BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

PHẠM THỊ MỸ LỆ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ĐỒNG THỜI METFORMIN VÀ SITAGLIPTIN
TRONG VIÊN NÉN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. NGUYỄN THỊ NGỌC VÂN

Cần Thơ - 2014


i

LỜI CẢM ƠN
Em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô TS. Nguyễn Thị Ngọc Vân, người đã
tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, định
hướng giải quyết những vấn đề mà em gặp phải trong suốt quá trình làm đề tài tốt
nghiệp.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Ths. Nguyễn Ngọc Nhã Thảo đã tận tình
chỉ bảo, hỗ trợ và động viên em trong suốt thời gian làm đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Ths. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, cô Ths.
Dương Thị Trúc Ly, cơ Ths. Nguyễn Thị Bích Thủy, cơ Ds. Nguyễn Thị Tường Vi

và thầy Ds. Lữ Thiện Phúc đã ln động viên, tận tình chia sẻ kinh nghiệm q báu
và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đề tài tốt nghiệp.
Em cũng không quên gửi lời cảm ơn đến cô Nguyễn Thị Đặng, cô Trần Thị Thanh
Thúy đã luôn động viên tinh thần và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề
tài tại Liên bộ mơn Hóa phân tích - Kiểm nghiệm - Độc chất.
Mình xin chân thành cảm ơn các bạn lớp Dược khóa 35, các em lớp Dược khóa 36
đã quan tâm, chia sẻ những khó khăn và giúp đỡ để mình hoàn thành đề tài tốt
nghiệp.
Con xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn động viên con vượt qua
những khó khăn trong suốt thời gian làm đề tài.


ii

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận văn này được đảm bảo tính trung thực và chưa từng được ai cơng bố
trong bất kì cơng trình nghiên cứu khác.

Cần Thơ, tháng 06 năm 2014

Phạm Thị Mỹ Lệ


iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................ii

MỤC LỤC ................................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT......................................... vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ................................................... ix
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................. 3
1.1. METFORMIN HYDROCLORID .................................................................... 3
1.1.1. Đại cương ..................................................................................................... 3
1.1.2. Tính chất lý hóa ............................................................................................. 3
1.1.3. Tính chất dược lý ........................................................................................... 3
1.1.4. Một số phương pháp định lượng metformin hydroclorid.............................. 4
1.2. SITAGLIPTIN PHOSPHAT MONOHYDRAT ............................................. 7
1.2.1. Đại cương ...................................................................................................... 7
1.2.2. Tính chất lý hóa ............................................................................................. 8
1.2.3. Tính chất dược lý ........................................................................................... 8
1.2.4. Một số phương pháp định lượng sitagliptin phosphat monohydrat ............. 9
1.3. CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
METFORMIN VÀ SITAGLIPTIN ....................................................................... 10
1.4. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ................................................ 12
1.4.1. Khái niệm .................................................................................................... 12
1.4.2. Các yêu cầu thẩm định qui trình phân tích định lượng ............................... 12
CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 16
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 16
2.1.1. Chế phẩm Janumet® .................................................................................... 16


iv

2.1.2. Chất chuẩn làm việc .................................................................................... 16
2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................................................. 16

2.3. HĨA CHẤT - DUNG MƠI - TRANG THIẾT BỊ ......................................... 16
2.3.1. Hóa chất - dung mơi .................................................................................... 16
2.3.2. Trang thiết bị ............................................................................................... 17
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 18
2.4.1. Xử lý mẫu .................................................................................................... 18
2.4.2. Thăm dò điều kiện sắc ký tối ưu ................................................................. 18
2.4.3. Xác định tính tương thích hệ thống của quy trình định lượng .................... 20
2.4.4. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời metformin và sitagliptin ......... 21
2.4.5. Áp dụng quy trình định lượng đồng thời metformin và sitagliptin với chế
phẩm trên thị trường .............................................................................................. 25
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ ........................................................................................ 27
3.1. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ TỐI ƯU ................................................. 27
3.1.1. Bước sóng phát hiện .................................................................................... 27
3.1.2. Pha động ...................................................................................................... 27
3.2. XÁC ĐỊNH TÍNH TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG ....................................... 29
3.2.1. Xác định tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn ................................... 29
3.2.2. Xác định tính tương thích hệ thống trên mẫu thử ....................................... 29
3.3. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
METFORMIN VÀ SITAGLIPTIN ....................................................................... 31
3.3.1. Tính đặc hiệu ............................................................................................... 31
3.3.2. Tính tuyến tính ............................................................................................ 35
3.3.3. Độ chính xác ................................................................................................ 37
3.3.4. Độ đúng ....................................................................................................... 40
3.4. ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN
VÀ SITAGLIPTIN VỚI CHẾ PHẤM TRÊN THỊ TRƯỜNG ........................... 42
CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN ..................................................................................... 43
4.1. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ TỐI ƯU ................................................. 43


v


4.1.1. Bước sóng phát hiện .................................................................................... 43
4.1.2. Pha động ...................................................................................................... 44
4.2. TÍNH TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG ............................................................ 46
4.3. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
METFORMIN VÀ SITAGLIPTIN ....................................................................... 47
4.3.1. Tính đặc hiệu ............................................................................................... 47
4.3.2. Tính tuyến tính ............................................................................................ 48
4.3.3. Độ chính xác ................................................................................................ 49
4.3.4. Độ đúng ....................................................................................................... 49
4.3 ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI METFORMIN
VÀ SITAGLIPTIN VỚI CHẾ PHẤM TRÊN THỊ TRƯỜNG ........................... 50
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 51
KIỂN NGHỊ ............................................................................................................. 52
PHỤ LỤC


vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Từ ngun

Nghĩa Tiếng Việt

̅
𝐗

Giá trị trung bình


µ

Khoảng tin cậy

ACN

Acetonitril

As

Asymmetry factor

Hệ số bất đối

DAD

Diode array detector

Đầu dò dãy diod quang

DPP

Dipeptidyl peptidase

Men dipeptidyl peptidase
Giới hạn tin cậy

e
HPLC


High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography
k'

Capacity factor

Hệ số dung lượng

N

Theoretical plates

Số đĩa lý thuyết

MeOH

Methanol

MET

Metformin hydroclorid

Pic

Peak


Đỉnh trên sắc ký đồ

R2

Coefficient of Correlation

Hệ số tương quan

RP

Reversed phase

Pha đảo

Rs

Resolution factor

Hệ số phân giải

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

S

Area


Diện tích đỉnh

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

SKĐ

Sắc ký đồ

Sắc ký đồ

SIT

Sitagliptin

tR

Retention time

tt/tt

Thể tích / thể tích

TEA

Triethylamin


UV-Vis

Ultraviolet-visible
spectrophotometry

Thời gian lưu

Quang phổ tử ngoại khả kiến


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phương pháp định lượng metformin trong viên nén theo tiêu chuẩn
của một số Dược điển .................................................................................................. 4
Bảng 1.2. Các nghiên cứu định lượng metformin bằng phương pháp HPLC ............ 5
Bảng 1.3. Các nghiên cứu định lượng sitagliptin bằng phương pháp HPLC. ............ 9
Bảng 1.4. Tóm tắt các điều kiện sắc ký định lượng đồng thời metformin và
sitagliptin bằng phương pháp HPLC ......................................................................... 11
Bảng 2.1. Độ tinh khiết chất chuẩn làm việc ............................................................ 16
Bảng 2.2. Các hóa chất và dung mơi được sử dụng ................................................. 17
Bảng 2.3. Các trang thiết bị được sử dụng ............................................................... 17
Bảng 2.4. Các điều kiện pha động được khảo sát ..................................................... 20
Bảng 2.5. Nồng độ các dung dịch xây dựng đường chuẩn ....................................... 22
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên metformin và
sitagliptin trong mẫu chuẩn ....................................................................................... 29
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên metformin và
sitagliptin trong mẫu thử ........................................................................................... 29
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ tinh khiết của pic ..................................................... 32
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ tương đồng giữa phổ thử và phổ chuẩn ................... 33

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh của
metformin và sitagliptin trong mẫu chuẩn ................................................................ 35
Bảng 3.6. Tính tương thích, ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy ...... 36
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại định lượng metformin trong mẫu thử ........... 37
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ lặp lại định lượng sitagliptin trong mẫu thử ............ 37
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian định lượng metformin ............ 38
trong mẫu thử ............................................................................................................ 38
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian định lượng sitagliptin........... 38
trong mẫu thử ............................................................................................................ 38


viii

Bảng 3.11. Kết quả thử độ đúng phương pháp định lượng metformin và
sitagliptin ................................................................................................................... 41
Bảng 3.12. Kết quả xác định hàm lượng metformin và sitagliptin .......................... 42
trong chế phẩm trên thị trường .................................................................................. 42
Bảng 4.1. Giới hạn hàm lượng hoạt chất trong viên nén theo quy định ................... 50
của Dược điển Việt Nam IV ..................................................................................... 50
Bảng 4.2. Kết quả đánh giá hàm lượng metformin và sitagliptin............................. 50
trong chế phẩm Janumet®.......................................................................................... 50


ix

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của metformin hydroclorid ............................................. 3
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của sitagliptin phosphat monohydrat ............................. 7
Hình 3.1. Hình ảnh chồng phổ UV-Vis của metformin và sitagliptin ..................... 27
Hình 3.2. SKĐ ở các điều kiện pha động (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) và (8) ......... 28

Hình 3.3. SKĐ phổ 3 chiều của mẫu chuẩn ở điều kiện sắc ký tối ưu. .................... 29
Hình 3.4. SKĐ tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn ....................................... 30
Hình 3.5. SKĐ tính tương thích hệ thống trên mẫu thử. .......................................... 30
Hình 3.6. SKĐ mẫu pha động, mẫu trắng B1, mẫu chuẩn, ...................................... 31
mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn. .................................................................................. 31
Hình 3.7. SKĐ mẫu thử, mẫu trắng B2, mẫu thử phân hủy trong NaOH 0,1N
sau 36 giờ, mẫu trắng B3, mẫu thử phân hủy trong HCl 0,1N sau 36 giờ ................ 32
Hình 3.8. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của pic metformin trong mẫu thử ............ 33
Hình 3.9. Kết quả kiểm tra độ tinh khiết của pic sitagliptin trong mẫu thử ............. 33
Hình 3.10. Kết quả thử độ tương đồng giữa phổ UV-Vis metformin chuẩn và
phổ UV-Vis metformin trong mẫu thử...................................................................... 34
Hình 3.11. Kết quả thử độ tương đồng giữa phổ UV-Vis sitagliptin chuẩn và
phổ UV-Vis sitagliptin trong mẫu thử ...................................................................... 34
Hình 3.12. Đồ thị tuyến tính của metformin trong hỗn hợp chuẩn .......................... 35
Hình 3.13. Đồ thị tuyến tính của sitagliptin trong hỗn hợp chuẩn. .......................... 36
Hình 3.14. SKĐ tính tuyến tính metformin và sitagliptin trong hỗn hợp
chuẩn. ........................................................................................................................ 36
Hình 3.15. SKĐ khảo sát độ lặp lại, độ chính xác trung gian (ngày 1) của
phương pháp định lượng đồng thời metformin và sitagliptin ................................... 39
Hình 3.16. SKĐ khảo sát độ chính xác trung gian (ngày 2) của phương pháp
định lượng đồng thời metformin và sitagliptin ......................................................... 39
Hình 3.17. SKĐ khảo sát độ chính xác trung gian (ngày 3) của phương pháp
định lượng đồng thời metformin và sitagliptin ......................................................... 40
Hình 3.18. SKĐ độ đúng phương pháp định lượng đồng thời metformin và
sitagliptin trong chế phẩm. ........................................................................................ 41


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, đái tháo đường là bệnh rối loạn chuyển hoá do nhiều
nguyên nhân khác nhau gây nên, đặc trưng của bệnh là tăng đường huyết mạn tính
cùng với rối loạn chuyển hố carbonhydrat, lipid và protein do thiếu insulin có kèm
hoặc khơng kèm kháng insulin với các mức độ khác nhau. Hệ quả của tăng đường
máu mạn tính là tổn thương nhiều cơ quan như: mắt, thận, thần kinh [59].
Năm 2012, thống kê của Liên đoàn Đái tháo đường quốc tế cho thấy trên tồn thế
giới có hơn 371 triệu người mắc bệnh đái tháo đường. Trong đó, tỷ lệ mắc tại các
nước có thu nhập trung bình và thấp là 8,6% (chiếm 79,5% các trường hợp mắc
bệnh đái tháo đường trên thế giới), trong khi các nước có thu nhập cao là thấp hơn
với tỷ lệ là 7,9% [34].
Năm 2011, Bộ Y tế ban hành hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo đường tuýp
2, theo đó metformin là thuốc được chỉ định đầu tay, đặc biệt trên những bệnh nhân
có thể trạng béo phì hay thừa cân [5]. Những năm gần đây, một số nhóm thuốc mới
như thuốc ức chế men dipeptidyl peptidase - 4 (DPP 4). Trong nhóm này, sitagliptin
được đưa vào sử dụng vào đầu năm 2007, hiệu quả trị liệu được khẳng định qua rất
nhiều nghiên cứu và trên lâm sàng. Sitagliptin được sử dụng ở dạng đơn trị hoặc
phối hợp với metformin. Hiệu quả kiểm sốt đường huyết khi phối hợp hai thuốc
này duy trì đến hơn 52 tuần, kèm với mức giảm trị số HbA1c có ý nghĩa, giảm 2,1%
sau 24 tuần điều trị [15].
Hiện nay, chế phẩm chứa đồng thời metformin và sitagliptin đã ra đời và đang
chiếm lĩnh thị trường trên thế giới như Janumet® của cơng ty Merck Sharp and
Dohme BV. Chính vì sự kết hợp mới của sitagliptin và metformin trong điều trị nói
chung và trong một chế phẩm nói riêng nên chưa có một tiêu chuẩn định lượng
đồng thời hai hoạt chất metformin và sitagliptin trong Dược Điển Việt Nam IV và
các Dược điển của các nước trên thế giới như Dược Điển Châu Âu (EP), Dược Điển
Mỹ (USP), Dược Điển Anh (BP)… Trên thế giới, các phương pháp đã được sử
dụng để định lượng đồng thời hai hoạt chất trên như quang phổ tử ngoại khả kiến


2


[12], [42], [51] sắc ký lỏng hiệu năng cao [30], [38], [47], [48], [49], [50], [52],
[53], [54]; sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao [18] và điện di mao quản [41],… Tại Việt
Nam, chưa có đề tài nào nghiên cứu định lượng đồng thời metformin và sitagliptin
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Chính vì vậy chúng tơi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng đồng thời
metformin và sitagliptin trong viên nén bằng phương pháp HPLC”
Mục tiêu của đề tài
1. Khảo sát điều kiện định lượng đồng thời metfomin và sitagliptin bằng
phương pháp HPLC.
2. Đánh giá quy trình phân tích bao gồm xác định tính tương thích hệ thống và
thẩm định quy trình định lượng đồng thời metfomin và sitagliptin bằng
phương pháp HPLC.
3. Áp dụng quy trình đã thẩm định để định lượng chế phẩm chứa đồng thời
metfomin và sitagliptin trên thị trường.
Ý nghĩa khoa học
Góp phần xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho chế phẩm chứa đồng thời
metformin và sitagliptin trong điều kiện hiện có.
Đề tài sẽ đóng góp như một kênh tham khảo, giúp bổ sung vào chuyên luận định
lượng đồng thời các chất cho Dược điển Việt Nam.
Ý nghĩa thực tiễn
Quy trình định lượng sau khi nghiên cứu có thể áp dụng để định lượng đồng thời hai
chất metformin và sitagliptin phục vụ cho nghiên cứu cũng như kiểm tra chất lượng
của dược phẩm.


3

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. METFORMIN HYDROCLORID
1.1.1. Đại cương [4]
Metformin hydroclorid có cấu trúc hóa học như hình 1.1.
NH

N

NH

N
H

NH 2

. HCl

Metf ormin
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của metformin hydroclorid.
- Công thức phân tử: C4H11N5.HCl.
- Phân tử lượng: 165,63 g/mol.
- Tên chung quốc tế: metformin hydroclorid.
- Tên khoa học: 1,1-dimethyl biguanid hydroclorid.
- Loại thuốc: Thuốc chống đái tháo đường (uống).
1.1.2. Tính chất lý hóa
Tinh thể màu trắng, dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%, thực tế khơng tan
trong aceton và methylen clorid. Điểm chảy từ 222oC đến 226oC. pKa 12,4 [8].
1.1.3. Tính chất dược lý

1.1.3.1. Cơ chế tác dụng

Metformin (MET) là dẫn xuất biguanid thuộc nhóm thuốc làm tăng nhạy cảm của tế
bào với insulin. Cơ chế tác dụng chính là giảm sản xuất glucose ở gan, ức chế sự tân
tạo glucose, làm tăng sử dụng glucose ở mơ ngoại biên (cơ, mỡ), nên giảm đề kháng
insulin. Ngồi ra, MET cịn làm giảm triglycerid, cholesterol tồn phần, tăng nhẹ
HDL-c, thích hợp với người có thể trạng béo phì [1], [4].


4

1.1.3.2. Chỉ định
Đái tháo đường tuýp 2, nhất là bệnh nhân có thừa cân hoặc béo phì [6].
1.1.3.3. Chống chỉ định
Đái tháo đường tuýp 1, nhiễm toan ceton, thiếu oxy tổ chức ngoại biên, suy thận, rối
loạn chức năng gan, phụ nữ có thai và người có chế độ ăn giảm cân [6].
1.1.3.4. Tác dụng phụ
Các tác dụng phụ trên đường tiêu hóa như chán ăn, buồn nơn, nơn, đầy bụng, tiêu
chảy gặp ở 20% bệnh nhân.
Tác dụng phụ liên quan đến liều lượng, hay xảy ra khi bắt đầu điều trị và thường là
thống qua. MET khơng gây hạ glucose máu [6].
1.1.3.5. Liều dùng, cách dùng
Liều khởi đầu là 500 mg, ngày 2 lần, uống vào các bữa ăn sáng và tối. Mỗi tuần
tăng liều 1 lần, 500 mg cho một lần tăng liều, liều tối đa là 2500 mg/ngày. Liều cao
trên 2000 mg/ngày có thể chia làm 3 lần trong ngày, uống vào bữa ăn để dung nạp
thuốc tốt hơn [4].
1.1.4. Một số phương pháp định lượng metformin hydroclorid
1.1.4.1. Định lượng metformin hydroclorid trong viên nén theo tiêu chuẩn Dược
điển [3], [16], [55]
Phương pháp định lượng MET trong viên nén theo tiêu chuẩn Dược điển được tóm
tắt trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Phương pháp định lượng metformin trong viên nén theo tiêu chuẩn của

một số Dược điển
Phương pháp
Đo độ hấp thu của dung dịch mẫu thử tại bước sóng
Dược điển Việt Nam IV

cực đại 232 nm. Tính hàm lượng MET theo A (1%,
1 cm) là 789, dung môi là nước.

Dược điển Anh 2013

Tương tự như phương pháp của Dược điển Việt

(BP 2013)

Nam IV


5

Phương pháp
Phương pháp HPLC (trong chuyên luận viên nén
chứa MET phóng thích kéo dài):
- Cột C18 ( 3,9 mm × 30 cm, 10 µm).
- Pha động: ACN: đệm (tỷ lệ 1:9, có thể điều chỉnh

Dược điển Mỹ 2011
(USP 34)

đến 1:19), dung dịch đệm chứa natri heptansulfonat 0,5 g/l và natri clorid 0,5 g/l.
- Nhiệt độ cột: 30 C.

- Phát hiện: UV 218 nm.
- Tốc độ dòng : 1 ml/phút
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.

1.1.4.2. Các nghiên cứu liên quan về định lượng metformin hydroclorid
Trên thế giới, nhiều nghiên cứu đã ứng dụng các phương pháp khác nhau để định
lượng MET như sắc ký lỏng hiệu năng cao [10], [13], [24], [25], [36], [37], điện di
mao quản [31], [45],...
Các nghiên cứu định lượng MET bằng phương pháp HPLC được tóm tắt trong bảng
1.2.
Bảng 1.2. Các nghiên cứu định lượng metformin bằng phương pháp HPLC
Năm

Tác giả

Đối tượng
nghiên cứu

Điều kiện sắc ký

Tltk

- Cột Mubondapak C18

(150 x 4,6 mm, 4 µm).
- Pha động: hỗn hợp gồm 40%

A.
2003


Zarghi,

Huyết

ACN, natri dodecyl sulfat 0,01

Foroutan

tương

M, natri dihydrophosphat 0,01M,

SM

pH 5,1.
- Tốc độ dịng: 1,5 ml/phút.
- Bước sóng: 235 nm.

[13]


6

Năm

Tác giả

Đối tượng
nghiên cứu


Điều kiện sắc ký

Tltk

- Cột YMC CN

(50 x 2 mm, 3 µm).

Katja
2003

Heinig,

Huyết

Franz

tương

Bucheli

- Pha động: amonium acetat

10 mM và acid acetic 1% trong

[36]

hỗn hợp ACN: nước (80:20).
- Tốc độ dịng: 0,8 ml/phút.
- Đầu dị khối phổ.

- Cột Varian® pursuit C18

(100 ì 2 mm, 3 àm).

Marlice
2007

A.

Huyt

Spoli

tung

Marques

- Pha ng: hn hợp gồm nước:

ACN: acid formic

[37]

(55:45:0,048%)
- Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút.
- Đầu dị khối phổ.
- Cột VertiSep UPS CN

Phan
Quỳnh

2008

Lan,
Vũ Đình

(150 x 4,6 mm , 5 µm).
Huyết
tương

- Pha động: ACN:đệm phosphat

pH 6,0 (0,05 M) (70:30).

[10]

- Phát hiện: UV 234 nm.

Hòa

- Tốc độ dịng: 1ml/phút.
- Cột Nova-Pak silica

(150 x 3,9 mm, 4 µm).
2009

F. AlRimawi

Viên nén

- Pha động: đệm amonium


dihydrogenphosphat : MeOH
(21:79).
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

[24]


7

Năm

Tác giả

Đối tượng

2012

Stenger,
Luciana
Catia

Tltk

- Cột C18 Phenomenex ® Luna

Fernanda
Cristina

Điều kiện sắc ký


nghiên cứu

(250 mm x 4,6 mm, 5 µm).
Nguyên

- Pha động: 10 mM acid

liệu, viên

heptansulphonic (pH 3,0):

nén

ACN:MeOH (75:8:17).

[25]

- Tốc độ dòng: 1ml/phút.

Block

- Phát hiện: 210 nm.

1.2. SITAGLIPTIN PHOSPHAT MONOHYDRAT
1.2.1. Đại cương [40]
Sitagliptin phosphat monohydrat có cấu trúc hóa học như hình 1.2
F
F
H


NH2 O
N

N

N
F

.

H3PO4

.

H2O

N
CF3

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của sitagliptin phosphat monohydrat
- Công thức phân tử: C16H15F6N5O.H3PO4.H2O.
- Phân tử lượng: 523,32 g/mol.
- Tên chung quốc tế: sitagliptin.
- Tên khoa học: 7 - [(3R) - 3 - amino - 1 - oxo - 4 - (2, 4, 5 - trifluorophenyl) butyl]
- 5, 6, 7, 8 - tetrahydro - [3 -(trifluoromethyl) - 1, 2, 4 - triazolo [4, 3 - a] pyrazin
phosphat (1:1) monohydrat.
- Loại thuốc: thuốc chống đái tháo đường (uống), nhóm ức chế men DPP-4.



8

1.2.2. Tính chất lý hóa
Tinh thể trắng, tan trong nước và N,N-dimethyl formamid, tan ít trong MeOH và
tan rất ít trong ethanol, acetonitril, không tan trong isopropanol và isopropyl acetat.
Điểm chảy 215-217°C. pKa 7,7 [22], [23].
1.2.3. Tính chất dược lý
1.2.3.1. Cơ chế tác dụng [1]
Sitagliptin (SIT) thuộc nhóm thuốc ức chế enzym DPP-4 là enzym thủy phân
hormon increatin thành các chất bất hoạt. Cơ chế kiểm soát đường huyết của SIT
thông qua việc làm tăng lượng hormon increatin, bao gồm GLP-1 (glucagon - like
peptid - 1) và GIP (glucose - dependent insulinotropic polypeptid) do tế bào ống
tiêu hóa sản xuất. Vì vậy, đường huyết sau ăn được kiểm sốt tốt do:
- SIT làm tăng tổng hợp và bài tiết insulin từ tế bào β của tuyến tụy.
- Ức chế tế bào α tuyến tụy tiết glucagon.
Cả hai tác động trên đều phụ thuộc vào nồng độ glucose huyết tương. Vì thế, khác
với các nhóm thuốc khác, SIT khơng gây hạ đường huyết. Ở liều điều trị, SIT ức
chế một cách chọn lọc lên enzym DPP-4 mà không tác động đến một số enzym liên
quan như DPP-8 và DPP-9.
1.2.3.2. Chỉ định
Đái tháo đường tuýp 2, tăng đường huyết sau ăn [1], [6].
1.2.3.3. Chống chỉ định
Các trường hợp có tiền sử quá mẫn với SIT như sốc phản vệ, phù mạch [1].
1.2.3.4. Tác dụng phụ
Tác dụng phụ hiếm gặp như buồn nôn, đau đầu, đau bụng [39].
Tuy nhiên, cần thận trọng vì đã có những báo cáo về tình trạng viêm tụy cấp, xuất
huyết hoặc hoại tử tụy. Cần điều chỉnh liều đối với bệnh nhân suy giảm chức năng
thận [11], [39].
1.2.3.5. Liều dùng, cách dùng
100 mg/ngày, thời điểm dùng thuốc không phụ thuộc vào bữa ăn [39].



9

1.2.4. Một số phương pháp định lượng sitagliptin phosphat monohydrat
Cho đến nay, chưa có chuyên luận kiểm nghiệm SIT trong Dược Điển Việt Nam IV
và các Dược điển của các nước trên thế giới như Dược Điển Châu Âu (EP), Dược
Điển Mỹ (USP), Dược Điển Anh (BP),…Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu liên quan
đến định lượng SIT. Trong đó các phương pháp như sắc ký lỏng hiệu năng cao [17],
[43], [46], [57], [58]; quang phổ tử ngoại khả kiến [28], [44]; điện di mao quản [19]
đã được ứng dụng để định lượng SIT.
Các nghiên cứu định lượng SIT bằng phương pháp HPLC được tóm tắt trong bảng
1.3.
Bảng 1.3. Các nghiên cứu định lượng sitagliptin bằng phương pháp HPLC
Năm

Tác giả

Đối tượng
nghiên cứu

Điều kiện sắc ký

Tltk

- Cột Symmetry C18

(150 × 4,6 mm, 5 μm).
- Pha động: hỗn hợp acid


Ramakrishna
2008

Nirogi,
Vishwottam

Huyết tương

formic 0,03% - ACN
(30:70, tt/tt).

[43]

- Nhiệt độ cột: 30oC.

Kandikere

- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
- Đầu dò khối phổ.
- Cột Waters Atlantis HILIC

Silica (50 x 2,1 mm, 3 µm).
- Pha động: hỗn hợp ACN và

2010

Wei

Zeng,


Yang Xu

Huyết tương

nước (80/20, tt/tt) chứa 10
mM amonium acetat (pH
4,7).
- Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút.
- Đầu dò khối phổ.

[57]


10

Năm

Tác giả

Đối tượng

Điều kiện sắc ký

nghiên cứu

Tltk

- Cột Zorbax Eclipse XDB

C18 (150 ì 4,6 mm, 5àm)

- Pha ng: m KH2PO4

2013

R.Lavanya,

Nguyờn liệu

Md.Yunoos

và viên nén

0,01 M : MeOH (50:50,
tt/tt) điều chỉnh đến pH 2,5

[46]

bằng 0,2% acid
orthophosphoric.
- Tốc độ dòng 0,7 ml/phút.
- Phát hiện: 267 nm.
- Cột Hypersil BDS C18

(250 x 4,6 mm, 5µm).
- Pha động: đệm phosphat 10

2013

V.Deepthi,


Nguyên liệu

mM (pH 3,5) : ACN

Poornima.Y

và viên nén

(60:40).

[56]

- Phát hiện: UV 260 nm.
- Tốc độ dịng: 1,2 ml/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 20 µl.

1.3. CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
METFORMIN VÀ SITAGLIPTIN
Những năm gần đây, trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu định lượng
đồng thời MET và SIT. Các phương pháp chủ yếu được ứng dụng trong việc định
lượng đồng thời MET và SIT như quang phổ UV-Vis [12], [42], [51], sắc ký lỏng
hiệu năng cao [30], [38], [47], [48], [49], [50], [52], [53], [54]; sắc ký lớp mỏng
hiệu năng cao [18] và điện di mao quản [41],…
Các nghiên cứu định lượng đồng thời MET và SIT bằng phương pháp HPLC được
tóm tắt trong bảng 1.4.


11

Bảng 1.4. Tóm tắt các điều kiện sắc ký định lượng đồng thời metformin và

sitagliptin bằng phương pháp HPLC
Năm

Tác giả

Đối tượng
nghiên cứu

Điều kiện sắc ký

Tltk

- Cột Symmetry® Waters C18

Ramzia I.
2011

El-Bagary,
Ehab

(150 mm ì 4,6 mm, 5 àm).
Viờn nộn

F.Elkady

- Pha ng: m KH2PO4 pH 4,6:

ACN:MeOH (30:50:20).

[48]


- Phát hiện: UV 220 nm.
- Tốc dũng: 1ml/phỳt.
- Ct Xterra Symmetry C8

(100ì4,6 mm, 5 àm).
T. Raja
2012

A.Laksh-

- Pha động: hỗn hợp gồm MeOH:

Viên nén

mana Rao

ACN:đệm phosphat pH 8

[54]

(20:35:45).
- Phát hiện: UV 254 nm.
- Tốc độ dòng: 1ml/phút.
- Cột Phenomnex C18

Govinda-

(250 x 4,6 mm, 5 µm)


samy,
2012

Jeyabalan,

Viên nén

Narendra

- Pha động: đệm KH2PO4 0,02 M

pH 4,3: ACN (55:45).

[30]

- Bước sóng: UV 252 nm.

Nyola

- Tốc độ dịng: 1ml/phút.
- Cột Qualisil BDS C8

2013

Ramalinga
m Peraman

(250 mm x 4,6 mm, 5 µm).
Viên nén


- Pha động: hỗn hợp MeOH: nước

(45:55), chứa 0,2% acid n-heptansulfonic và 0,2% TEA; điều chỉnh

[47]


12

Năm

Tác giả

Đối tượng

Điều kiện sắc ký

nghiên cứu
đến

pH

3,0

bằng

Tltk
acid

orthophosphoric.

- Phát hiện: UV 267 nm.
- Tốc độ dòng: 1ml/phút.
- Cột Zodiac C18

(250 x 4,6 mm, 5 µm).

Sudheer
2014

Kumar

Viên nén

Sapavat

- Pha động: đệm KH2PO4 pH 5,8:

ACN (55:45).

[53]

- Phát hiện: UV 244 nm.
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.

1.4. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
1.4.1. Khái niệm
Thẩm định quy trình phân tích là một q trình tiến hành thiết lập bằng thực nghiệm
các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh rằng phương pháp đáp ứng
u cầu phân tích dự kiến [2].
Có rất nhiều tài liệu hướng dẫn về thẩm định quy trình của các tổ chức như: Hiệp

hội đồng thuận quốc tế, gọi tắt là ICH (International Conference on Harmonization),
Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ, gọi tắt là FDA (United State Food
and Drug Administration), Dược điển Mỹ (United State Pharmacopeia) và Hiệp hội
chính thức các nhà hóa phân tích, gọi tắt là AOAC (Association of Official Analytical
Chemists). Các chỉ tiêu thẩm định và tiêu chuẩn chấp nhận cho từng tiêu chí đó cịn

tùy thuộc vào loại quy trình phân tích.
1.4.2. Các u cầu thẩm định qui trình phân tích định lượng [2], [9], [26], [27],

[29], [33], [56], [60]
Theo hướng dẫn Q2 (R1) tháng 11 năm 2005 của ICH, các yêu cầu cần cho thẩm
định quy trình phân tích định lượng bao gồm:


13

- Tính đặc hiệu
- Tính tuyến tính và miền giá trị
- Độ chính xác
- Độ đúng
1.4.2.1. Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu của một quy trình phân tích là khả năng của quy trình cho phép
xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà khơng bị ảnh hưởng bởi sự có
mặt của chất khác có trong mẫu thử.
Tùy theo mục đích sử dụng của phương pháp, khi tiến hành thẩm định tính đặc hiệu
của phương pháp HPLC cần tiến hành sắc ký một số hoặc tất cả các loại mẫu sau
đây theo quy trình phân tích:
- Mẫu trắng: pha động, dung mơi hịa tan mẫu, pha lỗng mẫu (nếu có); mơi
trường hịa tan,…
- Mẫu nền (giả dược): tương tự như chế phẩm thuốc nhưng không chứa chất cần

phân tích. Mẫu giả dược có thể được bào chế tương tự như chế phẩm thuốc.
- Mẫu chuẩn: chứa chất chuẩn của chất cần phân tích. Chất chuẩn nên được kết
hợp với mẫu nền hoặc hòa tan trong mẫu trắng.
- Mẫu thử: chứa dược chất cần phân tích. Mẫu thử có nồng độ chất cần phân tích
tương đương với nồng độ trong mẫu chuẩn.
- Mẫu thử thêm chuẩn: thêm vào một lượng chất chuẩn của chất cần phân tích vào
mẫu thử.
- Mẫu chuẩn hoặc mẫu thử được thêm vào các thành phần như: tạp chất chuẩn,
chất phân hủy chuẩn hay các chất tồn dư trong quá trình chiết xuất tổng hợp, bào
chế, bảo quản và sử dụng.
- Mẫu chuẩn và/hoặc mẫu thử được xử lý lão hóa cấp tốc với các tác nhân như
nhiệt độ, tia tử ngoại, acid, kiềm và các chất oxy hóa.
Ngồi ra, tùy theo loại đầu dị được sử dụng trong phương pháp HPLC, tính đặc
hiệu cịn được thể hiện qua dữ liệu đặc trưng. Đối với đầu dò dãy diod quang
(DAD), dùng phổ tử ngoại - khả kiến và độ tinh khiết của pic thu được trong sắc ký


14

đồ mẫu thử để chứng minh tính đặc hiệu đối với hoạt chất cần phân tích của phương
pháp. Nếu pic thu được trong sắc ký đồ mẫu thử có độ tinh khiết xấp xỉ 100% và
phổ tử ngoại khả kiến của pic thu được trong sắc ký đồ mẫu thử giống với phổ tử
ngoại khả kiến của pic tương ứng trong sắc ký đồ mẫu chuẩn (hệ số trùng phổ xấp
xỉ 1,0) thì tính đặc hiệu đối với hoạt chất cần phân tích của phương pháp HPLC
càng được củng cố.
1.4.2.2. Tính tuyến tính và miền giá trị
Tính tuyến tính
Tính tuyến tính của một quy trình phân tích diễn tả kết quả phân tích thu được tỷ lệ
với nồng độ (trong khoảng nhất định) của chất phân tích trong mẫu thử. Xác định
tính tuyến tính của phương pháp HPLC bằng cách tiến hành sắc ký các mẫu chuẩn ở

các nồng độ khác nhau, tiến hành phân tích theo quy trình. Xây dựng phương trình
biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu đáp ứng pic
thu được trên sắc ký đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu.
Phương trình đường chuẩn tuân theo biểu thức y = ax + b. Đường chuẩn phải có ít
nhất 5 mức nồng độ khác nhau [33]. Nồng độ thấp nhất và cao nhất của đường
chuẩn phải bao phủ khoảng xác định của phương pháp. Hệ số tương quan của
phương trình 0,995 ≤ R2 ≤ 1 [56]. Trong trường hợp hệ số tương quan khơng đáp
ứng u cầu, phải có các giải thích phù hợp.
Miền giá trị (khoảng tuyến tính)
Miền giá trị là khoảng nồng độ thuộc đường chuẩn và đáp ứng các yêu cầu độ đúng,
độ chính xác của phương pháp phân tích, ở khoảng nồng độ này vẫn cịn sự phụ
thuộc tuyến tính giữa giá trị đo được và nồng độ. Với phương pháp HPLC dùng để
định lượng hoạt chất trong chế phẩm thuốc, miền giá trị tối thiểu phải tương ứng từ
80% đến 120% nồng độ hay hàm lượng ghi trên nhãn [33].
1.4.2.3. Độ chính xác
Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân
tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị RSD. Độ
chính xác bao gồm độ lặp lại, độ chính xác trung gian và độ sao chép lại.


15

Độ lặp lại biểu thị độ chính xác trong cùng điều kiện tiến hành và trong khoảng thời
gian ngắn, cụ thể là việc thực hiện phương pháp được tiến hành bởi cùng một người
trong cùng một phịng thí nghiệm trên cùng một dụng cụ máy móc và trong cùng
một thời gian.
Độ chính xác trung gian biểu thị độ chính xác của phương pháp theo các biến số
của phịng thí nghiệm tại nhiều ngày khác nhau, với nhiều kiểm nghiệm viên khác
nhau.
Đại lượng biểu thị cho độ chính xác là trị số RSD của kết quả phân tích các mẫu

độc lập trong cùng điều kiện phân tích. Giá trị RSD cho phép tùy thuộc vào nồng độ
của các chất có trong mẫu thử [14], [27].
1.4.2.4. Độ đúng
Độ đúng là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu
đã biết. Phương pháp thêm chuẩn là một cách để xác định độ đúng của quy trình
phân tích. Theo đó, một lượng chính xác chất chuẩn của chất cần phân tích đã biết
hàm lượng được cho vào mẫu giả dược, thường được thực hiện tại ít nhất 3 mức
nồng độ tương ứng với 80%, 100% và 120% so với hàm lượng ghi trên nhãn và
nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp. Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít
nhất 03 mẫu độc lập. Phân tích mẫu theo quy trình phân tích và xác định tỷ lệ phục
hồi. Tỷ lệ phục hồi tùy theo nồng độ của hoạt chất phân tích mà có quy định cụ thể.
Trong những trường hợp khơng có các mẫu giả dược thích hợp, có thể chấp nhận
thêm chất chuẩn của chất cần phân tích đã biết hàm lượng vào mẫu thử. Lượng chất
chuẩn thêm vào khoảng 100% ± 20% lượng hoạt chất đã có sẵn và tổng lượng hoạt
chất trong mẫu phải nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp [2].