0109 nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng vitamin c trong viên sủi đa thành phần bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (44.01 MB, 82 trang )
Í Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
BO Y TE
TRUONG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CÀN THƠ
ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CÁP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
VITAMIN C TRONG VIEN SUI DA THANH PHAN
BANG PHUONG PHAP SAC Ki LONG HIEU NANG CAO
Ts. NGUYEN THI NGOC VAN
Can Tho - 2015
Í Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
BO
Y TE
TRUONG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CÀN THƠ
ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CÁP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
VITAMIN C TRONG VIÊN SỦI ĐA THANH PHAN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Chủ tịch hội đồng
2
we ed
PGS.TS. Phạm Thị Tâm
Chủ nhiệm đề tài
V
Ts. Nguyén Thi Ngoc Van
Can Tho - 2015
Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
iy
MUC LUC
Trang
đ9099.6)09/ S0ƠỊƠỎ
i
MỤC TLC isa sccscccssssorsuvonsstverevscvsncoversssosensersonneserevonsesoussnenooevves oussenesasasvassnssusessese ii
KHĂN 9: TÔM TẤT ĐỀ TÀI Ga
anh
eeeieesennnseeseeeeseeesee ii
PHAN 2: TOAN VAN CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨPU .................................-. x
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIÉT TẮTT.................................
2-5 se xi
ĐANH MỤC CÁC BÀ NỔ ca
PRAT ME RA TH
VFHAN MO DẤTT
agaa-a.-y-.-aanguadagagtionaddaooaan xiii
cu ỹÿŸÝŸŸỸ.agggdaaogaaddgaaaraaaguaraden xv
ng eaeoanbodOOSSDOGDONIiIGS2-ai30510800ã00
28A 1
Chuong 1 =< TONG QUAN TAL LIRU cssccssssssnsisssecisecsssosesssconoasacovecesassontesstbiacss 3
1.1 Téng quan vé vitamin C o.....ccccccssceseccsscssssesveseesesvescscecacevevensucarsteaeereareneeesacaee 3
1.2'Céc phirong phan phan tich vitamin C |... scsecssssssnsocessesevssesesveaussesseansvessssconssss 7
1.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu mang a0 .......c.ccscssesessescsssesesseseseereersnesseatenees 12
1.4 Tham định quy trình bằng phương pháp HPLC .........................
-- - 5 se +x+s+24 12
Chương 2 - ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................ 15
2.1 DGi tuong nghién CU... cccccccsesscsesescesescsvssesvsucsescasscavacscacacsverseeneacencaveneees 15
2.2 Địa điểm và phương tién nghién CUU.......ccccccecessesesecetscscsescecseseesesreareneeessees l6
2.3 Phương pháp nghiên cứu ...............................
- --Ặ- - SH
ng ng vn 17
Chương 3-RẾT QUÁ NGHIÊN CỨU.
na
iiiiiioiaaiaaa-Ÿ-aa 22
3.1 Xây dựng và thầm định quy trình. .......................
-¿- - 6 5s xxx cEgxr ve zez 22
3.2 Áp dụng quy trình định lượng .......................---- - + xxx kv vEkrErrrrkrrererxre 40
Chương 4 - BÀN LUẬN..............................-5-5 ©s< Sen Sư xu
xxx xeerersrsre 44
4.1 Xây dựng và thầm định quy trÌn..........................6xx SE eEvEEkzrevxrsrcera 44
4.2 Áp dụng quy trình định lượng ......................- ¿2 - + xxx ‡EvEkvkckkrsrsersri 52
KET LUAN VA KIEN NGHỊ,...................................--.s<
55s s6 cessssessessssspsssessese 54
TAI LIEU THAM KHAO
PHU LUC
ii
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học ˆ
PHAN 1: TOM TAT DE TAI
tii
Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
V
I.PHÀN MỞ ĐÀU
Ngày nay viên nén sủi bọt có chứa vitamin C là một dạng thực phẩm chức năng bổ
sung vitamin cho cơ thể rất được ưa chuộng và được nhiều cơng ty dược trong và
ngồi nước sản xuất ở nhiều hàm lượng khác nhau. Trong đó, vitamin C là một hợp
chất hữu cơ tan trong nước, tham gia vào nhiều
quá trình sinh học quan trọng của
co thé [18]. Tuy nhiên, cơ thể người không tự tổng hợp được vitamin C va vitamin
C được cung cấp cho cơ thể phần lớn qua thực phẩm và các dạng viên bổ sung
vitamin C, đặc biệt là các viên sủi bọt [16].
Do đặc trưng của vitamin C dễ bị phân hủy nên việc định lượng để xác định hàm
lượng vitamin C là cần thiết để đảm bảo tác dụng của viên sủi cũng như sức khỏe
của người sử dụng [20]. Việc định lượng vitamin C đã được đề cập trong USP 35,
BP 2013, EP 7:2010 với phương pháp chuẩn độ thể tích [7].[31].[32]. Thêm vào đó,
hiện nay Dược Điển Việt Nam
IV chưa có chuyên luận định lượng vitamin C 6
dạng viên sủi, và việc định lượng vitamin C nguyên liệu hay trong viên nén đều chỉ
dừng lại ở phương pháp chuẩn độ thể tích.
Do đó, nhằm xây dựng quy trình định lượng với độ nhạy và độ chính xác cao bằng
phương pháp HPLC để góp phần cải tiến quy trình định lượng vitamin C, chúng tôi
tiền hành thực hiện đề tài:
“Xây dựng quy trình định lượng vitamin C trong viên sủi đa thành phần bằng
phương pháp HPLC”
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Xây dựng và thâm định quy trình định lượng vitamin C trong viên sủi đa thành
phần bằng phương pháp HPLC.
2. Ứng dụng định lượng hàm lượng vitamin C có trong 4 sản phâm viên sủi đa
thành phần đang lưu hành trên thị trường.
H. ĐÓI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Các sản phẩm trên được mua từ các nhà thuốc ở Cần Thơ, còn thời hạn sử dụng và
được bảo quản ở nhiệt độ theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
IV
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
Chất chuẩn gốc: Vitamin C (L-(+)-Ascorbic acid) 99,5%, độ tỉnh khiết 99,17%
được mua từ Viện kiểm nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh. Số lơ: 016 070614. Được
bảo quản theo điều kiện khuyến cáo ghi trên nhãn.
|
Phương pháp nghiên cứu
~- Xây dựng quy trình định lượng vitamin C có trong các sản phẩm
+ Dung môi pha mẫu: dung dịch đệm phosphat pH 3,0.
+ Chuẩn bị mẫu chuẩn: từ dung dịch chuẩn gốc vitamin C 300ppm, tiến hành pha
các dung dịch chuẩn vitamin C có nồng độ lần lượt là 30; 60ppm và bảo quản ở
5°C,
+ Chuẩn bị mẫu thử: cân 20 viên chế phẩm, tính khối lượng trung bình và nghiền
nhanh thành bột mịn. Cân lượng bột viên tương ứng với 60mg vitamin C cho vào
becher, hòa tan mẫu bằng khoảng 20ml dung dịch đệm pH 3,0, sau đó điều chỉnh
pH dung dịch mẫu về pH 3,0 bằng dung dịch H;POx 4%, đánh siêu âm 1 phút để
loại khí. Cho dung dịch mẫu vào bình định mức 100ml và bỗổ sung vừa đủ thể tích
(A). Pha lỗng (A) thành các nồng độ khác nhau cho q trình phân tích.
+ Thăm dị điều kiện sắc ký tối ưu
Sử dụng phổ UV đề tìm bước sóng hấp thu cực đại của vitamin C trên mẫu chuẩn.
Thực hiện thăm dò điều kiện sắc ký tối ưu bằng các điều kiện sắc ký dự kiến như
Sau:
- Hệ thống máy HPLC Dionex Ultimate 3000.
- Pha tĩnh: cột Phenomenex Luna C18 (250mm; 4,6mm; Sum; 100A).
- Các pha động:
MeOH : nước acid H3PO4 pH 4,0 với tỉ lệ 5:95 (1)
MeOH : nước acid H:POa pH 3,5 với tỉ lệ 5:95 (2)
MeOH : nước acid H:POa pH 3,0 với tỉ lệ 5:95 (3)
- Thể tích tiêm mẫu: 20uI.
~- Nhiệt độ cột: 255C
- Đầu đị: UV-Vis tại bước sóng 248nm.
- Tốc độ dòng: 1,0ml/phút.
Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
Vi \
+ Xác định tính tương thích hệ thống của quy trình định lượng
+ Tham định quy trình định lượng: tính đặc hiệu, tính tuyến tính và miền giá trị, độ
chính xác, độ đúng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
- Xác định hàm lượng vitamin C trong các viên sii đa thành phân
Tiến hành sắc ký mẫu thử.
Từ phương trình tuyến tính và diện tích đỉnh của vitamin C trong mẫu thử có thể
suy ra hàm lượng vitamin C trung bình trong l viên theo cơng thức :
_ Stx mtb x Dx100
1,0617x
Px 1000
(mg)
Với:
X: Hàm lượng vitamin C trung bình trong I viên (mg).
St: Dién tich đỉnh của vitamin € có trong mẫu thử (mAU.phút).
mtb: Khéi lượng trung bình của 1 viên sản phẩm (g).
D: Độ pha loãng.
P: Lượng bột viên đã cân (g).
II. KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả xây dựng quy trình định lượng vitamin C có trong các sản phẩm
3.1.1 Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu
Điều kiện sắc ký tối ưu là:
- Hệ thống máy HPLC Dionex Ultimate 3000.
- Hệ pha động: MeOH : nước acid H:POa pH 3,0 (Š:95)
- Pha tĩnh: cột Phenomenex Luna C18 (250mm; 4,6mm; 5pm;
100A).
- Thé tich tiém: 20p1
- Tốc độ dòng: 1,0ml/phút.
- Nhiệt độ cột: 259C.
- Đầu đị: UV-Vis, bước sóng phát hiện: 248nm.
3.1.2 Kết quả khảo sát tính trơng thích hệ thống
Thơng số thời gian lưu và diện tích đỉnh của vitamin C trong mẫu chuẩn và mẫu thử
Bocalex và Plusssz đều có RSD% nhỏ hơn 2,0%.
vi
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Vụ (
3.1.3 Kết quả thẩm định quy trình
Tính đặc hiệu: quy trình có tính đặc hiệu cho vitamin C.
Tính tuyến tính và miền giá trị
Phương trình tuyến tính của các nồng độ: = 1,0617x + 0,3306. Với R2 = 0,9999,
Phương trình hồi quy của 5 nồng độ là : ¥ = 1,0617x.
Miền giá trị (ppm): [15-120].
Độ chính xác
Đạt độ chính xác trong và độ chính xác liên ngày của vitamin C trong mẫu thử
Bocalex, mẫu thử Plusssz, mẫu thử Myvita, mẫu thử Beroca
Độ đúng
Đạt độ đúng của vitamin C trong mẫu thử Bocalex, mẫu thử Plusssz, mẫu thử
Myvita, mau thir Beroca
Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
LOD = 0,22ppm
LOQ = LOD x 3,3 = 0,73ppm
3.2 Áp dụng quy trình định lượng
Hàm
lượng vitamin C trung bình của 3 lơ sản phẩm Bocalex lần lượt là 56,66mg,
56,02mg va 56,61 mg. So voi gia tri ghi nhãn là 60mg, hàm lượng này đạt theo Tiêu
chuẩn cơ sở: + 20% so với hàm lượng nhãn (48mg — 72mg vitamin C).
Tương tự, hàm lượng vitamin C trung bình của 3 lơ sản phẩm Plusssz lần lượt là
65,70mg, 63,5mg và 64,54mg so với giá trị ghi trên nhãn là 60mg.
Hàm
lượng vitamin C trung bình trong 3 lô của sản phẩm MyVita
69,59mg
Hàm
là 69,81mg,
va 68,67mg so với giá trị ghi trên nhãn là 75mg.
lượng vitamin C trung bình trong 3 lơ của sản phẩm Berocca la 503,11mg,
501,51mg và 498,43mg so với giá trị ghi trên nhãn là 500mg.
IV. KẾT LUẬN
Sau thời gian thực hiện, chúng tôi đã hoàn thành một số mục tiêu đề ra của luận
văn, bao gôm:
Vii
(wrox PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
Xây dựng và thâm định quy trình định lượng vitamin C trong 4 sản phẩm viên sủi
đa thành phần phổ biến đang lưu hành trên thị trường bằng phương pháp HPLC với
hệ pha động isocratic MeOH
: H3PO4 pH 3,0 (5:95) va pha tinh la cét Phenomenex
Lunar C18 (250mm; 4,6 mm; 5 im; 100Ả). Thời gian cho mỗi lần tiêm mẫu là 10
phút và pic vitamin C xuất hiện ở khoảng phút thứ 4, tách khỏi các pic tạp.
Áp dụng định lượng thành công hàm lượng vitamin C trong 3 lô khác nhau của 4
sản phẩm trên.
VIii
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
PHAN Il: TỒN VĂN CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
ix
(wrox PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
Xu
DANH MUC CAC Ki HIEU VA CHU VIET TAT
STT
Chữ tắt, ký hiệu
Chir nguyén
Y nghia
l
As
Asymmetry
Hệ số bắt đối
2
Bocalex
Bocalex Multi
Chế phẩm Bocalex
®
tCœ
+
U›)
Multi vitamin
BP
British Pharmacopoeia
DDVN IV
Duge dién Viét Nam IV
EP
European Pharmacopoeia
Dược Điển Châu Âu
HPLC
High Performance Liquid
Sắc ký lỏng hiệu năng
Chromatography
cao
International Conference
Hiệp hội đồng thuận
on Harmonisation
quốc tế
LOD
Limit of Detection
Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit of Quantitation
Giới hạn định lượng
MeOH
Methanol
Dung môi Methanol
Number of theoretical
Số đĩa lý thuyết
ICH
10
11
Dược Điển Anh
plates
12
Plusssz
Plusssz Max Multi
Chế phẩm Plusssz Max
Multi
13
Ppm
Parts per million
Một phần triệu
14
RNI
Recommended Nutrition
Lượng dinh dưỡng
Intakes
khuyến cáo hằng ngày
Resolution
Độ phân giải
Relative standard deviation
Độ lệch chuẩn tương
15
16
RSD
đối
17
Diện tích đỉnh
Area
(đơn vị: mAU.phút)
18
SD
Standard deviation
Độ lệch chuẩn
19
tr
Retention time
Thời gian lưu của pic
Xx
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
X \,
(đơn vị: phút)
20
21
22
TT
TT/BYT
USP
Thuốc thử
Thông tư Bộ Y Tế
The United States
Dược Điển Mỹ
Pharmacopeia
23
WHO
World Health Organization
xi
Tổ chức Y tế Thế giới
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
YUL
DANH MUC CAC BANG
Trang
Bảng 1.1. Lượng dùng vitamin C khuyến cáo hằng ngày cho người Việt Nam (RNI)
HH TQ SH g0 HT
9.
0 TH. TT
TH TT vợ cà
c0.
TT
19 0.49 78 7
Bảng 1.2. Các phương pháp định lượng nguyên liệu vitamin C............................ 8
Bang 1.3. Các phương pháp định lượng vitamin C trong viên nén..................... 10
Bảng 1.4. Một số nghiên cứu về định lượng vitamin C bằng phương pháp HPLCI 1
Bảng 2.1. Các sản phẩm để xây dựng, thâm định quy trình và định lượng......... 15
Bảng 2.2. Các hóa chất, dung mơi được dùng..................»- sec cv veeevvevevzvseee 16
Bảng 2.3. Các thiét bi diroc ding ...ccsssssessesssceessseseerssssssneseseeseneatscsessccuscesssscans 16
Bảng 3.1. Kết quả tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn (n=6)................... 24
Bảng 3.2. Kết quả tính tương thích hệ thống trên mẫu thử Bocalex................... 25
Bảng 3.3. Kết quả tính tương thích hệ thống trên mẫu thử Plusssz..................... 25
Bảng 3.4. Diện tích đỉnh của vitamin C của mẫu chuẩn ở 5 nồng độ................. 28
Bảng 3.5. Kết quả độ chính xác của vitamin C trong mẫu thử Bocalex.............. 30
Bảng 3.6. Kết quả độ chính xác của vitamin C trong mẫu thử Plusssz............... 31
Bảng 3.7. Kết quả độ chính xác của vitamin C trong mẫu thử Myvita................ 33
Bảng 3.8. Kết quả độ chính xác của vitamin C trong mẫu thử Beroca............... 35
Bảng 3.9. Kết quả độ đúng của vitamin C trong mẫu thử Bocalex..................... 36
Bảng 3.10. Kết quả độ đúng của vitamin C trong mẫu thử Plusssz.................... 37
Bảng 3.11. Kết quả độ đúng của vitamin C trong mẫu thử Myvita.................... 38
Bảng 3.12. Kết quả độ đúng của vitamin C trong mẫu thử Beroca..................... 39
xi
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
xì v
Bảng 3.13. Hàm lượng vitamin C trong các lô sản phẩm định lượng Bocalex và
07...
1.
`
4]
Bảng 4.1. Các thông số của pic vitamin C khi không điềư chỉnh pH dung dịch mẫu
50415 0"...
HH...
44
Bảng 4.2. Các thông số của pic vitamin C sau khi điều chỉnh pH dung dịch mẫu
JOCAÏ€X...............
TPÏUSSS/Z,............
TH
HT
HH HT TH
ko HH TH
ng HT HT TH TT TT
Cu
Hi
cự H1
Hư cep 45
ren
45
Bảng 4.4. Các thơng số trong kiểm định phương trình hồi QUY..................S
<2 50
Bảng 4.5. Nhu cầu vitamin C hằng ngày theo WHO.........................
2c Scsszrevzsersea 53
xiii
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
yy
DANH MUC CAC HINH
Trang
Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo vitamin Co..ccsccccssesccscssesecssssessessesesesceseeseoseesseseceeeess 3
Hình 3.1. Phổ UV của vitamin C.....................cs-:s+St
2x22 1 1111212511258
sen
Hình 3.2 Sắc ký đồ hệ pha động (1) .....................-2-©2s
2z 22x set chết EEESeEEtnc nen
Hình 3.3 Sắc ký đồ hệ pha dGng (2) .sccccecsccssssssssssecssescecsseresecssersseessecssetsssesseen
Hình 3.4 Sắc ký đồ hệ pha dOng (3) ..ceccssccessesssessessesssecsessesessesscssesersssecerseeeece
Hình 3.5. Các sắc ký đồ của
Hình 3.6. Các sắc ký đồ của
Hình 3.7. Các sắc ký đồ của
Hình 3.8. Các sắc ký đồ của
22
23
23
23
tính tương thích hệ thống trên mẫu chuẩn............... 24
tính tương thích hệ thống trên mẫu thử Bocalex.... 25
tính tương thích hệ thống trên mẫu thử Plusssz..... 26
mẫu pha động (1), mẫu trắng (2), mẫu chuẩn (3), mẫu
thử Bocalex (4) và mẫu thử thêm chuẩn (Š)......................
se s2 ©s2srevrszztzzzse .... 2Ố
Hình 3.9. Các sắc ký đồ của mẫu pha động (1), mẫu trắng (2), mẫu chuẩn (3), mẫu
thử Plusssz (4) và mẫu thử thêm chuẩn (5)....................--..--¿-©s2
St tsvtEe CS E2 EEZEe zin 27
Hình 3.10. Các sắc ký đồ của mẫu pha động (1), mẫu trắng (2), mẫu chuẩn (3), mẫu
thủ Myvita (4) và mẫu thử thêm chuẩn (5)......................-.-csztkcscevecvekseszcerssssreree 27
Hình 3.11. Các sắc ký đồ của mẫu pha động (1), mẫu trắng (2), mẫu chuẩn (3), mẫu
thử Beroca (4) và mẫu thủ thêm chuẩn (5) ......................... "¬.
28
Hình 3.12. Các sắc ký đồ của mẫu chuẩn vitamin C ở nồng độ 15 ppm (1), 30 ppm
(2), 60 ppm (3), 90 ppm (4) và 120 ppm (ð)....................
..
29
Hình 3.13. Đường tuyến tính của vitamin C trong khoảng nồng độ 15 — 120 ppm29
Hình 3.14. Các sắc ký đồ của 6 mau thtr Bocalex ....ccccsccssssssssessssccsessessecsrceceevees 31
Hình 3.15. Các sắc ký đồ của 6 mẫu thử Plusssz.........................
toc nhe 31
Hình 3.16. Các sắc ký đồ của 6 mẫu thử Myvita.........................--ghen net
Hình 3.17. Các sắc ký đồ của 6 mẫu thử Beroca....................--- ceecs+2csecsevreersrze
Hình 3.18 Sắc ký đồ của mẫu trắng (1) và mẫu chuẩn 0,22ppm (2)..................
Hình 3.19. Các sắc ký đồ của 3 mẫu thử Bocalex của 3 lô 680914B (1),...........
330914A (2) và 630914B (3)
34
34
40
40
Ge
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
x
Vì
.
Hình 3.20. Các sắc ký đồ của 3 mẫu thử Plusssz của 3 lơ 26408 (1), 53518 (2) và
Uy. ...........
41
Hình 3.21. Các sắc ký đồ của 3 mẫu thử Myvita của 3 lô 680914B (1),............. 42
330914A (2) va 630914B (3) ceccscssssscecccsesecssesessessesssesees M........Ơ 42
Hình 3.22. Các sắc ký đồ của 3 mẫu thử Beroca của 3 lô 26408 (1), 53518 (2) và
"72v... 0...
42
Hình 4.1. Sắc ký đồ mẫu vitamin C chuẩn với hệ pha động (1) ......................-- 46
Hình 4.2. Sắc ký đồ mẫu vitamin C chuẩn với hệ pha động (2) .........................Hình 4.3. Sắc ký đồ mẫu vitamin C chuẩn với hệ pha động (3).........................
Hình 4.4. Sắc ký đồ mẫu thử Bocalex với hệ pha động (3)..........................--c---Hình 4.5. Sắc ký đồ mẫu thử Plusssz với hệ pha động (3)........................----ccc--
XV
46
47
48
48
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
|
PHẢN MỞ ĐÀU
Ngày nay viên nén sủi bọt có chứa vitamin C là một dạng thực phẩm chức năng bổ
sung vitamin cho cơ thê rất được ưa chuộng và được nhiều cơng ty dược trong và
ngồi nước sản xuất ở nhiều hàm lượng khác nhau. Trong đó, vitamin C là một hợp
chất hữu cơ tan trong nước, tham gia vào nhiều quá trình sinh học quan trọng của
cơ thể [18]. Tuy nhiên, cơ thể người không tự tổng hợp được vitamin C và vitamin
C được cung cấp cho cơ thê phần lớn qua thực phẩm và các dạng viên bổ sung
vitamin C, đặc biệt là các viên sủi bọt [161].
Do đặc trưng của vitamin C dễ bị phân hủy nên việc định lượng để xác định hàm
lượng vitamin C là cần thiết để đảm bảo tác dụng của viên sủi cũng như sức khỏe
của người sử dụng [20]. Việc định lượng vitamin C đã được đề cap trong USP 35,
BP 2013, EP 7:2010 với phương pháp chuẩn độ thể tích [7],[31],[32]. Thêm vào đó,
hiện nay Dược Điển Việt Nam
IV chưa có chuyên luận định lượng vitamin C ở
dạng viên sủi, và việc định lượng vitamin C nguyên liệu hay trong viên nén đều chỉ
dừng lại ở phương pháp chuẩn độ thể tích.
Do đó, nhằm xây dựng quy trình định lượng với độ nhạy và độ chính xác cao bằng
phương pháp HPLC để góp phần cải tiền quy trình định lượng vitamin C, chúng tôi
đã tiền hành thực hiện đề tài:
“Xây dựng quy trình định lượng vitamin C trong viên súi đa thành phan bằng
phương pháp HPLC”
Với mục tiêu:
1. Xây dựng và thâm định quy trình định lượng vitamin C trong viên sủi đa thành
phần bằng phương pháp HPLC.
2. Ứng dụng định lượng hàm lượng vitamin C có trong 4 sản phẩm viên sủi đa
thành phần đang lưu hành trên thị trường.
Ý nghĩa khoa học
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Góp phần làm cơ sở xây dựng một quy trình định lượng vitamin C trong viên sủi đa
thành phần bằng phương pháp HPLC.
Ý nghĩa thực tiễn
Ap dụng quy trình định lượng này để xác định hàm lượng vitamin C trong viên sủi
đa thành phần để đảm bảo tác dụng của viên sủi và sức khỏe cho người sử dụng.
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
Chuong 1. TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Téng quan về vitamin C
1.1.1 Cơng thức cấu tạo
OH
HO
HO
OH
Hình 1.1. Cơng thức cầu tao. vitamin C
Công thức phân tử: CaHsOs.
Vitamin C (Acid ascorbic) 1a (R)-5-[(S)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-5H-
furan 2-on, phải chứa từ 99,0% đến 100,5% CeH¿O¿ [1].
1.1.2 Tính chất lý hóa
|
Tinh thé khơng màu hay bột kết tỉnh trắng hoặc gần như trắng, biến màu khi tiếp
xúc với khơng khí, ánh sáng và âm. Khơng mùi hoặc gần như không mùi. Dễ tan
trong nước,
tan trong ethanol
96%, thực tế không
tan trong cloroform
va ether.
Chảy ở khoảng 190°C cùng với phân hủy [1].
1.1.3 Dược động học vitamin C
Hấp thu: Vitamin C được hấp thu dễ dàng sau khi uống. Cung cấp thường xuyên
lượng vitamin C qua chế độ ăn từ 30-180mg hàng ngày, khoảng 70-90% được hấp
thu.
Phân bố: Vitamin C phân bố rộng rãi trong các mô co thé, Nông độ vitamin C cao
được tìm thấy ở gan, bạch câu, tiểu cầu, mô tuyến và thủy tỉnh thể của mắt. Khoảng
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
25% vitamin C trong huyết tương kết hợp với protein. Vitamin C đi qua được nhau
thai và phân bố trong sữa mẹ.
|
Chuyén héa: Vitamin C oxy hóa thuận nghịch thành acid dehydroascorbic. Một ít
vitamin C chuyển hóa thành những hoạt chất khơng có hoạt tính gồm ascorbic acid-
2-sulfat và acid oxalic được bài tiết trong nước tiểu.
Thải trù: Ngưỡng đào thải qua thận khoảng
14ug/ml, ngưỡng này thay đổi theo
từng người. Khi cơ thể bão hòa vitamin C va nồng độ máu vượt quá ngưỡng,
vitamin C không biến đổi được và đào thải vào nước tiểu [2].
1.1.4 Độ ôn định và sự phân hủy của vitamin C
1.1.4.1 Độ ỗn định của vitamin C
Độ ổn định của vitamin C phụ thuộc vào nhiều yếu tố.
Nhiệt độ
,
Hàm lượng vitamin C giảm dần khi nhiệt độ bảo quản tăng dần [13],[23]. Một
nghiên cứu về độ ổn định của chất chuẩn vitamin C và vitamin C trong viên
nén
cho thấy, khi được lưu trữ ở các nhiệt độ từ 4°C đến 95°C, hàm lượng vitamin C
chuẩn và vitamin C trong viên nén đều giảm dần khi tăng dần nhiệt độ bảo quản
[21]. Tại bất kỳ nhiệt độ bảo quản nào, dạng acid ascorbic luôn ổn định hơn dạng
muối natri ascorbat [13].
Độ ẩm
Nước là một yếu tố quan trọng có liên quan đến sự ổn định của vitamin C, Sự phân
hủy của vitamin C sẽ tăng nhanh khi độ âm tăng [12].
Tốc độ phân hủy vitamin C ở dạng rắn cham hon khi vitamin C 6 dạng dung dịch
rất nhiều, tốc độ phân hủy 4,1 x 10s? khi ở dang rắn va 1,8 x 101 khi ở dang
dung dich [13].
Thời gian lưu trữ
Nhóm
tác giả Vítor Spínola, Berta Mendes, José §. Câmara, Paula C. Castilho thực
hiện nghiên cứu sự ảnh hưởng của thời gian lưu trữ lên độ ổn định của vitamin C
với kết quả: Ở 23°C, sau 1h, dung dịch mẫu chuẩn còn chứa khoảng 98,6% vitamin
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
C, vitamin
C trong
dịch
chiết trái cây còn
khoảng
98,1%.
Sau
5h,
hàm
lượng
vitamin C trong mẫu chuẩn còn lại 94,4%, trong mẫu thủ giảm còn 93,7% [29].
pH
Các mẫu vitamin C được hịa tan trong nước cất có pH khác nhau và bảo quản ở
nhiệt độ phòng. Sau 30 ngày, phần trăm còn lại của vitamin C ở các pH khác nhau
như sau: hàm lượng vitamin C còn lại khoảng 30% ở các pHÏ từ 2-8, ngoại trừ pH
3,
hàm lượng vitamin còn lại khoảng 56% [35].
1.1.4.2 Sự phân hủy của vitamin C
Quá trình phân hủy vitamin C là một quá trình phức tạp. Trong nước, sự phân hủy
xảy ra theo 2 hướng: thuận nghịch (phản úng oxi hóa — khủ) và khơng thuận nghịch
(khơng có phản ứng oxi hóa — khử)
Phản ứng không thuận nghịch: tốc độ phân hủy của vitamin C giảm khi pH tăng từ
2,2-6,0; khi pH tăng tới trên 7,0 thì sự phân hủy tăng. Sản phẩm tạo thành là
furfural, carbon dioxid, và một số sản phẩm khác.
Phản ứng thuận nghịch: được nghiên cứu rộng rãi hơn, nhanh gap 100-1000 lần
so
với phản ứng không thuận nghịch. Phản ứng này xảy ra nhanh hơn khi pH tăng từ
2,0-5,0 và giảm khi pH tăng từ 5,0-9,0; tăng lên khi pH trên 9 [33].
Acid dehydroascorbic (DHAA)
là sản phẩm oxi hóa đầu tiên của dung dịch acid
ascorbic (thuận nghịch), sau đó xảy ra q trình oxi hóa khơng thuận nghịch thành
2,3-diketogulonic acid và sau đó thành furan, keto acid và các acid carboxylic[12],
acid oxalic, cdc acid threonic [30].
1.1.5 Tác dung của vitamin C lên sức khỏe con người
1.1.5.1 Tác dụng được lý của vitamin C
Vitamin C có khả năng khử trong nhiều phản ứng sinh học oxy hóa — khử, là một
chất chống oxy hóa hữu hiệu. Vitamin C loại bỏ ngay các loại oxy, nitơ phản Ứng
(các ROS = Reactive oxygen species và các RNS = reactive nitrogen species) như
các gốc hydroxyl, peroxyl, superoxid, peroxynitrit và nitroxid), các oxy tự do và
các hypoclorid, là những gốc tự do gây độc hại cho cơ thể. Có rất nhiều chúng cứ
sinh học chúng tỏ các gốc tự do ở nồng độ cao có thể gây tổn hại cho tế bào.
5
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
Vitamin C cũng đã tham gia một số chất khử trong hệ thống enzyme chuyên hóa
thuốc cùng với cytochrom P4so. Hoạt tính của hệ thống enzyme chuyển hóa thuốc
này sẽ bị giảm nếu thiếu vitamin C [2].
Một số chức năng sinh học của vitamin C đã được xác định rõ ràng, gồm
có sinh
tổng hợp collagen, carnitin, catecholamine, tyrosin, corticosteroid, aldosteron [2],
[29]. Bên cạnh đó, vitamin C cịn điều hịa hấp thu, vận chuyển và dự trữ sắt [15].
Vitamin C còn được chứng minh giúp tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể do
tăng phản
ứng
kháng
thể, thúc đây hoạt động
của neutrophil
chống nhiễm khuẩn, tăng sức đề kháng, đặc biệt là ở trẻ em [17].
và tăng khả năng
Bên cạnh đó, vitamin C cịn là chất có lợi cho hệ tim và mạch máu. Vitamin C giúp
làm giảm sự tạo thành lipoprotein a, chất có tác động lớn đến bệnh tim mạch ở nồng
độ cao. Bên cạnh đó, vitamin C góp phần ngăn chặn sự liên kết của lipoprotein a
vào thành động mach. Do đó vitamin C rất hữu ích trong việc ngăn chặn sự tắc
nghẽn động mạch [26], giảm nguy cơ đột quy và bệnh mạch vành [28]. Vitamin C
cũng làm giảm nguy cơ rung nhĩ sau các cuộc phẫu thuật tim [22].
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy vitamin C có hiệu quả trong việc hạn chế sự
phát triển của các tế bào ung thư tuyến tụy [9], [10], làm giảm huyết áp ở các phụ
nữ sau mãn kinh do làm ngăn cản sự co mạch ở các hệ mạch ở các chỉ [25].
1,1.5,2 Thira vitamin C
Vitamin C rất ít độc tính và ít có tác dụng bất lợi ở liều cao [11]. Tuy nhiên ở một
số người, dùng vitamin C 2-3g/ngày có thẻ dẫn đến tiêu chảy. Bên cạnh đó, oxalat
(sản phẩm dị hóa cuối cùng của vitamin C) là một yếu tố quan trọng góp phần hình
thành sỏi thận, đặc biệt ở liều dùng trên 1000mg/ngay [37].
1.1.5.3 Thiếu vitamin C
Thiếu hụt vitamin C xảy ra khi thức ăn cung cấp không đầy đủ lượng vitamin C cần
thiết, dẫn đến bệnh scorbut. Có thể nhận biết bệnh này qua các triệu chứng như dễ
chảy máu nướu răng, da khô, mệt mỏi, chậm liền vết thương. Cung cấp vitamin C
cho cơ thể bằng rau quả hoặc các viên bổ sung vitamin C làm mắt hoàn toàn các
triệu chứng trên [2],[19].
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
1.1.6 Nhu cầu vitamin C hằng ngày
Cơ thể người không tự tổng hợp được vitamin C cho bản thân mà phải lẫy
từ nguồn
thức ăn [16]. Nhu cầu vitamin C hằng ngày cho từng nhóm tuổi theo khuyến nghị
của Viện Dinh dưỡng quốc gia (Bộ Y Tế) [3] được trình bày trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Lượng dùng vitamin C khuyến cáo hằng ngày cho người Việt Nam (RN])
Nhóm tuổi
Nhu cầu vitamin C (mg/ngày)
Trẻ em 0-6 tháng tuổi
25
Trẻ em 7 tháng tuôi — 6 tuổi
30
7-9 tudi
35
10-18 ti
40
19-trén 65 tudi
45
Phụ nữ có thai
35
Phụ nữ cho con bú
75
Vitamin C được bô sung chủ yếu qua thực phẩm hằng ngày. Hơn 90% lượng
vitamin C được cung cấp từ bữa ăn nhờ trái cây và rau củ (cam, dâu, cà chua, khoai
tây, cải lá xanh, cải bó xơi) [27],[30].
1.2 Các phương pháp phân tích vitamin C
1.2.1 Định tính vitamin C được quy định trong DDVN IV [1]
Định tính ngun liệu viaminC:
`
Có thể chọn một trong hai nhóm định tính sau:
Nhóm I: B, C
Nhóm II: A, C,D
Dung dich S : Hòa tan 1,0g chế phẩm trong nước khơng có carbon dioxyd (TT)
và
pha lỗng thành 20ml bằng cùng dung mơi.
A. Hịa tan 0,10g chế phẩm trong nước và pha lỗng ngay thành 100,0ml với cùng
dung mơi. Cho 1,0ml dung dịch mới pha vào 10ml dung dịch acid hydrocloric 0,1N
(TT) va pha loang thanh 100,0ml bang nuéc. Do độ hấp thu tử ngoại của dung dịch
thu được ngay sau khi pha lỗng. Dung dịch chỉ có duy nhất một cực đại hap thu
ở
243nm. Giá trị A (1%, lem) ở 243nm nằm trong khoảng từ 545 đến 585.
7
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
B. Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của acid
ascorbic chuẩn. Dập viên chứa 1 mg chế phẩm.
C. pH của dung dịch S nằm trong khoảng từ 2,1 đến 2,6.
'D. Thêm 0,2ml dung dịch acid nitric loãng (TT) và 0,2ml dung dịch bạc nitrat 2%
(TT) vào Iml dung dịch S, sẽ xuất hiện tủa màu xám.
1.2.2 Định lượng vitamin C trong DDVN IV, USP 35, BP 2013, EP 7:2010
Các phương pháp định lượng nguyên liệu vitamin C trong DĐVN IV, USP 35, BP
2013, EP 7:2010 được trình bày trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Các phương pháp định lượng nguyên liệu vitamin C
DĐVN IV [1
Hòa
phẩm.
hop
tan
trong
gồm
0,150g
một
80m
USP 35 [32]
chế | Hịa
BP 2013 [31], EP 7:2010
[7]
tan chính xác
khoảng
|Hịa
tan
chính
xác
hỗn | 0,400g chế phẩm trong hỗn khoảng 0,150g chế phẩm
xước |hợp gồm 100ml nước và | trong hỗn hợp gồm 80ml
khơng có carbon dioxyd | 25ml đụng dịch acid sulfuric | nước
khơng
có
carbon
ŒTT) và 10m] đưng địch | 2N, thêm 3ml dung dịch hồ | dioxyd (TT) và 10ml
acid sulfuric 1M (TT).| tinh bột. Chuan dé bang] dung dich acid sulfuric
Thém Iml dung dich hé | dung dịch Iod 0,1N chudn. | 1M. Thém Iml dung dich
tỉnh bột (TT). Chuẩn độ | Thực
bằng
0,IN
dung
(CĐ)
dịch
cho
iod|
hiện
song
song
mẫu trắng gồm 100ml nước,
tới khi | 25ml
acid
sulfuric
2N
xuất hiện màu xanh tím | 3ml dung dịch hồ tinh bột.
bền vững.
với | hồ
Hàm
vaj|
tỉnh
bột.
bằng
dung
0,05N
chuẩn
Chuẩn
dich
độ
Iod
cho tới khi
| xuất hiện màu xanh tím
lượng % vitamin C có | bền vững. !ml dung dich
Iml dung dich iod 0,1N | trong chế phẩm được tính | lod 0,05N tương đương
(CĐ)
tương đương
8,8lmg CeHsOc.
với | theo công thức:
vGi 8,81mg CeHsOc.
(V-B)xNx Fx100
W
Voi:
V: Thé tich dung địch iod 0,1N khi chuẩn độ mẫu thir (ml).
