0104 nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích một số thành phần glucocorticoid phổ biến trong các chế phẩm đông dược điều trị viêm thấp khớp bằng phương phá
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (50.35 MB, 77 trang )
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
BO
Y TE
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CÀN THƠ
ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CÁP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN TÍCH
MOT SO THANH PHAN GLUCOCORTICOID
PHO BIEN TRONG CAC CHE PHAM DONG DUOC
DIEU TRI VIEM, THAP KHOP BANG PHUONG PHAP
HPLC VOI DAU DO DAY DIOD QUANG
Chủ nhiệm đề tài
AA
f Lye
Chủ tịch hội đồng nghiệm thu
_—
genre
PP
TS. Dé Chau Minh Vinh Tho
ta
PGS.TS. Duong Xuan Chit
Qi
PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam
đoan
tát cả các kêt quả,
sô liệu và phô
đô trong nghiên cứu là
trung thực va tin cay.
Can Tho, ngay 12 thang 11 nam 2015
Tac gia cơng trình nghiên cứu
Pie
i
Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ
ill
Qi
PL Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
MỤC
LỤC
Trang
LYI ENHI HD cung ga
TH
án: 51e4 9821513669 tang vny h0 pv.o900xg9x.5500010789.:9109900019.45020245500250/63840 il
THÊ G6 các ng tua tia G2 435056461909400446500464153801AGGGISISSRAGVGGSEIRGNESGDGAIESGSRIASSsAviiieResksosvses H
PHAN 1. TOM TAT DE TAI
PHAN 2. TOAN VAN CONG TRINH NGHIEN CUU
Danh muc cdc ky hiéu, chit viet tat .c.c.cccccccccececcsccesesececsncecseceesesestssesestesesesesseereaveses Vii
P0061
:100) TA
...ố.Ố.Ố....ẻ.ẻìỒ....
xii
Danh muc hinh vé, so d6....ccccccsceccescssesesscsessesveseevereavseseanesessesesresesucavareatsssaesecaeenee Xili
PHẢN MỞ ĐẢU. . . . . . . . . . . . .
52-252 222221222212211221122112111
2111211111121 111111...
re |
CHUONG 1 - TONG QUAN TALI LIEU ..0..ooccccccccececcscsccscescesssceresceeseereateateseeseesens 3
1.1 Tổng quan về glucocorticOid........c.ccscscssessessssessesesesesesesseessesecsesacsucateneesansaseaeenees 3
1.1.1 Tác dụng dược lý của ølucoCOFtiCOI..............................c5 555525 S3 S2 xe esserxvce 3
1.1.2 Tinh chat ly héa cua glucocorticoid str dung trong nghién cứu......................... 4
u25. IECREH
H_ THẾ
TuessornanttiotioraGieGGGDGGDIOG001014GG5G161A2EG0A4EEWGGSE30x8888,26010u6a,44 4
1.1.2.2 Dexamethason acetat..........c.ccccsccsscssecsseccssscesssesseeseeeseeessecsssesseesesensesseasensenes 4
1.2.2.3 PredniSOÏOT................................
- -G
Ă G1
011
T1
no HH
ng ce 5
1.2.2.4 Triamcinolon aceftOT1d ............................-- - c + 1332 1321111513 2111 1 1 vn vn vn cg 5
1.2
Thue trang su dung thuốc
đông dược điều tri thap khớp. viêm khớp.................... 6
1.2.1 Vài nét về thuốc đông dược điều trị viêm khớp, thấp khớp........................--.---- 6
1.2.2 Tình
01984102
trạng trộn glucocorticoid
vào thuốc đơng
được
điều trị viêm
khớp,
11 .ồỐỔ.Ố.......................
7
1.3 Các nghiên cứu phân tích corticoid trộn trái phép trong thuốc đông dược điều trị
viêm khớp thấp khớp.....................-----+ + SE x£St£E£EkEEEEEEEEEkEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEECEErrkrrrrcs 8
1.3.1 Nghiên cứu phân tích định tính và định lượng.................................----- 555-5555 <<
1.4 Phuong phap sac ky lỏng hiệu năng CaO............................
-- c6 - 5c S221 3+2
cszcsxsee 10
1.4.1 Khái niệm và cầu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao...........................----c5¿ 10
1.4.2 Kỹ thuật rửa giải øradi€ri( ............................
.-- - -SG HH
ng ngu I1
IV
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
CHƯƠNG 2 - ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 12
2.1 Đối tượng nghiên cứu. . . . . . . .
¿+ 5< <2 E222 xEEEEEEEEkrkErkErkerkrrkrrrererrkered 12
2.1.1 Mẫu nghiên cứu thâm định qui trình định tính, định lượng............................. 12
2.1.2 Mẫu ngun liệu, chế phẩm điều thị thấp khớp, viêm khớp lưu hành tại
thanh ph6 Can Tho..cscccssesssecssesssessesssecsssessecssessecssssssecssecsseesecsrssssssessseeseessssesseesseess 12
2.2 Hóa chất — thuốc thử - trang thiét Di ccc
ec ceeescecesscsesecsesesecevececersnseveveesees 15
2.2.1 Hóa chất - thuốc thử........................-¿- 2 +. E213 11111 711115E11111111 1321 11.21e1xe cv, 15
2.2.2 Trang thiết bị - dụng CỤ....................-5 Là
ch TT g1
Hà HH g ng xe 15
2.3 Phương pháp nghiên CỨU.........................-...2 5 S1
TH
nh ng nà nưkp 15
. 2.3.1 Định danh mẫu trắng giả lập theo bài thuốc độc hoạt ký sinh thang............... 15
2.3.2 Chuẩn bị mẫu. . . . . . . . . -
St
E1 991g
T1 71881 1521
1e
15
2.3.3 Khảo sát điều kiện sắc ký tối tru ........................
¿4 c5s- v2 k+E2EEvEkEEErkerkevxrrkerkeea 16
2.3.4 Khảo sát phương pháp chiết và loại tạp
.....
17
2.3.4.1 Khảo sát phương pháp chiẾt...................
- c5 ©Ss St E3 HAY g1 g1 gExrkerrree 17
2.3.4.2 Khảo sát đung môi chiẾt.......................---s5s xeSzSxeExeckeExeEEerkerkrrkrrrerrerreerrere 18
2.3.4.3 Khảo sát phương pháp loại †ạp..........................
-- -- cm
ng 18
2.3.4.4 Khảo sát sự chiết kiệt và lắc kiỆt......................-s55
EE AE ckeeererkekeesrrei 18
2.3.5 Xác định tính tương tích hệ thống......................-¿- 2-65 s‡SzE£EeEE+EEEErrkecrrerrxee 19
2.3.6 Thâm định quy trình định lượng đồng thời PR, BM, TCA, DMA................... 20
2.3.6.1 Tính đặc hiệu. . . . . . . . - .
¿5:2 Ss
S22 v23 11218 1111731111111.
xrrr 20
2.3.6.2 Tính tuyến tính và miền giá tr|.....................
.---2- 2 se +zvxx+Eckeckerrerkerkerkerkevee 20
2.3.6.3 DG Chinh XAC 0N n6...
. Ả.....ÒỎ 21
2.3.6.4 DO
. ............. 21
2.3.6.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ................................ «Ăn
22
2.3.7 Áp dụng định tính, kiểm sốt hàm lượng PR, BM, TCA, DMA có trong một số
chế phẩm đơng dược điều trị thấp khớp đang lưu hành tại thành phố Cần Thơ.......22
CHƯƠNG 3 - KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU................................--222 ©-2+xezExeeerxerrrsed 23
3.1 Định danh mẫu
trắng theo theo bài thuốc độc hoạt ký sinh thang.................... 23
3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký tối ưu.............................s22 z©S+ExcEEEEEEEEEkkvrkerrkeerkerrked 23
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
3.3 Qui trình chiết tối ưu cho mẫu thử giả lập.....................--.s5s cccccecrEeEverkrsrrrsrvee 25
3.4 Tính tương thích hệ thống...................-¿2-2 2 S22 SEEEEEE1915271E5112ExEEEEEErtrerrkerree 26
3.5 Thâm định qui trình định lượng đồng thời PR, BM, TCA, DMA........................ 28
3.5.1 Tính đặc hiệu. . . . . . . . . . . ¿%2 +2S3SSE SE 3 T171 1111011111111 712121 kerkee 28
3.5.2 Tính tuyến tính, miễn giá trị, giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện........29
3.5.3 DO
can.
.............................. 31
3.5.4 Độ chính XÁC ........................--- -- <1 1
HS
nọ
9n
32
3.6 Ứng dụng kiểm soát chất lượng một số chế phẩm đông dược điều trị thấp khớp
lưu hành tại thành phố Cần TThơ....................
- 5 St +ESSE+EEEEEESEeEEEEEEEEEEErrkrerreerervered 33
CHƯƠNG 4 - BÀN LUẬN ............................ 5-1713
111511511111 1x1 errree 34
4.1 Khảo sát điều kiện sắc ký tối wu........................-¿5 s+sStStSESEEEEkEEEEEEEEEeEEvrkerserrerre 34
4.1.1 Khảo sát các loại pha tĨnh ...................... -- - c Ă t9
11 1v nh
ng
nriệp 34
4.1.2 Khảo sát loại dung môi pha động...........................
--- + Ă 5 S32 2 2. SA 1g ng xe 34
4.1.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH. ........................-.-Ăn S12 1H 1911111312 trưng erxee 35
4.1.4 Khảo sát tỉ lệ pha động.............................
- sàn
HH TH HH 1 gu To nh TT ng 36
4.1.5 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt đỘ..............................----- 55 ĂĂSs cv
ng ceccc 36
4.2 Quy trình chiết mẫu tối tru...........................--c2 s©E+EE+2E<£EkEEEEEEEtEEEEEEErEEevrerrrerrrerree 36
4.3 Thẩm định qui trình định lượng đồng thời PR, BM, TCA, DMA........................ 40
4.3.1 Tính đặc hiệu.... suseuscucesecsucauesuessscsecsucsvssussuesscsussessussusssssucsscsussuscascsuecucaneeneceeenees 40
4.3.2 Tinh tuyén tinh, mién giá trị, giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện. .......42
4.4 Ứng dụng kiểm soát chất lượng một số chế phẩm đông dược điều trị thấp khớp
lưu hành tại thành phố Cần Thơ.......................--+ %2 k‡EE£SkEZEEEEEEEEEEECEEEvEEererrrrrred 42
z0. 07 ...........
44
3i0/6.0002127757........ che
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Mái
45
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
PHAN 1. TOM TAT DE TAI
Trên thế giới, vấn đề xác định sự ngụy tạo glucocorticoid trong thuốc đông được
điều trị viêm, thấp khớp được nghiên cứu rất chuyên sâu, tập trung chủ yếu vào
định
tính
và
betamethason,
định
lượng
prenisolon,
các
methyl
glucocorticold
prednisolon,
phổ
biến
như
triamcinolon,
dexamethason,
hydrocortison...,
có trong các bài thuốc dân gian, chế phẩm đông dược điều trị viêm, thấp khớp bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép với đầu đị khối phổ [11], [22], [23] cho
độ chính xác, độ nhạy, tính đặc hiệu rất cao. Tuy nhiên, phương pháp này lại khơng
phù hợp với đa số phịng thí nghiệm trong nước vì đầu dị khối phơ rất đắc tiền hầu
như khơng được trang bị ở các phịng thí nghiệm phân tích thường qui tại Việt Nam.
Tại Việt Nam, các nghiên cứu về sự ngụy tạo glucocorticoid trong đông dược
điều trị viêm, thấp khớp còn rất hạn chế, chủ yếu là định tính bằng phương pháp
sắc ký lớp mỏng [10] cho độ chính xác, độ nhạy, tính đặc hiệu kém.
Chỉ có một
nghiên cứu Đào Văn Đơn [6] và cộng sự được cơng bố, xây dựng qui trình định lượng
đồng thời deaxamethason, betamethason, prednisolon bằng phương pháp HPLC với
đầu đò Uv-vis xây nhưng khơng áp dụng gui trình đã thâm định này để kiểm sốt chất
lượng đơng dược điều trị viêm, thấp khớp đang lưu hành trên thị trường.
Thêm vào đó, cho đến nay vẫn chưa có qui trình định lượng đồng thời các
glucocorticoid bang phuong phap phan tich sắc ký hiện đại cho độ tin cậy, độ nhạy,
độ chính xác cao, ngay cả trong các tài liệu chính thống như: DĐVN4, Dược điển
Anh (BP 2013), Dược điển Mỹ 2014 (USP37).
Do đó, đề tài “Nghiên cứu xây đựng qui trình phân tích một số thành phần
glucocorticoid. phổ biến trong các chế phẩm đông dược điều trị viêm, thấp khớp bằng
phương pháp HPLC với đầu dò dấy điod quang” là rất cần thiết và có ý nghĩa thực
tiễn rất lớn trong việc kiểm sốt chất lượng thuốc đơng được điều trị viêm, thấp khớp
đang sử dụng ngày cang gia tang trong cộng đồng.
VI
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Mục tiêu nghiên cứu
-
Xây
dựng
qui
trình
phân
tích
đồng
thời
dexamethason,
betamethason,
prednisolon và triamcinolon có trong mẫu đơng dược điều trị viêm, thấp khớp
bằng phương pháp HPLC/PDA.
- _ Thẩm định qui trình phân tích đã xây dựng theo hướng dẫn của ICH.
- _ Áp dụng qui trình phân tích đã thâm định để kiểm soát chất lượng các mẫu thuốc
đông được điều trị thấp khớp lưu hành tại TP. Cần Thơ. Thống kê và đánh giá
các kết quả về chất lượng sản phẩm.
Đối tượng nghiên cứn
- _ Trong nhóm thuốc đông được trị thấp khớp. Độc hoạt ký sinh tang là bài thuốc cổ
phương có thành phần từ 13 vị thuốc với các nhóm hoạt chất đa dạng, đại diện
trong điều trị thấp khớp.
Độc hoạt
12g
Đương quy
12g
Tang ký sinh
20g
xuyên khung
8g
Phong phong
8g
Đảng sâm
12g
Qué chi
4g
Phục linh
12g
Ngưu tất
12g
Bạch thược
12g
Đỗ trọng
12g
Cam thảo
6g
Sinh dia
12g
- _ Các chế phầm đông dược điều trị viêm, thâp khớp được thu mua ở các nhà thuốc
Đông Y tại Tp. Cần Thơ (dự kiến 20 mẫu)
.Phương pháp nghiên cứu
Dựa
vào
cấu
trúc
hóa
học
của
dexamethason,
betamethason,
prednisolon,
triamcinolon có pKa trung bình nên kĩ thuật sắc kí pha đảo đã được áp dung với hệ
dung môi phân cực bao gồm acetonitril, nước, có thêm hoặc khơng thêm acid acetic
băng (<0.5%), sử dụng kỹ thuật rửa giải gradient dé tach đặc hiệu cdc glucocorticoid
trong hỗn hợp chuẩn, mẫu giả lập được tạo từ bài thuốc độc hoạt tang ký sinh,
_thử giả lập. Trong quá trình thực nghiệm, các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tách
và độ chọn lọc của phương pháp như pH sẽ được thay đổi 4,0 — 8,0 phù hợp với đặc
VIH
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
tính của một corticoid và tỉ lệ dung môi acetonitril theo hướng tăng dần nhằm tim
điều kiện sắc kí tối ưu.
Xây dựng và thầm định phương pháp theo hướng dẫn của ICH [18] bao gồm:
khảo
sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng, giới hạn
phát hiện, giới hạn định lượng.
Kết quả nghiên cứu
Điều kiện sắc ký thích hợp được tìm thấy với hệ thống máy Hitachi L-2000,
cột sắc ký Phenomenex
(ACN:
HO)
Gemini C18
theo chương
(250 x 4,6mm,
5um),
dung môi pha động
trình gradient, thể tích tiêm mẫu
10L],
tốc độ dịng
1,2 ml/phút, bước sóng phát hiện 240 nm. Qui trình đã được thẩm định đạt yêu cầu theo
hướng dẫn của ICH với khoảng tuyến tính rộng (10 — 200 ug/m]), hệ số tương
quan
tin cậy (R?> 0.999), độ đúng (tỉ lệ phục hồi 95-98%) và độ chính xác cao (RSD< 5%),
giới hạn định lượng của Prednisolon, Betamethason, Triamcinolon, Dexamethason
lần lượt là 6ug/ml, 2ug/ml, 2ug/ml và 6ug/ml.
Quy trình đã được ứng dụng thành cơng trong việc xác định bốn corticoid này
trong
hai
mươi
mẫu
chế phẩm
điều
trị thấp
khớp
lưu
hành
trên thị trường
Tp. Cần Thơ, kết quả phát hiện 6 chế phẩm có trộn trái phép glucocorticoid.
Kết luận: Nghiên cứu góp phần nâng cao chất lượng thuốc đông dược điều trị
viêm, thấp khớp đang sử dụng ngày càng phô biến trong cộng đồng.
1X
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
PHẢN 2. TỒN VĂN CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
DANH MỤC CÁC KY HIEU, CAC CHU VIET TAT
STT
Chữ tắt, ký hiệu
]
ACN
2
AOAC
3
international
As
Chữ ngun
Acetonitril
Dung mơi Acetonitril
Association of Official
Hiệp hội các nhà hóa học
Asymmetry
Hệ số bất đối
Analytical Chemists
4
BĐM
Bình định mức
5
BM
Betamethason
6
Cf
Chloroform
7
CTCT
Cơng thức cầu tạo
§
CTPT
Cơng thức phân tử
9
DDVN4
Ý nghĩa
phân tich quoc té
Dung môi cloroform
Được điển Việt Nam 4
10
DCM
Dichloro methan
Dung môi dichloro methan
11
DMA
Dexamethason acetat
12
DKTD
Điều kiện thăm đị
các điều kiện sắc ký tham
13
EtOAc
Ethyl acetat
Dung mơi ethyl acetat
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
14
HPLC
Chromatography Liquid
1s
ICH
International conference
16
MeOH
17
PDA
Photo Diode Array
18
PR
Prednisolon
19
Rs
20
21
SKĐ
SKLM
Sắc ký đồ
Sắc ký lớp mỏng
22_
TCA
Triamcinolon acetonid
23.
TEA
Triethyl amin
Dung mi triethyl amin
24
Tr
Retention time
Thoi gian lưu của pic
harmonisation
Methanol
Hiệp nội đồng thuận
quéc tê
Dung méi methanol
Resolution
Pau do day diod quang
Độ phân giải
xi
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
DANH MUC CAC BANG
Trang
Bảng 1.1 So sánh các điều kiện sắc ky tối ưu trong các qui trình nghiên cứu........... 9
Bảng 1.2 So sánh qui trình xử lý mẫu giữa các tài liệu nghiên cứu.......................-.. 10
Bảng 2.1 Các chế phẩm ứng dụngg.........................---5 + ©ct 2E
EExeckerErrrkrrxerrervrvie 13
Bảng 2.2 Mã hóa các chế phẩm.....................
¿ +. 2° E1 E1 2E Ex073214212711 1171 7.eL 14
Bảng 3.1 Kết quả định danh mẫu trang gid lap theo theo bai
(45010
thuốc độc hoạt
1177 ................................ 23
Bang 3.2 Chương trình chạy gradient tỐi tru .....................---225s Se+cEcEEEEEzEerkerkeerria 24
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên mẫu hỗn hợp chuẩn
12...
.............................. 26
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống trên mẫu thử giả lập
J3 ............................................ 26
Bảng 3.5 Độ tinh khiết pic của mẫu thử giả lập và độ tương hợp phổ UV của mẫu
chuẩn và mẫu thử giả lập. . . . . . . .-
-- -- © ket
EEEkEEEk E111
117212 ce, 28
Bang 3.6 Kết quả phương trình hồi quy, miễn giá trị, LOD và LOQ ...................... 30
Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng..........................-©2s5 v2 ch x1 E111 tkerreee 31
Bang 3.8 Két quả khảo sát độ chính xác trong ngay (n=6) va liên ngày (n=3)........ 32
Bảng
3.9
Kết
quả
thành phố Cần Thơ. . . . . . . . . . -
khảo
sát
trên
các
mẫu
thu
thập
trên
thị
trường
¿6 c2 3 23E1113923715221711211
7111111. 15T1.11E111.11111 02.6 33
Bảng 4.1 Chương trình chạy gradienf tối ưu ....................
---+- + ss©
XI
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỊ
Trang
Hình 1.1 Phố UV của BM trong MeOH...........................
set rEtEESEEEEEEEEvEkrrrrrrerree 4
Hình 1.2 CTCT của BÌM........................ ¿5-52-5222 C1 1E211711 1171121121171 1111.1x xe. 4
Hình 1.3 Phổ UV của DMA trong MeOH....................
- 5 sss2tc SE Sv2ExgEEeEkerrsersecee 5
Hình 1.4 CTCT của DMA..........................---2+2-©5<
S522 EE2EE2CEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEerrrgrkrrecri, 5
Hình 1.5 Phổ UV của PR trong MeOH..........................
- 6-5 SsSSeSSEvEEEEEEEEE22ExEExczrree 5
Hình 1.6 CTCT của PR..............................
+ ©s+ tềSk T2 E11 E111 22111011011111111 1151. 1eExcee 5
Hình 1.7 Phơ UV của TCA trong MeOH.........................-5s +kEESEEvEESEESEEEEESEESEEvrerrreg 6
Hình 1.8 CTCT của TA ...........................
- 2-5656 SsEEEEEkEEEEExEEEEEEEEEEEEkEEkSEEEEESEkorkrrkrek 6
Hình 2.1 Sơ đồ khảo sát quy trình chiết có hỗ trợ nhiệt, sóng siêu âm..................... 17
Hình 2.2 Sơ đồ khảo sát dung môi chiết glucocorticoid......................--s5 s:s+zxezsee 18
Hình 3.1 Sắc ký đồ hỗn hợp chuẩn và thử ở điều kiện sắc ký tối ưu...................... 24
Hình 3.2 Sơ đồ qui trình chiết tối tưu..........................---2 2© E+EE+ES£2E£EEEEEeEkerkerkrrrrre 25
Hinh 3.3 SKD 6 lần tiêm liên tiếp của mẫu hỗn hợp chuẩn...........................--sccse+ 27
Hình 3.4 SKĐÐ 6 lần tiêm liên tiếp của mẫu thử giả lập ............................--2---s--cecce2 27
Hình 3.5 Chồng sắc ký đồ tính đặc hiệu.........................--©25- s22
xeerkecree 28
Hình 3.6 Độ tỉnh khiết của các pic trong mẫu thử giả lập..........................----2-cc«ecxee 30
Hình 3.7 Đường tuyến tính của PR, BM, BM, DMA............................-25c 5< ©z
Hình 3.9 Sắc ký đồ độ chính xác ngày 3........................--GSt tcrcESESEEEEEEEEEEErrrerxee 32
Hình 4.1 Sắc ký đồ khảo sát sự ảnh hưởng của pHl 3, 6.......................--.«-cs+zcszEzsrrr 35
Hình 4.2 Sắc ký đồ khảo sát sự ảnh hưởng của pH 9 và khơng chỉnh pH............... 35
Hình 4.3 Sắc ký đồ khảo sát dung mơi chiết: MeOH, EtOAc, CẼ......................c.- 37
Hình 4.4 sắc ký đồ khao sat dung méi chiét: MeOH, hén hop MeOH:H20............. 38
Hình 4.5 Sơ đồ quy trình chiét t6i Wu e..eccccscsssessessecssccscecstecececececetessessecsseeenseeees 39
Hình 4.6 Sắc ký đồ khảo sát chiết kiệt.......................--.6
Song 2 E111 Eexkervcở 40
Hình 4.7 Kiểm tra độ tỉnh khiết của mẫu thử giả lập và so sánh phổ UV của
mẫu chuẩn và mẫu thử giả lập........................
- -- 2s +2 vEEEkEEEEESEx 211715151 727e xe Ea 42
XI
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
PHAN MO DAU
Hiện nay, các bệnh lý viêm khớp, thấp khớp, viêm bao hoạt dịch, thối hóa
khớp... tăng đột biến trong xã hội hiện đại. Có nhiều phương pháp điều trị và dùng
thuốc khác nhau được áp dụng. Theơ đó, xu hướng sử dụng các thuốc Đơng y có
nguồn gốc thiên nhiên càng ngày gia tăng do hiệu quả điều trị đã được chứng minh
và tính an tồn cao.
Tuy nhiên, một số cơ sở sản xuất, mua bán thuốc đông y khơng chân chính,
đặc biệt các thuốc
đơng
y có nguồn
gốc
nhập
khẩu
đã sử dụng
thành phần
glucocorticoid (dexamethason, betamethason, prednisolon...) dé trén lan vao các
chế phẩm đông được nhằm đánh lừa người bệnh với hiệu quả điều trị cao trong giai
đoạn ban đầu, nhưng ngược lại đã để lại một hậu quả nghiêm trọng cho người bệnh
khi sử đụng thuốc lâu dài dẫn đến những độc tính, bệnh lý nặng nẻ trên thận, xương,
dạ dày. ...tạo ra những gánh nặng to lớn cho người bệnh và ngành y tế.
Việc trộn glucorticoid không hợp pháp vào chế phẩm đơng dược ngày càng
phổ biến, tỉnh vi và khó phát hiện. Để kiểm soát được vấn đề này, đã có nhiều
cơng trình nghiên cứu về việc đính tính phát hiện các glucocorticoid với kỹ thuật
SKLM
[10] và khối phổ [11], [22]. Tuy nhiên, việc kiểm soát hàm lượng các
glucocorticoid này chỉ có vài
Thêm
vào
đó, cho
nghiên cứu phát triển phương pháp định lượng [6].
đến nay vẫn
chưa
có qui trình định
lượng
đồng
thời các
glucocorticoid bang phương pháp phân tích sắc ký hiện đại với độ tin cậy, độ nhạy,
độ chính xác cao, ngay cả trong DĐVN4, Dược điển Anh 2013, Dược điển Mỹ 35.
Do đó, việc xây dựng một phương pháp phân tích có thể áp dụng định tính,
định lượng với độ nhạy, độ chính xác và tính đặc hiệu cao đề phân tích đồng thời các
thành phần glucocorticoid có trong các chế phẩm đơng dược điều trị thấp khớp
một yêu câu hêt sức cân thiêt. Vì thê chúng tơi tiên hành thực hiện đê tài:
XIV
là
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
“Nghiên cứu xây dựng qui trình phân tích một số thành phân glueocorticoid
phổ biển trong các chế phẩm đông dược điễu trị viêm, thấp khớp bằng phương
pháp HPLC với đầu dò dấy điod quang”
Với mục tiêu:
-
Khảo
sát điều sắc ký cho việc tách đặc hiệu dexamethason,
betamethason,
prednisolon và triamcinolon có trong mẫu đơng được điều trị viêm, thấp khớp
bằng phương pháp HPLC với đầu dị dãy diod quang.
-
Thâm
định
qui trình phân
tích đồng
thời
dexamethason,
betamethason,
prednisolon và triamcinolon có trong mẫu đơng dược điều trị viêm, thấp khớp
theo hướng dẫn của ICH.
- _ Áp dụng qui trình phân tích đã thâm định để kiểm sốt chất lượng các mẫu
thuốc đông được điều trị thấp khớp lưu hành tại TP. Cần Thơ.
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Chương 1 - TONG QUAN TAI LIEU
1.1 Téng quan vé glucocorticoid
1.1.1 Tac dung dugc ly cia glucocorticoid [2]
Tác dụng của glucocorticoid: ở nồng độ sinh lý các chất này cần cho cân bằng nội
môi, tăng sức chống đỡ của cơ thể với stress và duy trì các chức năng khác của cơ thé
như: tác dụng trên chuyển hóa, trên các cơ quan và tuyến,... Trong đó tác dụng chống
viêm, chống đị ứng hay được áp dụng trong điều trị một số bệnh mãn tính như: thấp
khớp, hen phế quản, viêm xoang...
Tác dụng không mong muốn của glucocorticoid: phù, loét da day tá tràng, suy thượng
thận, tác dụng trên sự tăng trưởng của trẻ em,...Những tác dụng này thường gặp ở
những người dùng thuốc lâu dài hoặc đùng quá liều. Một số tác dụng không mong
muốn hay gặp:
- _ Gây suy tuyến thượng thận: do khi dùng thuốc glucocorticoid từ n goài vào cơ thé
sẽ làm ức chế tuyến thượng thận bài tiết, dẫn đến tình trạng suy giảm khả năng
bai tiét glucocorticoid cia chinh cơ thể người đó. Lúc đó cơ thể hay mệt mỏi, nơn
ói, nặng hơn nữa có thể gây huyết áp thấp hay tụt huyết áp.
- _ Tăng cân do giữ muối nước, cơ thể bệnh nhân map ra, bung to, chan tay teo lai,
da mỏng dễ bằm máu, nứt da bụng...
-
Loét da day ta trang.
- _ Loãng xương: uống corficoid lâu ngày làm cho xương bị mỏng dần nên rat dé bị
gãy xương.
- _ Thai kỳ: có thê gây hại cho thai.
- _ Làm trẻ em chậm phát triển chiều cao, dẫn đến bị lùn.
Chỉ định của corticoid: điều trị thay thế khi vỏ thượng thận không tiết đủ hormon,
bệnh tự miễn, dị ứng, shock phản vệ, hen phế quản, viêm cơ khớp, viêm da,...
Liều
dùng
của
glucocorticoid:
liều
dùng
glucocorticoid
dao
0,5-20mg/lần tùy thuộc tác dụng của thuốc và mục đích điều trị.
động
rộng
từ
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
1.1.2 Tính chất lý hóa của glucocorticoid sử dụng trong nghiên cứu
1.1.2.1 Betamethason (BM) [4], [25], [26]
Betamethason là 9-fuoro-1 1B, 17, 21-trihydroxy-I6B-methylpregna- l,4- diene-3,20-
đione. CTPT: CzzH›sFOs . Tính chất:
- _ Bột kết tỉnh màu trắng hoặc gần như trắng.
- _ Thực tế khơng tan trong nước, ít trong ethanol khan, rất ít tan trong methylen
clorid. Tan nhiều trong methanol.
pKa= 12,42.
-
Cue đại hấp thu khi pha trong methanol 14 238,5nm.
Absorbance
-
200
k
225
1
250
1
275
300
1
325
L
350
L
375
400
Wavelength
Hinh 1.1 Phé UV cha BM trong MeOH
Hình 1.2 CTCT của BM
1.1.2.2 Dexamethason acetat (DMA) [4], [25], [26]
Dexamethason acetat 1a 9-fluoro-11B,17 - dihydroxy-16a-methyl-3,20-dioxopregna-
1,4-dien-21-yl acetat. CTPT: C2s4H31FOs. Tinh chat:
- Bé6t két tinh mau trang hodc gan nhu trang, da hinh.
- __ Dễ tan trong ethanol 96% và aceton, khó tan trong methylen clorid, thực tế không
tan trong nước.
-
pKa= 12,14. (dang base)
-
Cực đại hấp thu khi pha trong methanol 238,5nm.
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Absorbance
(re
200
L
225
tL
250
k
275
30
4
1
325
1
350
1
375
400
Wavelength
Hình 1.3 Phé UV ctia DMA trong MeOH
Hinh 1.4 CTCT cua DMA
1.2.2.3 Prednisolon (PR) [5], [25], [26]
Prednisolon 1a 11B,17,21-Trihydroxypregna-1,4-diene-3,20-dion. CTPT:. C21H280s.
Tinh chat:
-
Bé6t mau trang hodc gan nhv trang, tinh thé, hut 4m.
-
Tinh tan: rất ít tan trong nước, dé tan trong ethanol 96% va trong methanol, hoi
tan trong aceton, hoi tan trong methylen clorid.
-
pKa= 12,58.
Absorbance
- _ Cực đại hấp thu trong methanol 1a 242nm.
200
1
225
1
250
L
275
300
L
325
1
360
L
375
400
O
Wavelength
Hình 1.5 Phé UV ctia PR trong MeOH
Hinh 1.6 CTCT cua PR
1.2.2.4 Triamcinolon acetonid (TCA) [25], [26]
Triamcinolon
acetonid
1a 9-Fluoro-11b,21-dihydroxy-16a,17-(1-methylethylidene
dioxy) pregna-1,4-diene-3,20- dione. CTPT: Co4H31F Os. Tính chat:
-
Mau trang hodc gan nhv trang, dang bét tinh thé.
-
Tinh tan: thực tế không tan trong nước, ít tan trong ethanol 96%. Tan nhiều trong
methanol.
-
pKa= 11,75 (dang base), cuc dai hap thu trong methanol là 238nm.
Absorbance
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
200
1
1
L
225
250
275
300
1
4
325
350
L
375
400
Wavelength
Hình 1.7 Phổ UV của TCA trong MeOH
Hinh 1.8 CTCT cua TCA
1.2. Thực trạng sử dụng thuốc đông dược điều trị thấp khớp, viêm khớp
1.2.1 Vài nét về thuốc đông dược điều trị viêm khớp, thấp khớp
Thuốc đông dược hay thuốc đơng y là những thuốc có nguồn gốc tự nhiên, từ
động vật, thực vật hoặc khoáng chất được bào chế theo lý luận và phương pháp của
y học cổ truyền các nước phương Đông. Thuốc đông dược được dùng đề phòng bệnh,
chữa bệnh, phục hồi chức năng của cơ thể [4].
Hiện nay, việc sử dụng thuốc
đông dược là xu hướng ở Việt Nam và trên tồn
thế giới. Thuốc đơng dược được đánh giá là cho hiệu quả cao trong điều trị nhiều
căn bệnh trong đó có bệnh viêm khớp đạng thấp hay còn được gọi là bệnh thấp khớp.
Nhiều nghiên cứu cả về in vivo và in vitro đã chứng minh biệu quả của một số
thảo được cũng như của các thành phan hóa hoc trong điều trị viêm khớp dạng thấp.
Một
số được
liệu như cúc gai, ngải đắng,
oải hương,
măng
tây, cỏ roi ngựa,
huyền sâm,...có thể sử dụng bằng cách uống hoặc dùng ngoài để điều trị bệnh
thấp khớp. Cho đến nay, các vị thuốc như nhục đậu khấu, hương thảo, đại mạch,
tầm ma,... vẫn còn được dùng phổ biến như một liệu pháp thay thế thuốc trong
điều trị viêm khớp dạng thấp [3].
Nghiên cứu của Leventhal L. J. vào năm 1994 đã cho thấy, nhóm bệnh nhân sử
dụng dầu hạt nho đen có sự giảm đau khớp rõ rệt hơn so với nhóm bệnh nhân sử dụng
thuốc kháng viêm non-steroid [19].
Cây Lôi công đẳng, một loại thảo được phân bố chủ yếu ở miền Nam Trung
Quốc, đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị viêm khớp ở nước này. Khi so sánh với
nhóm sử dụng giả dược, kết quả cho thấy những bệnh nhân được điều trị với Lôi công
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
đẳng có sự thuyên giảm rõ rệt và giảm đáng kể các triệu chứng như sưng khớp, cứng
khớp buổi sáng và đau khớp. Đồng thời thử nghiệm lâm sàng cũng đã khẳng định
rằng, vị thuốc này đem lại hiệu quả điều trị rõ rệt chỉ sau 4 tuần đầu sử dụng.
1.2.2 Tình trạng trộn glucocorticoid vào thuốc đơng dược điều trị viêm khóp,
thấp khớp
Xu hướng của thế giới cũng như ở Việt Nam
là quay về với các sản phẩm
nguồn gốc tự nhiên do tính an tồn đã được khẳng định. Dựa vào xu hướng đó, nhiều
cơ sở đã trộn thêm tân dược vào các chế phẩm đông dược để giảm nhanh triệu chứng
bệnh nhằm đánh vào tâm lý của người bệnh và thu lợi. Tuy nhiên việc này dễ gây
tai biến, đị ứng thuốc cho bệnh nhân. Thậm chí đã có bệnh nhân phải nhập viện trong
tình trạng nguy kịch như suy thận cấp, suy hô hap... do qua liều hay dị ứng thuốc tân
được bị trộn lẫn [2], [30].
Các nhóm thuốc tân được thường được trộn thêm vào thuốc đông được:
glucocorticoid, thuốc giảm đau hạ sốt, thuốc kháng histamin, thuốc an thần gây ngủ,
các dẫn chất sidenafil...Các mẫu thuốc đông được hay bị lợi dụng để trộn thêm
tân dược
thường
gặp
ở nhóm
thuốc
chữa
thấp khớp,
hen và thậm
chí có cả ở
thuốc bổ. Trong đó, nhóm kháng viêm corticoid là thành phần trộn trái phép phổ biến
nhất cho các chế phẩm đông dược mà đặc biệt là trong các chế phẩm đông dược điều
trị bệnh viêm khớp, thấp khớp. Nhiều năm trở lại đây, các cơ quan chức năng đã đình
chỉ
lưu
hành
hàng
loạt những
thuốc
đơng
được
bị phát hiện
trộn trái phép
thành phần corticoid.
Tháng 4 năm 2005, Cục Quản lý dược Việt Nam đã ra thơng báo đình chỉ lưu
hành trên tồn quốc mặt hàng thuốc viên nang “Tăng phì hồn” (Ceng Fui Yen) do
Công ty trách nhiệm hữu hạn Dược phẩm WELIP - Malaysia sản xuất, Công ty cổ
phần Dược liệu Trung Ương 2 nhập khẩu. Theo Cục Quản lý dược, vỏ nang thuốc
“tăng phì hồn” có chứa hai chất khơng có trong hồ sơ đăng ký thuốc là cyproheptadin
hydrochlorid và đexamethason. Đây là những thuốc chữa bệnh đều khơng có lợi cho
bệnh nhân khi sử dụng theo hướng dẫn sử dụng trên nhãn thuốc [28].
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
'Tháng 6 năm 2007, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã tiến hành phân tích
mẫu thuốc mang tên “Dân tộc cứu nhân vật” có nguồn gốc từ Campuchia, loại thuốc
được cho là có hiệu quả điều trị rất nhiều bệnh trong đó có thấp khớp và được xem là
thần được. Theo kết quả công bố, “Dân tộc cứu nhân vật” bị phát hiện là có chứa
paracetamol, diazepam, cyproheptadine và dexamethason. Bộ Y tế đã có văn bản
nghiêm cấm việc sản xuất, nhập khẩu, buôn bán và sử dụng loại thuốc này trên
toàn quốc [30].
Tháng 11 năm 2008, Viện kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ Chí Minh đã phát
hiện một số thuốc đơng được có chứa tân được, trong đó có chế phẩm Tuyết liên
phong thấp linh (Sauran Fong Sep Lin) cia nha san xudt Welip
(M) Sdn Bhd,
Malaysia, số lô 5266, tuy nhiên khơng có số đăng ký nhập khẩu của Bộ Y tế. Thuốc
có cơng dụng trị phong thấp, viêm khớp xương, đau nhức cơ bắp, đau lưng và thần
kinh tọa và bị phát hiện trong thành phần có chứa betamethason acetat [29].
Thánh 12 năm 2009, Cục Quản lý Dược ban hành văn bản đình chỉ lưu hành và
thu hồi trên tồn quốc đối với thuốc Tân hịa truy phong tê thấp thủy chai 280 mỊ,
số lô sản xuất 010409, số đăng ký V1049-H12-]0 vì đã trộn trái phép tân dược
betamethason. Loại thuốc này do cơ sở sản xuất thuốc y học cổ truyền Hinh Hịa,
địa chỉ số 123/33 Bình Tây, quận 6, thành phố Hồ Chí Minh sản xuất với những
tác dụng như: ích can thận, bố khí huyết, chỉ thống lý và khu phong khớp, chủ trị
đau lưng mỏi gối, tay chân co duỗi khó khăn, đau cứng khớp xương và tê dại
toàn thân [3 1].
Với thực trạng hiện nay, khi việc kiểm sốt chất lượng thuốc đơng dược cịn chưa
đạt hiệu quả, các chế phâm đơng được trộn trái phép thuốc tân được khơng chỉ tạo
nên những khó khăn cho công tác quán lý chất lượng thuốc mà cịn gây ra những
hậu quả vơ cùng nặng nề cho sức khỏe người tiêu dùng.
1.3 Các nghiên cứu phân tích corticoid trộn trái phép trong thuốc đông được
điều trị viêm khớp thấp khớp
1.3.1 Nghiên cứu phân tích định tính và định lượng
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Để đáp ứng nhu cầu thực tế đặt ra, đã có nhiều nghiên cứu về cả định tính và
định lượng corticoid trộn trái phép trong đông dược được tiễn hành.
Ớ nước ngồi, vấn đề trộn trái phép corticoid trong thuốc đơng được đã được
nghiên
định
cứu từ rất lâu. Các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào cả định tính và
lượng
bằng
kỹ thuật
sắc ký
lỏng
hiệu
năng
cao
với
đầu
dị khối phô.
Phương pháp này cho độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao, tuy nhiên khơng phù hợp với
đa số phịng thí nghiệm trong nước vì chưa được trang bị đầu dò khối phổ [15], [16],
[17], [22]. [23].
Các nghiên cứu trong nước tập trung chủ yếu vào định tính bằng sắc ký lớp mỏng
[10] hay phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò khối phổ với chế độ
tiêm mẫu trực tiếp [11]. Chỉ có một nghiên cứu về định lượng được công bố [6].
Điều này cho thấy vấn dé trộn trái phép corticoid vào thuốc đông được chỉ mới được
chú ý nghiên cứu gần đây và cần phải được nghiên cứu nhiều hơn. Một số nghiên cứu
về trộn trái phép corticoid trong đơng được được tóm tắt trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1 So sánh các điều kiện sắc ký tối ưu trong các qui trình nghiên cứu
Tác giả
`
X/Ec
Cột sắc ký
ĐA
Đảo Văn Đơn
và cộng sự [6]
Andersen J.H.
Gemini C18
(250x4.6mm;
Sum)
Hypercarb
Pha động
Đầu dị
-
ACN:H20
(45:55, tt/tt)
ACN:AF
1%
dòng
(ml/phut)
Nhiệt
độ cột
(°C)
Nhiệt
UV
1,5
độ
MS
0,22
49
phòng
và cộng sự[13]
(100x2,1;5um)
Cui suX. [17]
va cong
(q0ox2imm,
1/7um)
MCOHAF
01%
(gradient)
MỹSMS
043
40
KuY-Rva
Ð
_ (250x4,6mm;
QDS-80A
ACN:H2O
UV
1,2
Nhật
độ
xy
SA
cộng sự [20]
BEH C18
5um)
__(3:7, tt/tt)
Tốcđộ
(3: 7, tt/tt)
3
240nm
phòng
1.3.2 Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu
Với nền mẫu phức tạp, các nghiên cứu tập trung vào dùng phương pháp chiết pha
rắn để chiết các corticoid và loại tạp. Phương pháp có thể cho độ tự động hóa cao,
rất thuận tiện khi áp dụng vào thực tế khi có sự hỗ trợ của bộ chiết pha rắn. Tuy nhiên,
7
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
với phương pháp này, sẽ khó đảm bảo về độ phục hỗồi và khó áp dụng vào thực tế ở
Việt Nam vì đa số phịng thí nghiệm chưa được trang bị bộ chiết pha rắn.
Bên cạnh phương pháp chiết pha rắn, có một số nghiên cứu phát triển phương
pháp chiết có hễ trợ của nhiệt hoặc siêu âm. Đây là phương pháp đơn giản, đễ áp
dụng vào thực tế vì khơng yêu cầu cao về trang thiết bị và cho độ phục hồi cao.
Các qui trình xử lý mẫu của một số nghiên cứu trong và ngồi nước được tóm tắt
trong Bảng 1.2.
Bảng 1.2 So sánh qui trình xử lý mẫu giữa các tài liệu nghiên cứu
Tac gia
Dao Van Đôn
va cộng sự [6]
Lê Đào Khánh
Long và cộng sự
[10]
Nguyén Quang
Nếnsố lượng
mẫu
x
mau
Đông dược,
2g
Đông dược
ˆ
pp chidt — loai° =
tap
d
Dung mơi chiê/cột
Chiết nóng
ta
A_—
TẾ
Siêu am, lac
long lỏng
tx
a
Tế
FtAc
.
.
MeOH:H20 (3:7),
EtAc
.
.
Nam, Trần Hùng
[11]
Đông dược,
0,1g
Siêu âm, lắc
lỏng lỏng
MeOH:H20 (3:7),
EtAc
Andersen J.H.
Nước tiểu,
SPR
HLB + Anion X
Cui X. và cộng sự
Trứng và
SPE
va cộng su [13]
[L7]
Ku Y-Rvac6ng
sự [20]
Luo Y. và cộngsự
[29]
3ml
Dinh tinh
HLB
.
Chiêt nóng,
SPE
Chloroform,
silica gel
ngựa, Iml
Ngâm lạnh
Tert-butyl-ether
a
Dinh tinh
Catridge
stra, 5g
Đông dược,
5ml
Huyết tương
|
Ghi chú
-
-
1.4 Phương pháp sắc ký lồng hiệu năng cao
1.4.1 Khái niệm và cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu nang cao [7], [8]
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp tách trong đó pha động là một chất
lỏng, còn pha tĩnh là một chất rắn, hoặc là một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn
đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ. Q trình sắc ký lỏng
dựa trên cơ chế phân bố, hấp phụ, trao đổi ion hay loại trừ theo kích cỡ.
Chất phân tích sau khi được rửa giải ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi đầu dò.
Việc lựa chọn đầu đò để sử dụng phải dựa trên tính chất lý hóa của chất cần được
10
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
phân tích như: khả năng hấp thụ UV — Vis, huỳnh quang... Đầu đị PDA là đầu dị
thơng dụng nhất trong HPLC.
Đầu dị PDA
cung cấp phổ UV-Vis
của các chất
phân tích trong khoảng bước sóng đã chọn, kiểm tra sự tinh khiết của sản phẩm và
định danh được sản phẩm bằng cách so sánh phổ của pic sắc ký với phổ của một
- ngân hàng đữ liệu hoặc với phổ của một chất chuẩn.
ghi
Dung
May tính
nhngn & xd
ly dd liệu
mdi
Cót
sắc
kí
BG phan
tiềm
mẫu trị động
Fh
=—i
do
Bơm
—
Nuoe tha aes
Hình 1.9 Sơ đồ cấu tạo máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.4.2 Kỹ thuật rửa giải gradient [7], [§]
Trong HPLC có 2 kỹ thuật rửa giải là: đẳng dịng (tỷ lệ đung mơi khơng thay đổi
trong suốt q trình chạy) và gradient (tỷ lệ dung mơi thay đổi theo thời gian).
Kỹ
thuật
chạy gradient ra đời trong khoảng
1973,
góp phần
cải thiện những
nhược điểm của kỹ thuật đắng dịng như: khơng thể phân tích được I hỗn hợp chất
quá phức tạp như mẫu địch chiết được liệu, sinh phẩm, thực phẩm....
Trong rửa giải gradient do tỷ lệ thành phần dung môi thay đổi, độ phân cực của
pha động cũng thay đổi theo thời gian đẫn đến độ chọn lọc của hệ thống khác nhau
đối với các chất giúp tách các chất tan một cách hiệu quả hơn với độ phân giải tốt
hơn và chiều rộng băng các pic gần như tương đương so với kỹ thuật isocratic.
Kỹ thuật rửa giải gradient với nhiều ưu điểm hơn isocratic (tiết kiệm thời gian,
dưng môi, độ phân giải tốt, có thể áp dụng trên những mẫu phức tạp, nhiều thành
phần). Tuy nhiên đòi hỏi hệ thống thiết bị phải có cấu hình tốt hơn (hệ thống bơm có
thể sử dụng rửa giải gradient, lựa chọn đetector phù hợp), dung mơi sử dụng,
chương trình gradient, nhiệt độ. ..thêm vào đó, độ lặp lại cũng hơi kém hơn so với kỹ
thuật rửa giải đẳng dòng.
lãi
I\6[ruwpuis Tài liệu phục vụ học tập, nghiền cứu khoa học
Chương 2 - ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Mẫu nghiên cứu thẫm định qui trình định tính, định lượng
Trong nhóm thuốc đơng được trị thấp khớp, Độc hoạt tang ký sinh thang là bài
thuốc cổ phương có thành phần từ 15 vị thuốc với các nhóm hoạt chất đa dạng,
đại diện trong điều trị thấp khớp [3].
Đây cũng là bài thuốc được rất nhiều cơ sở sản xuất, gia giảm thành các dạng bào
chế khác nhau, vì vậy chúng tơi chọn bài thuốc
này để xây dựng mẫu
trắng
giả lập và mẫu thử giả lập cho nghiên cứu.
Qua khảo sát tần suất xuất hiện của các được liệu trong bài thuốc độc hoạt tang .
ký sinh thang trên thị trường chúng tôi quyết định chọn 13 dược liệu đại diện cho
bài thuốc như sau:
Độc hoạt
Tang ký sinh
Phong phong
12g
20g
8g
Đương quy
Xuyên khung
Đảng sâm
12g
8g
12g
Ngưu tất
12g
Bạch thược
12g
Đỗ trọng
12g
Quế chỉ
Sinh dia
4g
Phục linh
Cam thảo
12g
12g
6g
2.1.2 Mẫu nguyên liệu, chế phẩm điều thị thấp khớp, viêm khớp lưu hành tại
thành phố Cần Thơ
Chế phẩm được mua tại các nhà thuốc trên thị trường thành phố Cần Thơ như:
Nhà thuốc Vạn Tế Sanh, địa chỉ: 04 đường Lê Thánh Tôn — phường Tân An —
quận Ninh Kiều — thành phố Cần Thơ.
Nhà thuốc Đức Hưng Đường, địa chỉ: 40 đường Lý Thường Kiệt — phường Tân
An — quận Ninh Kiều — thành phố Cần Thơ.
Nhà thuốc Tế Sanh Đường, địa chỉ: 43 đường Nguyễn Văn Cừ - phường An Hội
- quận Ninh Kiều - thành phố Cần Thơ.
12
(re
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
- _ Nhà thuốc Đức Vinh Phát, địa chỉ: 186E đường 30/04 — phường An Phú —- quận
Ninh Kiều — thành phố Cần Thơ.
“Các
chế phẩm
thu thập cho việc kiểm soát chất lượng, được liệt kê trong
Bảng 2.1 và 2.2.
Bảng 2.1 Các chế phẩm thu thập cho việc kiểm soát chất lượng
STT
Tên sản phẩm
Thành phân
1
Saurean Fong Sep
=
Viêm khớp, dau lưng.
2
Hoichun Zaizao
Wan
£
tẠ
¬
Bạch thược, đương quy,
Nhức khớp xương, đau
cột sông.
Đau thân kinh tọa, đau
Phong thấp truy
Độc hoạt, tang ky sinh,
phục linh, đỗ trọng, đương
Mỗi lưng, mỏi gân cốt,
ˆ
Chuifong
¬
| Nha thc-Van Tế:Sanh
J
1ọaThơngHhin
phong thấu cốt hồn
5
SỐ
f
,
TT
,vênkhung sinh địa...
;
`
lưng, đau khớp.
quy
Toukuwan
Chỉ định
ˆ
trọng, xích thược....
đau lưng, đau gân.
;
_
x
Phong thấp tê bại, thấp
.
Tổ,
khớp,
3 ng mỏi
Đột hoạt, đương quy, đô
6
Thâp khớp hồn
7
ấn
Didicera
Độc hoạt, tang ký sinh,
.
.
phịng phong, cam thảo...
g
¬ ke
gpa
Phong . cot thơng
ủy
^
as
Độc hoạt, tang ký sinh, cam
thảo, phịng phong...
Viêm thân kinh (08,
viêm khớp, đau mỏi
]
ưng
Phong tê, thâp khớp,
đau lưng, đau thần kinh
toa
Truy phong té thap
thủy
Tang ky sinh ngưu tat,
đương quy, đồ trọng...
khớp, đau nhức xương
khó
9
10
aad
Cokhép kungfu
-
`
4
2
3
800g _Phue
Phong,
do trọng thỔ
linh...
Hỗ trợ điều trị thấp
2
OP:
H6 tro diéu trị tê nhức
„ng khớp,
giảm acid
uric
| Ne@thuoeDircsAirnpiDirones
H
Phong tê thấp khớp
hoàn
Độc hoạt, tang II sinh,
ngưu tat, cam thảo, đương
ne
ames
aa um ea Baus
hoan
trọng...
13
đau
4
thần kinh tọa.
3
s.
Seopa
Nha'th 7721
Che SanhiDuones| aes
Bồ thận đau lưng
“Thục địa, “đương quy, đỗ
12
Phong tê thấp, đau
mg
mệt mỏi.
