Í (re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TÉ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CÀN THƠ

TRAN NGOC LUAN

DATHOC
Y DƯỢC CÀ THÔI

| THU VIEN |
NGHIEN CUU XAY DUNG QUI TRINH

PHAN TICH MOT SO GLUCOCORTICOID
NGUY TAO TRONG CHE PHAM DONG DUOC
DIEU TRI THAP KHOP BANG PHUONG PHAP
SAC KY LONG SIEU HIEU NANG VOI DAU DO UV-VIS
Chuyên ngành: Kiêm nghiệm Thuốc ye

dc chat

Mã số: 60.72.04.10.CK lulrpzv„“`8 1ĐẠIHƯi0 VIÊN
ÿ phi;

LUAN

ae

;

VAN CHUYEN

KHOA

mLCAPLONTRONG
i quyệy
I

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Dương Xuân Chữ

2. TS. D6 Chau Minh Vinh Tho
CAN THO - 2016

cal Tig


Gen PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

(

LOI CAM DOAN
Tôi xin cam đoan tất cả các kết quả, số liệu, dữ liệu sắc ký trong đề tài là

nghiên cứu của tôi và chưa từng được công bó ở bắt cứ tài liệu nào.
Tơi xin cam đoan giữ bí mật tồn bộ kết quả thực nghiệm nghiên cứu từ

các mẫu chế phâm đông dược thu thập được trên thị trường tỉnh Hậu Giang.

Thành phố Cần Thơ, ngày 22 tháng 08 năm 201ú

phil

Tran Ngoc Luan


I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

xẻ
Ul

LOI CAM ON
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thay PGS.TS. Dương Xuân Chữ,

Thầy TS. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ - người trực tiếp hướng dẫn chỉ dạy những
kiến thức chuyên môn quý báo và luôn quan tâm, đôn đốc, an ủi động viên
tỉnh thần học tập của em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý Thầy Cô trong Hội đồng xét
duyệt đề cương luận văn chuyên khoa cấp I, Q Thầy Cơ ở phịng Đào tạo
Sau đại học đã tư vấn giúp đỡ em hoàn thành đúng tiến độ đề tài.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Q Thầy Cơ ở Liên Bộ Mơn Hóa
phân tích — Kiểm nghiệm — Độc chất, Bộ Mơn Dược liệu — Khoa Dược, Bộ
Mơn Hóa hữu cơ — Khoa Khoa học cơ bản đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để

em hoàn thành đề tài.

Xin chân thành cảm ơn Quý đồng nghiệp ở Trung tâm Kiểm nghiệm

Dược phẩm — Mỹ phẩm tỉnh Hậu Giang đã giúp đỡ hỗ trợ lấy các mẫu chế
phẩm đông được làm thực nghiệm trong đề tài.
Xin cảm ơn các anh chị em lớp Chuyên khoa I — Kiểm nghiệm thuốc và
độc chất khóa 2014 — 2016, các em sinh viên Dược

khóa 37 đã nhiệt tình

giúp đỡ trong thời gian thực nghiệm làm đề tài.

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Gia đình đã tạo điều kiện thuận lợi,
tạo chỗ dựa tỉnh thần vững chắc giúp bản thân được an tâm học tập và hoàn
thành đề tài nghiên cứu này.
Xin chân thành cảm ơn.


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cửu khoahọc_

NI”

ƒ ẲÍ

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn

Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị

Chương 1. TỎNG QUAN TÀI LIỆU ..............................-- 22-55
1.1. Tổng quan về glueocorticoid.....................-----s- zz©xe+rxzcczzvrrsztrsed
1.2. Thực trạng sử dụng thuốc đơng dược điều trị thấp khớp, viêm khớp ... 9

1.3. Các nghiên cứu phân tích corticoid trộn trái phép trong thuốc đồng

dược điều trị viêm khớp thấp khớp.........................---2 x+zcrree
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng .................................
Chương 2. ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu.................................
se ©cs+EevtxztEEzrxtzrerrerrreee

2.2. Hóa chất — thuốc thử - trang thiết bị.........................-------+--c-c---e:

2.2.1. Hóa chất - thuốc thử..........................-2--222222Z222szt+trrzxeerrre
2.2.2. Trang thiết bị - đụng Cụ.........................-- --6-cccrtertcerrkererreerecee
2.3. Phương pháp ngh1Ên CỨU..........................-- 5-2

ren

2.3.1. Thiết kế nghiên cứu........................-----2-©¿+2+zz+EEketvkeerrxrerreerree
2.3.2. Cỡ mẫu. . . . . . . . . . . .

HH


2111x111 1151151111

E111 Ek Sen rersree

2.3.3. Phương pháp chọn mẫu.........................-2---2++222++ccxvrrrrerrrrea

2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ..............................------¿ceeccez
2.4. Nội dung nghiên CỨU..........................--¿5-5 S252 se S222 2x
eerexre


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

Ỳ Vv

2.4.1. Định danh mẫu trắng giả lập.......................--22 se vse+xrExrrrrerkrrrree 24

2.4.2. Chuẩn bị mẫu........................---:22-22+2EE1EEE1311711E1271112111E1211x.12211e7 24
2.4.3. Khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu.....................--- st©cs+cxevrxevrsevrrtevrey 25

2.4.4. Khảo sát quy trình chiết tối ưu.....................--2 s-s+2x+zxerkesrxrevrxee 25
2.4.5. Xác định tính tương tích hệ thống...............................-----2¿-ccec+erxeree 28
2.4.6. Thâm định quy trình định lượng ........................-22-2 ©setrxertxrereez 29
2.4.7 Áp dụng định tính, kiểm sốt hàm lượng các chế phẩm................ 31
2.5. Đạo đức trong nghiên CỨU .............................
¿55 < 5552 St xxx
rvrerere 31


Chương 3. KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU ..................................--------2-ccs‹c-ee 32
3.1. Định danh mẫu trắng theo theo bài thuốc giả lập................................ 32
3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu..........................--2--cc+2cxettZExerrErsezrrrrxee 32
3.3. Quy trình chiết tối ưu cho mẫu thử........................-2---2-stcxxerrxeerrvzverre 34
3.4. Tính tương thích hệ thống...........................--2 ©+++©E+z+cCckevcExeerrrveerrrrked 35
3.5. Thâm định qui trình phân tích......................-...-----2
2 2£+E+ExeeEEEevrveezre 37
3.6. Ứng

dụng kiểm sốt chất lượng các chế phẩm đông dược điều trị viêm

khớp, thấp khớp thu thập ở tỉnh Hậu Giang ..............................----c.c-z-: 43
Chương 4. BÀN LUẬN ..............................-.s----22 cs©cs©zzrvevssereeevseoeseccrseee 47

4.1. Khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu..........................--+: +eccvxeccrerrreeerreerrre 47
4.2. Quy trình chiết tối tu cho mẫu thử............................--22 se 2+ze+vvxeerrrv 53
43.

Tham

định

quy

trình

định

lượng


đồng

thời

prednisolon,

methylprednisolon, bethamethason, dexamethason acetat ................ 57

4.4. Ứng dụng kiểm sốt chất lượng các chế phẩm đơng dược điều trị viêm

khớp, thấp khớp thu thập ở tỉnh Hậu Giang ..................................-- 60
snn

0a

.............

62

KEN NGHỊ........................... "5.................ơƠỎ 63
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

V


DANH MUC CAC CHU VIET TAT
_

'

Chữ viết tất

ACN
AF
AOAC

BM
Cf
DXA
DDVN IV

EtOAc

HLB
HPLC

Nguyên văn
Acetonitrile

Dung môi acetonitrile

Acid formic

Dung mơi acid formic


Association of Official

Hiệp hội hóa học phân

Analytical Chemists

tích

- Betamethasone
Chloroform

Dung mơi cloroform

Dexamethasone acetat

Dược điển Việt nam IV
Ethyl acetat

Dung môi ethyl acetat
Cột chiết pha rắn HLB

High Performance Liquid
Chromatography

ICH

Ý nghĩa

Sắc ký lỏng hiệu năng cao


International Conference on

Hiệp hội đồng thuận

Harmonisation

quốc tế

Kiểm tra chất lượng

KTCL
LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantitation

Giới hạn định lượng

MeOH

Methanol

Dung môi methanol


MPR

Methy! prednisolone

PDA

Photo Diode Array

PR

Prednisolone

SPE

Solid phase extraction

TCCL
UPLC

Đầu dò dãy diod quang
Chiết pha rắn
Tiêu chuẩn chất lượng

Ultra performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng


t


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

Vị

DANH MUC CAC BANG
Bảng

Tén bang

Trang

1.1

Théng kê thuốc đông được, dược liệu không đạt chất

10

lượng qua mẫu lấy để kiểm tra chất lượng từ năm 2009
— 2013
1.2

Các thuốc đông dược trộn trái phép hoạt chất tân được

12

phát hiện tại tỉnh Hậu Giang


1.3

So sánh các điều kiện sắc ký tối ưu trong các qui trình

14

nghiên cứu
1.4

So sánh quy trình xử lý mẫu giỡa các tài liệu nghiên

15

cứu
2.1

Các chế phẩm ứng đụng

21

3.1

Kết quả định danh mẫu trắng theo theo bài thuốc giả lập

32

3.2

Tỉ lệ acetonitril — nước chạy theo chương trinh gradient


33

tối ưu
3.3

Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên mẫu

35

hỗn hợp chuẩn 04 glucocorticoid
3.4

Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên mẫu thử

35

giả lập
3.5

Kết quả khảo sát tính tuyến tính, miễn giá trị

38

3.6

Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định

40

lượng

3.7

Kết quả khảo sát độ đúng

3.8

Kết quả khảo sát độ chính xác

3.9

Kết quả khảo sát các mẫu thu thập trên thị trường

4.1

Khảo sát các chương trình chạy gradient

41
42
44
5]


Xe

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học Vừ

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, DO THI
Tên hình vẽ, đồ thị
Phổ UV của dexamethason acetat trong methanol


1.2

Cấu trúc của dexamethason acetat

1.3

Phổ UV của betamethason trong methanol

1.4

Cấu trúc của betamethason

1.5

Phổ UV của prednisolon trong methanol

1.6

Cấu trúc của prednisolon

1.7

Phổ UV của methylprednisolone trong methanol

1.8

Cấu trúc của methylprednisolone

2.1


Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng

ND

A

1.1

Trang

HAN

Hình

“own

(re

cao Thermo UPLC

20

Sơ đồ khảo sát quy trình chiết có hỗ trợ nhiệt, sóng siêu

26

Ultimate3000 với đầu dị Uv-Vis
2.2

âm, ly tâm

2.3

Sơ đồ khảo sát dung môi chiét glucocorticoid

27

3.1

Sắc ký đồ minh họa điều kiện sắc ký tối ưu

33

3.2

Sơ đồ qui trình chiết tối ưu

34

3.3

Sắc ký đồ của 6 lần tiêm liên tiếp của mẫu hỗn hợp

36

chuẩn
3.4

Sắc ký đồ của 6 lần tiêm liên tiếp của mẫu thứ giả lập

36


3.5

Sắc ký đồ minh họa tính đặc hiệu

37

3.6

Phương trình tuyến tính của 04 glucocorticoid

38

3.7

Sắc ký đồ minh họa tính tuyến tính của qui trình phân
tích

3.8

Sắc ký đồ minh họa khảo sát giới hạn phát hiện và giới

40

hạn định lượng

3.9

Sắc ký đồ minh họa độ đúng


42


+

(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

Hinh

VU

Tén hinh vé, dé thi

Trang

3.10

Sắc ký đồ minh họa độ chính xác

43

3.11

Sắc ký đồ minh họa mẫu thử 26 dương tính với

46

bethamethason


3.12

Sắc ký đồ minh họa mẫu thử 03 dương tính với

46

bethamethason

4.1

Sắc ký đồ khảo sát bước sóng và pha động

48

4.2

Sắc ký đồ khảo sát pha tĩnh

49

4.3.

Sắc ký đồ khảo sát ảnh hưởng của pH

50

44

Sắc ký đồ khảo sát điều kién gradient


52

4.5.

Sắc ký đồ khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ với phatnh

53

4.6

Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết

54

4.7

Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết

54

4.8

Sắc ký đồ khảo sát dung méi chiét methanol — nude voi

55

nhiều tỉ lệ
4.9


Sắc ký đồ khảo sát dung môi loại tạp

56

4.10

Sắc ký đồ khảo sát chiết kiệt

56

4.11

Sắc ký đồ khảo sát lắc kiệt

57

4.12

Sắc ký đồ kiểm tra lại tính đặc hiệu

58


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

ĐẶT VẤN ĐÈ
Ngày nay các bệnh lý viêm khớp dạng thấp, thấp khớp, viêm bao hoạt


dịch, thối hóa khớp... tăng đột biến trong xã hội hiện đại. Có nhiều phương
pháp điều trị và dùng thuốc khác nhau được áp dụng. Theo đó, xu hướng sử
dụng các thuốc đơng y có nguồn gốc thiên nhiên ngày cảng gia tăng do hiệu
quả điều trị đã được chứng minh và tính an tồn cao. Tuy nhiên, một số cơ sở
sản xuất, mua bán thuốc đơng y khơng chân chính, đặc biệt các thuốc đơng y

có nguồn gốc nhập khâu đã sử dụng thành phan glucocorticoid nhu:
dexamethason,

betamethason,

prednisolon,

methylprednisolon,

triamcinolon,...

để trộn lẫn vào các chế phẩm đông được nhằm đánh lừa

người bệnh với hiệu quả điều trị rất tốt trong giai đoạn

clobetasol,

ban đầu, nhưng sau đó

da dé lai hậu quả nghiêm trọng cho người bệnh khi sử đụng thuốc lâu dai dẫn
đến những tác dụng phụ nặng nề trên thận, xương, dạ dày,... tạo ra những

gánh nặng to lớn cho người bệnh và ngành y tế.
Hiện nay, việc tân tạo glucocorticoid bất hợp pháp vào các chế phẩm.

đông dược ngày càng trở nên phơ biến, tính vi và khó phát hiện. Để kiểm sốt

được vấn để nảy, đã có nhiều nghiên cứu về việc đính tính phát hiện các
glucocorticoid với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng và khối phổ [10].[34]. Tuy nhiên,

việc kiểm soát hàm lượng các glucocorticoid này vẫn còn rất hạn chế do hàm
lượng hoạt chất thấp và nền mẫu dược liệu phức tạp. Thêm vào đó, cho đến

nay vẫn chưa có qui trình định lượng déng thdi cdc glucocorticoid bang
phương pháp phân tích sắc ký hiện đại với độ tin cậy, độ nhạy, độ chính xác
cao trong Dược điển Việt Nam IV, Dược điển Anh (BP 2013), Dược điển Mỹ

(USP 36).


(

(re

,

2

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

Do đó, việc xây dựng một phương pháp phân tích có thể áp dụng định
tính, định lượng với độ nhạy, độ chính xác và tính đặc hiệu cao để phân tích
đồng thời một số glucocorticoid thường trộn trái phép vào các chế phâm đông

dược điều trị viêm khớp, thấp khớp là một yêu cầu cần thiết. Đề tài: “Nghiên

cứu xây dựng qui trình phân tích một số glucocorticoid ngụy tạo trong chế

phẩm đông được điều trị thấp khớp bằng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu
năng với đầu đò Uv-Vis” với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng và thâm định qui trình định tính, định lượng đồng thời
prednisolon,

methylprednisolon,

bethamethason,

dexamethason

acetat bằng

phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng với đầu đò Uv-Vis.

2. Áp dụng qui trình phân tích đã được thẩm định để phát hiện và xác
định

hàm

lượng

prednisolon,

methylprednisolon,

bethamethason,


dexamethason acetat trong chế phẩm đông được điều trị thấp khớp lưu hành
tại tỉnh Hậu Giang.


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

Chương 1

TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tỗng quan về glucocorticoid (GC)
1.1.1. Nguồn gốc của glucocorticoid
Glucocorticoid

cé

ngn

géc

thiên

nhiên

sự thay

đổi

gồm


hai

chất

chính:

hydrocortison (cortisol) và cortison.
Glucocorticoid

bán

tổng

hợp:

nhóm

thế trên phân

tử

hydrocortison làm thay đổi cường độ các hoạt tính của hợp chất thiên nhiên
này, với mục đích có được tác động GC mạnh, ít hoặc khơng có tác động giữ
muối và nước.[9]
1.1.2. Tác dụng sinh lý của glucocorticoid
Tác dụng kháng viêm và ức chế miễn dịch: GC chống lại các biểu hiện
của quá trình viêm dù đo bất kỳ nguyên nhân gì (cơ học, hóa học, nhiễm

khuẩn, tia xạ, miễn dịch,...)

Tác dụng chuyển hóa giucid, protein, lipid: GC làm tăng đường huyết
lúc đói dé đảm bảo cung cấp glucose cho các mơ phụ thuộc glucose như não
và tim,...làm tăng thối hóa và tổng hợp triglycerid nhưng quá trình sau
chiếm ưu thế hơn nên làm tăng dự trữ mỡ, có sự tái phân phối mỡ khơng đồng
đều: mỡ tích tụ ở xương địn, sau cổ và mặt nhưng lại mất mỡ ở chỉ.
Tác dụng trên chất điện giải và cân bằng nước: GC liều cao gây giữ

muối, nước và thải trừ K” nên có thể dẫn đến phù và nhược cơ, ngăn hấp thu
calci ở ruột và tăng đào thải qua thận nên giảm dự trữ calci trong cơ thé.

Tác dụng khác: kích thích thần kinh, tăng tiết địch vị và pepsin, giảm tiết
chất nhày, giảm tổng hợp prostaglandin, gây ra tăng huyết áp thường xảy ra

khi dùng liều cao.[16]


I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

1.1.3. Chỉ định của glucocorticoid

Các bệnh về khớp: viêm khớp gout cấp, viêm khớp đo thấp khớp, viêm
xương khớp.

Thiéu năng thượng thận tiên phát hoặc thú phát.
Bệnh thận: viêm cầu thận, hội chứng thận nhiễm mỡ.
Rối loạn collagen: viêm da, động mạch kết hòn.

Bệnh dị ứng: mề đay, viêm mũi đị ứng, các đạng ban đa,...
Bệnh về hô hấp:


hen phế quản, viêm phối do hút nước hoặc dị vật, triệu

chứng ức chế hô hấp ở trẻ sơ sinh.
Bệnh ung thư: u lympho bao, bénh bach cau.
Bệnh gan: viêm gan mãn tiến triển, viêm gan do rượu.
Các bệnh khác: sốc do nhiễm khuẩn, tăng calci máu, ghép cơ quan,...
Liều dùng của glucocorticoid: dao động rộng từ 0,5 — 20 mg/lần tùy theo
loại thuốc và mục đích điều tri.[19]

1.1.4. Tac dung phu cua glucocorticoid
Lỗng xương: GC làm tăng q trình phân hủy xương nhưng lại ức chế

q trình cốt hóa, nên 50% bệnh nhân đùng GC liều cao bị gãy xương khơng
có chấn thương.

Gây suy tuyến thượng thận: do khi dùng thuốc GC từ ngoài vào cơ thể sẽ
làm ức chế tuyến thượng thận bài tiết, dẫn đến tình trạng suy giảm khả năng

bài tiết GC của chính cơ thể người đó. Sự giảm liều đột ngột làm cho cơ thể
bệnh nhân mệt mỏi, buồn nôn, chán ăn, đột quy, đau đầu, hạ huyết ap, ha

đường huyết, làm trầm trọng thêm bệnh qua trung gian miễn dich.
Rối loạn dịch và chất điện giải: tăng cân do giữ muối, nước và thải trừ

lon KỶ.
Ức chế sự phát triển chiều cao của trẻ em.
Bénh Cushing. Loét da day ta trang.[9]


Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học


1.1.5. Tính chất lý hóa của các #lucocorticoid trong nghiên cứu
1.1.5.L Dexamethason acetat (DXA)
Dexamethason

acetat:

dioxopregna-1,4-dien-21-yl

9-fluoro-11B,
acetate.

Cong

17-dihydroxy-160-methyl-3,20thức phân

tử:

C¿¿Hạ;FO¿.

Tính

chất:
- _ Bột kết tỉnh màu trắng hoặc gần như trắng, đa hình.
-_

Dễ tan ethanol 96% và aceton, khó tan trong methylen clorid, pKa =
12,14 (dạng base).

- _ Cực đại hấp thu khi pha trong methanol 238,5nm. [4][37][38]

Absorbance

(re

200

1

225

1

250

L

275

300

L

325

L

350

|


375

400

Wavelength

Hình 1.1: Phổ UV của dexamethason acetat trong methanol [36]

Hình 1.2: Cấu trúc của dexamethason acetat [36]


Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

1.1.5.2. Bethamethason (BM)
Betamethason:

9-fluoro-118,

17, 21-trihydroxy-16B-methylpregna-1, 4-

diene 3,20-dione. Công thức phân tử: C;ạ;H;FO¿. Tính chất:
-

Dang bot két tinh mau trang hoặc gần như trắng.

-

Thực tế không tan trong nước, it tan trong ethanol khan, rat ít tan
trong methylen clorid.


-

Cực đại hấp thu khi pha trong methanol là 238,5nm. [4][37][38]
Absorbance

(re

200

i

225

1

250

1

275

300

+

325

1

350


L

375

400

Wavelength

Hình 1.3: Phổ UV của betamethason trong methanol [36]

Hình 1.4: Cấu trúc của betamethason [36]


Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

1.1.5.3. Prednisolon (PR)
Prednisolon: 11f, 17, 21-Trihydroxypregna-1, 4-diene-3, 20- dion. Cong

thức phân tử: C;¡H;sO;. Tính chất:
-_ Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trang, tinh thể, hút âm.
-_

Rất ít tan trong nước, dé tan trong ethanol 96% va methanol, hơi tan
trong aceton và methylen clorid.
Cực đại hấp thu trong methanol là 242 nm. [4][37][38]
Absorbance

(re


200

L

225

1

250

l

275

300

L

325

[

350

1

375

400


Wavelength

Hình 1.5: Phố UV của prednisolon trong methanol [36]

Hình 1.6: Cấu trúc của prednisolon [36]


(re

,

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

8

1.1.5.4. Methylprednisolon (MPR)
Methylprednisolon:

118,17,21-trihydroxy-6a-methylpregna-1,4-dien-

3,20-dion. Céng thirc phan tir: C22H3905. Tinh chat:

- _ Bột kết tỉnh đa hình trắng hoặc gần như trắng.
- _ Thực tế không tan trong nước, hơi tan trong ethanol 96 %, it tan trong
aceton và dicloromethan.
- _ Cực đại hấp thu trong methanol là 243 nin. [4][37][38]
Absorbance

(


200

225

250

275

300

325

360

375

400

Hình 1.7: Phố UV của methylprednisolon trong methanol [36]

Hình 1.8: Cấu trúc của methylprednisolon [36]


I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

1.2. Thực trạng sử dụng thuốc đông dược điều trị thấp khớp, viêm khớp

1.2.1. Sơ lược về thuốc đông dược điều trị viêm khóp, thấp khớp
Thuốc đơng dược hay thuốc đơng y là những thuốc có nguồn gốc tự
nhiên, từ động vật, thực vật hoặc khoáng chất được bào chế theo lý luận và


phương pháp của y học cô truyền các nước phương Đơng. Thuốc đơng dược
được dùng để phịng bệnh, chữa bệnh, phục hồi chức năng của cơ thể. 13]

Tổ chức y tế thế giới (WHO) đề ra chiến lược phát triển Y học cổ truyền
từ năm 2014 - 2023 và đã được đưa ra dé thông qua Hội đồng Y
Jy học cổ truyền nhằm

tế thế giới về

mục đích hỗ trợ các nước thành viên trong việc chủ

động phát triển và thực hiện các chính sách, kế hoạch hành dong tang cường

vai trò của y học cổ truyền trong việc bảo vệ sức khỏe người bệnh.[40]
Thuốc đông dược được đánh giá là cho hiệu quả cao trong điều trị nhiều
căn bệnh trong đó có bệnh viêm khớp dạng thấp hay còn được gọi là bệnh

thấp khớp. Nhiều nghiên cứu cả về in vivo và in vitro đã chứng mỉnh hiệu quả
của một số thảo dược cũng như của các thành phần hóa học trong điều trị

viêm khớp đạng thấp.
Một số dược liệu như cúc gai, ngải đắng, mang tây, cỏ roi ngựa, huyền

sâm,...có thể sử dụng bằng cách uống hoặc dùng ngoài để điều trị bệnh thấp
_ khớp. Cho đến nay, các vị thuốc như nhục đậu khấu, hương thảo, đại mạch,
tầm ma,...vẫn còn được dùng phổ biến như một liệu pháp thay thế thuốc
trong điều trị viêm khớp dạng thấp.[22]
Bên cạnh đó, thuốc có nguồn gốc thiên nhiên hầu như rất ít tác dụng phụ,
do đó rất phù hợp cho việc sử dụng lâu dài để điều trị căn bệnh mãn tính như


thấp khớp.


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

1.22.

10

Tình trạng trộn giucocorticoid vào thuốc đơng dược điều trị viêm

khóp, thấp khớp tại Việt Nam
Xu hướng của thế giới cũng như ở Việt Nam là quay về với các sản
phẩm nguồn gốc tự nhiên, thị trường thuốc đông dược ngày càng tăng trưởng

nên nhiều cơ sở kinh doanh bất chính đã trộn thêm tân dược vào các chế

phẩm đông dược đề đánh lừa người bệnh và trục lợi bất chính.

Các nhóm thuốc tân được thường được trộn thêm vào thuốc đông dược

như: GC, thuốc giảm đau hạ sốt, thuốc an thần, các dẫn chất sildenafil điều trị
rối loạn cương dương...Trong đó, nhóm kháng viêm GC là thành phần trộn

trái phép phổ biến nhất cho các chế phẩm đông được điều trị bệnh viêm khớp,
thấp khớp.
Hiện nay vấn đề kiểm soát chất lượng nguyên liệu được liệu và các chế

phẩm đông dược đang là vấn đề cấp thiết trong xã hội. Trong năm 2013, Viện
Kiêm nghiệm thuốc và các Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc của tỉnh, thành phố
trực thuộc Trung ương đã tăng cường kiểm tra việc sử dụng được liệu, thuốc
từ dược liệu, thuốc y học cổ truyền. Tổng số mẫu lay trong năm 2013 để kiểm
tra chất lượng là §.040 mẫu, phát hiện 576 mẫu không đạt tiêu chuẩn chất

lượng với tỷ lệ là 7,16%.[20]
Bảng 1.1: Thống kê thuốc đông dược, dược liệu không đạt chất lượng qua

mẫu lấy đề kiểm tra chất lượng từ năm 2009 — 2013 [20]
Năm

2009
2010
2011
2012
2013

Số mẫu lấy để | Số mẫu không đạt | Tỷ lệ mẫù không đạt

KTCL
5.672
6.511
5.801
6.345
8.040

TCCL
518
625

353
524
576

TCCL
9,13%
9,60%
6,09%
8,26%
7,16%


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

11

Nhiều năm trở lại đây, các cơ quan chức năng đã đình chỉ lưu hành hàng
loạt những thuốc đơng dược bị phát hiện trộn trái phép thành phần corticoid.
Tháng 6 năm 2007, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã tiến hành
phân tích mẫu

thuốc mang

tên “Dân tộc cứu nhân vật” có nguồn gốc từ

Campuchia, loại thuốc được cho là có hiệu quả điều trị rất nhiều bệnh trong
đó có thấp khớp và được xem là thần được. Theo kết quả công bố, “Dân tộc


cứu nhân vật” bị phát hiện là có chứa paracetamol, diazepam, cyproheptadine
và dexamethason. Bộ Y tế đã có văn bản nghiêm cấm việc sản xuất, nhập
khẩu, buôn bán và sử dụng loại thuốc này trên toàn quốc.[21]

Tháng 11 năm 2008, Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh
đã phát hiện một số thuốc đơng dược có chứa tân được, trong đó có chế phẩm

Tuyết liên phong thấp linh (Sauran Fong Sep Lin) của nhà sản xuất Welip (M)

Sản Bhd, Malaysia, số lơ 5266, tuy nhiên khơng có số đăng ký nhập khẩu của
Bộ Y tế. Thuốc có cơng dụng trị phong thấp, viêm khớp xương, đau nhức cơ

bắp, đau lưng và thần kinh tọa và bị phát hiện trong thành phần có chứa
betamethason acetat.[8]
Tháng 5 năm 2010, Cục Quản lý được đã ra quyết định rút số đăng kí lưu
hành thuốc Hạnh đức khu phong tê thấp thủy, SĐK: V1116-H12-10, đo cơ sở
sản xuất thuốc Y học cổ truyền Hinh Hịa, địa chỉ: 123/33 Bình Tây, quận 6,

thành phố Hồ Chí Minh vì lý do chứa thành phần không đúng với hồ sơ đăng
ký thuốc, thuốc đông dược có chứa tân dược là dexamethasone.[3]

Thanh tra Sở Y tế Hà Nội đã phát hiện cơ sở lương y gia truyền Hà Tộc
do ông Hà Quang Phước làm chủ, sản xuất thuốc không đạt tiêu chuẩn chất

lượng. Tại thời điểm kiểm tra, đồn đã tiến hành niêm phong 10 gói thuốc bột
đóng gói có nhãn “Thuốc Đơng Y gia truyền”, gửi Viện Kiểm nghiệm thuốc
Trung ương kiểm nghiệm, kết quả phát hiện trong các mẫu thuốc này đều có
thành phần tân được là prednisolone và dexamethason acetat.[12]



(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

12

Riêng ở tỉnh Hậu Giang, có trên 50 cơ sở mua bán đơng dược và duoc
liệu. Năm 2009 — 2013, có 21,76% thuốc đông dược và dược liệu không đạt

TCCL, dược liệu giả chiếm 7,30%, thành phẩm thuốc đông dược tỷ lệ khơng
đạt TCCL khá cao 15,38%[2]. Năm 2014, có 27,27% thuốc đông được và
dược liệu lấy mẫu không đạt TCCL, trong đó phát hiện 08 mẫu thuốc giả.[15]
Bảng 1.2: Các thuốc đông dược trộn trái phép hoạt chất tân dược
phát hiện tại tỉnh Hậu Giang.[
1]
ˆ

01

k

Hoat chat tan

1¬
dược trộn vào

Tên thc

STT


Phong tê Ơng già

Aspirin
th son
D exametha

| Đau au khớpkhép hồhoan

so

etamethason
ăng tơ | Betameth
03 | Ngự gu dụng dung tứ đăngtô

04 | Phong

ong

thấp

hoan

e

uen

Thị trần Ngã Sáu, Châu

Thành, Hậu Giang


chông gậy
02

.

Địa phương phát hiện

cốt

thổ

âp cột thông

Betamethason

Thị trân Một Ngàn, Châu
:
`
Giang
A, Hậu
Thành

Thi tran Nang Mau, Vi
Thủy,
" Hậu Giang

Thi tran

Nang


, men Nang

Mau,

Thuy, Hau Giang

au, Vi

`

Vi

Các mẫu thuốc này đã được lấy mẫu tại tỉnh Hậu Giang nhưng phải gởi
mẫu kiểm tra tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh vì Trung
tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm — Mỹ phẩm tỉnh Hậu Giang không đủ phương

tiện và qui trình kỹ thuật để phân tích định tính, định lượng đồng thời các GC
có trong các mẫu đông dược điều trị viêm khớp, thấp khớp ngụy tạo này.
Tuy nhiên trong thời gian tới, Trung tâm đã được trang bị các thiết bị
phân tích hiện đại từ dự án phát triển y tế vùng đồng bằng sông Cửu Long,
nên việc xây dựng được qui trình kỹ thuật để phân tích các mẫu này từ đẻ tai
nghiên cứu này sẽ có một ý nghĩa thực tiễn rất lớn trong việc áp dụng kiểm

sốt chất lượng các chế phẩm đơng dược điều trị viêm khớp, thấp khớp tại
tỉnh Hậu Giang.


(re

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học


1.3. Các nghiên cứu phân tích định tính, định lượng glucocorticoid trong
thuốc đông dược điều trị viêm khớp thấp khớp
1.3.1. Nghiên cứu phân tích định tính và định lượng
Trên thế giới, các nghiên cứu định tính và định lượng các GC đã áp dụng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu đò khối phổ cho độ nhạy, độ
đặc hiệu rất cao. Tuy nhiên phương pháp này hiện nay không phù hợp với đa
số phịng thí nghiệm trong nước vì chưa được trang bị hệ thống đầu dị
này.[25],[26],[39],[33],[34],[35]. Có một số nghiên cứu dùng phương pháp

sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu đò PDA.[31]
Tại Việt nam, các nghiên cứu áp đụng phương pháp sắc ký lớp mỏng cho
việc định tính các GC cho độ nhạy và tính đặc hiệu kém[10]. Phương pháp

sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dị khối phổ với chế độ tiêm mẫu trực

tiếp[11] thì cần trang bị đầu dò khối phổ rất đắt tiền. Có hai nghiên cứu định
tính, định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu đò Uv-

Vis va PDA được công bế.[6],[14]
Các tài liệu tham khảo cũng cho thấy, chưa có nghiên cứu nào ứng dụng
phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng ghép với đầu đò Uv-Vis với ưu điểm

vượt trội về hiệu năng tách làm tăng tính đặc hiệu của phương pháp, giảm thời
gian và tiết kiệm dung mơi phân tích trong việc định tính, định lượng đồng
thời một số GC thường ngụy tạo trong các mẫu đông dược này.
Một số nghiên cứu về định tính và định lượng

trong bảng 1.3.


các GC

được tóm tắt


I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

14

Bảng 1.3: So sánh các điều kiện sắc ký tối ưu trong các qui trình nghiên cứu

Tác giả

Pha tĩnh

Đào Văn Đôn

Gemini C18

và cộng sự[6] | (250x4,6mm; 5um) |

Trinh Thi Quy

Inertsil C18

và cộng sự [14] | (250x4,6mm; 5um) |
Andersen J.H.

Hypercarb


và cộng sự [23]

(0021 ; 2um)

Pha động | Đầu đò |
ACN-H,O0

(45:55)

ACN-H,0

UV

Tốc độ | Nhiệt

dong | đổ
(mUphúo | SẼ
15

CC)

,

DAD

L6

(65:35)

,


ACNAFI%
(3:7)

Ms

0,22

40

MS/MS

0,3

40

MeOH-AF

Cui X. và cộng

sur [26]

.

.

BEH C18

(100x2,1mm;
1,7nm)


0,1%

chương
trình
gradient

Gagliardi L. va

Purospher

cộng sự [27]

(250x4,6mm;5um)

HạO-ACN
(40:60)

Herrero P. và
cộng sự [29]

XDB C18
(50x4,6mm;

MeOHActone

,

1,§um)


(80:20)

Herrero P. và
céng su [28]

Ku Y-R va
cộng sự [32]
¬

Luo Y. và cộng

sự [34]
Noben J.P và

cong su [35]
e

Van de hauwe

O. và công sự

1813

UV

1

MS/MS

1


MS/MS

1

UV

12
,

MS/MS

025

| (250x10mm, ; Sum) | (28:72)
MeOH | MS/MS}

2,5

XDB C18
AF1%/AC
(50x4,6mm; 5m) | N (78:22);

ODS-80A
(250x4,6mm; 5um)
Hypercarb

ACN-HạO
(3:7)
AF-H;ạOACN


(30x2,1; 2,5um)

(0,5:5:95)

ODS

H,O-

Hypercarb

A NT

(100x4,6mm;7um)

(10:90)

Ms

nad

radient

25

30


(re


Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

15

1.3.2. Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu

Với nền mẫu phức tạp, các nghiên cứu tập trung vào dùng phương pháp
chiết pha rắn để chiết các corticoid và loại tạp. Phương pháp có thể cho độ tự
động hóa cao, rất thuận tiện khi áp dụng vào thực tế khi có sự hỗ trợ của bộ
chiết pha rắn. Tuy nhiên, với phương pháp này, sẽ khó đảm bảo về độ phục
hồi và khó áp dụng vào thực tế ở Việt Nam vì đa số phịng thí nghiệm chưa

được trang bị bộ chiết pha rắn.
Bên cạnh phương pháp chiết pha rắn, có một số nghiên cứu phát triển
phương pháp chiết có hỗ trợ của nhiệt hoặc siêu âm. Đây là phương pháp đơn

giản, đễ áp dụng vào thực tế vì khơng u cầu cao về trang thiết bị và cho độ
phục hồi cao.

Bảng 1.4: So sánh quy trình xử lý mẫu giữa các tài liệu nghiên cứu

Nên

Tác giả

Đào

Văn

mẫu- |


on man
lượng mầu

ào Văn Đôn
va cộng sự [6]

Đơng

Lê Đào Khánh Long
VÀ
và cộng sự [10]

ˆ
Đơng dược

¬

Đơ

one

d

One2g aug’

-

Tran Công Dũng và
cộng sự [S]


.

Trịnh Thị Quy và

Ph

há

ous P “P
chiêt — loại tạp

‹

Chiét néng

Andersen J.H.

và cộng sự [23]
Cui X. và cộng sự

[26]

lardiL,

_
ự

`


và

cô

L. và cộng

EtOAc

Siêu âm, lắc lỏng | MeOH - HạO (3:7),
.
lỏng
EtOAc

Đơng được,

Liều uống
`

Chiết nóng

Cf hay ethanol

Đơng dược

Cột SPE

MeOH

1 ngày


cộng sự [14]
Nguyễn Quang Nam
và cộng su [11]

‹

Dung môi chiêt/cột

Đông dược, | Siêu âm, lắc lỏng | MeOH - HạO (3:7),
0,1g
lỏng
EtOAc

Nước tiểu,

3ml
Trứng và sữa,

SPE

Catridge
SPE

58

Mỹ nhậm
1
â

¥ pham, *8


HLB + Anion X

Siêu âm,

SPE

HLB

MeOH - CH;C],

(1:9), Cụ


16

I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học

-

as

Tac gia

Nén mau —

Phuong phap

lượng mầu


chiêt — loại tạp

x

H errero P.P. vàvà cộng
cộ sự | GC trong biùn
[29]
thải
H
“Và cô
aa

wt

.

ne a eka

°

SPE

HLB

errero P. và cộng sự
[28]

Nước thai va
nước sông


SPE

HLB

Ku Y-R và cộng sự
[32]

Đơng dược,
5ml

Chiết nóng,
SPE

Cf,
silicagel

Ngâm lạnh

Tert-butyl-ether

Luo

Y.

và cộ

Huyết t

h6 6, Và con sự
[34]


MS 2"Š |

ngựa, lml

Noben J.P và cộng sự

"

[35]

Van de h
công % 39)

O.

,

4

va

Phan,

20

aes

SPE


an

Dung môi chiêt/cột

EtOAc

Cig

,

| Gan ngựa, 5g | Ngâm lạnh,SPE | Acetonitril, C18

1.4. Phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng (UPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật sắc ký tách hỗn hợp trên
cột được nhồi đầy bằng các hạt có kích thước < 10um. Do vậy phải dùng một
bơm có áp suất cao khoảng 300 bar, đây pha động qua cột với tốc độ dòng

khoảng vài ml/phút và cho phép phân giải nhanh một lượng mẫu nhỏ cỡ
20ug. Quá trình tách các chất khác nhau trong cùng một mẫu ra khỏi nhau
này dựa trên cơ chế phân bố, hấp phụ, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ
phân tử.
Chất phân tích sau khi được rủa giải ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi

đầu dò. Việc lựa chọn đầu dò để sử dụng phải dựa trên tính chất lý hóa của
chất cần được phân tích như: khả năng hấp thụ Uv-Vis, huỳnh quang, điện
hóa. Trong đó, đầu dị Uv-Vis và đầu dị đãy điod quang (PDA) là thơng dụng
nhất trong phân tích sắc ký lỏng, có khả năng cung cấp phổ Uv-Vis của các
chat phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sw tinh khiết và định


tính, định lượng thành phần chính bằng cách so sánh phổ của pic sắc ký với
phổ của một ngân hàng đữ liệu hoặc với phổ của một chất chuẩn.