BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ

NGUYỄN NHỰT MINH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID
TRONG CÂY NHÂN TRẦN TÍA
(Adenosma bracteosum Bonati)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC

Cần Thơ – Năm 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC Y DƢỢC CẦN THƠ

NGUYỄN NHỰT MINH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH
ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID
TRONG CÂY NHÂN TRẦN TÍA
(Adenosma bracteosum Bonati - Scrophulariaceae)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ ĐẠI HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
ThS. NGUYỄN NGỌC QUỲNH

Cần Thơ – Năm 2015


LỜI CẢM ƠN
Con xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ và gia đình đã ln ủng hộ,
là chỗ dựa tinh thần, giúp con hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn Cô Ths. Nguyễn Ngọc Quỳnh, ngƣời đã tận tình
hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, luôn theo sát giúp
đỡ em hoàn thành luận văn này.
Em xin cảm ơn Cô Ths. Thạch Trần Minh Uyên, Thầy Ths. Lê Thanh Vĩnh Tuyên,
Cô Ths. Nguyễn Thị Trang Đài, Chị Nguyễn Vũ Phƣơng Lan, Chị
Ngô Thị Kim Hƣơng đã luôn động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em
trong quá trình thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Ths. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, thầy
Ds. Lữ Thiện Phúc và các thầy cơ trong LBM Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc
chất, trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện
làm việc tốt nhất cho em.
Em cũng xin cảm ơn tất cả các thầy cô trong trƣờng Đại học Y Dƣợc Cần Thơ đã
tận tình dạy dỗ chúng em trong những năm vừa qua để chúng em có kết quả nhƣ
ngày hôm nay.
Xin chân thành cảm ơn các anh chị lớp Dƣợc khóa 35, các bạn làm luận văn lớp
Dƣợc khóa 36 đã luôn quan tâm, chia sẽ, giúp đỡ những lúc khó khăn, để mình
hồn thành đề tài tốt nghiệp.

Nguyễn Nhựt Minh



LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan tất cả những kết quả trong luận văn này là hoàn toàn của riêng tôi
và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào.
Cần Thơ, ngày

tháng

Sinh viên ký tên

Nguyễn Nhựt Minh

năm


i

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC ................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT .................................................. iv
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ.............................................................................vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ NHÂN TRẦN TÍA ....................................................................................... 3

1.1.1. Thực vật học........................................................................................................... 3

1.1.2. Thành phần hóa học ............................................................................................... 5
1.1.3. Tác dụng sinh học .................................................................................................. 9
1.2. TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID ............................................................................................ 10

1.2.1. Isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AD6) ................................................... 11
1.2.2. Isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid (AD4) ...................................................... 12
1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ......................................................... 12

1.3.1. Khái niệm và cấu tạo máy HPLC......................................................................... 12
1.3.2. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký........................................................ 13
1.4. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG BẰNG HPLC ................................................... 16

1.4.1. Tính tƣơng thích hệ thống .................................................................................... 16
1.4.2. Tính đặc hiệu/ tính chọn lọc ................................................................................. 17
1.4.3. Độ chính xác ........................................................................................................ 17
1.4.4. Độ đúng ................................................................................................................ 18
1.4.5. Tính tuyến tính và miền giá trị ............................................................................. 18
1.4.6. Giới hạn phát hiện (LOD) – Giới hạn định lƣợng (LOQ) ................................... 19

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 20
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU .................................................................................................. 20

2.1.1. Mẫu nguyên liệu................................................................................................... 20


ii

2.1.2. Chất chuẩn đối chiếu ............................................................................................ 20
2.1.3. Dung mơi, hóa chất .............................................................................................. 20
2.1.4. Trang thiết bị ........................................................................................................ 20

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................. 21

2.2.1. Tinh khiết hóa các flavonoid làm chất đối chiếu ................................................. 21
2.2.2. Khảo sát quy trình chiết xuất các flavonoid từ Nhân trần tía ............................. 22
2.2.3. Khảo sát các điều kiện để định lƣợng đồng thời các flavonoid bằng HPLC ....... 27
2.2.4. Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời các flavonoid bằng HPLC ............... 28
2.2.5. Ứng dụng quy trình đã thẩm định để định lƣợng các flavonoid trong Nhân trần tía
đƣợc thu hái ở 3 tỉnh ở các thời kỳ sinh trƣởng khác nhau.................................................. 31

CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 33
3.1. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU ........................ 33

3.1.2. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng ............................................................................. 33
3.1.3. Phƣơng pháp HPLC ............................................................................................. 34
3.2. KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CÁC FLAVONOID TỪ NHÂN TRẦN TÍA 35

3.2.1. Dung mơi chiết ..................................................................................................... 35
3.2.2. Nhiệt độ chiết ....................................................................................................... 35
3.2.3. Thời gian chiết ..................................................................................................... 36
3.2.4. Thể tích dung mơi chiết ....................................................................................... 36
3.2.5. Số lần chiết ........................................................................................................... 36
3.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID TRONG
NHÂN TRẦN TÍA BẰNG HPLC ................................................................................................. 37

3.3.1. Chuẩn bị mẫu thử ................................................................................................. 37
3.3.2. Thăm dò điều kiện sắc ký .................................................................................... 39
3.4. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID TRONG
NHÂN TRẦN TÍA BẰNG HPLC ................................................................................................. 42

3.4.1. Tính tƣơng thích hệ thống .................................................................................... 42

3.4.2. Thẩm định quy trình định lƣợng đồng thời các flavonoid bằng HPLC ............... 42
3.5. ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG CÁC FLAVONOID TRONG NHÂN TRẦN TÍA
THU HÁI TỪ 3 TỈNH, Ở CÁC THỜI ĐIỂM SINH TRƢỞNG KHÁC NHAU ............................. 46


iii

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 48
4.1. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU ........................ 48

4.1.1. Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng ............................................................................. 48
4.1.2. Phƣơng pháp HPLC ............................................................................................. 48
4.2. KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHIẾT CÁC FLAVONOID TỪ CÂY NHÂN TRẦN TÍA ... 49
4.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID TRONG
NHÂN TRẦN TÍA BẰNG HPLC ................................................................................................. 50

4.3.1. Chuẩn bị mẫu thử ................................................................................................. 50
4.3.2. Thăm dò điều kiện sắc ký .................................................................................... 51
4.4. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CÁC FLAVONOID TRONG
NHÂN TRẦN TÍA BẰNG HPLC................................................................................................ 55

4.4.1. Tính tƣơng thích hệ thống .................................................................................... 55
4.4.2. Tính đặc hiệu ........................................................................................................ 55
4.4.3. Tính tuyến tính, LOD và LOQ ............................................................................. 56
4.4.4. Độ chính xác ........................................................................................................ 58
4.4.5. Độ đúng ................................................................................................................ 58
4.5. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐÃ THẨM ĐỊNH ĐỂ ĐỊNH LƢỢNG MỘT VÀI MẪU
THU HÁI Ở CÁC TỈNH, Ở CÁC THỜI ĐIỂM SINH TRƢỞNG KHÁC NHAU .................. 58

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 61

KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Từ nguyên

%
ACN
AOAC
As

Selectivity factor
Acetonitrile
Assiocation of Official
Analytical Chemists
Asymmetry

DĐVN IV

Nghĩa tiếng Việt
Phần trăm
Hệ số chọn lọc
Dung mơi acetonitril
Hiệp hội hóa học phân tích quốc

tế
Hệ số bất đối
Dƣợc điển Việt Nam IV

DMSO

Dimethyl sulfoxide

Dung môi dimethyl sulfoxid

EtOAc

Ethyl acetate

Ethyl acetat

HPLC

High Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ICH

Hiệp hội đồng thuận quốc tế

IR

International conference

Harmonisation
Infrared

k’

Capacity factor

Hệ số dung lƣợng

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lƣợng

MeOH

Methanol

Dung môi methanol

(Phổ) hồng ngoại

Số đĩa lý thuyết


N
NMR

Nuclear magnetic resonance

Cộng hƣởng từ hạt nhân

PDA

Photo Diod Array

Dãy diod quang

PL

Phụ lục

ppm

Phần triệu

Rf

Retardation factor

Hệ số lƣu trữ

Rs
SKĐ


Resolution

Độ phân giải
Sắc ký đồ

SKLM
RSD
S

Sắc ký lớp mỏng
Relative stadard deviation

Độ lệch chuẩn tƣơng đối
Diện tích pic


v

Chữ viết tắt

Từ nguyên

Nghĩa tiếng Việt

SD

Stadard deviation

Độ lệch chuẩn


S/N

Signal/ Noise

Tỷ số tín hiệu/ nhiễu

tR

Retention time

Thời gian lƣu

tt

Thể tích

UV

Ultra violet

Tử ngoại

VS

Vanilin sulfuric

Vanilin sulfuric

YHCT


Y học cổ truyền


vi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Kết quả hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các loại cao chiết................9
Bảng 2.1. Danh mục chất chuẩn đối chiếu ...............................................................20
Bảng 2.2. Các yếu tố khảo sát quy trình chiết xuất. .................................................23
Bảng 2.3. Khảo sát dung môi chiết. ..........................................................................23
Bảng 2.4. Khảo sát nhiệt độ chiết. ............................................................................24
Bảng 2.5. Khảo sát thời gian chiết. ...........................................................................25
Bảng 2.6. Khảo sát thể tích dung mơi chiết. .............................................................25
Bảng 2.7. Khảo sát số lần chiết.................................................................................26
Bảng 2.8. Một số điều kiện pha động khảo sát .........................................................28
Bảng 2.9. Khảo sát tính tuyến tính và miền giá giá trị của AD6, AD4 ....................30
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết. .............................................................35
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết. ...............................................................35
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát thời gian chiết. ..............................................................36
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thể tích dung mơi. .........................................................36
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát số lần chiết ....................................................................36
Bảng 3.6. Một số điều kiện pha động đã khảo sát ....................................................39
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tính tƣơng thích của hệ thống trên mẫu chuẩn (n=6) ...42
Bảng 3.8. Khảo sát tính tƣơng thích của hệ thống trên mẫu thử (n=6) ....................42
Bảng 3.9. Khoảng tuyến tính của isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AD6) ..44
Bảng 3.10. Khoảng tuyến tính của isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid (AD4) ...44
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát tính tuyến tính .............................................................44
Bảng 3.12. Tỷ lệ S/N của AD6, AD4 tại các nồng độ 1 ppm, 0,5 ppm và 0,25 ppm ... 45


Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ chính xác trong ngày (n=6) ...................................45
Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng .......................................................................46
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát hàm lƣợng flavonoid trong một số mẫu Nhân trần tía .... 46

Bảng 4.1. Điều kiện pha động tối ƣu ........................................................................54


vii

DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của Nhân trần tía .........................................................4
Hình 1.2. Cây mang hoa (1) và hoa tƣơi (2) của Nhân trần tía. .................................4
Hình 1.3. Thân (1) và hoa (2) Nhân trần tía phơi khơ. ...............................................4
Hình 1.4. Cơng thức hóa học một số hợp chất chính trong tinh dầu Nhân trần tía. ...6
Hình 1.5. Cơng thức hóa học một số flavonoid trong Nhân trần tía ..........................7
Hình 1.6. Cơng thức hóa học của stigmasterol (1) và acid betulinic (2) và (3)
sitosterol-3-O-β-D glucopyranosid. ............................................................................8
Hình 1.7. Cơng thức hóa học của một số hợp chất phenol trong Nhân trần tía. ........8
Hình 1.8. Cấu trúc ba khung cơ bản của flavonoid trong thiên nhiên......................10
Hình 1.9. Cơng thức cấu tạo (a) và phổ UV của isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid . 12
Hình 1.10. Cơng thức cấu tạo (a) và phổ UV của isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid .. 12

Hình 1.11. Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao ........................................13
Hình 2.1. Hệ thống HPLC Hitachi L-2000 với đầu dị PDA L-2455.......................21
Hình 3.1. SKĐ AD6 và AD4 với 3 hệ dung môi khác nhau ....................................33
Hình 3.2. Biểu đồ kết quả khảo sát quy trình chiết xuất các flavonoid trong
Nhân trần tía bằng phƣơng pháp chiết có hỗ trợ siêu âm. ........................................37
Sơ đồ 3.1. Quy trình chiết mẫu thử. ..........................................................................38
Hình 3.3. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn ở các điều kiện sắc ký khác nhau ....................40
Hình 3.4. Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn ở các điều kiện sắc ký thích hợp .....................41

Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu thử ở các điều kiện sắc ký thích hợp................................41
Hình 3.6. Sắc ký đồ mẫu chuẩn (a), mẫu pha động (b), mẫu trắng (c), mẫu thử (d)
và mẫu thử thêm chuẩn (e) khi khảo sát tính đặc hiệu. .............................................43
Hình 3.7. Phổ UV tại thời gian lƣu của các chất trong mẫu thử và mẫu chuẩn .......43
Hình 3.8. Biểu đồ so sánh hàm lƣợng (mg/100g) các flavonoid có trong
Nhân trần tía tại các tỉnh, ở những thời kỳ sinh trƣởng khác nhau ..........................47


viii

Hình 4.1. Overlay SKĐ mẫu thử với pha động (a) methanol – acid formic 0,1%
(30:70), (b) methanol – acid formic 0,1% (40:60), (c) acetonitril – acid formic 0,1%
(20:80), (d) acetonitril – acetic 1% (10:90) và (e) acetonitril – acetic 1% (5:95).....52
Hình 4.2. SKĐ điều kiện pha động (1) và (2) ..........................................................53
Hình 4.3. SKĐ điều kiện pha động (3) và (4) ..........................................................53
Hình 4.4. Overlay sắc ký đồ mẫu thử tại điều kiện pha động tối ƣu với acid H3PO4
tại các pH=3 (điều kiện pha động 5) và pH=4 (điều kiện pha động 6) .....................54
Hình 4.5. Kiểm tra độ tinh khiết pic tại thời gian lƣu của (a) AD6 và (b) AD4 trong
mẫu thử. .....................................................................................................................56
Hình 4.6. Overlay SKĐ tuyến tính hỗn hợp chuẩn ở 7 nồng độ khảo sát ................58
Hình 4.7. Thực địa tại (1) Tây Ninh, (2) Bình Dƣơng, (3) An Giang nơi thu hái
Nhân trần tía và (4) mẫu mua tại nhà thuốc bệnh viện YHCT Cần Thơ. .................60


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cho đến nay trên thế giới có khoảng 800 triệu ngƣời mắc bệnh gan do nhiều
nguyên nhân khác nhau, trong đó viêm gan do virus vẫn là vấn đề đƣợc quan tâm
nhất, ghép gan do tác nhân virus vẫn chiếm tỷ lệ cao [24]. Các thuốc tân dƣợc dùng

điều trị bệnh viêm gan thƣờng có giá thành cao và nhiều tác dụng khơng
mong muốn. Do đó vấn đề tìm thuốc có nguồn gốc từ dƣợc liệu đang rất đƣợc
quan tâm. Nhiều dƣợc liệu đã đƣợc sử dụng trong điều trị viêm gan và bƣớc đầu có
hiệu quả tốt, trong đó có Nhân trần tía [30].
Tại Việt Nam, hiện nay việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính
sinh học ngày càng đƣợc chú trọng và đẩy mạnh. Tuy nhiên, các nghiên cứu trƣớc
đây về Nhân trần tía tại Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung đƣợc nghiên
cứu chủ yếu về tác dụng dƣợc lý, chƣa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học,
cũng nhƣ hàm lƣợng các hoạt chất có trong cây [19]. Hơn nữa, việc sử dụng
Nhân trần tía làm thuốc trong đơng y hay các chế phẩm từ tồn cây Nhân trần tía
nhƣ viên uống, cao thuốc, các loại trà,… ngày càng trở nên phổ biến nhƣng hầu hết
là ở dạng cao toàn phần, dịch chiết toàn phần. Việc xác định thành phần flavonoid
chính với hàm lƣợng là bao nhiêu thì vẫn cịn đang bỏ ngỏ.
Do đó, việc xây dựng quy trình định lƣợng các flavonoid trong cây Nhân trần tía sẽ
là một đóng góp vào dữ liệu khoa học, cũng nhƣ góp phần đảm bảo chất lƣợng
dƣợc liệu và các chế phẩm từ Nhân trần tía mang lại hiệu quả điều trị và an tồn
trong chăm sóc sức khỏe nhân dân. Chính vì vậy, đề tài
“Nghiên cứu xây dựng quy trình định lƣợng đồng thời các flavonoid trong cây
Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati)”
Đƣợc thực hiện với các mục tiêu cụ thể:
1. Xây

dựng

và

thẩm

định


quy

trình

định

lƣợng

hai

flavonoid

isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid và isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid
trong Nhân trần tía bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dị dãy diod quang.
2. Ứng dụng quy trình định lƣợng hai flavonoid trong Nhân trần tía đƣợc
thu hái từ các tỉnh, ở các thời kỳ sinh trƣởng khác nhau.


2

Ý nghĩa đề tài:
 Kết quả của đề tài sẽ là một kênh tham khảo dữ liệu giúp bổ sung vào
chuyên luận dƣợc liệu cho Dƣợc điển Việt Nam V.
 Là cơ sở tham khảo về mặt pháp lý cho việc kiểm định nguồn dƣợc liệu nhằm
đảm bảo chất lƣợng thuốc, chế phẩm từ Nhân trần tía đến tay ngƣời tiêu dùng
an tồn, hiệu quả, góp phần nâng cao cơng tác chăm sóc sức khỏe nhân dân.


3


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ NHÂN TRẦN TÍA
1.1.1. Thực vật học
1.1.1.1. Tên khoa học và phân loại
Tên khoa học: Adenosma bracteosum Bonati.
Tên khác: Nhân trần Tây Ninh, Nhân trần nhiều lá bắc, Tuyến hƣơng lá hoa,
Nhân trần cái.
Vị trí phân loại: [9], [43]
Giới Thực vật (Plantae)
 Phân giới Thực vật bậc cao (Cormobionta)
 Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
 Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
 Phân lớp Hoa môi (Lamiidae)
 Bộ Hoa mõm sói (Scrophulariales)
 Họ Hoa m m sói (Scrophulariaceae)
 Chi Adenosma
 Lồi Nhân trần tía (Adenosma bracteosum Bonati)
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật
Nhân trần tía thuộc loại cây thân thảo, cao 30-40 cm. Thân hình trụ, phân cành từ
gốc, phần ngọn có 4 cành. Cành mọc tỏa ngang hay đứng thẳng. Lá mọc đối, hình
mác thn, dài khoảng 2 cm, rộng 7 mm, không cuống, gốc lá gần nhƣ ơm thân,
ngun hoặc có răng cƣa trịn, gân lá r .
Cụm hoa mọc ở đầu cành thành bông dày đặc, dài 1,5-3 cm, tổng bao gồm những
lá bắc dạng lá, hình tim, đầu nhọn, mép ngun, có lơng thơ; đài có 5 răng
khơng đều, 3 răng ngồi rộng, 2 răng trong hẹp; tràng có ống hình trụ chia 2 mơi,
mơi trên bằng đầu, chia đôi, môi dƣới dài bằng môi trên, chia 3 thùy gần bằng nhau;
nhụy có 1 ơ; bầu nhẵn. Quả nang, hình trứng thn, thắt lại ở đầu, nằm gọn trong
đài. Mùa hoa quả: tháng 5-9 [28].



4

1. Cây mang hoa
2. Lá
3. Hoa
4. Lá đài
5. Đài hoa
6. Quả

Hình 1.1. Đặc điểm hình thái của Nhân trần tía

(1)

(2)

Hình 1.2. Cây mang hoa (1) và hoa tƣơi (2) của Nhân trần tía.

1

2
Hình 1.3. Thân (1) và hoa (2) Nhân trần tía phơi khơ.


5

1.1.1.3. Phân bố sinh thái
Trong số 3 loài thuộc chi Adenosma R. Br. đƣợc sử dụng làm thuốc ở Việt Nam,
lồi Nhân trần tía có phạm vi phân bố hạn chế, chỉ phát hiện thấy ở vài tỉnh phía
Nam, nhƣ Tây Ninh, Bình Dƣơng, Vũng Tàu, đảo Phú Quốc và Cơn Đảo.
Có tài liệu cịn ghi nhận ở Kon Tum, Đắc Lắc. Cây cũng phân bố khá phổ biến ở

Lào và Campuchia [28].
Nhân trần tía chỉ gặp vào thời gian từ giữa mùa mƣa đến đầu mùa khô hằng năm.
Cây ƣa sáng, ƣa ẩm và có thể chịu đƣợc khơ hạn sau khi đã ra hoa, kết quả.
Cây thƣờng mọc thành đám có khi tới hàng ngàn mét vng trên những bãi đất
bằng dƣới chân đồi, trong thung lũng hay những đám ruộng cao mới bỏ hoang.
Nơi mọc của Nhân trần tía thƣờng là đất cát pha và hơi chua. Ở những nơi đất bị
rửa trôi mạnh, nghèo dinh dƣỡng, cây chỉ cao khơng q 15 cm đã thấy có hoa quả.
Sau khi quả già, toàn cây tàn lụi. So với các loài Bồ bồ và Nhân trần (mọc ở các
tỉnh phía Bắc), Nhân trần tía có vịng đời ngắn hơn, chỉ tồn tại 3,5 – 4 tháng và
mức độ khai thác, sử dụng cũng ít hơn [28].
Bộ phận dùng: thân, cành mang lá và hoa đã phơi hay sấy khơ của cây Nhân trần tía
(Herba Adenosmatis bracteosi).
Chế biến: thu hái khi cây đang ra hoa, phơi hoặc sấy ở 40 - 50oC đến khơ. Dƣợc liệu
có mùi thơm nồng, vị cay mát và hơi đắng [4].
1.1.2. Thành phần hóa học
1.1.2.1. Tinh dầu
Lê Tùng Châu, E. Hetelyi và cộng sự khảo sát Nhân trần tía khi cây đang ra hoa
(tháng 11, 12) ở Tây Ninh thì thấy có 0,6% tinh dầu. Tinh dầu màu vàng nhạt,
mùi cay nồng, thoảng mùi ascaridol. Ba thành phần chính trong tinh dầu đƣợc
xác định là: carvacrol (27%), carvacrol methyl ester (28%), β-bisabolen (30,4%).
Trong đó, carvacrol là chất có tác dụng diệt khuẩn đứng hàng đầu trong những hợp
chất tinh dầu [8].
Năm 2005, Lê Thị Minh Thảo đã xác định đƣợc các thành phần trong tinh dầu
Nhân trần tía là γ-terpinen, caryophyllen, humulen, carvacrol methyl ester,


6

carvacrol, β-bisabolen. Hơn nữa, dựa vào phƣơng pháp định tính điểm chỉ bằng GC
và HPLC có thể phân biệt đƣợc nguồn gốc Nhân trần tía trong lồi [21].

Năm 2013, đã phân lập và xác định cấu trúc carvacrol trong tinh dầu Nhân trần tía.
Xác định hàm lƣợng carvacrol trong tinh dầu bằng HPLC, trong đó carvacrol chiếm
hàm lƣợng lớn trong tinh dầu Nhân trần tía khoảng 26% [27].
OH

β-bisabolen

Carvacrol

Humulen

OH

O

γ-terpinen

Carvacrol methyl ester

Thymol

Hình 1.4. Cơng thức hóa học một số hợp chất chính trong tinh dầu Nhân trần tía.
1.1.2.2. Flavonoid
Năm 1999, Nguyễn Minh Đức và cộng sự đã phân lập đƣợc một hợp chất flavonoid
từ Nhân trần tía đƣợc xác định là scutellarein-6-O-glycosid. Đây là quá trình
phân lập và xác định scutellarein-6-O-glycosid từ Adenosma bracteosum Bonati
đầu tiên tại Việt Nam [14].
Ngoài ra, một số flavonoid từ Nhân trần tía đã đƣợc xác định cấu trúc:
HOOC
O

HO

O

OH

O
HO

HO
OH

O

OH
O

O

O

OH

OH

HO

O

OH


O
COOH

Biflavon với cấu trúc Isoscutellarein 8-O-β-D-glucuropyranosid [23]


7

HOOC

OH

O

HO
HO

O

O

OH
HO
OH

O

Scutellarin [12]
R1

OH
4''

5''

1''
3''

O

3'

OH O

R2 2''

OH 7

4'

2'

OH

1

8

O


5'

2
6'

6

4

3

5

OH

O

Hợp chất hóa học

R1

R2

4′, 5, 7-trihydroxy flavon-8-O-glucuronid-6′′-methyl ester [26]

COOCH3

OH

Isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid 3′′-methyl ether [1]


CH2OH

OCH3

Isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid [10]

COOH

OH

Isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid [11]

CH2OH

OH

3'

R1
H3CO

8
7

4'

2'
1


O

2

5'
6'

H3CO

6

OH

4

R3

3

5

R2

O

Hợp chất hóa học

R1

R2


R3

8, 4′-dihydroxy-6, 7, 3′-trimethoxy-flavon [15]

OH

H

OCH3

Cirsilinenol [19]

H

OH

OCH3

5,4′-dihydroxy-6,7,8,3′-tetramethoxy flavon [11]

OCH3

OH

OCH3

5,4′-dihydroxy-6,7,8,-trimethoxy flavon [11]

OCH3


OH

H

Hình 1.5. Cơng thức hóa học một số flavonoid trong Nhân trần tía
1.1.2.3. Các thành phần khác
Ngồi thành phần chính là tinh dầu và flavonoid, Nhân trần tía cịn có một số nhóm
hợp chất khác là: bracteosid A, bracteosid B và bracteosid C [14].


8

Năm 2013, đã phân lập đƣợc 2 hợp chất từ Nhân trần tía là stigmasterol và
acid betulinic [25]; sitosterol-3-O-β-D glucopyranosid [19].
29

24
23
20

19

22

18
20

29
28

1

30

25

21

25

17

11

26

26

22
OH

17

27

13

28

9


1

2

14

8

11

19
13

15

9
5

3

O

7

27

HO

3

5

23

24

(1)

HO

22

21

(2)

27

24

20
18
12
H

4'
HO
HO

9

2

O

3'
2'
H

11

19

6'
5' H

1

1'

3
O

5

4

13
14

6


7

25
26

16
15

8

10
H

H

H

H

17

23

H

(3)

Hình 1.6. Cơng thức hóa học của stigmasterol (1) và acid betulinic (2) và
(3) sitosterol-3-O-β-D glucopyranosid.

Ngoài ra, trong Nhân trần tía cịn có các hợp chất phenol nhƣ piceol [10], acid kojic
[17], (2,4'-hydroxybenzyl)-5-hydroxy-6-methylhydroxypyran-4-on [17],
acid p-hydroxybenzoic [12], polyphenol, coumarin và saponin.
O

CH3

O

OH
O
OH

OH
O
OH

Piceol

OH

Acid p-hydroxybenzoic

Acid kojic
OH

O
OH
OH


CH2

OH
O

(2,4'-hydroxybenzyl)-5-hydroxy-6-methylhydroxypyran-4-on

Hình 1.7. Cơng thức hóa học của một số hợp chất phenol trong Nhân trần tía.


9

1.1.3. Tác dụng sinh học
1.1.3.1. Tính chống oxy hóa [16]
Năm 2010, nghiên cứu sàng lọc hoạt tính chống oxy hố của 56 lồi dƣợc liệu đƣợc
thực hiện. Hoạt tính chống oxy hóa in vitro đƣợc đánh giá bằng các phƣơng pháp:
FRAP, đo MDA, sàng lọc khả năng loại gốc tự do DPPH và xác định khả năng
ức chế enzym xanthin oxidase. Kết quả hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các loại
cao chiết Adenosma bracteosum theo từng phƣơng pháp đánh giá đƣợc thể hiện ở
bảng 1.1.
Bảng 1. Kết quả hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các loại cao chiết
Phương pháp

Cao diclorometan

Cao MeOH

Cao nước

FRAP (μmol Fe2+/L)


555 ± 5

4333 ± 33

3019 ± 71

MDA (%)

12,89 ± 0,78

80,86 ± 2,06

17,19 ± 3,85

DPPH (%)

26,7 ± 1,42

90,62 ± 0,85

36,93 ± 0,69

Enzym xanthin oxidase (%)

2,35

70,14

26,57


So sánh với các dƣợc liệu khác thì Adenosma bracteosum có các trị số rất cao ở cả
bốn phƣơng pháp thử nghiệm. Tác giả kết luận cao chiết Adenosma bracteosum có
hoạt tính chống oxy hóa rất mạnh so với 56 loài dƣợc liệu nghiên cứu.
1.1.3.2. Tác dụng tăng tiết mật và bảo vệ gan
Công thức phối hợp cao Diệp hạ châu (100 mg), cao Nhân trần tía (80 mg),
cao Rau má (40 mg) và cao Nghệ (30 mg) ở liều 0,5 - 1 g/kg đã đƣợc chứng minh
ức chế sự tăng hàm lƣợng MDA ở các mô tế bào gan bị tổn thƣơng mà cịn có
tác dụng làm giảm sự tăng hoạt độ các transaminase GOT và GPT trong
tổn thƣơng gan do CCl4. Thí nghiệm trên chuột lang thấy dịch chiết Nhân trần tía
làm tăng tiết mật 24,7% so với lô đối chứng [9],[13].
1.1.3.3. Tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm
Carvacrol trong tinh dầu Nhân trần tía đã đƣợc chứng minh có tác dụng
kháng khuẩn mạnh [9].


10

1.1.3.4. Thử lâm sàng chữa viêm gan do virus
Bệnh viện Chợ Quán thành phố Hồ Chí Minh đã dùng Nhân trần tía chữa hơn 4000
trƣờng hợp bị viêm gan do virus và cho kết quả tốt [29].
1.1.3.5. Thử lâm sàng xơ gan cổ trướng
Bệnh viện Y học Dân tộc tỉnh Tây Ninh đã dùng Nhân trần tía chữa gần
100 bệnh nhân, kết quả khỏi bệnh chiếm 24%, có tiến triển khá và tốt 46,6% [29].
1.1.3.6. Độc tính
Tồn cây Nhân trần tía chặt nhỏ phơi khơ, chiết cồn 40%, rồi cơ cách thủy đến
dịch đậm đặc. Cho chuột nhắt trắng uống với liều tính ra dƣợc liệu khơ là 300 g/kg,
chuột khơng chết [29].
1.1.375. Cơng dụng
Tồn cây Nhân trần tía bỏ rễ chữa viêm gan, vàng da, ăn uống kém tiêu, sốt,

cảm cúm. Protecliv, sản phẩm đƣợc bào chế từ 50% cao Nhân trần tía và 50%
tảo Spirulina có tác dụng chống nhiễm độc gan do tác dụng phụ của rifampicin và
các dẫn xuất rifampicin ở bệnh nhân phải điều trị lao bằng các loại thuốc đó [18].
1.2. TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID
Flavonoid là một nhóm lớn của các hợp chất phenol thực vật có cấu trúc cơ bản là
diphenylpropan (C6 - C3 - C6), đƣợc phân loại thành 3 nhóm chính, dựa vào cấu trúc
của mạch 3C và dạng của dị vòng, gồm: dẫn xuất chƣa no (flavon, flavonol,
flavanon, và flavanonol), dẫn xuất no (catechin and antocyanidin) và flavonoid với
vòng 3C mở (chalcon) hay vịng furan (auron). Cho đến nay, có khoảng 9.000 chất
đã đƣợc xác định cấu trúc. Trong đó, các flavon, flavonol, và flavanon là phong phú
nhất trong thực vật [31], [40].
H
O

O

O

O

O

OH

flavon

flavonol

O


flavanon

Hình 1.8. Cấu trúc ba khung cơ bản của flavonoid trong thiên nhiên


11

Các dẫn xuất flavonoid có nhiều tác dụng sinh học nổi bật nhƣ khả năng bắt các gốc
tự do nhƣ HO•, ROO•. Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và
khi sinh ra cạnh ADN, các chất béo màng tế bào,… sẽ gây ra những nguy hại nhƣ
hủy hoại tế bào, gây ung thƣ và tăng nhanh sự lão hóa. Flavonoid tạo đƣợc phức với
các ion kim loại mà các ion này chính là xúc tác nhiều phản ứng oxy hóa.
Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong q trình hoạt động của enzym
oxy hóa khử. Flavonoid còn ức chế tác động của hialuronidase, enzym làm tăng tính
thấm của mao mạch. Khi thừa enzym này thì gây ra bệnh xuất huyết dƣới da. Nhiều
dƣợc phẩm chứa flavonoid chiết từ dƣợc liệu đã đƣợc chứng minh có tác dụng làm
bền thành mạch, giảm tính “giịn” và tính thấm của mao mạch.
Tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm tổn thƣơng gan, bảo vệ
chức năng gan khi một số chất độc đƣợc đƣa vào cơ thể súc vật thí nghiệm.
Ngồi ra, flavonoid cịn có tác dụng chống loét, chống viêm, tác dụng trên hệ
tuần hoàn (tăng biên độ co bóp, thể tích tim, tăng tuần hồn não), hệ thần kinh
(an thần), một số tài liệu gần đây cịn chỉ ra flavonoid có khả năng chống ung thƣ,
HIV [2].
Các flavonoid có khả năng hấp thụ tia UV, phổ UV-Vis của chúng rất đặc trƣng.
Hai dải hấp thụ chính là: dải I (300–380 nm) do sự hấp thụ của vòng A và dải II
(240–280 nm) do sự hấp thụ của vịng B. Vị trí của các bƣớc sóng hấp thu cung cấp
thông tin về dạng flavonoid và các nhóm thế gắn trên vịng, do đó, phổ UV – Vis là
phƣơng pháp chính đƣợc sử dụng để phát hiện và định lƣợng flavonoid trong nhiều
thập kỷ [40].
1.2.1. Isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid (AD6) [10]

 Dạng bột vơ định hình, màu vàng sáng.
 Công thức phân tử: C21H17O12. Phân tử lƣợng: 461,36.
 Điểm chảy 222,9 C.
 Dễ tan trong MeOH, aceton, H2O; ít tan trong EtOAc và không tan trong
CHCl3, benzen và các dung môi kém phân cực khác.
 Phổ UV - Vis cho 2 đỉnh hấp thu tại 330 nm và 273 nm.


12

OH
O
HO
HO

O
HO

O

OH

HO

O

OH

O


(b)

(a)

Hình 1.9. Cơng thức cấu tạo (a) và phổ UV (b) của isoscutellarein 8-O-β-glucuropyranosid

1.2.2. Isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid (AD4) [11]
 Dạng bột vơ định hình, màu vàng;
 Cơng thức phân tử: C21H19O11. Phân tử lƣợng: 447,37.
 Dễ tan trong MeOH, DMSO; không tan trong CHCl3.
 Phổ UV - Vis cho 2 đỉnh hấp thu cực đại tại 328 nm và 273 nm.
A
OH
O

HO
HO
HO

O

HO

OH
O

OH

O


(a)

(b)

Hình 1.10. Công thức cấu tạo (a) và phổ UV (b) của isoscutellarein 8-O-β-glucopyranosid

1.3. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO [4], [5]
1.3.1. Khái niệm và cấu tạo máy HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) là
phƣơng pháp trong đó pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ dòng
nhất định. Pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng
tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã
đƣợc biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.


13

Q trình sắc ký xảy ra có thể theo các cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay
rây phân tử.
Thông thƣờng một hệ thống HPLC bao gồm một hệ thống bơm, bộ phận tiêm mẫu,
cột sắc ký, đầu dò và một hệ thống thu dữ liệu. Pha động đƣợc cung cấp từ một vài
bình chứa và chảy qua cột, sau đó chạy qua đầu dị.
Chất phân tích sau khi đƣợc rửa giải ra khỏi cột sẽ đƣợc phát hiện bởi đầu dò.
Việc lựa chọn đầu dò để sử dụng phải dựa trên tính chất lý hóa của chất cần đƣợc
phân tích nhƣ: khả năng hấp phụ UV-Vis, huỳnh quang,… Đầu dị PDA là đầu dị
thơng dụng nhất trong HPLC. Đầu dò PDA cung cấp phổ UV-Vis của các chất phân
tích trong các bƣớc sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và định danh
đƣợc sản phẩm bằng cách so sánh phổ của pic sắc ký với phổ của một ngân hàng
dữ liệu hoặc với phổ của một chất chuẩn.


Hình 1.11. Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.2. Các thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký
Thời gian lưu (tR) và thể tích lưu:
Thời gian lƣu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến thời điểm
chất đó đƣợc phát hiện ở nồng độ cực đại (Cmax). Trong cùng một điều kiện sắc ký
đã chọn, thời gian lƣu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian
lƣu khác nhau tùy thuộc vào bản chất, cấu tạo và tính chất của chất đó. Vì vậy,
thời gian lƣu là đại lƣợng định tính các chất.