BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN PHƯƠNG MINH THẢO

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
VITAMIN C TRONG VIÊN SỦI BỌT ĐA THÀNH PHẦN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Cần Thơ - 2015


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN PHƯƠNG MINH THẢO

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
VITAMIN C TRONG VIÊN SỦI BỌT ĐA THÀNH PHẦN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

Người hướng dẫn khoa học: Ts. Nguyễn Thị Ngọc Vân
Ds. Nguyễn Thị Tường Vi

Cần Thơ – 2015


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin kính gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Ts. Nguyễn Thị Ngọc
Vân và cô Ds. Nguyễn Thị Tường Vi, người cô ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ
và động viên em trong quá trình thực hiện luận văn. Em xin chân thành cảm ơn thầy
Ts. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, người thầy đã rất nhiệt tình giúp đỡ và ln tận tình
truyền đạt cho em những kinh nghiệm và kiến thức quý báu, tạo điều kiện tốt nhất
để em hoàn thành bài luận văn tốt nghiệp này.
Em xin chân thành cảm ơn đến tất cả các thầy cô trong Bộ môn Hóa Phân Tích –
Kiểm Nghiệm – Độc Chất, trường Đại học Y Dược Cần Thơ, đặc biệt là thầy
ThS. Lữ Thiện Phúc, cô ThS. Dương Thị Trúc Ly đã truyền đạt cho em những
kiến thức vô cùng quý giá, cô Nguyễn Thị Bích Thủy, cơ Nguyễn Thị Đặng và cơ
Trần Thị Thanh Thúy đã giúp đỡ em và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá
trình em làm đề tài tại bộ môn.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý thầy cô trường Đại học Y Dược
Cần Thơ đã hết lòng truyền đạt kiến thức cũng như phát triển kỹ năng cho em
trong suốt 5 năm học vừa qua.
Con xin cảm ơn ba mẹ đã luôn chăm sóc, yêu thương và là nguồn động lực to lớn
giúp con học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị trong phịng Kiểm Nghiệm của Cơng Ty
Cổ Phần Dược Hậu Giang đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình em làm luận
văn.
Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn làm luận văn tại bộ mơn Hóa Phân Tích – Kiểm
Nghiệm – Độc Chất và các bạn ở các bộ mơn khác đã ln sẵn lịng giúp đỡ và ln

bên cạnh tôi trong thời gian qua.


LỜI CAM ĐOAN

Tôi tên Nguyễn Phương Minh Thảo xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của
tơi. Các số liệu và kết quả được nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chưa
từng được sử dụng trong bất kỳ tài liệu nào khác.

Thành phố Cần Thơ – 9/6/2015

Nguyễn Phương Minh Thảo


i

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC .............................................................................................................. i
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ......................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................... vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................ 1
Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3
1.1 Tổng quan về vitamin C ................................................................................... 3
1.2 Các phương pháp phân tích vitamin C ............................................................. 7
1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao......................................................... 12
1.4 Thẩm định quy trình bằng phương pháp HPLC ............................................. 12

Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 15
2.1 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 15
2.2 Địa điểm và phương tiện nghiên cứu .............................................................. 16
2.3 Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 17
Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 22
3.1 Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu ........................................................ 22
3.2 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống .................................................... 24
3.3 Kết quả thẩm định quy trình ........................................................................... 26
3.4 Áp dụng quy trình định lượng ........................................................................ 34
Chương 4 - BÀN LUẬN .................................................................................... 36
4.1 Điều kiện sắc ký tối ưu ................................................................................... 36
4.2 Tính tương thích hệ thống............................................................................... 41
4.3 Thẩm định quy trình định lượng ..................................................................... 41
4.4 Áp dụng quy trình định lượng ........................................................................ 44


ii

KẾT LUẬN .......................................................................................................... 46
KIẾN NGHỊ......................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


iii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
STT

Chữ tắt, ký hiệu


Chữ nguyên

Ý nghĩa

1

As

Asymmetry

Hệ số bất đối

2

Bocalex

Bocalex Multi

Chế phẩm Bocalex
Multi vitamin
Dược Điển Anh

3

BP

British Pharmacopoeia

4


DĐVN IV

Dược điển Việt Nam IV

5

EP

European Pharmacopoeia

Dược Điển Châu Âu

6

HPLC

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng

Chromatography

cao

International Conference

Hiệp hội đồng thuận

on Harmonisation


quốc tế

7

ICH

8

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

9

LOQ

Limit of Quantitation

Giới hạn định lượng

10

MeOH

Methanol

Dung môi Methanol


11

N

Number of theoretical

Số đĩa lý thuyết

plates
12

Plusssz

Plusssz Max Multi

Chế phẩm Plusssz Max
Multi

13

Ppm

Parts per million

Một phần triệu

14

RNI


Recommended Nutrition

Lượng dinh dưỡng

Intakes

khuyến cáo hằng ngày

15

RS

Resolution

Độ phân giải

16

RSD

Relative standard deviation

Độ lệch chuẩn tương
đối

17

S


Area

Diện tích đỉnh
(đơn vị: mAU.phút)

18

SD

Standard deviation

Độ lệch chuẩn


iv

19

tR

Retention time

Thời gian lưu của pic
(đơn vị: phút)

20

TT

Thuốc thử


21

TT/BYT

Thông tư Bộ Y Tế

22

USP

The United States

Dược Điển Mỹ

Pharmacopeia
23

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới


v

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Lượng dùng vitamin C khuyến cáo hằng ngày cho người Việt Nam (RNI)

................................................................................................................................. 7
Bảng 1.2. Các phương pháp định lượng nguyên liệu vitamin C ............................ 8
Bảng 1.3. Các phương pháp định lượng vitamin C trong viên nén ...................... 10
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu về định lượng vitamin C bằng phương pháp HPLC11
Bảng 2.1. Các sản phẩm để xây dựng, thẩm định quy trình định lượng (1) và áp
dụng quy trình (2) ................................................................................................. 15
Bảng 2.2. Các hóa chất, dung mơi được dùng ...................................................... 16
Bảng 2.3. Các thiết bị được dùng ......................................................................... 16
Bảng 3.1. Kết quả tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn (n=6) .................... 24
Bảng 3.2. Kết quả tính tương thích hệ thống trên mẫu thử Bocalex .................... 25
Bảng 3.3. Kết quả tính tương thích hệ thống trên mẫu thử Plusssz...................... 25
Bảng 3.4. Diện tích đỉnh trung bình của vitamin C của mẫu chuẩn ở 5 nồng độ . 27
Bảng 3.5. Kết quả độ chính xác của vitamin C trong mẫu thử Bocalex ............... 29
Bảng 3.6. Kết quả độ chính xác của vitamin C trong mẫu thử Plusssz ................ 31
Bảng 3.7. Kết quả độ đúng của vitamin C trong mẫu thử Bocalex ...................... 32
Bảng 3.8. Kết quả độ đúng của vitamin C trong mẫu thử Plusssz ....................... 33
Bảng 3.9. Hàm lượng vitamin C trong các lô sản phẩm định lượng Bocalex và
Plusssz ................................................................................................................... 35
Bảng 4.1. Các thông số của pic vitamin C khi không điều chỉnh pH dung dịch mẫu
Bocalex ................................................................................................................. 36


vi

Bảng 4.2. Các thông số của pic vitamin C sau khi điều chỉnh pH dung dịch mẫu
Bocalex ................................................................................................................. 37
Bảng 4.3. Các thông số của pic vitamin C sau khi điều chỉnh pH dung dịch mẫu
Plusssz ................................................................................................................... 37
Bảng 4.4. Các thông số trong kiểm định phương trình hồi quy ........................... 42
Bảng 4.5. Nhu cầu vitamin C hằng ngày theo WHO ........................................... 45



vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo vitamin C ................................................................... 3
Hình 3.1. Phổ UV của vitamin C .......................................................................... 22
Hình 3.2 Sắc ký đồ hệ pha động (1) ..................................................................... 23
Hình 3.3 Sắc ký đồ hệ pha động (2) ..................................................................... 23
Hình 3.4 Sắc ký đồ hệ pha động (3) ..................................................................... 23
Hình 3.5. Các sắc ký đồ của tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn .............. 24
Hình 3.6. Các sắc ký đồ của tính tương thích hệ thống trên mẫu thử Bocalex .... 25
Hình 3.7. Các sắc ký đồ của tính tương thích hệ thống trên mẫu thử Plusssz ...... 26
Hình 3.8. Các sắc ký đồ của mẫu pha động (1), mẫu trắng (2), mẫu chuẩn (3), mẫu
thử Bocalex (4) và mẫu thử thêm chuẩn (5) ......................................................... 26
Hình 3.9. Các sắc ký đồ của mẫu pha động (1), mẫu trắng (2), mẫu chuẩn (3), mẫu
thử Plusssz (4) và mẫu thử thêm chuẩn (5) .......................................................... 27
Hình 3.10. Các sắc ký đồ của mẫu chuẩn vitamin C ở nồng độ 15 ppm (1), 30 ppm
(2), 60 ppm (3), 90 ppm (4) và 120 ppm (5)......................................................... 28
Hình 3.11. Đường tuyến tính của vitamin C trong khoảng nồng độ 15 – 120 ppm28
Hình 3.12. Các sắc ký đồ của 6 mẫu thử Bocalex ................................................ 30
Hình 3.13. Các sắc ký đồ của 6 mẫu thử Plusssz ................................................. 30
Hình 3.14 Sắc ký đồ của mẫu trắng (1) và mẫu chuẩn 0,22ppm (2) .................... 34
Hình 3.15. Các sắc ký đồ của 3 mẫu thử Bocalex của 3 lô 680914B (1), ............ 34
330914A (2) và 630914B (3) ................................................................................ 34
Hình 3.16. Các sắc ký đồ của 3 mẫu thử Plusssz của 3 lô 26408 (1), 53518 (2) và
06717 (3) ............................................................................................................... 35
Hình 4.1. Sắc ký đồ mẫu vitamin C chuẩn với hệ pha động (1) ........................... 38
Hình 4.2. Sắc ký đồ mẫu vitamin C chuẩn với hệ pha động (2) ........................... 38

Hình 4.3. Sắc ký đồ mẫu vitamin C chuẩn với hệ pha động (3) ........................... 39
Hình 4.5. Sắc ký đồ mẫu thử Plusssz với hệ pha động (3) ................................... 40


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay viên nén sủi bọt có chứa vitamin C là một dạng thực phẩm chức năng bổ
sung vitamin cho cơ thể rất được ưa chuộng và được nhiều cơng ty dược trong và
ngồi nước sản xuất ở nhiều hàm lượng khác nhau. Trong đó, vitamin C là một hợp
chất hữu cơ tan trong nước, tham gia vào nhiều quá trình sinh học quan trọng của
cơ thể [18]. Tuy nhiên, cơ thể người không tự tổng hợp được vitamin C và vitamin
C được cung cấp cho cơ thể phần lớn qua thực phẩm và các dạng viên bổ sung
vitamin C, đặc biệt là các viên sủi bọt [16].
Do đặc trưng của vitamin C dễ bị phân hủy nên việc định lượng để xác định hàm
lượng vitamin C là cần thiết để đảm bảo tác dụng của viên sủi cũng như sức khỏe
của người sử dụng [20]. Việc định lượng vitamin C đã được đề cập trong USP 35,
BP 2013, EP 7:2010 với phương pháp chuẩn độ thể tích [7],[31],[32]. Thêm vào đó,
hiện nay Dược Điển Việt Nam IV chưa có chuyên luận định lượng vitamin C ở
dạng viên sủi, và việc định lượng vitamin C nguyên liệu hay trong viên nén đều chỉ
dừng lại ở phương pháp chuẩn độ thể tích.
Do đó, nhằm xây dựng quy trình định lượng với độ nhạy và độ chính xác cao bằng
phương pháp HPLC để góp phần cải tiến quy trình định lượng vitamin C, chúng tôi
đã tiến hành thực hiện đề tài:
“Xây dựng quy trình định lượng vitamin C trong viên sủi bọt đa thành phần

bằng phương pháp HPLC”
Với mục tiêu:
Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng vitamin C trong viên sủi đa thành
phần bằng phương pháp HPLC.

Để thực hiện mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành cụ thể:
1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng vitamin C trong viên sủi đa thành
phần bằng phương pháp HPLC.


2

2. Định lượng hàm lượng vitamin C có trong 2 sản phẩm viên sủi đa thành phần
đang lưu hành trên thị trường.
Ý nghĩa khoa học
Góp phần làm cơ sở xây dựng một quy trình định lượng vitamin C trong viên sủi đa
thành phần bằng phương pháp HPLC.
Ý nghĩa thực tiễn
Áp dụng quy trình định lượng này để xác định hàm lượng vitamin C trong viên sủi
đa thành phần để đảm bảo tác dụng của viên sủi và sức khỏe cho người sử dụng.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về vitamin C
1.1.1 Cơng thức cấu tạo
H
OH
HO

O
O


HO

OH

Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo vitamin C
Công thức phân tử: C6H8O6.
Vitamin C (Acid ascorbic) là (R)-5-[(S)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-5Hfuran 2-on, phải chứa từ 99,0% đến 100,5% C6H8O6 [1].
1.1.2 Tính chất lý hóa
Tinh thể khơng màu hay bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng, biến màu khi tiếp
xúc với khơng khí, ánh sáng và ẩm. Khơng mùi hoặc gần như không mùi. Dễ tan
trong nước, tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong cloroform và ether.
Chảy ở khoảng 190oC cùng với phân hủy [1].
1.1.3 Dược động học vitamin C
Hấp thu: Vitamin C được hấp thu dễ dàng sau khi uống. Cung cấp thường xuyên
lượng vitamin C qua chế độ ăn từ 30-180mg hàng ngày, khoảng 70-90% được hấp
thu.


4

Phân bố: Vitamin C phân bố rộng rãi trong các mơ cơ thể. Nồng độ vitamin C cao
được tìm thấy ở gan, bạch cầu, tiểu cầu, mô tuyến và thủy tinh thể của mắt. Khoảng
25% vitamin C trong huyết tương kết hợp với protein. Vitamin C đi qua được nhau
thai và phân bố trong sữa mẹ.
Chuyển hóa: Vitamin C oxy hóa thuận nghịch thành acid dehydroascorbic. Một ít
vitamin C chuyển hóa thành những hoạt chất khơng có hoạt tính gồm ascorbic acid2-sulfat và acid oxalic được bài tiết trong nước tiểu.
Thải trừ: Ngưỡng đào thải qua thận khoảng 14µg/ml, ngưỡng này thay đổi theo
từng người. Khi cơ thể bão hòa vitamin C và nồng độ máu vượt quá ngưỡng,
vitamin C không biến đổi được và đào thải vào nước tiểu [2].
1.1.4 Độ ổn định và sự phân hủy của vitamin C

1.1.4.1 Độ ổn định của vitamin C
Độ ổn định của vitamin C phụ thuộc vào nhiều yếu tố.
Nhiệt độ
Hàm lượng vitamin C giảm dần khi nhiệt độ bảo quản tăng dần [13],[23]. Một
nghiên cứu về độ ổn định của chất chuẩn vitamin C và vitamin C trong viên nén
cho thấy, khi được lưu trữ ở các nhiệt độ từ 4oC đến 95oC, hàm lượng vitamin C
chuẩn và vitamin C trong viên nén đều giảm dần khi tăng dần nhiệt độ bảo quản
[21]. Tại bất kỳ nhiệt độ bảo quản nào, dạng acid ascorbic luôn ổn định hơn dạng
muối natri ascorbat [13].
Độ ẩm
Nước là một yếu tố quan trọng có liên quan đến sự ổn định của vitamin C. Sự phân
hủy của vitamin C sẽ tăng nhanh khi độ ẩm tăng [12].
Tốc độ phân hủy vitamin C ở dạng rắn chậm hơn khi vitamin C ở dạng dung dịch
rất nhiều, tốc độ phân hủy 4,1 x 10-6s-1 khi ở dạng rắn và 1,8 x 10-4s-1 khi ở dạng
dung dịch [13].
Thời gian lưu trữ
Nhóm tác giả Vítor Spínola, Berta Mendes, José S. Câmara, Paula C. Castilho thực
hiện nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian lưu trữ lên độ ổn định của vitamin C


5

với kết quả: Ở 230C, sau 1h, dung dịch mẫu chuẩn còn chứa khoảng 98,6% vitamin
C, vitamin C trong dịch chiết trái cây còn khoảng 98,1%. Sau 5h, hàm lượng
vitamin C trong mẫu chuẩn còn lại 94,4%, trong mẫu thử giảm còn 93,7% [29].
pH
Các mẫu vitamin C được hòa tan trong nước cất có pH khác nhau và bảo quản ở
nhiệt độ phòng. Sau 30 ngày, phần trăm còn lại của vitamin C ở các pH khác nhau
như sau: hàm lượng vitamin C còn lại khoảng 30% ở các pH từ 2-8, ngoại trừ pH 3,
hàm lượng vitamin còn lại khoảng 56% [35].

1.1.4.2 Sự phân hủy của vitamin C
Quá trình phân hủy vitamin C là một quá trình phức tạp. Trong nước, sự phân hủy
xảy ra theo 2 hướng: thuận nghịch (phản ứng oxi hóa – khử) và khơng thuận nghịch
(khơng có phản ứng oxi hóa – khử)
Phản ứng khơng thuận nghịch: tốc độ phân hủy của vitamin C giảm khi pH tăng từ
2,2-6,0; khi pH tăng tới trên 7,0 thì sự phân hủy tăng. Sản phẩm tạo thành là
furfural, carbon dioxid, và một số sản phẩm khác.
Phản ứng thuận nghịch: được nghiên cứu rộng rãi hơn, nhanh gấp 100-1000 lần so
với phản ứng không thuận nghịch. Phản ứng này xảy ra nhanh hơn khi pH tăng từ
2,0-5,0 và giảm khi pH tăng từ 5,0-9,0; tăng lên khi pH trên 9 [33].
Acid dehydroascorbic (DHAA) là sản phẩm oxi hóa đầu tiên của dung dịch acid
ascorbic (thuận nghịch), sau đó xảy ra q trình oxi hóa khơng thuận nghịch thành
2,3-diketogulonic acid và sau đó thành furan, keto acid và các acid carboxylic[12],
acid oxalic, các acid threonic [30].
1.1.5 Tác dụng của vitamin C lên sức khỏe con người
1.1.5.1 Tác dụng dược lý của vitamin C
Vitamin C có khả năng khử trong nhiều phản ứng sinh học oxy hóa – khử, là một
chất chống oxy hóa hữu hiệu. Vitamin C loại bỏ ngay các loại oxy, nitơ phản ứng
(các ROS = Reactive oxygen species và các RNS = reactive nitrogen species) như
các gốc hydroxyl, peroxyl, superoxid, peroxynitrit và nitroxid), các oxy tự do và
các hypoclorid, là những gốc tự do gây độc hại cho cơ thể. Có rất nhiều chứng cứ


6

sinh học chứng tỏ các gốc tự do ở nồng độ cao có thể gây tổn hại cho tế bào.
Vitamin C cũng đã tham gia một số chất khử trong hệ thống enzyme chuyển hóa
thuốc cùng với cytochrom P450. Hoạt tính của hệ thống enzyme chuyển hóa thuốc
này sẽ bị giảm nếu thiếu vitamin C [2].
Một số chức năng sinh học của vitamin C đã được xác định rõ ràng, gồm có sinh

tổng hợp collagen, carnitin, catecholamine, tyrosin, corticosteroid, aldosteron [2],
[29]. Bên cạnh đó, vitamin C cịn điều hịa hấp thu, vận chuyển và dự trữ sắt [15].
Vitamin C còn được chứng minh giúp tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể do
tăng phản ứng kháng thể, thúc đẩy hoạt động của neutrophil và tăng khả năng
chống nhiễm khuẩn, tăng sức đề kháng, đặc biệt là ở trẻ em [17].
Bên cạnh đó, vitamin C cịn là chất có lợi cho hệ tim và mạch máu. Vitamin C giúp
làm giảm sự tạo thành lipoprotein a, chất có tác động lớn đến bệnh tim mạch ở nồng
độ cao. Bên cạnh đó, vitamin C góp phần ngăn chặn sự liên kết của lipoprotein a
vào thành động mạch. Do đó vitamin C rất hữu ích trong việc ngăn chặn sự tắc
nghẽn động mạch [26], giảm nguy cơ đột quỵ và bệnh mạch vành [28]. Vitamin C
cũng làm giảm nguy cơ rung nhĩ sau các cuộc phẫu thuật tim [22].
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy vitamin C có hiệu quả trong việc hạn chế sự
phát triển của các tế bào ung thư tuyến tụy [9], [10], làm giảm huyết áp ở các phụ
nữ sau mãn kinh do làm ngăn cản sự co mạch ở các hệ mạch ở các chi [25].
1.1.5.2 Thừa vitamin C
Vitamin C rất ít độc tính và ít có tác dụng bất lợi ở liều cao [11]. Tuy nhiên ở một
số người, dùng vitamin C 2-3g/ngày có thể dẫn đến tiêu chảy. Bên cạnh đó, oxalat
(sản phẩm dị hóa cuối cùng của vitamin C) là một yếu tố quan trọng góp phần hình
thành sỏi thận, đặc biệt ở liều dùng trên 1000mg/ngày [37].
1.1.5.3 Thiếu vitamin C
Thiếu hụt vitamin C xảy ra khi thức ăn cung cấp không đầy đủ lượng vitamin C cần
thiết, dẫn đến bệnh scorbut. Có thể nhận biết bệnh này qua các triệu chứng như dễ
chảy máu nướu răng, da khô, mệt mỏi, chậm liền vết thương. Cung cấp vitamin C


7

cho cơ thể bằng rau quả hoặc các viên bổ sung vitamin C làm mất hoàn toàn các
triệu chứng trên [2],[19].
1.1.6 Nhu cầu vitamin C hằng ngày

Cơ thể người không tự tổng hợp được vitamin C cho bản thân mà phải lấy từ nguồn
thức ăn [16]. Nhu cầu vitamin C hằng ngày cho từng nhóm tuổi theo khuyến nghị
của Viện Dinh dưỡng quốc gia (Bộ Y Tế) [3] được trình bày trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Lượng dùng vitamin C khuyến cáo hằng ngày cho người Việt Nam (RNI)
Nhóm tuổi

Nhu cầu vitamin C (mg/ngày)

Trẻ em 0-6 tháng tuổi

25

Trẻ em 7 tháng tuổi – 6 tuổi

30

7-9 tuổi

35

10-18 tuổi

40

19-trên 65 tuổi

45

Phụ nữ có thai


55

Phụ nữ cho con bú

75

Vitamin C được bổ sung chủ yếu qua thực phẩm hằng ngày. Hơn 90% lượng
vitamin C được cung cấp từ bữa ăn nhờ trái cây và rau củ (cam, dâu, cà chua, khoai
tây, cải lá xanh, cải bó xơi) [27],[30].
1.2 Các phương pháp phân tích vitamin C
1.2.1 Định tính vitamin C được quy định trong DĐVN IV [1]
Định tính ngun liệu vitamin C:
Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau:
Nhóm I: B, C
Nhóm II: A, C, D
Dung dịch S : Hòa tan 1,0g chế phẩm trong nước khơng có carbon dioxyd (TT) và
pha lỗng thành 20ml bằng cùng dung mơi.
A. Hịa tan 0,10g chế phẩm trong nước và pha loãng ngay thành 100,0ml với cùng
dung môi. Cho 1,0ml dung dịch mới pha vào 10ml dung dịch acid hydrocloric 0,1N
(TT) và pha loãng thành 100,0ml bằng nước. Đo độ hấp thu tử ngoại của dung dịch


8

thu được ngay sau khi pha loãng. Dung dịch chỉ có duy nhất một cực đại hấp thu ở
243nm. Giá trị A (1%, 1cm) ở 243nm nằm trong khoảng từ 545 đến 585.
B. Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của acid
ascorbic chuẩn. Dập viên chứa 1 mg chế phẩm.
C. pH của dung dịch S nằm trong khoảng từ 2,1 đến 2,6.
D. Thêm 0,2ml dung dịch acid nitric loãng (TT) và 0,2ml dung dịch bạc nitrat 2%

(TT) vào 1ml dung dịch S, sẽ xuất hiện tủa màu xám.
1.2.2 Định lượng vitamin C trong DĐVN IV, USP 35, BP 2013, EP 7:2010
Các phương pháp định lượng nguyên liệu vitamin C trong DĐVN IV, USP 35, BP
2013, EP 7:2010 được trình bày trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Các phương pháp định lượng nguyên liệu vitamin C
DĐVN IV [1]

USP 35 [32]

BP 2013 [31], EP 7:2010
[7]

Hòa tan 0,150g chế Hịa tan chính xác khoảng Hịa

tan

chính

xác

phẩm trong một hỗn 0,400g chế phẩm trong hỗn khoảng 0,150g chế phẩm
hợp gồm 80ml nước hợp gồm 100ml nước và trong hỗn hợp gồm 80ml
khơng có carbon dioxyd 25ml dung dịch acid sulfuric nước khơng có carbon
(TT) và 10ml dung dịch 2N, thêm 3ml dung dịch hồ dioxyd (TT) và 10ml
acid sulfuric 1M (TT). tinh bột. Chuẩn độ bằng dung dịch acid sulfuric
Thêm 1ml dung dịch hồ dung dịch Iod 0,1N chuẩn.

1M. Thêm 1ml dung dịch

tinh bột (TT). Chuẩn độ Thực hiện song song với hồ tinh bột. Chuẩn độ

bằng dung dịch iod mẫu trắng gồm 100ml nước, bằng

dung

dịch

Iod

0,1N (CĐ) cho tới khi 25ml acid sulfuric 2N và 0,05N chuẩn cho tới khi
xuất hiện màu xanh tím 3ml dung dịch hồ tinh bột.
bền vững.

xuất hiện màu xanh tím

Hàm lượng % vitamin C có bền vững. 1ml dung dịch

1ml dung dịch iod 0,1N trong chế phẩm được tính Iod 0,05N tương đương
(CĐ) tương đương với theo công thức:
8,81mg C6H8O6.

(V  B )  N  F  100

W

với 8,81mg C6H8O6.


9

Với:

V: Thể tích dung dịch iod 0,1N khi chuẩn độ mẫu thử (ml).
B: Thể tích dung dịch iod 0,1N khi chuẩn độ mẫu trắng (ml).
N: Hệ số hiệu chỉnh (mEq/ml).
F = 88,06mg/mEq.
W: Khối lượng cân mẫu thử (mg).
Các phương pháp định lượng viên nén vitamin C trong DĐVN IV, USP 35, BP
2013, EP 7:2010 được trình bày trong bảng 1.3.


10

Bảng 1.3. Các phương pháp định lượng vitamin C trong viên nén
DĐVN IV [1]

USP 35 [32]

BP 2013 [31], EP
7:2010 [7]

Tính khối lượng trung Cân 20 viên, nghiền thành bột mịn Cân 20 viên, và
bình của 20 viên và và hịa tan vào bình định mức nghiền

thành

bột

nghiền thành bột mịn. 1000ml có chứa 250ml acid mịn. Hịa tan một
Cân

một lượng bột metaphosphoric – acid acetic. Lắc lượng bột tương ứng


viên tương ứng với đều trong 30 phút, bổ sung thể tích khoảng 0,15g acid
khoảng 0,1g vitamin C, bằng nước và đem ly tâm. Hút một ascorbic trong hỗn
thêm 30ml hỗn hợp thể tích dung dịch tương đương hợp 30ml nước và
nước đun sơi để nguội với 2mg vitamin C vào bình nón, 20ml acid sulfuric
và

dung

dịch

acid thêm 5ml acid metaphosphoric – 1M. Chuẩn độ dung

acetic 1M (TT) (10 : 1), acid acetic và tiến hành chuẩn độ dịch trên với dung
lắc kỹ. Thêm 1ml dung bằng dung dịch dichlorophenol - dịch ceri (IV) amoni
dịch hồ tinh bột (TT), indophenol cho đến khi có màu sulfat 0,1M với chất
định lượng bằng dung hồng bền trong vòng 5 giây. Thực chỉ thị là dung dịch
dịch iod 0,1N (CĐ) cho hiện song song với mẫu trắng ferroin.
tới khi xuất hiện màu chứa 5,5ml acid metaphosphoric – 1ml dung dịch ceri
xanh lam bền vững.

acid acetic và 15ml nước. Hàm (IV) amoni sulfat

1ml dung dịch iod 0,1N lượng % vitamin C được tính theo tương
(CĐ) tương đương với công thức:
8,806mg C6H8O6.

đương

8,806mg C6H8O6.


(VS  VB)  F  100

W

Với:
VS: Thể tích dung dịch chuẩn độ khi thực hiện trên mẫu thử (ml)
VB: Thể tích dung dịch chuẩn độ khi thực hiện trên mẫu trắng (ml)
F: Hệ số chuyển đổi giữa thể tích dung dịch chuẩn độ và vitamin C (mg/ml)
W: Khối lượng cân mẫu thử (mg)

với


11

1.2.3 Một số nghiên cứu về định lượng vitamin C bằng phương pháp HPLC
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu về định lượng vitamin C bằng phương pháp HPLC
NHÓM TÁC GIẢ

PHƯƠNG PHÁP

PHA TĨNH

PHA ĐỘNG

(CỘT)
Valeria Radulescu,

HPLC, UV 242nm.


Pha tĩnh:

NaH2PO4 0,05M pH

Diana-Carolina

Thể tích tiêm: 20µl.

Cột

3,6 : MeOH (95:5)

Elies, Ion

Tốc độ dịng:

Lichrosorb

Voiculescu, Iovu-

0,7ml/phút.

RP-18.

Adrian Biris, Adam
Craciunescu [24]
Shafqat ulla, Arshad HPLC, UV 240nm.

Cột Intersil


đệm NaH2PO4 và

Thể tích tiêm: 10µl.

ODS-3 C18

acid metaphosphoric

Tốc độ dịng:

5µm,

(pH 3,0) : MeOH

1ml/phút.

250x4,6mm.

(20:80).

Hussein [34]

Nhiệt độ cột: 40oC.
Snezana S Mitić,

HPLC, UV 280nm.

Cột


Acid acetic (500ml)

Danijela A Kostić

Thể tích tiêm : 50µl.

Superspher

và 1,5g muối natri

[18]

Tốc độ dịng:

RP-18

của acid 1-

0,7ml/phút.

(250mm x

hexanesulfonic (pH

Nhiệt độ cột: 20oC.

4,6mm,

2,6).


10µm).
Alley E. Watada

HPLC, UV 254nm.

Cột C18:

Nước : NH4H2PO4

[36]

Thể tích tiêm: 10-

8mm x

(98,5:1,5), pH 3.

50μl.

10cm.

Tốc độ dòng:
4ml/phút.


12

1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.3.1 Định nghĩa
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên cột được

nhồi đầy bằng các hạt có kích thước ≤ 10µm. Do vậy phải dùng một bơm có áp suất
cao khoảng 300atm để đẩy pha động qua cột với tốc độ dòng khoảng vài ml/phút và
cho phép phân giải nhanh một lượng mẫu nhỏ cỡ 20µg.
Hiện nay, phương pháp HPLC ngày càng phát triển, nó áp dụng rất nhiều
trong ngành kiểm nghiệm đặc biệt là kiểm nghiệm thuốc.
Ưu điểm của HPLC
- Độ nhạy và độ chính xác cao.
- Áp dụng cho hầu hết các hợp chất không bay hơi chịu nhiệt hay dễ bị phân hủy
bởi nhiệt…
- Thời gian phân tách nhanh, độ tách tốt và kết quả phân tích ít phụ thuộc vào các
thao tác kỹ thuật nên tránh được sai số.
- Cột sắc ký có thể sử dụng nhiều lần mà khơng phải tái sinh, mẫu phân tích có thể
thu lại được vì đa số các detector khơng phân hủy mẫu.
Được xem là phương tiện định tính và định lượng hiệu quả trong các Dược Điển
hiện đại USP, BP, EP… trong kiểm nghiệm thuốc và phân tích hóa hợp chất tự
nhiên [6].
1.3.2 Các thông số đặc trưng của phương pháp HPLC
- Thời gian lưu và thể tích lưu.
- Độ phân giải Rs (hay hệ số tách của cột) (Resolution).
- Hệ số chọn lọc α (selectivity factor).
- Hệ số bất đối (Asymetrical factor).
- Hiệu lực cột và số đĩa lý thuyết (N) [6].
1.4 Thẩm định quy trình bằng phương pháp HPLC
Thẩm định quy trình định lượng là q trình thiết lập các thơng số đặc trưng của
phương pháp để chứng minh rằng phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến.
Theo ICH, các chỉ tiêu cần được thẩm định trong quy trình định lượng bao gồm:


13


- Tính đặc hiệu.
- Tính tuyến tính và miền giá trị.
- Độ chính xác.
- Độ đúng [14].
1.4.1 Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu hay tính chọn lọc của một quy trình phân tích là khả năng cho phép
xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà khơng bị ảnh hưởng bởi sự có
mặt của các chất khác (tạp chất, sản phẩm phân hủy,…) có trong mẫu thử.
1.4.2 Tính tuyến tính và miền giá trị
1.4.2.1 Tính tuyến tính của quy trình phân tích
Là khả năng suy ra các kết quả của phương pháp dựa vào đường biểu diễn sự phụ
thuộc giữa độ đáp ứng của đại lượng đo được là diện tích đỉnh (y) và đồng độ (x)
(hay có thể trực tiếp tính tốn dựa vào tương quan tỷ lệ giữa diện tích đỉnh (y) và
nồng độ (x)).
Tính chất tuyến tính được biểu thị bằng bình phương của hệ số tương quan R2. Để
khảo sát tính tuyến tính, tiến hành sắc ký tối thiểu 5 mẫu chuẩn với nồng độ khác
nhau, có giá trị trong khoảng từ 40% - 140% so với nồng độ chất phân tích, đo và
xác định diện tích đỉnh tại từng nồng độ khảo sát. Thiết lập phương trình hồi quy và
vẽ đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích đỉnh và nồng độ chất có trong 5
mẫu chuẩn.
Sử dụng “phân tích hồi quy” với trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số
trong phương trình hồi quy và trắc nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương
trình hồi quy.
1.4.2.2 Miền giá trị của quy trình phân tích
Là khoảng giữa nồng độ cao và nồng độ thấp của chất cần phân tích có trong mẫu
thử, với bất kỳ nồng độ trong khoảng này đều có thể đáp ứng về độ chính xác, độ
đúng và tính chất tuyến tính của phương pháp.
Miền giá trị được biểu thị bằng một khoảng nồng độ mà ở khoảng nồng độ này vẫn
còn phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích đỉnh và nồng độ.



14

1.4.3 Độ chính xác
Độ chính xác thể hiện mức độ dao động của các kết quả đo lường riêng biệt so với
giá trị trung bình. Độ chính xác bị ảnh hưởng bởi sai số ngẫu nhiên.
Đại lượng đặc trưng cho độ chính xác là độ lệch chuẩn tương đối (RSD%).
1.4.4 Độ đúng
Độ đúng của một quy trình phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy với
giá trị thực khi áp dụng quy trình đề xuất trên cùng một mẫu thử đã được làm đồng
nhất trong cùng điều kiện xác định. Độ đúng bị ảnh hưởng bởi sai số hệ thống.
Đại lượng đặc trưng cho độ đúng là tỷ lệ phục hồi, tỷ lệ này được xác định theo
công thức:
Y

X tt
 100
X lt

Với :
Y là tỉ lệ hồi phục của phương pháp định lượng (%).
Xlt là lượng chuẩn thêm vào ban đầu.
Xtt là lượng chuẩn tìm thấy được khi tiến hành sắc ký.
Tỷ lệ phục hồi phụ thuộc vào mẫu phân tích, quy trình xử lý mẫu và nồng độ chất
phân tích. Tỷ lệ phục hồi càng gần 100%, quy trình phục hồi có độ đúng càng cao.
Độ đúng được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở
tối thiểu 3 nồng độ thuộc miền giá trị của quy trình phân tích [5], [14].