BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN DƯ QUỲNH NHƯ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI EVODIAMINE VÀ RUTAECARPINE
TRONG QUẢ NGƠ THÙ DU (EVODIAE FRUCTUS)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC

CẦN THƠ – 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN DƯ QUỲNH NHƯ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI EVODIAMINE VÀ RUTAECARPINE
TRONG QUẢ NGƠ THÙ DU (EVODIAE FRUCTUS)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN

Cần Thơ – 2014


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cô Ts. Nguyễn Thị Ngọc Vân,
liên bộ môn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, trường Đại học Y dược
Cần Thơ, người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho em những kiến thức quý báu
cũng như chia sẻ và quan tâm tận tình để em có thể hồn thành tốt luận văn này.
Em cũng xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy, cơ tại liên bộ mơn
Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất, thầy ThS. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ,
cô ThS. Dương Thị Trúc Ly, cơ Nguyễn Thị Bích Thủy, cô Nguyễn Thị Tường Vi,
thầy Lữ Thiện Phúc, cô Nguyễn Thị Đặng đã luôn động viên và tạo mọi điều kiện
thuận lợi để em thực hiện tốt đề tài.
Em xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy, cô tại bộ môn Dược liệu, đặc biệt là
cô ThS. Nguyễn Ngọc Quỳnh đã tạo điều kiện giúp em thực hiện luận văn tốt nghiệp.
Xin chân thành cảm ơn đến các anh, chị lớp Dược khóa 34 và các bạn làm luận văn
lớp Dược khóa 35, đặc biệt là các bạn cùng làm luận văn tại liên bộ mơn
Hóa phân tích – Kiểm nghiệm – Độc chất đã quan tâm và giúp đỡ mình trong quá
trình thực hiện đề tài.
Con xin gửi đến cha, mẹ và gia đình lịng biết ơn sâu sắc vì đã ln quan tâm
và là chỗ dựa tinh thần lớn nhất cho con.


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan những kết quả trong luận văn này là trung thực, hồn tồn
của riêng tơi và chưa từng được cơng bố trong bất kì nghiên cứu nào.
Cần Thơ, ngày 24 tháng 6 năm 2014
Sinh viên


Nguyễn Dư Quỳnh Như


MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC ................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ..................................................................vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1. Thực vật học về cây Ngô thù du ................................................................................ 3
1.1.1. Tên khoa học và vị trí phân loại .................................................................3
1.1.2. Đặc điểm hình thái cây Ngơ thù du ............................................................3
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến .................................................................4
1.2. Tổng quan về quả Ngơ thù du .................................................................................... 4
1.2.1. Đặc điểm hình thái ......................................................................................4
1.2.2. Đặc điểm vi phẫu ........................................................................................5
1.2.3. Thành phần hóa học ....................................................................................7
1.2.4. Tác dụng dược lý ........................................................................................7
1.3. Tổng quan về hai alkaloid trong phạm vi nghiên cứu của đề tài ........................... 8
1.3.1. Evodiamine .................................................................................................8
1.3.2. Rutaecarpine ...............................................................................................9
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .................................................. 10
1.4.1. Khái niệm về HPLC .................................................................................10
1.4.2. Các thơng số đặc trưng của q trình sắc ký ............................................10

1.5. Các phương pháp chiết xuất dược liệu .................................................................... 13
1.5.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất ........................................13
1.5.2. Các phương pháp hòa tan chiết xuất ........................................................15
1.5.3. Một số phương pháp chiết xuất dùng trong các nghiên cứu trên đối tượng
quả Ngô thù du ...................................................................................................17
1.6. Một số nghiên cứu có liên quan đến quả Ngơ thù du ........................................... 18


Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 20
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................ 20
2.2. Dung môi – hóa chất.................................................................................................. 20
2.3. Trang thiết bị .............................................................................................................. 20
2.4. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 21
2.4.1. Kiểm tra mẫu dược liệu ............................................................................21
2.4.2. Khảo sát các điều kiện để định lượng đồng thời evodiamine và rutaecarpine
bằng phương pháp HPLC ...................................................................................21
2.4.3. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất evodiamine và rutaecarpine từ quả Ngơ thù
du ........................................................................................................................22
2.4.4. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời evodiamine và rutaecarpine
bằng phương pháp HPLC ...................................................................................27
2.5. Ứng dụng quy trình định lượng đã thẩm định để định lượng một vài mẫu thu mua
trên thị trường .................................................................................................................... 31
Chương 3 - KẾT QUẢ ............................................................................................ 33
3.1. Kiểm tra mẫu dược liệu Ngô thù du ........................................................................ 33
3.2. Khảo sát các điều kiện để định lượng đồng thời evodiamine và rutaecarpine bằng
phương pháp HPLC .......................................................................................................... 34
3.3. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất evodiamine và rutaecarpine từ quả Ngô thù du
............................................................................................................................................. 37

3.3.1. Quy trình chiết xuất evodiamine và rutaecarpine từ quả Ngơ thù du bằng

phương pháp chiết hồi lưu (PP 1) .......................................................................37
3.3.2. Quy trình chiết xuất evodiamine và rutaecarpine từ quả Ngơ thù du bằng
phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm (PP 2) ......................................................41
3.3.3. Đánh giá hiệu quả chiết evodiamine và rutaecarpine từ quả Ngô thù du giữa
phương pháp chiết hồi lưu và phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm .................45
3.4. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời evodiamine và rutaecarpine bằng
phương pháp HPLC .......................................................................................................... 48
3.4.1. Tính tương thích hệ thống ........................................................................48
3.4.2. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời evodiamine và rutaecarpine .50
3.5. Ứng dụng quy trình định lượng đã thẩm định để định lượng một vài mẫu thu mua
trên thị trường .................................................................................................................... 56
Chương 4 - BÀN LUẬN.......................................................................................... 58
4.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ......................................................................................... 58
4.2. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất evodiamine và rutaecarpine từ quả Ngô thù du
............................................................................................................................................. 59


4.2.1. Quy trình chiết xuất evodiamine và rutaecarpine từ quả Ngô thù du bằng
phương pháp chiết hồi lưu ..................................................................................60
4.2.2. Quy trình chiết xuất evodiamine và rutaecarpine từ quả Ngơ thù du bằng
phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm..................................................................61
4.2.3. Đánh giá hiệu quả chiết evodiamine và rutaecarpine từ quả Ngô thù du giữa
phương pháp chiết hồi lưu và phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm .................61
4.3. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời evodiamine và rutaecarpine bằng
phương pháp HPLC .......................................................................................................... 62
4.3.1.Tính tương thích hệ thống .........................................................................62
4.3.2. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời evodiamine và rutaecarpine
bằng phương pháp HPLC ...................................................................................63
4.4. Ứng dụng quy trình định lượng đã thẩm định để định lượng một vài mẫu thu mua
trên thị trường .................................................................................................................... 65

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 67
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 68
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Chữ tắt,

STT

ký hiệu

1

ACN

2

AOAC

3

Chữ nguyên

Ý nghĩa

Acetonitrile

Dung mơi acetonitril


Association of Official

Hiệp hội hóa học phân tích

Analytical Chemists

quốc tế

As

Asymmetry

Hệ số bất đối

4

DCM

Dichloromethan

Dung môi dicloromethan

5

DĐVN IV

Dược điển Việt Nam IV

6


HPLC

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography
International conference

Hiệp hội đồng thuận

harmonisation

quốc tế

7

ICH

8

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

9


LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lượng

10

MeOH

Methanol

Dung mơi methanol

11

PDA

Photo Diode Array

Đầu dị dãy diod quang

12

PP

Phương pháp

13


Rs

Resolution

14

SKĐ

Sắc ký đồ

15

tR

Retention time

16

tt

Thể tích

Độ phân giải

Thời gian lưu của pic


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Một số phương pháp chiết xuất dùng trong các nghiên cứu trên đối tượng

quả Ngô thù du ..........................................................................................................17
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu liên quan đến quả Ngô thù du ....................................18
Bảng 2.1. Danh mục dung mơi và hóa chất đã sử dụng ............................................20
Bảng 2.2. Các điều kiện pha động được khảo sát .....................................................22
Bảng 2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết hồi lưu ...................................23
Bảng 2.4. Khảo sát dung môi chiết cho PP 1 ............................................................24
Bảng 2.5. Khảo sát thời gian chiết cho PP 1 .............................................................24
Bảng 2.6. Khảo sát thể tích dung mơi chiết cho PP 1 ...............................................24
Bảng 2.7. Khảo sát số lần chiết cho PP 1 ..................................................................25
Bảng 2.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết có hỗ trợ siêu âm ...................25
Bảng 2.9. Khảo sát dung môi chiết cho PP 2 ............................................................26
Bảng 2.10. Khảo sát thời gian chiết cho PP 2 ...........................................................26
Bảng 2.11. Khảo sát thể tích dung mơi chiết cho PP 2 .............................................26
Bảng 2.12. Khảo sát số lần chiết cho PP 2 ................................................................27
Bảng 2.13. Khảo sát tính tuyến tính và miền giá giá trị của evodiamine và rutaecarpine
...................................................................................................................................29
Bảng 2.14. Một số mẫu dược liệu Ngô thù du được mua tại thành phố Cần Thơ ....31
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát 9 điều kiện sắc ký..........................................................34
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát dung môi chiết cho PP 1 ...............................................37
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát thời gian chiết cho PP 1 ................................................37
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thể tích dung mơi chiết cho PP 1 ..................................38
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát số lần chiết cho PP 1 .....................................................38
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát dung môi chiết cho PP 2 ...............................................41
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát thời gian chiết cho PP 2 ................................................41
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát thể tích dung mơi chiết cho PP 2 ..................................42
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát số lần chiết cho PP 2 .....................................................42
Bảng 3.10. Hàm lượng evodiamine từ phương pháp chiết hồi lưu (PP 1) và phương
pháp chiết xuất có hỗ trợ siêu âm (PP 2) ..................................................................45
Bảng 3.11. Hàm lượng rutaecarpine từ phương pháp chiết hồi lưu (PP 1) và phương
pháp chiết có hỗ trợ siêu âm (PP 2) ..........................................................................46



Bảng 3.12. Kết quả so sánh phương sai giữa PP 1 và PP 2 ......................................46
Bảng 3.13. Kết quả so sánh hàm lượng trung bình evodiamine giữa PP1 và PP2 ...47
Bảng 3.14. Kết quả so sánh hàm lượng trung bình rutaecarpine giữa PP1 và PP2 ..47
Bảng 3.15. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên mẫu hỗn hợp chuẩn ....48
Bảng 3.16. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên mẫu thử ......................49
Bảng 3.17. Kết quả khảo sát tính tuyến tính, LOD, LOQ .........................................52
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ chính xác trong ngày (n=6) ....................................53
Bảng 3.19. Kết quả khảo sát độ chính xác liên ngày (n=3) ......................................54
Bảng 3.20. Kết quả khảo sát độ đúng của evodiamine ............................................55
Bảng 3.21. Khảo sát độ đúng của rutaecarpine .........................................................56
Bảng 3.22. Hàm lượng evodiamine và rutaecarpine trong 5 mẫu dược liệu Ngô thù
du được mua tại thành phố Cần Thơ .........................................................................56


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
Trang
Hình 1.1. Cây Ngơ thù du ...........................................................................................4
Hình 1.2. Quả Ngơ thù du khơ ....................................................................................4
Hình 1.3. Bột quả Ngơ thù du dưới kính hiển vi .........................................................6
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học (a) và phổ UV (b) của evodiamine .................................9
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học (a) và phổ UV (b) của rutaecarpine ..............................10
Hình 3.1. Quả Ngơ thù du .........................................................................................33
Hình 3.2. Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học ................................................33
Hình 3.3. Mẫu bột dược liệu Ngơ thù du dưới kính hiển vi quang học ....................33
Hình 3.4. Chồng các SKĐ mẫu thử ở điều kiện (1), (2), (3).....................................35
Hình 3.5. Chồng các SKĐ mẫu thử ở điều kiện (4), (5), (6).....................................35
Hình 3.6. Chồng các SKĐ mẫu thử ở điều kiện (7), (8), (9).....................................36
Hình 3.7. SKĐ mẫu hỗn hợp chuẩn và mẫu thử ở điều kiện sắc ký tối ưu ...............36

Hình 3.8. Biểu đồ kết quả tối ưu hóa quy trình chiết bằng phương pháp chiết hồi lưu
...................................................................................................................................39
Hình 3.9. Sơ đồ quy trình chiết mẫu bằng phương pháp chiết hồi lưu .....................40
Hình 3.10. Biểu đồ kết quả tối ưu hóa quy trình chiết bằng phương pháp chiết có hỗ
trợ siêu âm .................................................................................................................43
Hình 3.11. Sơ đồ quy trình chiết mẫu bằng phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm ...44
Hình 3.12. SKĐ mẫu thử khi chiết bằng phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm với quy
trình chiết tối ưu ........................................................................................................45
Hình 3.13. Chồng các SKĐ tính tương thích hệ thống trên mẫu hỗn hợp chuẩn .....49
Hình 3.14. Chồng các SKĐ tính tương thích hệ thống trên mẫu thử ........................50
Hình 3.15. Chồng các SKĐ mẫu dung môi pha mẫu (1), mẫu pha động (2), mẫu hỗn
hợp chuẩn (3), mẫu thử (4), mẫu thử thêm chuẩn (5) ...............................................50
Hình 3.16. SKĐ kết quả độ tinh khiết pic của mẫu thử và phổ 3 chiều của mẫu thử 51
Hình 3.17. Kết quả kiểm tra độ tương đồng về phổ UV giữa chuẩn và thử của
evodiamine (1) và rutaecarpine (2) ...........................................................................51
Hình 3.18. Đồ thị tính tuyến tính của evodiamine ....................................................52
Hình 3.19. Đồ thị tính tuyến tính của rutaecarpine ...................................................53
Hình 3.20. Chồng SKĐ các mẫu thử khảo sát độ chính xác trong ngày...................54
Hình 3.21. Chồng SKĐ của 5 mẫu dược liệu Ngô thù du mua tại thành phố Cần Thơ
...................................................................................................................................57


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Ngơ thù du có tên khoa học là Evodia rutaecarpa họ Cam (Rutaceae),
là một trong những dược liệu quý của y học cổ truyền, dùng trong những bệnh viêm
nhiễm, sốt nóng, đau bụng,… Ngơ thù du có nguồn gốc ở vùng Đông Nam Trung
Quốc (Quảng Tây, Hồ Nam, Vân Nam, Sơn Tây, Triết Giang), Nhật Bản và Ấn Độ.
Ở nước ta, cây mọc nhiều ở tỉnh Hà Giang, người dân thường gọi là cây Xà lạp hay
cây Ngơ thù [1],[9],[19].
Trên thế giới đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như

tác dụng sinh học của các hợp chất có trong cây Ngô thù du. Dựa theo những tài liệu
tham khảo, nhận thấy rằng quả của cây Ngơ thù du có nhiều hoạt tính sinh học đáng
quan tâm như tính kháng viêm, chống huyết khối, tác dụng giãn mạch, hạ huyết áp,…
Đặc biệt là tác dụng diệt tế bào ung thư, có hiệu quả trong các trường hợp ung thư vú,
ung thư cổ tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư bạch cầu,…Các nghiên cứu cho
thấy rằng, hai hợp chất chủ yếu có tác dụng dược lý kể trên là evodiamine và
rutaecarpine cũng chính là hai alkaloid có hàm lượng cao trong quả Ngô thù du.
Đồng thời, tiêu chuẩn chất lượng của dược liệu Ngô thù du trong Dược điển Trung
Quốc 2005 là dựa trên hàm lượng hai alkaloid này [21],[22],[29],[34],[40].
Tại Việt Nam, hiện nay việc nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính
sinh học ngày càng được chú trọng và đẩy mạnh. Tuy nhiên, số lượng những
nghiên cứu trên quả Ngơ thù du cịn khá hạn chế. “Nghiên cứu thành phần hóa học
có cấu trúc alkaloid từ cây Ngô thù du Việt Nam” của trường Đại học Duy Tân là
sự công bố đầu tiên về cấu trúc chi tiết của các hợp chất quan trọng trong quả
Ngô thù du Việt Nam [7]. Bên cạnh đó, tiêu chuẩn chất lượng quy định trong
Dược điển Việt Nam IV cho dược liệu Ngô thù du là dựa vào hàm lượng tinh dầu
có trong quả, điều này chưa thuận lợi cho việc đánh giá chất lượng dược liệu [4].
Do đó, việc xây dựng quy trình định lượng evodiamine và rutaecarpine trong quả
Ngơ thù du sẽ là một đóng góp có ý nghĩa lớn cho dữ liệu khoa học về Ngô thù du,


cũng như giúp nâng cao hiệu quả sử dụng nguồn dược liệu này trong chăm sóc
sức khỏe nhân dân. Dựa vào những thực tế như trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
EVODIAMINE

VÀ

RUTAECARPINE


TRONG

QUẢ

NGÔ

THÙ

DU

BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC”
Với những mục tiêu cụ thể như sau:
1. Tối ưu hóa quy trình chiết xuất evodiamine và rutaecarpine từ quả Ngô thù du.
2. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời hai alkaloid trên.
3. Ứng dụng quy trình đã thẩm định để định lượng một số mẫu dược liệu
Ngô thù du thu mua trên thị trường thành phố Cần Thơ.
Ý nghĩa khoa học: kết quả của đề tài sẽ là một kênh tham khảo dữ liệu giúp bổ sung
vào chuyên luận dược liệu cho Dược điển Việt Nam V.
Ý nghĩa thực tiễn:
1. Đề tài thành công sẽ giúp đánh giá và so sánh chất lượng nguồn dược liệu của
Việt Nam với dược liệu ngoại nhập, từ đó có thể phát triển hơn nguồn dược liệu
trong nước.
2. Là cơ sở tham khảo về mặt pháp lý cho việc kiểm định chất lượng
nguồn nguyên liệu nhằm đảm bảo chất lượng thuốc, chế phẩm từ Ngô thù du
đến tay người tiêu dùng hiệu quả, an tồn, góp phần nâng cao cơng tác chăm sóc
sức khỏe nhân dân.


Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Thực vật học về cây Ngô thù du

1.1.1. Tên khoa học và vị trí phân loại
-

Cây Ngơ thù du có tên khoa học là Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth., họ Cam
(Rutaceae) [1],[9].

-

Theo Dược điển Trung Quốc 2005, Ngơ thù du có tên khoa học là Evodia
rutaecarpa (Juss.) Benth., Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth. var. officinalis
(Dode) Huang, Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth. var. bodinieri (Dode) Huang,
họ Cam (Rutaceae) [34].

-

Vị trí phân loại [5]:
Giới Plantae

Ngành Magnoliophyta
Lớp Magnoliopsida
Phân lớp Rosidae
Bộ Rutales
Họ Rutaceae

Chi Evodia

Lồi Rutaecarpa
1.1.2. Đặc điểm hình thái cây Ngô thù du
Cây cao chừng 2,5 – 5m. Cành màu nâu hay tím nâu, khi cịn non có lơng mềm dài,
khi già lơng rụng đi, trên mặt cành có nhiều bì khổng. Lá mọc đối, kép lơng chim lẻ,



có từ 2 – 5 đơi lá chét có cuống ngắn, phiến lá chét ngun, có lơng mịn màu nâu
ở cả hai mặt, mặt dưới nhiều hơn. Hoa đơn tính khác gốc tập hợp thành tán hay chùm.
Hoa màu vàng trắng, hoa cái lớn hơn hoa đực. Mùa hoa vào tháng 6 – 8, mùa quả
vào tháng 9 – 10 [1],[9].
1.1.3. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến
Bộ phận dùng là quả (Fructus Evodiae), được thu hái vào tháng 8 đến tháng 11,
khi quả chưa nứt. Cắt cành có quả phơi nắng hay sấy cho khô ở nhiệt độ thấp
40 – 50oC, loại bỏ cành, lá, cuống quả và các tạp chất khác [1],[4].

Hình 1.1. Cây Ngơ thù du

Hình 1.2. Quả Ngô thù du khô

1.2. Tổng quan về quả Ngô thù du
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Quả hình cầu hoặc hình cầu dẹt, đường kính 0,2 – 0,5cm. Khi chưa chín có màu xanh,
khi chín có màu tím đỏ, trên mặt có nhiều điểm tinh dầu. Đỉnh quả có kẻ nứt
hình sao 5 cánh, chia quả thành 5 mảnh. Gốc quả cịn sót lại cuống phủ lơng tơ vàng.
Chất cứng, giịn. Mặt cắt ngang quả thấy rõ 5 ô, mỗi ô chứa 1 hạt đến 2 hạt màu
vàng nhạt đến màu đen bóng. Mùi thơm ngát, vị cay, đắng [4],[9].


1.2.2. Đặc điểm vi phẫu
Bột quả có màu nâu, lơng che chở đa bào gồm 2 đến 6 tế bào, đường kính 140µm đến
350µm. Một số khoang tế bào chứa các chất màu vàng nâu đến đỏ nâu. Lông tiết có
đầu hình bầu dục gồm 7 đến 14 tế bào, chân có 2 đến 5 tế bào và thường chứa
chất tiết màu vàng. Cụm tinh thể calci oxalat hình cầu gai hoặc hình lăng trụ,
đường kính 10µm đến 25µm. Tế bào mơ cứng có thành dày và có ống trao đổi rõ

thành từng cụm lớn hoặc rời rạc, đường kính 35µm đến 70µm. Mảnh mơ mềm có
chứa tinh thể calci oxalat hình cầu gai hoặc hình lăng trụ. Tinh bột, khối màu,
mạch vạch. Đơi khi cịn thấy các mảnh vỡ màu vàng của các khoang dầu [4],[32].


Hình 1.3. Bột quả Ngơ thù du dưới kính hiển vi:
Lông che chở đa bào chứa chất tiết (1), Lông che chở đa bào khơng có chất tiết (2),
Lơng tiết (3), Tinh thể canxioxalat hình cầu gai (4), (5), Tinh thể canxioxalat hình
lăng trụ (6), (7), Tế bào mơ cứng (8), Mảnh vỡ màu vàng của các khoang dầu (9)


1.2.3. Thành phần hóa học
Quả chứa tinh dầu, acid carboxylic, limonoid, flavonoid và nhiều alkaloid. Tùy thuộc
vào điều kiện thổ nhưỡng mà hàm lượng các thành phần hóa học sẽ khác nhau.
Hiện nay, các thành phần có cấu trúc alkaloid là đối tượng nghiên cứu được quan tâm
nhiều trên loại dược liệu này [9],[14],[30],[42].
Thành phần tinh dầu chủ yếu là các dẫn chất của monoterpen như: myrcene, βphellandrene, limonene, α-terpineol, linalool, β-elemene, trans-caryophyllene,…[19]
Quả Ngơ thù du có hai nhóm alkaloid là indolopyridoquinazoline và quinolone.
Một

số

indoloquinazoline

dihydrorutaecarpine,

alkaloid

7-carboxyevodiamine,


như:

evodiamine,

rutaecarpine,

dehydroevodiamine,

14-formyl-

dihydrorutaecarpine và rhetisinine,… Một số quinolone alkaloid như: evocarpine,
dihydroevocarpine, 1-methyl-2-pentadecyl-4(1H)-quinolone, 1-methyl-2-undecyl4(1H)-quinolone, 1-methyl-2-dodecyl-4(1H)-quinolone, 1-methyl-2-nonyl-4(1H)quinolone,… [14],[19],[31].
Một số limonoid như: evodol (limonin diosphenol), evodin, evodinon (rutaevine),
obacunone, jangomolide, graucin A, 12α-hydroxylimonin, 12-α-hydroxyevodol,
6α-acetoxy-5-epilimonin và 6-β-acetoxy-5-epilimonin,…[19].
Quả Ngơ thù du cịn chứa các flavonoid như: evodioside B và epimedoside C [14].
1.2.4. Tác dụng dược lý
Ngô thù du là một dược liệu được sử dụng khá rộng rãi trong y học cổ truyền đặc biệt
là y học cổ truyền Trung Quốc. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học nói chung
và y học nói riêng, rất nhiều tác dụng dược lý mới của quả Ngơ thù du đã được
tìm ra, hứa hẹn rằng đây sẽ là một nguồn nguyên liệu làm thuốc quý giá.
Trong đơng y, Ngơ thù du là vị thuốc có vị cay, đắng, mùi hăng, tính ơn, hơi có độc,
vào 4 kinh can, thận, tì, vị và được sử dụng với các công dụng như: chữa ăn uống
không tiêu, nôn mửa, đau bụng, tiêu chảy. Ngồi ra cịn dùng trong trường hợp cơ thể
tê đau, chân tay yếu, đau đầu, đau răng, miệng lưỡi lở ngứa, cảm lạnh…, dùng ở dạng
bột hoặc dạng sắc [1],[9].


Trong nhiều năm trở lại đây, các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Ngô thù du đã
đi sâu hơn vào việc nghiên cứu trên các hoạt chất cụ thể, đơi khi kết hợp với việc định

tính, định lượng và phân lập các chất. Quả Ngơ thù du có khả năng ức chế virus H1N1
mà trong đó evodiamine và rutaecarpine đóng vài trị là các tác nhân chính,
có tiềm năng ứng dụng để điều trị các bệnh viêm nhiễm có liên quan đến virus cúm
[13]. Rutaecarpine có khả năng ức chế kết tập tiểu cầu, chống huyết khối, làm tăng
co bóp cơ tử cung, tác dụng giãn mạch, hạ huyết áp, chống lại tình trạng thiếu
oxy máu và giúp cải thiện chức năng tim [24],[29]. Evodiamine có hoạt tính
kháng viêm, tác dụng chống béo phì, làm tăng co bóp cơ tim, tăng nhịp tim, có
khả năng chống thiếu máu cục bộ cơ tim và được sử dụng như một chất chống xơ vữa
động mạch. Đặc biệt, evodiamine có khả năng diệt tế bào ung thư, có tác dụng
đối với ung thư phổi, ung thư cổ tử cung, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư vú, ung thư
đại tràng,…[21],[22],[38],[40]. Theo nghiên cứu của Yeo Jiyoung vào năm 2011
[37], sự kết hợp của Ngô thù du và các vị thuốc đông y khác như nhân sâm, sắn dây,
củ mài, địa hoàng, bạch đậu khấu và chỉ thực có thể làm giảm lượng đường huyết
đối với đái tháo đường tuýp 2 trên mơ hình tế bào và mơ hình động vật tiểu đường.
Báo cáo từ một nghiên cứu vào năm 2007 cho thấy rằng, một số alkaloid có cấu trúc
quinolone trong quả Ngơ thù du có khả năng ức chế chọn lọc men MAO-B
(monoaminoxydase B) phụ thuộc liều. Với tác dụng dược lý này, các quinolone
alkaloid có thể được ứng dụng để điều trị các bệnh như Alzheimer và Parkinson [18].
1.3. Tổng quan về hai alkaloid trong phạm vi nghiên cứu của đề tài
Evodiamine và rutaecarpine thuộc nhóm alkaloid có cấu trúc Indoloquinazoline.
1.3.1. Evodiamine [16],[19],[44],[45]
Ở nhiệt độ thường là chất rắn màu trắng đến hơi vàng.
Công thức phân tử: C19H17N3O.
Phân tử lượng: 303,36.
Khối lượng riêng: 1,39 g/cm3.
Nhiệt độ sôi: 575,07oC ở 760mmHg.
Nhiệt độ nóng chảy: 278oC.


Tính tan: DMSO (5mg/ml, ở 40°C), tan được trong cloroform, diclorometan, aceton,

ethyl acetat, ít tan trong nước, methanol và ethanol (< 1mg/ml, ở 25oC).
Evodiamine có đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 225,3nm.

(a)

(b)

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học (a) và phổ UV (b) của evodiamine

1.3.2. Rutaecarpine [15],[19],[44],[45]
Chất rắn màu trắng ở nhiệt độ thường.
Công thức phân tử: C18H13N3O.
Phân tử lượng: 287,32.
Khối lượng riêng: 1,45g/cm3.
Nhiệt độ sôi: 550oC ở 760mmHg.
Nhiệt độ nóng chảy: 260oC.
Tính tan: DMSO (18mg/ml, ở 25oC), tan được trong cloroform, benzen, diethylether,
ít tan trong nước và ethanol (< 1mg/ml, ở 25°C).
Rutaecarpine có hai đỉnh hấp thu ở bước sóng 212,6nm và 341,7nm.


(a)

(b)

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học (a) và phổ UV (b) của rutaecarpine

1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [4],[6],[8]
1.4.1. Khái niệm về HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) là

kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột được nhồi đầy bằng các hạt có kích thước
< 10µm. Do vậy, phải dùng một bơm có áp suất cao khoảng 300atm để đẩy pha động
qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh một lượng
mẫu nhỏ cỡ 20µg.
Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ dòng nhất định.
Pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc
một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng
liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ.
Q trình sắc ký xảy ra có thể theo các cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay
rây phân tử.
1.4.2. Các thơng số đặc trưng của q trình sắc ký
-

Thời gian lưu (tR) và thể tích lưu:
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến thời
điểm chất đó được phát hiện ở nồng độ cực đại (Cmax). Trong cùng một điều
kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác


nhau thì thời gian lưu khác nhau tùy thuộc vào bản chất, cấu tạo và tính chất
của chất đó. Vì vậy, thời gian lưu là đại lượng định tính các chất.
Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ khơng đổi thì thời gian lưu có thể
thay thế bằng thể tích lưu. Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau cột
trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu.
-

Hệ số phân bố K:
Là tỷ lệ giữa nồng độ chất tan trong pha tĩnh (CS) và trong pha động (CM) tại
thời điểm cân bằng.


K

CS
CM

(1)

Ái lực tương đối của một chất với hai pha sẽ lượng giá hệ số K. Đối với một
chất, nếu K càng lớn thì chất đó phân bố nhiều vào pha tĩnh và sẽ di chuyển
chậm, nếu K nhỏ thì nó sẽ di chuyển nhanh.
-

Hệ số dung lượng k’(Capacity factor):
Là một đại lượng được dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất, còn được
gọi là hệ số phân bố khối giữa hai pha.

k' 

CSVS
CM VM

(2.1)

Hoặc

k'

t R t M
tM


(2.2)

trong đó: VS, VM lần lượt là thể tích pha tĩnh và thể tích pha động.
k’ phụ thuộc bản chất 2 pha, bản chất chất phân tích, nhiệt độ và đặc điểm cột
(phụ thuộc vào tỉ lệ VS/VM). Với một chất, k’ càng lớn thì tốc độ di chuyển
càng thấp. Để tách một hỗn hợp các chất, người ta thường chọn cột, pha động,
các điều kiện phân tích khác sao cho k’ của chất phân tích nằm trong khoảng
từ 1 – 8. Nếu k’ > 8 thì thời gian phân tích q dài, k’ < 1 thì pic sẽ xuất hiện
sớm, dễ lẫn với pic tạp và pic dung môi.
-

Hệ số chọn lọc α (Selectivity factor):
Là đại lượng đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B.


K B k ' B t R , B  t0 t ' R , A



K A k ' A t R , A  t0 t ' R , B



(3)

Theo quy ước thì B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên α luôn lớn hơn 1.
α càng lớn thì khả năng phân tách của hai chất càng rõ, thường dùng α trong
khoảng từ 1,05 đến 2,0 là tối ưu, α q lớn thì thời gian phân tích sẽ kéo dài.
-


Độ phân giải Rs (Resolution):
Độ phân giải là đại lượng đặc trưng cho mức độ tách của hai chất trên một cột
sắc ký. Độ phân giải giữa 2 pic A, B cạnh nhau được tính theo cơng thức sau:

Rs 

2(t R,B  t R, A )
N    1  k 'B 




WB  WA
4    k 'B 1 

(4)

với: WA, WB là độ rộng đáy pic A, B.
tR,A, tR,B là thời gian lưu của pic A, B.
N là số đĩa lý thuyết
Trong thực tế nếu các pic cân đối thì độ phân giải để 2 pic tách tối thiểu là
R=1,0. Trong phép định lượng R = 1,5 là phù hợp. Nếu R nhỏ thì các pic chưa
tách hẳn vì vậy khi tính diện tích pic sẽ khơng chính xác.
-

Hệ số bất đối AS (Asymmetry factor):

AS 

BC

AC

trong đó: BC là nửa chiều rộng phía sau pic được đo ở 1/10 chiều cao pic,
AC là nửa chiều rộng phía trước pic được đo ở 1/10 chiều cao pic.

(5)


Hệ số bất đối dùng để đánh giá mức độ cân đối của pic, thông thường yêu cầu
AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,2.
-

Số đĩa lý thuyết N (Theoretical plates):
Là đại lượng biểu thị hiệu lực của cột sắc ký trong điều kiện sắc ký nhất định.
Có thể tính số đĩa lý thuyết N theo các công thức sau:
2
2

𝑡𝑅
𝑡𝑅
𝑁 = 16 ( ) = 5,54 ( )
𝑊
𝑊1

(6.1)

2

ℎ𝑜ặ𝑐
trong đó:


ℎ 2
ℎ 2
𝑁 = 2𝜋 (𝑡𝑅 . ) = 6,28 (𝑡𝑅 . )
𝐴
𝐴

(6.2)

h: chiều cao pic,
A: diện tích của pic.

Số đĩa lý thuyết càng lớn, hiệu lực cột càng cao (đỉnh nhọn, hẹp). Trị số N tối
ưu của N gần bằng số đĩa lý thuyết tối đa (Nmax).
Nmax = 4000L/dp

(7)

trong đó: L là chiều dài cột (cm),
dp là đường kính tiểu phân (µm).
1.5. Các phương pháp chiết xuất dược liệu
Quá trình chiết các chất từ các tổ chức sống (các tế bào động vật, thực vật và vi sinh
vật), các chất tan nằm bên trong tế bào, cách biệt với bên ngoài bởi vách tế bào, vì
thế, các chất tan sau khi hịa tan thành dung dịch còn phải vượt qua vách tế bào để đi
vào dịch chiết. Do đó, q trình chiết các chất tan từ tổ chức sinh học thường được
gọi là q trình chiết xuất. Dung mơi chứa chất tan thu được gọi là dịch chiết, phần
dược liệu sau khi chiết lấy dịch gọi là bã. Tùy theo cơ chế và đặc điểm của quá trình
chiết mà người ta phân ra chiết lỏng – lỏng hay chiết rắn – lỏng [2],[3].
1.5.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất [2],[3],[10]
1.5.1.1. Yếu tố dược liệu:

Cấu trúc dược liệu: Bề dày của vách tế bào, đường kính của ống trao đổi là hai yếu
tố quan trọng nhất, nguyên liệu là gỗ thì quá trình chiết xuất sẽ chậm hơn nguyên liệu
là lá hay cánh hoa.


Mức độ chia nhỏ dược liệu: Mức độ và cách phân chia dược liệu phải phù hợp với
loại dược liệu, phương pháp chiết và dung môi sử dụng. Dược liệu càng được chia
nhỏ thì q trình hịa tan, khuếch tán và thẩm thấu xảy ra nhanh hơn, rút ngắn thời
gian chiết. Tuy nhiên càng chia nhỏ dược liệu, tính chọn lọc của quá trình càng giảm,
dịch chiết càng phức tạp hơn.
1.5.1.2. Yếu tố dung mơi
Khả năng hịa tan của dung mơi: Khả năng hịa tan các chất trong các dung môi là
khác nhau và phụ thuộc nhiều vào bản chất của chất tan và của dung mơi, khả năng
hịa tan càng lớn thì quá trình chiết xuất càng nhanh và càng có hiệu quả hơn. Có thể
dự đốn khả năng hòa tan một chất dựa vào độ phân cực của dung mơi, dung mơi
phân cực hịa tan tốt các chất phân cực, dung mơi kém phân cực hịa tan tốt các chất
kém phân cực.
Độ nhớt của dung môi: Độ nhớt của dung môi càng thấp, khả năng thấm vào tế bào,
sự khuếch tán của chất tan vào dung môi xảy ra càng dễ dàng, quá trình chiết xảy ra
càng mạnh.
Sự thấm của dung môi vào vách tế bào: Vách tế bào là một màng thân nước. Ở trạng
thái tươi, vách tế bào ngăn cản không cho dung môi kém phân cực, dung mơi ít tan
trong nước thấm vào tế bào hay tiếp xúc với chất tan làm quá trình chiết với các dung
mơi này khó khăn hơn. Ở các tế bào khô, lớp nước ngăn cách này đã mất đi nên quá
trình chiết sẽ dễ dàng hơn.
1.5.1.3. Yếu tố kỹ thuật chiết xuất
Sự chênh lệch nồng độ: Chênh lệch nồng độ càng lớn thì tốc độ của quá trình khuếch
tán càng lớn. Việc tăng lượng dung môi hay sử dụng phương pháp ngấm kiệt làm
tăng sự chênh lệch nồng độ này nên quá trình chiết xuất xảy ra nhanh hơn.
Sự khuấy trộn: Sự khuấy trộn làm tăng quá trình cân bằng nồng độ của dịch chiết bên

ngoài các tiểu phân dược liệu, giảm nồng độ của lợp dịch chiết ngay sát tiểu phân
dược liệu làm cho quá trình chiết xuất xảy ra nhanh hơn.