0108 nghiên cứu xây dựng quy trình định phân tích một số glucocorticoid ngụy tạo trong mỹ phẩm trị mụn làm trắng da bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (44.04 MB, 115 trang )
Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CÀN THƠ
4! QC Y DƯỢC CÂN THƠ
THU VIEN
NGUYEN QUOC TUAN
NGHIEN CUU XAY DUNG QUI TRINH
PHAN TICH MOT SO GLUCOCORTICOID NGUY TAO
TRONG MY PHAM TRI MUN, LAM TRANG DA
BANG PHUONG PHAP SAC KY LONG SIEU HIEU NANG
GHEP DAU DO HAI LAN KHOI PHO
Chuyén nganh: Kiém nghiệm thuốc và Độc chất
Mã số: 60.72.04.10.CK —
THU VEEN
PRU NG DAL HOC Y DUOC CAN THO
LUAN VAN CHU"
HAY TON TRENG BAN QUYEN
FEN
KHOA
TO
Người hướng dẫn khoa học:
TS. PHẠM THỊ TÓ LIÊN
TS. DO CHAU MINH VINH THO
Can Tho — Nam 2016
Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
[
LOI CAM DOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tơi. Các thơng tin
trích dan trong luận văn có nguồn gốc, độ chính xác cao và đã được chỉ dân
rõ ràng.
Các
số liệu và kết quả
được
nêu
trong
luận
văn
là trung thực,
chưa từng được cơng bồ trong bắt cứ cơng trình nào khác.
Cần Thơ, ngày 09 tháng 08 năm 2016
g=<
Học viên
Nguyễn Quốc Tuấn
Ve
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
I
LOI CAM ON
Luận văn này được thực hiện tại phịng thí nghiệm của Liên bộ mơn
Hóa phân
Dược
Cân
TV.Pharm.
tích - Kiểm
Tho,
nghiệm
Phịng
Kiểm
- Độc
chất, Khoa Dược,
nghiệm
- Cong
ty
Truong Dai hoc Y
Cé phan
Dược
phẩm
Dé hoan thành được luận văn này tôi đã nhận được rất nhiều sự
động viên, giúp đỡ của bạn bè và thầy cô.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất Cô
1S. Phạm Thị Tố Liên và Thay TS. Đỗ Châu Minh
Vĩnh Thọ đã truyền
đạt cho
tôi kiến thức khoa học quý giá cũng như đã nhiệt tình hướng dẫn hỗ trọ,
động viên tơi trong suốt q trình thực hiện để hồn thành luận văn này.
Xin cùng bày tỏ lịng biết on chan thành tới các thây cô giáo, người đã
đem lại cho tôi những kiến thúc bổ trợ, vô cùng có ích trong khóa học vừa qua.
Cũng xin gửi lời cảm on chân thành tới Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo
sau đại học, Đại học Y Dược
Cân Thơ đã tạo điều kiện cho tơi trong qua
trình học tập và Trung tâm Kiểm Trà Vinh đã hỗ trợ tôi trong quá trình thu
thập mẫu mỹ phẩm tại thị trường tỉnh Trà Vĩnh.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, đặc biệt các em
Dược
sĩ DK37
vừa
tốt nghiệp-làm
đề tài tốt nghiệp
kiểm nghiệm
thuốc,
những người đã luôn bên tôi, giúp đỡ, động viên và khuyến khích tơi trong
quả trình thục hiện cơng trình nghiên cứu của mình.
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
ly
MUC
LUC
Trang
Trang phu bia
Loi cam doan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ
ĐẶT VẤN ĐỀ ................... ch.
eerde
1
Chuong 1. TONG QUAN TALI LIỆU.........................
2-22 222E222EEE222EEE2222S2 3
1.1. Tổng quan về Glucocorticoid...........................--.s--52222cszcvzvssecccr
3
1.2. Thực trạng việc nguy tao glucocorticoid trong my pham
7
........
1.3. Các phương pháp xử lý mẫu phổ biến .................................--.---- 9
1.4. Phương pháp UPLC-M§S/MS
...........................á-Goccoe
cv sekrtrey
10
1.5. Một số nghiên cứu phân tích định tính, định lượng glucocorticoid
ngụy tạo trong mỹ phẩm và các chế phẩm khác ............................
15
1.6. Thâm định quy trình phân tích........................------c¿-222v2vc+t2c2vzve 17
Chương 2. ĐĨI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................---------.++rrrrrrrrrrrrres 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu. ...................................
c5 < cac che
22
2.3 Dung mơi - hóa chất - trang tiết bị...........................----©c¿ccecczeccsez
22
2.4. Nội dung nghiên cứu. ...........................-----s5
12kg veererrvy 23
Chương 3: KẾT QUÁ. .................................225-2522 xE2EEE2EE1152222322255 22252, 34
3.1. Điều kiện khối phổ tối ưu tín hiệu DXA, BM, PR, TAC và
nội chuẩn IMPR. .............22+.
.............
E22 1122111211122
......EEEerrrxe, 34
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học IV
3.2. Điều kiện sắc ký thích hgp tach dong thoi DXA, BM, PR, TAC
và nOi Chuan MPR u.seccccssecscssssssssssssecsesssvessssvecssavecsssssecsessnveseesenvesees 35
3.3. Qui trình xử lý mẫu tối ưu ...............................----.sc5c2zscrrerrrrrei 36
3.4. Thẩm định quy trình định tính, định lượng đồng thời DXA, BM,
PR, TAC trong mẫu mỹ phẩm bằng phương pháp UPLC-MS/MS_... 38
3.5. Ứng dụng qui trình phân tích các mẫu mỹ phẩm thu thập ở
tỉnh Tra Vinh o...ccccscccsscccssssecssssessssseccssvcssssesssuessssesssutsessnesensesessaees
46
Chương 4: BÀN LUẬN oncccccsssssssssssssssssesssesesssssscssssscessussessseuesessssssesesenseese 49
4.1. Điều kiện khối phổ tối ưu ..............................---2-22222czccvE2veceerer 49
4.2. Diều kiện sắc ký thích hợp..........................- sccsc+ccxxrcErrrerrsevrrrcrrr 51
4.3. Qui trình xử lý mẫu tối ưu .............................. T121 tre
56
4.4. Thâm định qui trình phân tích..........................-----©22z222z2Exscerzes 58
4.5. Ứng dụng qui trình phân tích các mẫu thị trường ................
61
KET LUAN 0015
....
...
64
KIÊN NGHỊ, ..................
2222222 12121.........
02211101111
1... xe
.....TÀI LIỆU THAM KHẢO
66
PHỤ LỤC
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
v
DANH MUC CAC KY HIEU, CAC CHU VIET TAT
ASEAN
Association of Southeast
Hiệp hội các quốc gia Đông
Asian Nations
Nam Á
ACN
Acetonitril
AOAC
Association of Official
Hiiệp hội các nhà hóa phân
Analytical Chemists
tích quốc tế
BDM
BM
Bình định mức
Betamethasone
Betamethason
CTPT
Cơng thức phân tử
DDVN 4
Dược điển Việt Nam 4
DXA
Dexamethasone acetate
GC
Glucocorticoid
GC-MS
Gas Chromatography-
Dexamethason acetat
Sắc ký khí ghép khối phổ
Mass Spectrometry
HLB
Hydrophilic Lipophilic
Độ cân bằng ưa ky nước
Balance
HPLC
High Performance Liquid
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Chromatography
ICH
International Conference
Hiệp hội đồng thuận quốc tế
Harmonisation
IS
Internal Standard
Nội chuân
LC-MS
Liquid Chromatography-
Sắc ký lỏng ghép nối khối phổ
Mass Spectrometry
LOD
Limit Of Detection
Giới hạn phát hiện
LOQ
Limit Of Quantitation
Giới hạn định lượng
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
MeOH
Methanol
Methanol
MPR
Methyl prednisolone
Methy] prednisolon
MS
Mass Spectrometry
Khối phổ
MRM
Multiple Reaction
Kiểm soát đa phản ứng
Monitoring
PDA
Photo Diode Array
Đầu đò đãy điod quang
ppb
Parts per billion
Một phần ty
ppm
Parts per million
Một phần triệu
PR
Prednisolone
Prednisolon
Reverse phase
Pha đảo
Relative Standard
Độ lệch chuẩn tương đối
RSD
Deviation
Sắc ký đỗ
SKD
SPE
Solid phase extration
Chiết pha rắn
SRM
Selected Reaction
Kiểm soát phản ứng chọn lọc
Monitoring
TAC
Triamcinolone acetonide
Triamcinolon acetonid
TEA
Triethanolamine
Triethanolamin
UPLC-MS/MS
Ultra Performance Liquid
Sắc ký lỏng siêu áp ghép nối
Chromatography tandem
với
Mass Spectrometry
tứ cực chập ba
United States
Dược điển Mỹ 36
USP 36
detector
khéi
phổ
kiểu
Pharmacopeia 36
UV-Vis
Ultraviolet-visible
Quang phổ tử ngoại-khả kiến
VILAS
Vietnam Laboratory
Hệ thống công nhận phịng thí
Accreditation Scheme
nghiệm Việt Nam
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Vl
A,
DANH MỤC CÁC BANG
Bảng 1.1: Các điều kiện sắc ký trong một số qui trình nghiên cứu phân tích,
phát hiện glucocorticoid trong mỹ phẩm trị mụn, trắng da và sản phẩm khác...
15
Bang 1.2: Các phương pháp xử lý mẫu trong một số qui trình nghiên cứu .....
16
Bảng 2.1: Chất chuẩn đối chiếu của các glucocorticoid nghiên cứu và
nội chuẩn....................................-«tt ề k1 E1111177111111171171172111111.111 111L
19
Bảng 2.2: Cơng thức mẫu trắng giả lập ...........................----¿--2-©52©75z
522cc
20
Bảng 2.3: Mã hóa các mẫu mỹ phẩm thu thập từ thị trường tỉnh Tra Vinh .... 21
Bang 2.4: Các trang thiết bị, dụng cụ dự kiến sử dụng trong nghiên cứu ..... 23
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát điều kiện MS tối ưu các chất phân tích .........
34
Bảng 3.2: Chương trình chạy gradient thích hợp ......................................
35
Bảng 3.3: Kết q tính tương thích hệ thống trên mẫu hỗn hợp chuẩn .... 39
Bảng 3.4: Kết quả tính tương thích hệ thống trên mẫu thử giả lập ........... 39
Bảng 3.5: Bảng kết quả khảo sát Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
..... 4I
Bang 3.6: LOD, LOQ của các chất cần phân tích ....................................-
43
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ đúng của quy trình phân tích ....................
44
Bảng 3.8: Kết quả độ chính xác trong ngày và liên ngày
.........................
46
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát trên các mẫu thu thập trên thị trường ............
47
Bảng 4.1: Chương trình chạy gradient thích hợp .................................-.-
34
NA
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Vài
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình 1.1: Phổ UV của DXA trong MeOH
......................222c:22ccc2E2ecsszet
4
Hình 1.2: Cấu trúc của DXA...............................-- 2525222221111
re.
Hình 1.3: Phổ UV của BM trong MeOH .............................---2222zxzcczversrer
Hinh 1.4: CAu tritc cla BM ooecceeeesscccssesssssessssssssscsessucensecensesensecsessnesstsavecee
Hinh 1.5: Phé UV ctia PR trong MeOH o.....ccscsscsssssssssseesssseesssssssesssssnneeee
4
5
5
6
Hình 1.6: Cấu trúc của PR....................
2-22 212E221112111E .......
21721112211. re. 6
Hinh 1.7: Phé UV cla TAC trong MeOH ............................--2:222czc2c2ccccrr 6
Hình 1.8: Cấu trúc TAC .......................... --©st22t2222119211121121122E221EEE.cEEecrrrreer
6
Hình 1.9: Phổ UV của MPR trong MeOH .........................--2-22ssc22sc2csrserrey 7
Hình 1.10: Cấu trúc MPR.......................
s2 ExEEEEE11272E77212211EEEtec
....--2-rrrres 7
Hình 1.11: Sơ đồ hệ thống UPLC ..........................--.2-2++2s+etvrxvetrrvscecez 10
Hình 1.12: Sơ đồ khối phổ MS/MS ...............
2. .............
s2 tcSEvetErvrrtrerrtrree 11
Hình 1.13: Sơ đồ khối của ba tứ cực ndi tiép (Triple quadrupole) ...........
12
Hình 1.14: Sơ đồ kỹ thuật tạo ion ESL..............................-s¿-2222xzz2ctzrvrerrer 13
Hình 1.15: Sơ đồ kỹ thuật ghi phổ SRM..............................---22-2222s22S2zeccrrr 14
Hình 1.16: Sơ đồ kỹ thuật ghi phổ MRM.............................. 565cc,
14
Hình 2.1: So dé tiến hành khảo sát dung mơi chiết.............................. .... 27
Hình 2.2: Sơ đồ tiến hành khảo sát phương pháp chiết ............................. 28
Hình 2.3: Sơ đồ tiến hành khảo sát loại tạp theo cách 1 ............................ 29
Hình 2.4: Sơ đồ tiến hành khảo sát loại tạp theo cách 2 ........................... 29
Hình 3.1: Năng lượng phân mảnh tối ưu và các mảnh tạo thành của các
DXA, BM, PR, TAC và nội chuẩn MPR.............................----5252vvvccccccccee 34
Hình 3.2: SKĐ của DXA, BM, PR, TAC và nội chuẩn MPR ở điều kiện
sắc ký và khối phô tối ưu trên nền mẫu thử giả lập ................................... 36
Hình 3.3: Sơ đồ qui trình xử lý mẫu tối ưu ..............................---2c¿+2czvzzcct 37
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học L X
|
Hình 3.4: SKĐ
mẫu thử giả lập chiết 3 lần và mẫu thử giả lập chiết
lần thứ 4 thể hiện kết quả khảo sát chiết kiệt PR.................................---.-e.
37
Hình 3.5: Kết quả xử lý dữ liệu gốc việc khảo sát chiết kiệt mẫu thử gia lap
sau 03 Lan Chiet ..ccccccccccccssssecssssvecscssssvessssvessssevecsssessssescessasessssssesessssecseeeee
Hình 3.6: SKD
DXA
trong mẫu hỗn hợp chuẩn pha trong MeOH
38
(a) và
trong mẫu thử giả lập (b), được tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp ........................
40
Hinh 3.7: SKD mau trắng (a), mẫu thử giả lập (b) ở điều kiện tối ưu ....... 4]
Hình 3.8: Đồ thị biễu diễn su tương quan giữa nồng độ và tỉ lệ diện tích
dinh DXA, BM, PR, TAC, so với nội chuẩn MPR.............................-s,ccsc¿-Hinh 3.9:
CUA PR
SKD mau chuân 750ppb,
500ppb, 250ppb,
100ppb,
42
50ppb, 20ppb
................
42
Hình 3.10: SKB minh hoa LOD cia DXA 0,1ppb; BM 3ppb; PR 0,1 ppb;
IV. 9100001...
43
Hình 3.11: SKĐÐ mẫu trắng giả lập thêm chuẩn BM 6 50ppb, 100ppb,
250ppb
4118111191 TK
Họ HH
HT HT TH TH TH
nh TH HT Tế uc
45
Hình 3.12: SKĐ các mẫu thử giả lập khảo sát độ chính xác liên ngày ..... 46
Hình 3.13: SKĐÐ mẫu M-17 có ngụy tạo BM, DXA.
...................................
48
Hình 4.1: SKĐÐ khảo sát pha động ở tỉ lệ đăng dịng của ACN-HạO (35:65)...
55
Hình 4.2: SKD khảo sát các tỷ lệ pha động với chương trình gradient2...
55
Hình 4.3. Phổ đồ của mẫu trắng (a), mẫu thử (b) ở chế độ MS fullscan và
chế độ MRM bắt chọn lọc mảnh con định lượng của PR (e) ....................
59
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
1
DAT VAN DE
Trong xã hội hiện đại ngày nay, chất lượng cuộc sống con người ngày
càng được quan tâm, bên cạnh nhu cầu về chăm sóc sức khỏe thì nhu cầu
làm đẹp là một trong những vấn đề rất được chú trọng. Theo đó, xu hướng
sử dụng mỹ phẩm với mục đích chăm sóc sắc đẹp đang rất phổ biến, điển hình
nhất là mỹ phẩm điều trị mụn và làm trắng da. Nắm bắt được điều này, một số
cơ sở sản xuất, mua bán khơng chân chính đã cung cấp mỹ phẩm có trộn
trai phép
thanh phan
glucocorticoid
nham
đánh
lừa người
tiêu ding
do
hiệu quả điều trị mụn và làm trắng tức thời trong thời gian đầu sử dụng,
nhưng để lại hậu quả nghiêm trọng cho người tiêu dùng (tổn thương thận,
xương, đa, dạ dày) khi sử dụng thời gian dài.
Năm 2003, chính phủ Việt Nam đã ký kết “Hiệp định hệ thống hòa hợp
ASEAN
mỹ
trong quản
phẩm,
được
hòa hợp ASEAN
lý mỹ
phẩm”.
Glucocorticoid
qui định trong phụ lục Annex
trong quản lý mỹ phẩm
đã bị cấm
II của Hiệp
dùng trong
định hệ thống
[16] cũng là trong danh mục chất
bị cắm qui định tại Thông tư số 06/2011/TT-BYT ngày 25 tháng 01 năm 2011
của Bộ Y tế qui định về quản lý mỹ phẩm [41].
Tại
Việt
Nam,
hiện
nay
việc
ngụy
tạo
glucocorticoid
mỹ phẩm ngày càng phổ biến và tỉnh vi hơn. Nhằm
vào
trong
mục đích kiểm sốt
van dé nay đã có một số cơng trình nghiên cứu về việc định tính phát hiện các
glucocorticoid bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao [7], [17].
Tuy nhiên, cho đến nay cịn rất ít các qui trình định lượng đồng thời các
glucocorticoid bằng phương pháp phân tích hiện dai cho độ tin cậy, độ chính
xác và độ nhạy cao, kể cả trong DĐVN IV, DĐ Anh (BP 2013), DĐ Mỹ (USP
36) [6], [37], [38]. Vì thế, việc xây dựng một qui trình phân tích nhằm định
tính nhanh
và
định
lượng
đồng
thời
các
glucocorticoid
ngụy
tạo trong
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
mỹ phẩm
2
với độ tin cậy, độ nhạy cao là yêu cầu hết sức cấp thiết. Do đó,
đề tài “'Wghiên cứu xây dung qui trinh phan tich m6t sé glucocorticoid nguy
tạo trong mỹ phẩm
trị mụn, làm trăng da bằng phương pháp sắc ký lỏng
siêu hiệu năng ghép đầu dò hai lần khối phổ” được thực hiện.
Với các mục tiêu:
-
Xây dựng và thâm định qui trình định tính, định lượng đồng thời
dexamethason, betamethason, prednisolon, triamcinolon có trong mỹ phẩm
trị mụn, làm trắng da bằng phương pháp UPLC-MS/MS.
- Ung
dụng qui trình phân tích đã thẩm định kiểm tra chất lượng một số
mỹ phẩm trị mụn, làm trắng da đang lưu hành tại tỉnh Trà Vinh.
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
3
Chương 1
TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tông quan về glucocorticoid
1.1.1. Tác dụng dược lÿ của glucocorticoid [3]
Glucocorticoid là một loại hormon do vùng bó vỏ thượng thận tiết ra,
gồm hai chất là hydrocortison và cortison. Glucocorticoid dang téng hợp gồm
nhiều chất khác nhau, được nghiên cứu và tổng hợp dựa trên sự thay đổi trong
công thức nhằm cải thiện tác dụng dược lý, thời gian tác dụng, nâng cao hiệu
quả điều trị và hạn chế tác dụng không mong muốn.
Tác dụng sinh lý cha glucocorticoid: Chống stress, kháng viêm, ức chế
miễn dịch, tham gia vào sự cân bằng nội môi, tác dụng trên chuyển hóa và
một số tác dụng khác: trên cơ quan, tuyến, sự tạo tế bào mắu,... Trong
đó, cơ
chế tác dụng chống viêm của glucocorticoid là ức chế các hóa chất trung gian
gây
sưng viêm, giảm chức năng của nguyên bào sợi, giảm sản xuất collagen
và glycosaminglycan nên ngăn cản sự phát triển của lớp sừng. Một số công ty
hay cá nhân kinh doanh trái phép lợi dụng tác dụng này để trộn vào mỹ phẩm
làm trắng da, trị mụn cấp tốc mà không quan tâm đến hậu quả. Lớp sừng có
nhiệm vụ bảo vệ da và cơ thể, mat đi lớp sừng các tế bào non dé bị ảnh hưởng
của bức xạ mặt trời nên da càng đễ bị nám hơn.
Hơn nữa, vì glucocorticoid có tác dụng ức chế miễn dịch nên nếu dùng
để giảm sưng viêm trong trị mụn sẽ che lấp đi dấu hiệu và làm tăng nhiễm
trùng, nhiễm nấm. Bên cạnh đó, glucocorticoid có khá nhiều tác dụng khơng
mong
muốn:
phù,
lỗng
xương,
suy tuyến
thượng
thận,
gây hội chứng
Cushing, chậm lành vết thương... Những tác dụng này thường gặp khi sử
dụng quá liều, dùng trong thời gian đài. Việc sử dụng glucocorticoid ở dang
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
4
bơi ngồi da trên điện rộng cũng làm hấp thu vào máu và chịu ảnh hưởng của
tác dụng không mong muốn giống như đường dùng khác.
1.1.2. Tính chất lý hóa của glucocorticoid và IS sử dụng trong nghiên cứu
1.1.2.1, Dexamethason acetat (DXA) [6], [37], [38]
Dexamethason
acetat:
9-fluoro-11$,17-dihydroxy-16a-methyl-3,20-
dioxopregna-1 ,4-dien-21-yl acetate.
CTPT: C;4H;¡FO¿. Phân tử lượng: 434.497743 g/mol
Tính chất:
- Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, đa hình.
- Dễ tan trong ethanol 96% và aceton, khó tan trong methylen clorid,
thực tế khơng tan trong nước.
- pKa = 12,14 (dạng base).
Absorbance
- Cực đại hấp thu khi pha trong methanol 238,5nm.
200
L
225
+
292
+
2756
4,
300
+
L
325
332
+
376
400
Viavelengih
Hinh 1.1: Phé UV cia DXA trong MeOH
Hình 1.2: Cấu trúc của DXA
- Cac phân mảnh dic trung: m/z 121, 122, 315, 43, 147, 223, 135, 41
1.1.2.2. Betamethason (BM) [6], [37], [38]
Betamethason:
9-fluoro-11B,17,21-trihydroxy-16f-methylpregna-1,4-
điene-3,20-dion.
CTPT: Ca2H29FOs.
Phân tử lượng: 392.461063 g/mol
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
5
Tính chất:
- Dạng bột kết tỉnh màu trắng hoặc gần như trắng.
- Thực tế khơng tan trong nước, ít tan trong ethanol khan, rất ít tan
trong methylen clorid.
- pKa = 12,42
- Cực đại hấp thu khi pha trong methanol là 238,5nm.
200
1
22
4
25
+,
275
—
3Ơ
+
326
+
350
L
375 400
Warelength
Oo
Hinh 1.3: Phé UV cia BM trong methanol
Hình 1.4: Cấu trúc của BM
- Các phân mảnh đặc trưng: z⁄2 121, 43, 122, 223, 147, 91, 41, 135
1.1.2.3. Prednisolon (PR) [6], [37], [38]
Prenisolon: 118, 17, 21-Trihydroxypregna-1, 4-diene-3, 20- dion
CTPT: Ca¡H;sO:.
Phân tử lượng: 360.44402 g/mol:
Tính chất:
- Bột kết tỉnh màu trắng hoặc gần như trắng.
- Rất ít tan trong nước, dé tan trong ethanol 96% va methanol, hoi tan
trong aceton va methylen clorid.
- pKa =
12,58
- Cực đại hấp thu trong methanol 1a 242 nm.
Absoebanco
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
20
+
225
+
250
2
275
300
:
325
+
350
+
375
400
Wavelength
©
Hình 1.5: Phổ UV của PR trong MeOH
Hình 1.6: Cấu trúc của PR
1.1.2.4. Triamcinolon acetonid (TAC) [37], [38]
Triamcinolon acetonid 1a 9-Fluoro-11b,21-dihydroxy-16a,17-(1methylethylidene dioxy) pregna-1,4-diene-3,20- dione.
CTPT: Co4H31FO¢.
Phân tử luong: 434.497743 g/mol
Tinh chat:
- Màu trắng hoặc gần như trắng, đạng bột tỉnh thé.
- Tính tan: thực tế khơng tan trong nước, ít tan trong ethanol 96%.
Tan nhiều trong methanol.
- pKa = 11,75 (dang base)
Absorbance
- Cực đại hấp thu trong methanol là 238nm.
20
225
25
2
275
300
‘
325
+
350
1
375
400
O
Wavelength
Hình 1.7: Phổ UV của TAC trong MeOH
Hình 1.8: Cấu trúc TAC
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
7
1.1.2.5. Nội chuẩn methyl prednisolon (S-MPR) [6], [37], [38]
Methylprednisolon: 11B,17,21-trihydroxy-60-methyl-pregna-1,4-dien-3,20-dion
CTPT: C22H300s.
Phân tử lượng: 374.4706 g/mol
Tính chất:
- Bột kết tỉnh đa hình trắng hoặc gần như trắng.
- Thực tế không tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96%, ít tan trong
Absorbance
aceton và dicloromethan.
20
1
2235
1
25⁄2
1
275
300
———
325
350
1
375
400
Hình 1.9: Phổ UV của MPR trong MeOH
Hình 1.10: Cấu trúc MPR
1.2. Thwe trang viéc nguy tao glucocorticoid trong my phẩm
1.2.1. Thực trạng việc ngụy tạo glucocorticoid trong mỹ phẩm
Trong vòng 10 năm trở lại đây, các sản phẩm mỹ phẩm được sản xuất,
nhập khẩu, phân phối, lưu thông trên thị trường rất phong phú, nhiều chủng
loại. Trong đó, mỹ phẩm trị mụn, làm trắng da đang chiếm tỉ lệ cao trong thị
trường mỹ phẩm nước ta, chúng được phân phối ở siêu thị, chợ, cửa hàng, cơ
sở làm đẹp tư nhân, cho đến bán hàng thông qua internet... Hơn nữa, với dân
số khoảng 83 triệu người, nước ta đã trở thành một thị trường tiềm năng của
những mặt hàng nhập lậu trái phép, không rõ nguồn gốc xuất xứ cũng như độ
an toàn, tin cậy khi sử dụng.
Bên cạnh đó, đã xuất hiện rất nhiều những mặt hàng mỹ phẩm như kem
trộn trắng da, kem trị mụn, kem tây da được pha trộn trái phép thành phần
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
8
glucocorticoid do những người khơng có chun mơn tự tạo ra mà khơng có
nhãn mác, khơng xác định được độ an tồn cũng như khơng hề đăng ký hợp
pháp có hiệu quả “thần tốc” chỉ sau một thời gian ngắn sử dụng, nhưng để lại
mối nguy hiểm rất lớn khi sử dụng lâu đài. Thời gian qua, Cục Quản lý Dược
đã ra nhiều quyết định xử phạt hành chính, quyết định đình chỉ lưu hành và
thu hồi nhiều sản phẩm mỹ phẩm của một số công ty nhập khâu và chịu trách
nhiệm đưa sản phẩm ra thị trường vì có chứa thành phần cấm sử dụng trong
mỹ phẩm và nhãn mỹ phẩm ghi thành phần cơng thức có chứa chất khơng
được phép sử dụng trong mỹ phẩm [44], [45]. Tất cả những điều phân tích
trên thật sự là thách thức lớn trong cơng tác quản lý chất lượng mỹ phẩm.
Điền hình là đầu tháng 9/2014, Cục Quản lý Dược có cơng văn đình chỉ
lưu hành trên tồn quốc lơ sản phẩm mỹ phẩm kem dưỡng da ngừa mụn của
một công ty trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh sản xuất vì mỹ phẩm có
chứa glucocorticoid [43].
Theo thống kê của bác sĩ Huỳnh Văn Bá trong một cơng trình nghiên
cứu của nhóm ơng tại Bệnh viện Da liễu Cần Thơ (năm 2009), có trên 74%
bệnh nhân mụn trúng cá có tiền sử bơi kem trộn và những sản phẩm tương tự
có glucocorticoid [42].
1.2.2. Hậu quả của việc sứ dụng mỹ phẩm trị mụn, làm trắng da ngụy tạo
glucocorticoid
Glucocorticoid là nhóm thuốc có gốc steroid hay được sử dụng vi đặc
tính dược lực quý báu là chống viêm mạnh, chống dị ứng và ức chế miễn
dịch [4]. Do có tác dụng chống viêm, làm nhẫn bóng da, giảm ngứa nên đễ bị
lợi dụng trộn trái phép vào các kem bôi da mỹ phẩm [34]. Hậu quả của nhóm
chat nay dé lại nhiều tác dụng phụ khi dùng tại chỗ: teo đa, xơ cứng bì, viêm
da ửng đỏ, mụn trứng cá hoặc bội nhiễm vi nắm, vi khuẩn và virus, chậm liền
sẹo, đục thuỷ tỉnh thể hoặc tăng nhãn áp [4]. Những hậu quả này nặng hay
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
3
nhẹ đều tùy thuộc vào thời gian và nồng độ sử dụng, những biến chứng vơ
cùng nghiêm trọng, có khi vĩnh viễn không phục hồi.
Mặc cho những cảnh báo liên tục từ các phương tiện truyền thông, mỹ
phẩm không nhãn mác, không rõ xuất xứ, trộn trái phép glucocorticoid vẫn
xuất hiện nhan nhãn khắp nơi và bày bán rộng rãi nhằm đáp ứng nhu cầu làm
đẹp của người dùng mà bất chấp tác hại cho sức khỏe. Mặc khác, để hòa
tiêu
chuẩn
với
các
nước
ASEAN
trong
quản
hợp
lý, kiểm tra chất lượng mỹ
phẩm thì việc tăng cường phát hiện, kiểm soát chất lượng mỹ phẩm trộn
glucocorticoid trai phép là một việc hết sức cần thiết và cấp bách hiện nay.
1.3. Các phương pháp xử lý mẫu phỗ biến
1.3.1. Phương pháp chiết trực tiép [8]
Phương pháp sử dụng dung mơi để chiết trực tiếp chất phân tích từ mẫu
thử, thường là dạng rắn (thuốc bột, thuốc viên,...) hay bán rắn (thuốc mỡ,
kem,...) là một phương pháp rất phô biến, tùy vào tính tan của chất phân tích
để lựa chọn dung mơi thích hợp. Bên cạnh đó, các điều kiện hỗ trợ (lắc,
khuấy, siêu âm, gia nhiệt...) cũng như các yếu tố: thời gian chiết, số lần
chiết... cũng ảnh hưởng đến hiệu suất chiết.
1.3.2 Phương pháp chiết léng-léng [8]
Nguyên tắc cơ bản của sự chiết lỏng - lỏng là sự phân bố của chất tan
vào hai pha lỏng không đồng tan, dựa vào hệ số phân bố của chất phân tích
trong các loại dung mơi để lựa chọn dung mơi chiết phù hợp từ dung dịch ban
đầu. Hệ số phân bố bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, bản chất hai pha (độ phân cực,
tính ái nước) và pH của dung dịch (pH, lực ion).
1.3.3. Phương pháp chiết pha ran (SPE) [8]
Chiết pha rắn là q trình tách chất phân tích từ mẫu bằng một chất rán,
sau đó rửa giải bằng dung mơi thích hợp. Từ lâu kỹ thuật này được sử dụng
dé tinh chế dịch chiết trong cân bằng chiết lỏng-lỏng. Với sự phát triển của
Gen PLIB Tai liệu phục vụ hoc tap, nghiên cứu khoahọc © 10
cơng nghệ hóa học đã tao ra nhiều chất liên kết chọn lọc, hiệu quả nên SPE
càng được sử dụng rộng rãi. Kỹ thuật này không chỉ được dùng như kỹ thuật
chiết tách mà còn được đưa vào hệ thống
GC-MS,
HPLC-MS
tạo thành hệ
phân tích hồn chỉnh (tinh chế và phân tích).
1.4. Phương pháp UPLC-MS/MS [10], [31]
Phương pháp UPLC-MS/MS
được xem là một trong những cơng cụ
phân tích mạnh nhất hiện nay cho độ nhạy (fg/ml), độ chính xác và tính đặc
hiệu cao được ứng dụng trong phân tích mẫu dược phẩm, thực phẩm, mỹ
phẩm, độc chất học, sinh được học và được động học...
1.4.1. Hệ thống máy UPLC [5], [40]
Hệ thống sắc ký lỏng siêu áp (UPLC) có thể chịu được áp suất lên đến
1200 bar cho phép phân tích với các cột sắc ký có kích thước hạt nhỏ
tir 1,5 - 5 um giúp giảm thời gian, dung môi phân tích và quan trọng hơn làm
tăng khả năng phân tách, hiệu năng cột giúp cải thiện độ phân giải và tính đặc
hiệu của phương pháp lên gấp nhiều lần.
Cật UPLC
—
đ
l
Phun
Mẫu tự động
*
Quản lý mẫu
,
Bìnhchứa
pha động
T
:
Bơm
Quản lý dung mơi
Hệ thống phân phối
Trạm đữ liệu máy
š
Mẫu
Dầu dị
Chất thải
Hình 1.11: Sơ đồ hệ thống UPLC
Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
11
1.4.2. Đầu dò hai lần khối phé (MS/MS) [10], [25], [39]
Nguyên tắc của kỹ thuật này là lựa chọn một ion xác định (thường là
M+, nhưng cũng có thể là ion con đặc trưng) trong các ion con của lần ion
hóa thứ nhất và loại bỏ tắt cả các ion khác trong bộ phận phân tích ion. Các
ion này được cho vào buồng va chạm với khí trơ Heli và bị phân mãnh thành
ion con hoặc mãnh trung hòa; tiếp theo các mãnh ion con này được cho vào
máy khối phổ thứ hai để phân tích và xác nhận. Khối phỏ ghi nhận được từ
một loại ion duy nhất nên khơng cịn bị ảnh hưởng của các tạp chất trong mẫu
nữa. Việc nhận định kết quả trên phổ MS/MS sẽ chính xác hơn, đặc biệt khi
hàm lượng chất phân tích thấp và nằm trong hỗn hợp phức tạp.
cS
wae
if 9 Ts) my = =
Mẫu
lonhóa
đa
"5i
Hình 1.12: Sơ đồ khối phổ MS/MS
1.4.3. Bộ phận phân tích khối phổ ba lần tứ cuc (triple quadrupole) Xevo
TOD,
kj thuat ghi phd SRM
(Selected Reaction
Monitoring)
va MRM
(Multiple Reaction Monitoring) [5]
1.4.3.1. Bộ phận phân tích khối ba lần tứ cực (triple quadrupole)
Dau do hai lan khdi phd (MS/MS) với bộ phận phân tích khối kiểu ba
lần tứ cực ghép nối tiếp nhau như hình 1.13.
Trong đó Q1 sẽ chọn lọc các ion mong muốn (ion cha mẹ) được đưa
vào Q2
có vai trị tạo ra sự phân
ly ion do va chạm
(collision induced
dissociation; CID) với các khí khí trơ (Na, Heli) ở áp suất cao hơn với mức
12
năng lượng va đập được lựa chọn. Nhờ va chạm này năng lượng động học của
các ion chuyền thành nội năng nên chúng bị phân mảnh tiếp tạo ra các ion nhỏ
hon, ion con (daughter ion). Tiép các ion con hình thành nay được dẫn vào
Q3 tách riêng và đến detector.
Hình 1.13: Sơ đồ khối đầu dị MS/MS ba tứ cực nối tiếp (Triple quadrupole)
% Ưu điểm
- Độ nhạy tốt nhất cho phân tích định lượng.
- Cho nhiều thơng tin về cấu trúc hợp chất nhờ sự kiểm soát những ion báo
trước, Ion con, mảnh trung hòa.
% Nhược điểm
Giá thành cao, đòi hỏi điều kiện về hệ thống điện trường đạt chuẩn
1.4.3.2. Kỹ thuật tạo ion ESI
Pha động đi ra từ cột sắc ký vào một ống mao quản bằng thép khơng gi
có đường kính 0,1-0,5mm, được phun sương ra khỏi ống mao quản với vận
tốc phun sương chậm
10-20u1/phút, các giọt sương này sẽ đi vào vùng điện
trường mạnh 3-6kV, dưới ảnh hưởng của điện thế các hạt sương này sẽ mang
điện tích. Khí xung quanh các hạt sương sẽ làm bay hơi dung môi ra khỏi các
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoahọc — 13
hạt sương. ở càng xa lỗ phun sương các hạt sương có kích thước càng nhỏ và
điện tích càng tăng lên, hệ quả là các hạt sương mang nhiều điện tích sẽ kém
bên dẫn đến sự bùng nơ coulomb tạo thành các ion. Các ion này sẽ được đưa
vào bộ phận phân tích khối phỏ.
|
ÁP ST KHƠNG KHÍ
Khí sương
|
các hạt
1. Hình thành
|
|_
|
Điện thế cao
i
tc—>
=
—*
oe
|
|
kì
er
`“
@
i
2 may bt
|
2
:”
CHÂN
KHƠNG
“i
=
——:TEEE
Khí sương
=
‡
Voi phun
Hình 1.14: Sơ đồ kỹ thuật tạo ion ESI
+ Yêu cầu kỹ thuật ESI
Dung mdi pht hop cho ky thuat ESI 1a ethanol, isopropanol, acetonitril,
acetone, tetrahydrofuran, chloroform.
Chat phân tích phải được biến đỏi thành chất điện ly, tan trong dung
dịch để phun sương.
Pha động phải có tính phân cực, đề có thé hịa tan chất phân tích thành ion.
Ưu điểm của kỹ thuật ESI
Kỹ thuật có thể tạo thành ion âm hoặc dương tùy vào việc áp đặt điện
thế, phù hợp cho các chất kém bền nhiệt, có tính phân cực, có khối lượng
phân tử lớn.
1.4.3.3.
Kỹ thuật ghi phổ SRM
(Selected Reaction
Monitoring)
và MRM
(Multiple Reaction Monitoring)
Đối với khối phỏ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS),
2 kỹ thuật ghi phơ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoahọc
4
14
SRM - kiểm sốt phản ứng lựa chọn: cơ lập ion cần chọn, sau đó phân
mảnh ion cơ lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập l mảnh ion con cần
Chất hữu cơ (%)
quan tâm và đưa vào đầu đò đẻ phát hiện.
oof
Qt
PR.
Q2
Q3
Hình 1.15: Sơ đồ kỹ thuật ghi phổ SRM
*+ MRM - kiểm soát đa phản ứng: Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion me)
ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cơ lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là
buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan
tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dị để phát hiện.
SS
Lya chon peptid
(MS1)
SS
-
Phân mảnh
SS
Lựa chọn mảnh
(MS2)
Hình 1.16: Sơ đồ kỹ thuật ghi phố MRM
one
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
15
1.5. Một số nghiên cứu phân (ích định tính, định lượng glucocorticoid
ngụy tạo trong mỹ phẩm và các chế phẩm khác
1.5.1. Nghiên cứu phân tích định tính, định lượng
Bảng 1.1: Các điều kiện sắc ký trong một số qui trình nghiên cứu phân tích,
phát hiện glucocorticoid trong mỹ phẩm trị mụn, trắng da và sản phẩm khác
ae
Phuong
Tác giả
pháp
.
ˆ
Pha tĩnh
Pha động
. ine 17]
Asean guideline
HPLC-
ACN:H2O
Nguyễn Thị Xuyên
HPLC- | Gemini C18 (250 x 4.6 nm,
UV
5 pm)
ACN:H20
HPLC-
Phenomenex Luna C18
ACN:HaO
và cộng sự 2l
ˆThi
Lêhị
.
H
`
Hường Hoa
7]
Gaudianoa.M.C và
cong su [3]
Jeong Pyo
UV
PDA
(250x4,6 mm)
(45:55)
>
(48:52)
HPLC- | Symmetry C18, (75x4.6mm,
PDA
va cong su [6]
LC-MS
Galgliardi.L, De
.
+ eg
Jessica Fiori va cộng
sự E7
Orsi.D va céng su 2)
(gradient)
ACN:H20
3.5um)
(50:50)
XTerra RP-18 (250 x 4.6 mm,
-
;
5 um, Waters, USA)
ACN:H20 (2:3)
HPLC-
PurospherLichrocart (250
ACN:H20
LC-MS
Waters Synergy C18 (150
mm x 2.0 mm, I.D.)
PDA
mm x 4.0 mm, 5m)
(60:40)
MeOHHCOOH 0,1%
.
(gradient)
MeOH-
Cui. X và cộng sự 29 | MS/MS |
PEHCI8(100x2,lmm,
| Coo . o,1%
1.7 nm)
Kamata.K và cộng
HPLC,
Zorbax SIL (250x4,6mm,
Chmielewska.A va
HPLC, | Nu-cleosil 100 RP-18 (125x |
sy [28]
cộng sự 11
UV
UV
Sum )
4mm, 5 pm)
(gradient)
| Ethanol-CHCH.
Hexan (1:2:7)
MeOH-H20
(55:45)
