơm hàng ngày.
Món ăn này du nhập vào Việt Nam thơng qua các gia đình người Khmer sinh
sống ven biên giới Việt Nam. Thu hái các bộ phận cây quanh năm. Vào tháng
2-3, có lá non và hoa. Lá sầu đâu đã được khoa học chứng minh sự hữu hiệu
trong việc phòng ngừa và chữa trị bệnh.

1.2. Lá sầu đâu
Lá kép hình lơng chim lẻ, mọc so
le, gồm 6-7 đơi chét lá mọc đối, hình
mác, dài 3-8 cm, rộng 2-3 cm, phiên
lệch, nhẵn, đầu nhọn, mép khía răng (lá
non có mép ngun). Lá ln xanh,
khơng rụng, lá một lần kép đáy hơi bất
đối xứng.
Hình 1.2. Lá sầu đâu
Từ xa xưa, người Ấn Độ đã dùng lá sầu đâu để làm thuốc như diệt côn
trùng, diệt tinh trùng, hạ đường huyết, chống viêm, chống ung thư, kháng
khuẩn, kháng nấm, chữa sốt rét. Ngồi ra, nó cịn có tác dụng chống oxy hóa
tế bào và kháng các tác nhân gây đột biến gen hoặc ung thư cũng như trị được
các bệnh như là: hạ đường huyết, thuốc chống ung thư, chống viêm [62].


5

1.2.1. Thành phần hóa học
Cây sầu đâu được di thực vào Việt Nam và được trồng phổ biến ở tỉnh
Ninh Thuận từ năm 1998, chủ yếu ở những vùng đất cát ven biển. Đến nay,
diện tích trồng đã trên 5000 ha, trong đó có gần 1000 ha đã cho thu hoạch
quả. Cây sầu đâu khơng thích hợp với các vùng đất và khí hậu ở các tỉnh phía
Bắc. Việc phát triển cây sầu đâu khơng chỉ nhằm mục đích phủ xanh đồi trọc,
đất trống ven biển, cải tạo môi trường sống, mà còn là nguồn nguyên liệu quý
cho các ngành y học, khoa học chế biến đa ngành. Ở Việt Nam, đã có một số
nhóm tác giả ở các Viện nghiên cứu, trường Đại học thực hiện các đề tài
nghiên cứu liên quan đến loài cây này, chủ yếu là trong lĩnh vực sản xuất
phân bón, thuốc bảo vệ thực vật thảo mộc.
Năm 2001, Viện Sinh học Nhiệt đới thực hiện đề tài theo nghị định thư

giữa Việt Nam và Ấn Độ về “Nghiên cứu và sử dụng cây xoan chịu hạn
(Azadirachta indica), tức cây sầu đâu, trồng tại Việt Nam”. Kết quả, đã hồn
thiện qui trình nhân giống cây sầu đâu bằng nuôi cấy mô và đã tiến hành thử
nghiệm trồng cây sầu đâu trên diện rộng ở huyện Ninh Phước, tỉnh Ninh
Thuận. Xác định được qui trình chiết tách thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt
sầu đâu; qui trình tách và tinh sạch azadirachtin và salanin; xác định hàm
lượng azadirachtin, salanin và nimbin bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp[10].
18

12 COOMe
11 30

O 19

1
10

2
3
29

5
4

28

Azadirachtin

Salanin


COOMe

9
6

8
7

13
17
14
16
15
O

OCOCH3

Nimbin

Hình 1.3. Cấu trúc của azadirachtin, salanin và nimbin

21
O
20
22 23


6

Năm 2003, Nguyễn Tiến Thắng và cộng sự nghiên cứu biến động hàm

lượng azadirachtin và nimbin trong lá Azadirachta indica và hiệu quả xua
đuổi, gây chết và biến dạng của dịch chiết nhân hạt sầu đâu đối với rầy nâu
(Nilapasvata lugens Stal), kết quả cho thấy có sự dao động khá lớn hàm lượng
azadirachtin và nimbin trồng tại Việt Nam phụ thuộc mùa và thời gian trong
năm, vào mùa khô hạn hàm lượng cao hơn so với mùa mưa [9].
Năm 2004, Nguyễn Minh Thanh và nhóm nghiên cứu đã tìm hiểu thành
phần hóa học của lá cây sầu đâu ở Ninh Thuận, tác giả đã phân lập được bốn
hợp chất limonoid từ cao ethyl acetate và ba flavonoid từ cao butanol [8].
Năm 2005, Văn Thị Hồng Nguyệt cũng đã phân lập được một số
limonoid từ cao Ethyl acetate của lá sầu đâu Ninh Thuận [17].
Năm 2005 Pongtip Sithisarn và Wandee Gritsanapan đã khảo sát tác
dụng loại bỏ gốc tự do của DPPH và hàm lượng flavonoid toàn phần trong
dịch chiết nước của lá sầu đâu. Kết quả cho thấy dịch chiết lá Sầu đâu chứa
lượng flavonoid toàn phần nằm trong khoảng 110.0 đến 511.4 mg quercetin
trong 100g dịch chiết với giá trị EC50 bằng phương pháp DPPH nằm trong
khoảng 28,85µg/ml đến 173µg/ml. Kết quả cho thấy hàm lượng flavonoid
trong lá cây sầu đâu xiêm trong dịch chiết tương quan với hoạt tính chống
oxy hố [51].
Năm 2005, Ngơ Văn Đát và cộng sự nghiên cứu ly trích và chiết xuất
hoạt chất azadirachtin từ hạt cây sầu đâu Ấn Độ (Neem) gia cơng thành chế
phẩm Vineem 1.500EC, chế phẩm có tác dụng trừ rệp sáp, bọ trĩ hại nho từ
68,9% đến 75,5% sau 7 ngày phun, tác dụng trừ sâu xanh hại bắp cải từ 60%
đến 90% sau 5-7 ngày phun [7]. Tác giả Trần Kim Qui và nhóm nghiên cứu
đã xây dựng được qui trình chiết xuất limonid từ lá sầu đâu bằng cồn 95° để
sản xuất thuốc bảo vệ thực vật Neemcide SP 3% và từ hạt, bằng phương pháp
ép nguội khung bản, thu được dầu và cao chiết có hàm lượng AZRL 1,61%


7


làm nguyên liệu sản xuất thuốc Neemcide SC 3%[14]. Nghiên cứu điều chế
thuốc Limo 3000 BR với hoạt chất trích ly từ lá sầu đâu Ninh Thuận, khảo sát
tác dụng diệt mối mọt ngũ cốc bảo vệ kho lương thực, thực phẩm…[13].
Năm 2006, Pongtip Sithisarn và cộng sự đã khảo sát tác dụng chống
oxy hóa của dịch chiết nước lá Sầu đâu được chiết xuất bằng nhiều phương
pháp khác nhau đồng thời dùng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để phát hiện 2 thành
phần flavonoid có hoạt tính chống oxi hóa là rutin và quercetin. Kết quả cho
thấy phương pháp sắc với nước nóng thích hợp để thu được các flavonoid có
tác dụng chống oxi hóa [50].

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của quercetin
Năm 2010, Oluwole B. Akinola và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng
của dịch chiết ethanol từ lá Azadirachta indica (AIE) trên giải phẫu vi mô gan
và các dấu hiệu oxy hóa ở chuột tiểu đường. Bảy mươi lăm chuột Wistar (8
tuần tuổi) được phân ngẫu nhiên vào năm nhóm điều trị: kiểm sốt; bệnh tiểu
đường; tiểu đường + AIE; Chỉ số AIE; tiểu đường + glibenclamide. Tăng
đường huyết xảy ra ở chuột nhịn ăn với streptozotocin. AIE được dùng đường
uống với liều 500 mg/kg bw/d và glibenclamide ở 600 μg/kg bw/ngày trong
50 ngày (50 ngày). Loài vật đã được đưa vào những ngày điều trị 7, 21 và 50.
Gan bị nhuộm màu với PAS. Các dấu hiệu của sự oxy hóa cũng được ước
tính. Ở 50 ngày, nghiên cứu mô học về gan của chuột bị tiểu đường cho thấy


8

sưng PAS + tế bào gan, có khả năng được xác nhận là glycogen. Ngược lại,
các tế bào gan của chuột bị tiểu đường do AIE điều trị thiếu glycogen. Phát
hiện chính ở những con chuột này đã làm tăng thêm sự ức chế oxy hóa.
Những phát hiện trong mơ hình này cho thấy hiệu quả có lợi của AIE trong
việc cải thiện glycogenosis gan do tiểu đường [27].

Năm 2010, Willy Shah và cộng sự đã định lượng rutin và quercetin
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao từ bột lá sầu đâu. Việc tách sắc
ký được thực hiện trên cột Phenomenex C18 (250mm x 4,6mm; 5 µm) với
pha động là hỗn hợp 60:40 v/v methanol và 0,1% axit photphoric trong nước
với tốc độ dòng 1,2 ml/phút và bước sóng phát hiện là 258nm, với thời gian
lưu là 10 phút. Điều này giúp ích cho việc phân tích định tính và phân tích
định lượng rutin và quercetin từ lá sầu đâu. Kết quả tìm được 0,9079mg rutin
và 0,1005mg quercetin từ 100mg bột lá sầu đâu [63].
Năm 2012, Nguyễn Thị Ý Nhi đã chiết tách hoạt chất limonoid từ cao
ethyl acetat của lá cây sầu đâu thu hái ở Ninh Thuận, kết quả cô lập được 20
hợp chất triterpen tinh khiết, trong đó có một hợp chất là protolimnoid, 15
hợp chất là tetranortriterpenoid và 4 hợp chất pentanortriterpenoid. Trong các
hợp chất cơ lập được có 16 hợp chất mới:[12]


9



Limonoid khơng mở vịng C:
O

O 23

23

21
18

4'


20

22

3'

17

AcO

5'

11
19

30

O

1'

13

11
19

30

7


5

OAc

AcO

10
5

22

30 13

OH

10
5

3

HO

7

4

30

1


15

22

17
11

19

9

20

18

OH

14

7

4

11
19

1

15


14
3

O

1'

O 23

21

17

13

9

20

18

3'
5'

1

3

O


22

17

15

9

4'
20

18

O 23

21

21

O

1

HO



13


9
14
10
5

3

OH

AcO

15
3'

7

1'

O C C

4

CH 2

CH
29

28

29


Azadirachtolid D

28

O

29

4'

22

O

23

22

O

O

O

21

23

1

8

20

20

17

5'

13

HO
15

1

2'

1
7

11

1
11 3

O

1'


11

1

O

O

23

20

1'

3

(NEEM 31) (Hợp chất mới)

17

2'

4'

21

O

5'


O

(NEEM 33) (Hợp chất mới)
O

21
4'

O

2928

1-Desenecyl-7-O-methacryloyldeoxyazadirachtolid

(NEEM 24)
O

O

3-Deacetyldeoxyazadirachtolid

Deoxyazadirachtolid

(NEEM 39)
(Hợp chất mới)

28

19


30

13

1

15
9

9

9

15

3

HO

7

3

7

5

AcO


OH

5

3

7

OH

O C C

O

28

(NEEM 25) (Hợp chất mới)
21
18

O 23

20

(NEEM 23)

OCH 3

(NEEM 3) (Hợp chất mới)
O 23


21
18

22

OCH 3

21

22

20

17

11

9

13

3

AcO

5

7


28

1
3

OH

9

14

11
3
0

15

1

10

1'

O

29

1

15


O C

4

17

30

3
'

CH 2

3

C

AcO

CH

O

4'

2
9

3


O C

C

CH 3
C

CH 3

2
'

O

O

5'

15

10

3

H
28

1
4


1'

4

13

9

4'
7

5

OCH 3
22

17

11

19

14
10

OH
1
9


O 23
20

18

1

CH 3

O 1-Desenecyl-7-OAzadirachtolid
methacryloylazadirachtolid

O

3
0

O

4'

Azadirachtolid E

OH

CH 2

1'

5


AcO
29

1
9

3
'

10

H

7

5

5'

1'

3'
7'

AcO

4

29


O

28

O

C

O

C

CH

9'

1-Desenecyl-7-O-cinnamoyl-

1-Desenecyl-7-O-methacryloyl23-methoxyazadirachtolid

1-Desenecyl-7-O-senecyl23-O-methoxyazadirachtolid

23-O-methoxyazadirachtolide

(NEEM 19) (Hợp chất mới)

(NEEM 20) (Hợp chất mới)

(NEEM 22) (Hợp chất mới)



10

Limonoid mở vòng C
O 21
12

O

23
22

20

MeO2C

OH

O 21 O
12

18

1

O 19

15


5

7

O

3
5

CO 2Me

15

O

5

7

7

OH
28 CO Me

29

O

29


28

13

9
10

3

10

OH

30

1
15

9

O

3

29

30

1


9

O

22
17

11

O 19

13

23

18

2

11

O

21

20

MeO C

22

17

13

30

10

12

18

MeO2C

17
11

O 19

20

HO

OH

23

28

2


Azadirachtolid A

Azadirachtonenlid

Azadirachtolid C

(NEEM 5)

(NEEM 1) (Hợp chất mới)

(NEEM 17) (Hợp chất mới)

20

12

Me O2C
O 19

O

21

O

23

OCH 3


H3CO 21 O 23
OH

22

12

18

MeOOC
O 19

17

11
3013

1

15
10

1
10

O

13

5


OH

7

OH
28COOMe

29

CO 2Me
28

23-O-Metylazadirachtolid A

15

8

O

5
29

OH

17

11


3

7

22

20
18

9

9

3

OCH 3

20,22-Dihydroxy-21,23-dimethoxynimbinolid

(NEEM 4) (Hợp chất mới)

(NEEM 30) (Hợp chất mới)

Pentanortriterpenoid: các hợp chất pentanortriterpenoid có
nhánh là vịng γ-hydroxybutenolid, tetrahydroxytetrahydrofuran
và vòng lactam. Cụ thể gồm:
HO

21


O

23

O 21 O

O

OH

23

H CO

21

3
12

MeO 2C
O 19
1

20
18

22

20


MeO 2C
O 19

17

11

3013
9

22

18
3013

1

9

15

15
10
3

5
29

10


O

4

29

OH OH

Nimbandiol A
(NEEM 35) (Hợp chất mới)

1

5

29

(NEEM 14) (Hợp chất mới)
H
N

7

OH OH

20,22-Dihydroxy-21,23dimethoxynimbandiol
(NEEM 28) (Hợp chất mới)

O
23


12

20

MeOOC

18

17

11
19

1

O
5

21

15
8

3

Nimbandiol B

OH


13

9

7

OH OH

O

11

22
17

18

10

O

3

7

MeOOC
O 19

17


11

O 23 OCH
3
OH

20

12

30

13

9

15
10

O

3
5
29

7

OH OH

Nimbandiolactam-23

(NEEM 34) (Hợp chất mới)

Hình 1.5. Các hợp chất cô lập từ cao ethyl acetat của lá sầu đâu


11

Kết quả thử nghiệm khả năng ức chế enzym α-glucosidase của các hợp
chất tinh khiết cô lập từ cao ethyl acetat cho thấy có 16 hợp chất có khả năng
ức chế enzym α- glucosidase in vitro. Kết quả này có thể phần nào giải thích
được vì sao lá cây sầu đâu Azadirachta indica đã được sử dụng như một bài
thuốc để kiểm soát sự quá tăng đường huyết sau bữa ăn và sử dụng độc lập
điều trị bệnh đái tháo đường tuýp 2 hoặc sử dụng kết hợp trong điều trị bệnh
đái tháo đường.
Năm 2014, Võ Thị Kiều Oanh và cộng sự đã phân lập và xác định cấu
trúc một số limonoid trong lá Sầu đâu thu hái tại thành phố Long Xuyên, tỉnh
An Giang năm 2014. Kết quả cho thấy đã phân lập được 3 hợp chất thuộc
nhóm limonoid là nimbin (AT1), 6-deacetylnimbin (AT2) và nimbandiol
(AT3) [19].
12 COOMe
O

11

19

1
10

2

3
29

5
4

28

9
6

COOMe

30

8
7

18

21
O
20
22 23

13
17
14
16
15

O

OCOCH3

Hình 1.6. Cấu trúc của AT1 = Nimbin
12

COOMe

O

11

19

1
10

2
3
29

5
4

9
6

30


8
7

18

12

COOMe

21
O
20
22 23

1
10

2
3

O

29

5
4

28

28


COOMe

19

O

13
17
14
16
15

11

OH

9
6

30

8
7

18
13
17
14
16

15
O

OH

OH

AT2= 6-deacetylnimbin

AT3= nimbandiol

Hình 1.7. Cấu trúc của 6 – deacetylnimbin và nimbandiol

21
O
20
22 23


12

Kết quả này có thể được sử dụng để làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng
dụng loài cây trong dược phẩm, mỹ phẩm thân thiện với môi trường.
1.2.2. Tác dụng sinh học của lá sầu đâu
Hiện nay đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của lá sầu đâu,
các tác dụng đã được chứng minh bao gồm:
Tác dụng chống oxy hóa, loại bỏ gốc tự do của DPPH của dịch chiết
nước lá sầu đâu. Tác dụng diệt mối mọt của hoạt chất azadirachtin từ hạt cây
sầu đâu Ấn Độ (Neem) và tác dụng diệt rầy nâu của azadirachtin và nimbin
trong lá Azadirachta indica. Tác dụng hạ đường huyết: Nhóm nghiên cứu của

tác giả Nguyễn Thị Ý Nhi đã khảo sát tác dụng ức chế enzym α-glucosidase
của các cao chiết từ lá Sầu đâu. Kết quả cho thấy cao etyl acetat và cao
butanol có hoạt tính với giá trị IC50 lần lượt là 144,95 µg/ml và 196,57
µg/ml. Bên cạnh đó, hai phân đoạn A4 và A5 của cao etyl acetat có khả năng
ức chế enzym α-glucosidase mạnh hơn cao etyl acetat nhiều lần. Các hợp chất
tinh khiết phân lập từ cao etyl acetat cũng có hoạt tính ức chế enzym αglucosidase, ngay cả ở nồng độ thấp, với các chỉ số IC50(IC50<100µM) thấp
hơn giá trị tương ứng của chất đối chứng (acarbose) khá nhiều (IC50 360 µM)
[12].
Ngồi flavonoid có hoạt tính hạ đường huyết trong lá Sầu đâu, thành
phần rutin cũng được báo cáo là làm giảm mức đường huyết do ức chế hiệu
quả enzyme alpha-glucosidase. Trên in vivo, rutin có thể đảo ngược hình thái
đảo tụy, sự oxy hóa và hạ đường huyết ở những con chuột mắc bệnh tiểu
đường. Rutin cũng làm giảm nồng độ đường huyết lúc đói, glycosylated
hemoglobin đồng thời làm tăng lượng insulin, C-peptide, hemoglobin và
protein [44].


13

1.3. Vai trị cuả chất đánh dấu trong kiểm sốt chất lƣợng dƣợc liệu
1.3.1. Định nghĩa chất đánh dấu
Theo Quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015 của Cục Khoa
học Công nghệ và đào tạo, chất đánh dấu là một thành phần tự nhiên của dược
liệu dùng làm tiêu chuẩn để xác định đảm bảo chất lượng cho dược liệu và
không nhất thiết phải là chất có tác dụng sinh học hay tác dụng điều trị [3].
1.3.2. Vai trò của chất đánh dấu
Việc lựa chọn các chất đánh dấu có vai trị quan trọng trong kiểm soát
chất lượng của dược liệu như: xác định chi loài, thu được các dược liệu chất
lượng, đánh giá xử lý nguyên liệu sau thu hoạch, đánh giá các thành phẩm
trung gian và phát hiện các nguyên liệu, thành phẩm giả mạo, kém chất lượng.

Đối với dược liệu, chất đánh dấu thích hợp thường được lựa chọn là các
chất có hoạt tính sinh học đặc trưng, hoạt chất chính trong dược liệu hoặc các
chất có độc tính cũng được chọn [54].
Dược Điển Ấn Độ chọn rutin là chất đánh dấu để kiểm soát chất lượng
dược liệu sầu đâu trên thị trường, trong đó quy định hàm lượng của rutin
trong lá sầu đâu không được thấp hơn 1% [4].
1.4. Các phƣơng pháp chiết xuất thƣờng sử dụng trong dƣợc liệu
1.4.1. Định nghĩa về hòa tan chiết xuất
Hòa tan chiết xuất là một quá trình kỹ thuật dùng dung mơi để hịa tan và
tách các chất ra khỏi dược liệu. Dung môi chứa chất tan thu được gọi là dịch
chiết, phần dược liệu sau khi chiết lấy dịch gọi là bã.
Q trình hịa tan chiết xuất là q trình hịa tan khơng hồn tồn. Các
q trình đồng thời xảy ra trong chiết xuất bao gồm: sự hòa tan, sự khuếch
tán, sự thẩm thấu/thẩm tích. [1],[2]


14

1.4.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến q trình hịa tan chiết xuất
Có 3 nhóm yếu tố như sau:
- Yếu tố dược liệu: cấu trúc dược liệu (loại dược liệu non và dược liệu có
cấu trúc mỏng manh, dược liệu già và dược liệu có cấu trúc rắn chắc), mức độ
phân chia dược liệu (mức độ và cách phân chia dược liệu phải phù hợp với
loại dược liệu, phương pháp chiết và dung môi sử dụng).
- Yếu tố dung môi: bản chất dung môi, tỉ lệ dung môi và dược liệu, pH
của dung môi, ảnh hưởng của chất diện hoạt trong dung môi.
- Yếu tố kỹ thuật chiết xuất: ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian chiết xuất,
sự khuấy trộn. [1],[2]
1.4.3. Các phƣơng pháp chiết xuất dƣợc liệu [1],[2]
1.4.3.1. Phương pháp ngâm

Ngâm là phương pháp chiết gián đoạn, trong đó tồn bộ lượng dung
mơi được tiếp xúc đồng thời với tồn bộ lượng dược liệu trong những dụng cụ
thích hợp. Quá trình chiết xuất xảy ra ở mọi điểm trong thiết bị là như nhau và
dịch chiết được rút ra khỏi thiết bị cùng một lúc. Quá trình ngâm này có thể
được lặp lại thêm một hay vài lần để chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu. Sự
khuấy trộn, các yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, siêu âm, vi sóng, chất diện
hoạt,… có thể được sư dụng để gia tăng quá trình chiết.
- Phương pháp ngâm lạnh: dược liệu được ngâm với dung mơi ở nhiệt
độ phịng. Thời gian ngâm thường không dưới 12 giờ với các dược liệu mỏng
manh hay dược liệu đã xay nhỏ để đảm bảo q trình chiết được căn bản
hồn tất.
- Phương pháp ngâm nóng: là phương pháp ngâm được thực hiện ở
nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phịng nhưng dưới nhiệt độ sơi của dung mơi. Do có
sự gia nhiệt nên q trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng


15

độ cao hơn và ít tốn dung mơi hơn. Các dụng cụ chiết đặc biệt cho phương
pháp này ở quy mô vừa và nhỏ là Soxhlet và Kumagawa.
- Chiết bằng dung môi ở nhiệt độ sôi: là phương pháp ngâm được thực
hiện ở nhiệt độ sôi của dung môi. Do được chiết ở nhiệt độ sôi của dung môi
nên khả năng hịa tan của các chất tan vào dung mơi thường là cao nhất và
q trình hịa tan xảy ra nhanh. Quá trình chiết cần được thực hiện trong các
thiết bị thích hợp, nhiều trường hợp phải có bộ phận ngưng tụ dung môi và
phải gia nhiệt. Các phương pháp sắc, hầm hay nấu cao trong y học cổ truyền
là phương pháp chiết với dung môi ở nhiệt độ sôi với dung môi là nước. Với
các dung môi khác, dụng cụ chiết cần có bộ phận ngưng tụ dung mơi nên
cũng được gọi là phương pháp chiết hồi lưu.
1.4.3.2. Phương pháp chiết ngấm kiệt ngược dòng

Ngấm kiệt hay ngâm nhỏ giọt là phương pháp chiết xuất hoạt chất bằng
cách cho dung môi chảy rất chậm đều đặn qua khối dược liệu đã được phân
chia thích hợp trong thiết bị đặc biệt gọi là bình ngấm kiệt. Trong quá trình
ngấm kiệt không khuấy trộn.
Với cùng một lượng dung môi, phương pháp ngấm kiệt hút được nhiều
hoạt chất hơn ngâm, đây là một q trình chiết liên tục, dung mơi trong bình
ngấm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi tinh
khiết. Tuy nhiên, không áp dụng được với dung môi là nước hoặc các dược
liệu chứa nhiều chất nhầy, tinh bột, gôm,…Bao gồm phương pháp ngấm kiệt
cổ điển và phương pháp ngấm kiệt cải tiến.
Các phương pháp ngấm kiệt cải tiến (dành cho quy mô trung bình đến
lớn) có thể kể đến là: Ngấm kiệt phân đoạn hay tái ngấm kiệt, ngấm kiệt
ngược dòng (thực hiện với nhiều bình chiết, ngun tắc là dung mơi lỗng dần
đi vào các bình chứa chất đậm dần), ngấm kiệt dùng áp suất (cao hoặc giảm),
ngấm kiệt dùng siêu âm.