BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM
MỘT SỐ CHẾ PHẨM PROBIOTIC CÓ CHỨA CHỦNG
BACILLUS VÀ STREPTOCOCCUS FAECALIS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC

Cần Thơ – 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN THANH NHÀN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM
MỘT SỐ CHẾ PHẨM PROBIOTIC CÓ CHỨA CHỦNG
BACILLUS VÀ STREPTOCOCCUS FAECALIS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
ThS. NGUYỄN THỊ BÍCH THỦY

Cần Thơ – 2014


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Dương Thị Trúc Ly, người đã
hướng dẫn tận tình chu đáo, tạo mọi điều kiện thuận lợi về vật chất cũng như tinh
thần, động viên và luôn hỗ trợ em trong suốt quá trình làm đề tài để em có thể hồn
thành tốt luận văn này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô bộ môn Vi Sinh (cô Nguyễn
Thị Hải Yến, cô Trần Thị Như Lê, thầy Dương Hồng Phúc, cô Đỗ Ánh Minh, cô
Phạm Thị Ngọc Yến và thầy Lương Quốc Bình) đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt
nhất để em có thể hoàn thành luận văn đúng thời gian quy định.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô liên bộ mơn Hóa Phân TíchKiểm Nghiệm-Độc Chất (thầy Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, cơ Nguyễn Thị Bích Thủy,
cơ Nguyễn Thị Ngọc Vân, cô Nguyễn Thị Tường Vi, thầy Lữ Thiện Phúc, cô
Nguyễn Thị Đặng và cô Trần Thị Thanh Thúy) đã giúp đỡ, động viên em để có thể
hồn thành tốt đề tài.
Mình cũng xin gửi lời cảm ơn đến các bạn làm đề tài, các bạn lớp Dược
K35 đã chia sẽ, giúp đỡ trong thời gian hoàn thành đề tài.
Cuối cùng con xin vô cùng biết ơn cha mẹ đã luôn bên con, giúp đỡ, động
viên, tạo mọi điều kiện cho con, để có thể hồn thành tốt tất cả mọi việc.


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trong
luận văn này là trung thực và chưa có cơng trình nghiên cứu nào công bố.
Cần Thơ, ngày 12 tháng 6 năm 2014
Sinh viên


Nguyễn Thanh Nhàn


i

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC ................................................................................................................ i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................ v
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ vii
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................. x
ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC .................................................................. 3
1.1.1. Lịch sử về probiotic ............................................................................... 3
1.1.2. Định nghĩa probiotic .............................................................................. 4
1.1.3. Các vi sinh vật sử dụng trong sản phẩm probiotic trên thế giới ............ 5
1.1.4. Thành phần chế phẩm probiotic ............................................................ 6
1.1.5. Cơ chế tác dụng của probiotic ............................................................... 7
1.1.6. Tính an toàn của các probiotic sử dụng ................................................. 8
1.1.7. Tác dụng của probiotic .......................................................................... 9
1.1.8. Ứng dụng của probiotic trong dược phẩm ............................................ 13
1.1.9. Các tiêu chuẩn để chọn các chủng probiotic ......................................... 14
1.2. TỔNG QUAN VỀ BACILLUS VÀ STREPTOCOCCUS FAECALIS .......... 14
1.2.1. Giới thiệu về Bacillus ............................................................................ 14
1.2.2. Sơ lược về vi khuẩn Streptococcus faecalis .......................................... 16
1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH, PHÂN LOẠI VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI

SINH VẬT ............................................................................................................... 18
1.3.1. Các phương pháp định danh vi sinh vật ................................................ 18
1.3.2. Các phương pháp phân tích định lương vi sinh vật ............................... 19


ii

1.4. MỘT SỐ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN TRONG VÀ NGOÀI
NƯỚC ...................................................................................................................... 20
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 22
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................................... 22
2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU .......................................................................... 22
2.3. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG....................................................... 22
2.3.1. Hóa chất ................................................................................................. 22
2.3.2. Thiết bị sử dụng ..................................................................................... 22
2.4. MÔI TRƯỜNG NGHIÊN CỨU ................................................................... 23
2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 23
2.5.1. Quy trình phân lập ................................................................................. 23
2.5.2. Quy trình định danh ............................................................................... 24
2.5.3. Quy trình định lượng ............................................................................. 29
2.5.4. Quy trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh .......................................... 31
2.5.5. Thẩm định quy trình phân tích .............................................................. 32
2.5.6. Áp dụng quy trình phân tích chế phẩm probiotic trên thị trường.......... 35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ .......................................................................................... 36
3.1. KẾT QUẢ QUY TRÌNH PHÂN LẬP.......................................................... 36
3.1.1. Kết quả phân lập S.faecalis ................................................................... 36
3.1.2. Kết quả phân lập B.clausii ..................................................................... 36
3.1.3. Kết quả phân lập B.coagulans ............................................................... 36
3.2. KẾT QUẢ QUY TRÌNH ĐỊNH DANH ...................................................... 37
3.2.1. Kết quả định danh S.faecalis ................................................................. 37

3.2.2. Kết quả định danh B.clausii .................................................................. 39
3.2.3. Kết quả định danh B.coagulans ............................................................. 41
3.3. KẾT QUẢ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG .................................................... 42
3.3.1. Kết quả định lương S.faecalis ............................................................... 42
3.3.2. Kết quả định lượng B.clausii ................................................................. 42
3.3.3. Kết quả định lượng B.coagulans ........................................................... 43


iii

3.4. KẾT QUẢ QUY TRÌNH THỬ GIỚI HẠN VI SINH VẬT GÂY BỆNH ... 43
3.5. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ...................................................... 44
3.5.1. Kết quả thẩm định quy trình định danh ................................................. 44
3.5.2. Kết quả thẩm định quy trình định lượng ............................................... 46
3.5.3. Kết quả thẩm định quy trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh E.coli,
Shigella, Salmonella, Candida albicans, Staphylococcus aureus ........................... 54
3.6. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM TRÊN THỊ TRƯỜNG .................... 57
3.6.1. Kết quả phân lập từ chế phẩm ............................................................... 57
3.6.2. Kết quả định danh từ chế phẩm ............................................................. 58
3.6.3. Kết quả định lượng từ chế phẩm ........................................................... 59
3.6.4. Kết quả thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh ............................................. 60
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 61
4.1. QUY TRÌNH PHÂN LẬP ............................................................................ 61
4.1.1. Quy trình phân lập S.faecalis ................................................................ 61
4.1.2. Quy trình phân lập B.clausii .................................................................. 61
4.1.3. Quy trình phân lập B.coagulans ............................................................ 61
4.2. QUY TRÌNH ĐỊNH DANH ......................................................................... 61
4.2.1. Quy trình định danh S.faecalis .............................................................. 61
4.2.2. Quy trình định danh B.clausii................................................................ 62
4.2.3. Quy trình định danh B.coagulans .......................................................... 63

4.3. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ...................................................................... 64
4.3.1. Quy trình định lượng S.faecalis............................................................. 64
4.3.2. Quy trình định lượng B.clausii .............................................................. 64
4.3.3. Quy trình định lượng B.coagulans ........................................................ 64
4.4. QUY TRÌNH THỬ GIỚI HẠN VI SINH VẬT GÂY BỆNH ..................... 65
4.5. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH .................................................. 67
4.5.1. Thẩm định quy trình định danh S.faecalis, B.clausii và B.coagulans ... 65
4.5.2. Thẩm định quy trình định lượng S.faecalis, B.clausii và B.coagulans . 66


iv

4.5.3. Thẩm định quy trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh E.coli, Shigella,
Salmonella, C.albicans và Staphylococcus aureus .................................................. 68
4.6. ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐÃ THẨM ĐỊNH PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM
TRÊN THỊ TRƯỜNG .............................................................................................. 68
4.6.1. Phân lập từ chế phẩm ............................................................................ 68
4.6.2. Định danh từ chế phẩm ......................................................................... 69
4.6.3. Định lượng từ chế phẩm ........................................................................ 71
4.6.4. Thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh ......................................................... 72
KẾT LUẬN .............................................................................................................. 73
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................. 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC PHỤ LỤC


v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết


Ý nghĩa

Từ nguyên

tắt
ADN

Acid deoxyribose nucleic

Vật chất di truyền cấp độ phân tử

ARN

Acid ribonucleic

Vật chất di truyền cấp độ phân tử

B.

Bacillus

Chi Bacillus

BHI

Brain heart infusion

Môi trường dinh dưỡng


Bif.

Bifidobacterium

Chi Bifidobaccterium

C.

Candida

Chi nấm Candida

cfu

Colony forming unit

Đơn vị khuẩn lạc

DB

Decarboxylase Basal

Môi trường thực hiện phản ứng
decarboxylase

E.

Escherichia

Chi Escherichia


EMB

Eosin methylene blue

Môi trường chọn lọc E.coli

FAO

Food and Agriculture

Tổ chức nông lương thế giới

Organization
GRAS

Generally recognized as safe

Được xem như an toàn

GMP

Good Manufacturing Practice

Thực hành tốt sản xuất

IBS

Irritable Bowel Syndrome


Hội chứng ruột kích thích

KIA

Kligler’s iron agar

Mơi trường thử khả năng lên men
đường

L.

Lactobacillus

Chi Lactobacillus

LAB

Lactic acid bacteria

Vi khuẩn sinh acid lactic

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification


Giới hạn định lượng

MC

MacConkey agar

Môi trường MacConkey

MPN

Most propable number

Phương pháp định lượng số tối khả

MR

Methyl Red

Thử nghiệm phân biệt vi sinh vật


vi

MRSA

De Mann-Rogosa-Sharpe agar

Môi trường thạch MRS


NA

Nutrient agar

Môi trường thạch dinh dưỡng

NB

Nutrient broth

Môi trường dinh dưỡng lỏng

PFGE

Pulsed-field gel electrophoresis

Điện di xung điện

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase khuếch
đại ADN

S.

Streptococcus

Chi Streptococcus


SIM

H2S-Indole-Motility

Môi trường tìm H2S, indol, khả
năng di động

SPW

Saline peptone water

Dung dịch nước pha lỗng mẫu

TSA

Tryptic soy agar

Mơi trường thạch casein đậu tương

TSB

Tryptic soy broth

Mơi trường casein đậu tương lỏng

VP

Voges-Proskauer


Phản ứng tìm acetoin từ glucose

WHO

World Health Organization

Tổ chức y tế thế giới


vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Các vi sinh vật thường làm probiotic ..................................................... 5
Bảng 3.1. Kết quả nhuộm màu của S.faecalis ..................................................... 37
Bảng 3.2. Kết quả các phản ứng sinh hóa của S.faecalis .................................... 39
Bảng 3.3. Kết quả nhuộm màu của B.clausii ...................................................... 39
Bảng 3.4. Kết quả các phản ứng sinh hóa của B.clausii ..................................... 40
Bảng 3.5. Kết quả nhuộm màu của B.coagulans ................................................ 41
Bảng 3.6. Kết quả các phản ứng sinh hóa của B.coagulans ................................ 42
Bảng 3.7. Kết quả định lượng vi khuẩn S.faecalis .............................................. 42
Bảng 3.8. Kết quả định lượng vi khuẩn B.clausii ............................................... 43
Bảng 3.9. Kết quả định lượng vi khuẩn B.coagulans ......................................... 43
Bảng 3.10. Kết quả phát hiện vi sinh vật gây bệnh ............................................. 44
Bảng 3.11. Kết quả thử nghiệm độ đặc hiệu, độ nhạy định danh
đối với S.faecalis ................................................................................................. 44
Bảng 3.12. Kết quả thử nghiệm độ đặc hiệu, độ nhạy định danh
đối với B.clausii ................................................................................................... 45
Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm độ đặc hiệu, độ nhạy định danh
đối với B.coagulans ............................................................................................. 45
Bảng 3.14. Kết quả thử nghiệm giới hạn phát hiện đối với S.faecalis ................ 45

Bảng 3.15. Kết quả thử nghiệm giới hạn phát hiện đối với B.clausii ................. 45
Bảng 3.16. Kết quả thử nghiệm giới hạn phát hiện đối với B.coagulans ........... 46
Bảng 3.17. Kết quả thử nghiệm độ đặc hiệu, độ nhạy định lượng
của S.faecalis ....................................................................................................... 46
Bảng 3.18. Kết quả thử nghiệm độ đặc hiệu, độ nhạy định lượng
của B.clausii ......................................................................................................... 46
Bảng 3.19. Kết quả thử nghiệm độ đặc hiệu, độ nhạy định lượng
của B.coagulans ................................................................................................... 47
Bảng 3.20. Số khuẩn lạc đếm được ở 5 nồng độ vi khuẩn S.faecalis ................. 47
Bảng 3.21. Số khuẩn lạc đếm được ở 5 nồng độ vi khuẩn B.clausii................... 48


viii

Bảng 3.22. Số khuẩn lạc đếm được ở 5 nồng độ vi khuẩn B.coagulans ............. 48
Bảng 3.23. Kết quả thử độ lặp lại của quy trình định lượng S.faecalis .............. 49
Bảng 3.24. Kết quả thử độ lặp lại của quy trình định lượng B.clausii ................ 50
Bảng 3.25. Kết quả thử độ lặp lại của quy trình định lượng B.coagulans .......... 50
Bảng 3.26. Kết quả độ đúng của quy trình định lượng S.faecalis ....................... 51
Bảng 3.27. Kết quả độ đúng của quy trình định lượng B.clausii ........................ 52
Bảng 3.28. Kết quả độ đúng của quy trình định lượng B.coagulans .................. 52
Bảng 3.29. Kết quả giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng S.faecalis .............. 53
Bảng 3.30. Kết quả giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng B.clausii ............... 53
Bảng 3.31. Kết quả giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng B.coagulans ......... 53
Bảng 3.32. Kết quả xác định độ đặc hiệu đối với Candida albicans .................. 54
Bảng 3.33. Kết quả xác định độ đặc hiệu đối với Escherichia coli .................... 54
Bảng 3.34. Kết quả xác định độ đặc hiệu đối với Salmonella ............................ 54
Bảng 3.35. Kết quả xác định độ đặc hiệu đối với Shigella ................................. 55
Bảng 3.36. Kết quả xác định độ đặc hiệu đối với Staphylococcus aureus ......... 55
Bảng 3.37. Kết quả thử giới hạn phát hiện đối với Candida albicans ................ 55

Bảng 3.38. Kết quả thử giới hạn phát hiện đối với Escherichia coli .................. 56
Bảng 3.39. Kết quả thử giới hạn phát hiện đối với Salmonella .......................... 56
Bảng 3.40. Kết quả thử giới hạn phát hiện đối với Shigella ............................... 56
Bảng 3.41. Kết quả thử giới hạn phát hiện đối với Staphylococcus aureus ....... 57
Bảng 3.42. Kết quả phân lập 4 mẫu chế phẩm chứa S.faecalis ........................... 57
Bảng 3.43. Kết quả phân lập 2 mẫu chế phẩm chứa B.clausii ............................ 58
Bảng 3.44. Kết quả phân lập 2 mẫu chế phẩm chứa B.coagulans ...................... 58
Bảng 3.45. Kết quả nhuộm màu và phản ứng sinh hóa của 4 chủng vi khuẩn phân
lập từ chế phẩm chứa S.faecalis........................................................................... 58
Bảng 3.46. Kết quả nhuộm màu và phản ứng sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn phân
lập từ chế phẩm chứa B.clausii ............................................................................ 59
Bảng 3.47. Kết quả nhuộm màu và phản ứng sinh hóa của 2 chủng vi khuẩn phân
lập từ chế phẩm chứa B.coagulans ...................................................................... 59


ix

Bảng 3.48. Kết quả số vi sinh vật sống trong 4 mẫu chế phẩm chứa S.faecalis . 59
Bảng 3.49. Kết quả số vi sinh vật sống trong 2 mẫu chế phẩm chứa B.clausii .. 60
Bảng 3.50. Kết quả số vi sinh vật sống trong 2 mẫu chế phẩm
chứa B.coagulans ................................................................................................. 60
Bảng 3.51. Kết quả phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu chế phẩm..... 60


x

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc S.faecalis trên mơi trường TSA ........................ 36
Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc B.clausii trên mơi trường TSA ......................... 36
Hình 3.3. Hình dạng khuẩn lạc B.coagulans trên mơi trường TSA .................... 37

Hình 3.4. Cầu khuẩn Gram dương S.faecalis (vật kính 100X) ........................... 37
Hình 3.5. Vi khuẩn S.faecalis khơng sinh bào tử (vật kính 100X) ..................... 38
Hình 3.6. Vi khuẩn S.faecalis khơng kháng acid (vật kính 100X) ..................... 38
Hình 3.7. Trực khuẩn Gram dương B.clausii (vật kính 100X) ........................... 39
Hình 3.8. Bào tử của vi khuẩn B.clausii (vật kính 100X) ................................... 40
Hình 3.9. Vi khuẩn B.clausii khơng kháng acid (vật kính 100X) ....................... 40
Hình 3.10. Trực khuẩn Gram dương B.coagulans (vật kính 100X) ................... 41
Hình 3.11. Bào tử của vi khuẩn B.coagulans (vật kính 100X) ........................... 41
Hình 3.12. Vi khuẩn B.coagulans khơng kháng acid (vật kính 100X) ............... 42
Hình 3.13. Đồ thị tương quan giữa nồng độ vi khuẩn S.faecalis và số khuẩn lạc
trung bình đếm được trên đĩa thạch. .................................................................... 47
Hình 3.14. Đồ thị tương quan giữa nồng độ vi khuẩn B.clausii và số khuẩn lạc
trung bình đếm được trên đĩa thạch. .................................................................... 48
Hình 3.15. Đồ thị tương quan giữa nồng độ vi khuẩn B.coagulans và số khuẩn
lạc trung bình đếm được trên đĩa thạch. .............................................................. 49


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ khi Alexander Fleming phát hiện ra tính chất kháng vi khuẩn của nấm
Penicillium spp. vào năm 1929, thế giới đã chứng kiến ưu thế nhanh chóng của
thuốc kháng sinh trong điều trị các bệnh khác nhau. Sự phát triển một cách rộng rãi
và hiệu quả của thuốc kháng sinh đã khiến cho ngành y học quá tin tưởng vào
phương pháp trị liệu kháng sinh như đại diện cho phương pháp chữa trị chống lại
các bệnh khác nhau. Tuy nhiên, tồn tại một số hạn chế nhất định liên quan với
phương pháp trị liệu kháng sinh. Phương pháp trị liệu kháng sinh cũng dẫn đến thay
đổi hệ cân bằng của ruột và gây ra một vài ảnh hưởng xấu có thể tồn tại lâu dài ngay
cả sau khi ngừng sử dụng cách điều trị này. Trong khi đó, một vài bệnh lây nhiễm
từng được cho rằng sẵn sàng có thể xử lý với thuốc kháng sinh nhưng giờ khơng

cịn hiệu quả nữa. Chính vì những ngun nhân này, mọi người đều nhận ra rằng
ngăn ngừa hoặc giảm nguy cơ bị bệnh thích hợp hơn là để đến lúc phải điều trị
bệnh. Những nghiên cứu để tìm kiếm biện pháp phòng ngừa hơn là chữa bệnh, để
hệ vi sinh vật trong ruột cơ thể người không bị ảnh hưởng xấu không ngừng phát
triển. Và khái niệm probiotic, một hoặc nhiều chủng vi sinh vật (đặc biệt là vi khuẩn
hoặc nấm men) mà khi đưa vào cơ thể con người có một tác động có lợi bằng việc
cải thiện hệ vi sinh vật nội sinh. Do nhu cầu chăm sóc sức khỏe mà các chế phẩm
probiotic không ngừng gia tăng.
Hiện nay probiotic được ứng dụng rộng rãi trong các thực phẩm, dược phẩm và
chăn nuôi, đặc biệt là dược phẩm và thực phẩm. Ở thị trường Việt Nam, việc sử
dụng các sản phẩm probiotic đang rất phát triển, các thương hiệu cung cấp bao gồm
hai thị trường chính là nhập khẩu và sản xuất trong nước. Các chế phẩm này thường
ở dạng rất đậm đặc, do đó thường gặp vấn đề lớn trong việc đảm bảo độ sống sót
của vi sinh vật trong quá trình sản xuất và bảo quản. Hiện nay, Việt Nam chưa có
tiêu chuẩn nào để kiểm tra các chế phẩm probiotic về mặt số lượng, chất lượng và
các chỉ tiêu vi sinh để đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng. Chính vì vậy, chúng
tơi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số chế phẩm


2

probiotic có chứa chủng Bacillus và Streptococcus faecalis” với mục tiêu: xây dựng
quy trình kiểm nghiệm các chế phẩm chứa Bacillus và Streptococcus faecalis.
Mục tiêu cụ thể:
- Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus và Streptococcus faecalis từ chế phẩm
probiotic trên thị trường.
- Định danh vi khuẩn phân lập được bằng phương pháp thường quy.
- Định lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc.
- Phát hiện vi sinh vật gây bệnh bằng phương pháp cấy trên đĩa thạch.
- Thẩm định các quy trình định danh, định lượng và phát hiện vi sinh vật gây

bệnh.
- Áp dụng quy trình đã thẩm định kiểm nghiệm một số chế phẩm probiotic chứa
vi khuẩn Bacillus và Streptococcus faecalis dạng đơn chủng và đa chủng từ
các chế phẩm thu thập được. Đánh giá chất lượng của các chế phẩm
probiotic đã thực hiện.
Ý nghĩa khoa học:
Đóng góp trong việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số chủng probiotic từ
đó góp phần xây dựng tiêu chuẩn quốc gia về kiểm nghiệm các chế phẩm probiotic.
Ý nghĩa thực tiễn:
Ứng dụng quy trình trong kiểm nghiệm các chế phẩm probiotic đang lưu hành
trên thị trường, góp phần đảm bảo sức khỏe nâng cao chất lượng cuộc sống cho
người dân.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC
1.1.1.Lịch sử về probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry Tissier
(1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của những đứa trẻ
mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ Y hơn những đứa trẻ
khỏe mạnh. [59]
Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff-người Nga, đạt giải Nobel đã chứng minh
được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố của hệ vi sinh vật
đường ruột. Ơng giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của những người Cô-dăc ở
Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên
nhân có thể là do họ tiêu thụ rất nhiều các sản phẩm sữa lên men, điều này được ông
báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc sống”-The Prolongation of life (1908) [59].

Người ta đề xuất rằng sự tiêu hóa một vài vi khuẩn được chọn lựa có thể có ích lợi
ảnh hưởng đến vùng dạ dày-ruột của con người. Metchnikoff tin rằng lý do chính
gây ra quá trình lão hóa của con người là do chất độc tạo thành bởi sự thối rữa và sự
lên men trong ruột (O’Sullivan et al., 1992 ). [10]
Có thể nói Tissier và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề xuất mang
tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về
probiotic.[49]
Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi khuẩn lactic
từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [35]. Cùng năm đó, các nhà nghiên cứu
Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả năng làm giảm bệnh táo
bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Harvard phát hiện ra các vi khuẩn
đường ruột đóng một vai trị quyết định trong q trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức
ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ
không tự sản xuất ra được [34]. Sau đó 5 năm, một trong các đồ uống lên men đặt


4

tên là “Yakult” từ sữa được cho là hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health)
được sản xuất. [35]
Các kiến thức có được về probiotic thơng qua những nghiên cứu này đã thúc đẩy
mạnh mẽ ngành công nghiệp các sản phẩm sữa. Từ đó lĩnh vực này càng phát triển,
rất nhiều loại vi khuẩn đã được sử dụng trên thế giới trong các sản phẩm sữa lên
men, thực phẩm từ thực vật, thịt và các sản phẩm khác. [46]
1.1.2 Định nghĩa probiotic
Từ “probiotic” có nguồn gốc từ Hy Lạp có nghĩa là “cho cuộc sống”. Nó được
định nghĩa lại qua nhiều năm qua những kiến thức khoa học và sự hiểu biết tốt hơn
về mối liên hệ lợi ích cho đường ruột và sự khỏe mạnh nhận được [46]. Lilly và
Stillwell (1965) đã mô tả trước tiên probiotic như hỗn hợp được tạo thành bởi một
động vật nguyên sinh mà thúc đẩy sự phát triển của đối tượng khác. Phạm vi của

định nghĩa này được mở rộng hơn bởi Sperti vào đầu những năm bảy mươi bao gồm
dịch chiết tế bào thúc đẩy phát triển của vi sinh vật. [36]
Định nghĩa chung này sau đó được làm cho chính xác hơn bởi Fuller (1989) [59],
ông định nghĩa probiotic như “một chất bổ trợ thức ăn chứa vi sinh vật sống mà có
ảnh hưởng có lợi đến vật chủ bằng việc cải thiện cân bằng hệ vi sinh vật ruột của
nó”. Khái niệm này sau đó được phát triển xa hơn: “vi sinh vật sống (vi khuẩn lactic
và vi khuẩn khác, hoặc nấm men ở trạng thái khô hay bổ sung trong thực phẩm lên
men) mà thể hiện một ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏe của vật chủ sau khi được
tiêu hóa nhờ cải thiện tính chất hệ vi sinh vật vốn có của vật chủ”. [39]
Năm 2001 Tannock thay đổi định nghĩa về probiotic thành “vi sinh vật sống mà
đi ngang qua vùng ruột và làm lợi cho sức khỏe của người tiêu dùng”. [46]
Năm 2001 Schrezemeir và Van de Vrese định nghĩa probiotic là “sự chuẩn bị của
sản phẩm chứa vi sinh vật có thể sống được với số lượng hiệu quả sau khi vào trong
khoang của cơ thể vật chủ và gây ra tác dụng có lợi trên vật chủ”. [46]
Và hiện nay theo định nghĩa của FAO/WHO (2001): “probiotic là những vi thể
sống mà với số lượng được kiểm soát hợp lý sẽ giúp bồi bổ sức khoẻ cho người tiếp
nhận”. [46]


5

1.1.3. Các vi sinh vật sử dụng trong sản phẩm probiotic trên thế giới
Các probiotic có thể là vi khuẩn, nấm mốc và men, nhưng hầu hết probiotic là vi
khuẩn. Trong đó vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) được sử dụng phổ biến nhất. LAB
là nhóm vi khuẩn Gram dương có khả năng lên men, khơng có độc tính, hầu hết
khơng gây bệnh và có khả năng sản sinh acid lactic từ carbohydrat. Nhóm LAB bao
gồm Streptococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và
Bifidobacterium. Nhóm khơng sinh acid lactic bao gồm Bacillus và men
Saccharomyces. Ngồi ra cịn một số nhóm vi sinh vật khác ít sử dụng hơn. [29],
[62]

Bảng 1. Các vi sinh vật thường làm probiotic [43]
Nhóm

Lồi

Lactobacilli

Lactobacillus acidophilus
L. casei
L. delbrueckii ssp. bulgaricus
L. johnsonii
L. reuteri
L. rhamnosus
L. salivarius
L. paracasei
L. fermentum
L. plantarum
L. crispatus

Bifidobacteria

Bifidobacterium animalis
Bif. breve
Bif. infantis
Bif. longum
Bif. adolescentis
Bif. animalis ssp. lactis
Bif. bifidum



6

LAB khác

Enterococcus faecium
Enterococcus faecalis
Lactococcus lactis
Streptococcus thermophilus

Không phải LAB

Bacillus cereus
Bacillus subtilis
Clostridium butyricum
Escherichia coli
Propionibacterium freudenreichii
Saccharomyces boulardii

1.1.4. Thành phần chế phẩm probiotic
Vi sinh vật trong chế phẩm probiotic thường gồm 4 nhóm sau:
- Nhóm vi khuẩn lactic: thường chọn các chủng vi khuẩn lactic điển hình thuộc
giống

Lactobacillus

(Lactobacillus

acidophillus,

Lactobacillus


plantarum,

Lactobacillus casei …). Trong hoạt động sống vi khuẩn lactic chuyển đường thành
acid lactic, ngồi ra nó có thể sinh ra bacteriocin-một loại hợp chất có hoạt tính
kháng khuẩn và có phổ ức chế vi sinh vật khá rộng. Loại chất kháng sinh này khơng
gây ra tính kháng kháng sinh ở các vi khuẩn gây bệnh. Acid lactic và bacteriocin có
khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh, giải độc cho đường ruột. [7]
- Nhóm vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh: chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính αamylase và protease. Các chủng này khơng gây độc, khơng gây bệnh cho người và
vật ni. Nhóm vi khuẩn này có tác dụng phân giải các hợp chất hữu cơ bị ô nhiễm
trong môi trường. Thường chọn các chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus (Bacillus
subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis,…). Ngồi khả năng sinh αamylase và protease chúng cịn sinh ra bacteriocin. Các vi khuẩn này chủ yếu tham
gia vào q trình làm sạch mơi trường và tham gia vào quá trình đấu tranh sinh học,
ức chế vi khuẩn gây bệnh, hạn chế dịch bệnh cho vật nuôi. [7]
- Nhóm vi khuẩn quang tự dưỡng: gồm các vi khuẩn tía và vi khuẩn khơng tía có
khả năng đồng hóa H2S và CO2 để xây dựng tế bào và không sinh ra O2. Trong khi


7

phân hủy H2S hoặc muối sulfua kim loại gây ra, làm giảm tính độc cho mơi trường.
Khi cho thêm vi khuẩn quang tự dưỡng vào thức ăn hoặc môi trường nước ni có
thể loại bỏ nhanh chóng NH3, H2S, acid hữu cơ, những chất có hại, cân bằng pH, cải
thiện chất lượng nước. [7]
- Nhóm nấm men: gồm một số lồi thuộc giống Saccharomyces, sử dụng nấm
men sẽ có tác dụng tận dụng lượng đường được tạo thành trong môi trường nước để
lên men rượu nhẹ, hạn chế dinh dưỡng của các loại vi sinh vật gây bệnh khác, cải
thiện mùi và màu của nước. [7]
Đối tượng cạnh tranh của vi khuẩn probiotic: những vi khuẩn probiotic này có
hoạt động chống lại những vi khuẩn có hại. Đó là sự ngăn chặn hoạt động của một

số vi khuẩn sau: Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Escherichia coli,
Salmonella typhosa, Salmonella schottmuelleri, Shigella dysenteriae, Shigella
paradysenteriae,

Pseudomonas

fluorescens,

Pseudomonas

aeruginosa,

Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Vibrio comma.
1.1.5. Cơ chế tác dụng của probiotic
1.1.5.1. Probiotic cạnh tranh trên vị trí receptor
Trong ống tiêu hóa, probiotic sẽ cố gắng tìm gắn vào các receptor trên tế bào
biểu mô ruột. Một vài probiotic rất có hiệu quả trong việc tấn cơng để gắn lên các
receptor, những probiotic tốt có thể tìm gắn vào các receptor với số lượng lớn lắp
đầy các receptor từ đó ngăn chặn được các vi khuẩn có hại gắn vào, một số khác có
thể ảnh hưởng đến sự bám dính của vi khuẩn có hại lên receptor. [23]
Ngồi ra theo hai nhà nghiên cứu Lu và Walker cho rằng probiotic cịn có thể
tăng cường khả năng kết chặt các chỗ tiếp nối giữa các tế bào đường ruột với nhau
dẫn đến nâng cao chất lượng sự miễn dịch. [23]
1.1.5.2. Probiotic ảnh hưởng lên hệ thống miễn dịch
Trong cơ thể chúng ta có hai hệ thống miễn dịch đó là miễn dịch tự nhiên và
miễn dịch thu nhận được, probiotic làm thúc đẩy cả hai hệ miễn dịch này. Nó làm
gia tăng sản sinh các cytokin giúp kiểm sốt tốt tình trạng viêm. Trong ống tiêu hóa


8


probiotic liên kết với nhau hạn chế sự thấm qua của các vi khuẩn có hại và chất độc
vào máu.
Probiotic làm giảm đi một vài phản ứng dị ứng nghiêm trọng như sốc mẫn cảm
hay hen suyễn do chúng giúp làm cân bằng giữa việc gửi tín hiệu tốt và xấu đến hệ
thống miễn dịch để giữ cho hệ thống luôn hoạt động tốt hay giúp tạo đáp ứng miễn
dịch kịp thời và hiệu quả. [23]
1.1.5.3. Probiotic tiêu thụ chất dinh dưỡng có sẵn
Ruột là mơi trường lý tưởng cho các vi khuẩn sinh acid lactic phát triển, chúng
tiêu thụ phần lớn chất dinh dưỡng có sẵn thích hợp cho nhiều loại vi khuẩn, từ đó
LAB ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn có hại. [23]
1.1.5.4. Tạo mơi trường acid
Lactobacilli và Bifidobacterium là hai họ vi khuẩn sản sinh acid lactic và acid
acetic trong môi trường sống của chúng, làm giảm pH trong đường tiêu hóa do đó
có thể ức chế sự phát triển của vi khuẩn có hại nhạy cảm với pH thấp. [23]
1.1.5.5. Sản xuất enzym có lợi
Probiotic tiết ra nhiều loại enzym có lợi cho sức khỏe bao gồm lactase là enzym
phân hủy đường lactose có trong sữa mà cơ thể khơng thể tiêu hóa. Các tác động
của enzym do probiotic tiết ra đã được chứng minh có thể làm giảm bệnh truyền
nhiễm, dung nạp lactose, sự thiếu hụt hệ thống miễn dịch. [23]
1.1.5.6. Sản sinh ra chất ức chế
Các vi khuẩn probiotic sinh các chất ức chế: bacteriocin, siderophore, lysozym,
protease, H2O2, các acid hữu cơ, amoni, diacetyl, …, các chất này được sinh ra bên
trong đường ruột và bên ngồi mơi trường ni sẽ có tác dụng ức chế sự phát triển
của các vi khuẩn gây hại khác. [7], [ 23]
Ngồi ra, probiotic cịn có khả năng ức chế sự bám chặt, lan rộng và hạn chế sự
phát triển của các vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Salmonella, Candida,
Helycobacter pylori, … [23]
1.1.6. Tính an toàn của các probiotic sử dụng



9

Chúng ta có thể tìm kiếm dễ dàng nhiều sản phẩm probiotic trên thị trường, trong
đó hỗn hợp bao gồm Enterococcus faecalis, Streptococcus thermophilus, ba loài
Bifidobacterium và bảy loài Lactobacillus được chứng minh rằng khi chúng ở trong
ruột là những vi sinh vật có lợi chủ yếu cho hệ thống miễn dịch và tốt cho sức
khỏe.[69]
Dựa trên kết quả nghiên cứu của những thử nghiệm được tầm soát ngẫu nhiên
(RCTs) được thống kê chỉ ra rằng không xảy ra các nguy cơ liên quan (RR 1,00;
95%) đến sử dụng probiotic [64]. Nhiều nghiên cứu ảnh hưởng của probiotic trên
quy mô lớn ở hầu hết các độ tuổi trong dân số đã rút ra kết luận liên quan đến sự an
toàn của probiotic, trên 500 nghiên cứu đã được thực hiện từ các probiotic và khơng
có cái nào cho thấy sự khơng an tồn của probiotic, nghiên cứu cũng cho thấy rằng
độ an toàn của probiotic trên hầu hết mọi người bao gồm trẻ em, thanh thiếu niên,
người lớn và người già. [23]
Trong báo cáo của FAO/WHO đánh giá probiotic trong thực phẩm đã công bố
“mối liên quan giữa bệnh dịch của con người và việc sử dụng probiotic được ghi
nhận là ít và tất cả các trường hợp này chỉ xuất hiện ở những bệnh nhân nặng” [9].
Các loài thuộc chi Lactococcus và Lactobacillus hầu hết thuộc nhóm được xem như
an toàn (GRAS) trong khi các vi khuẩn chi Streptococcus, Enterococcus và một số
chi khác thuộc nhóm LAB chứa một số tác nhân gây bệnh cơ hội. LAB về bản chất
đề kháng với nhiều kháng sinh. Sự đề kháng kháng sinh gắn với plasmid là một vấn
đề đáng quan tâm vì khả năng lan truyền sự đề kháng cho các chủng khác [14]. Do
đó để đảm bảo an tồn cho người sử dụng tổ chức FAO (2002) khuyến cáo các
chủng probiotic khơng những cần được phân loại chính xác mà còn phải được cung
cấp và lưu giữ tại các bảo tàng vi sinh vật đạt tiêu chuẩn quốc tế. Quy trình sản xuất
phải theo tiêu chuẩn GMP. [8]
1.1.7. Tác dụng của probiotic
1.1.7.1. Điều trị tiêu chảy

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng probiotic có khả năng tiết ra chất bảo vệ trong điều
trị tiêu chảy cấp tính, tiêu chảy do rotavirus và tiêu chảy do sử dụng kháng sinh


10

[25]. Rất nhiều nghiên cứu đã được khảo sát cho thấy nhiều lồi probiotic có thể
ngăn chặn và điều trị tiêu chảy cấp tính ở trẻ em. Bifidobacterium bifidum,
Bifidobacterium breve, Bifidobacterium lactis, Lactobacillus rhamnosus và
Lactobacillus reuteri đã được biết đến là sẽ đem lại sức khỏe tích cực cho trẻ em
khi chúng bị nhiễm rotavirus. [23]
Trong thí nghiệm của McFarland và cộng sự về liệu pháp kháng sinh gồm
metronidazole hoặc vancomycin thực hiện cùng thời gian với Saccharomyces
boulardii và với nghiên cứu trên những bệnh nhân đã từng nhiễm Clostridium
difficile và nhiễm lần đầu cho thấy Saccharomyces boulardii có khả năng ức chế sự
tái phát của bệnh. Mặt khác, một số probiotic đã được kiểm tra cho thấy có khả
năng ngăn ngừa tiêu chảy du lịch như Lactobacillus, Bifidobacterium,
Streptococcus và Saccharomyces. [63]
1.1.7.2. Điều trị bệnh viêm ruột, hội chứng ruột kích thích (IBS)
Trong lịng ruột chất nhầy được tiết ra từ các tế bào thành ruột giúp bảo vệ ruột,
các probiotic và vi khuẩn có hại tương tác với những tế bào này và đáp ứng với
những yếu tố gây viêm, trong đó probiotic có thể kích thích hệ thống miễn dịch làm
giảm đi tình trạng viêm. [23]
Tổng hợp từ nhiều nghiên cứu có rất nhiều lồi probiotic có đáp ứng tốt trong
điều trị, cải thiện sức khỏe cũng như làm giảm triệu chứng của hội chứng ruột kích
thích

bao

gồm


Lactobacillus

acidophilus,

L.rhamnosus,

L.plantarum,

Bifidobaterium infantis, L.salivarius, B.lactis, … [23]. Mặt khác những nghiên cứu
ngẫu nhiên cũng cho thấy Bifidobateria và Lactobacilli có lợi cho đường ruột và
làm giảm đáng kể các vấn đề của hội chứng Crohn.
1.1.7.3. Điều trị dị ứng
Theo nghiên cứu của đại học Western của Australia việc sử dụng probiotic với
thành phần Lactobacillus fermentum suốt bốn tháng làm giảm đáng kể tình trạng dị
ứng da ở trẻ từ 6-8 tháng tuổi. Ngoài ra việc cho trẻ sử dụng sản phẩm chứa
L.rhamnosus GG và B.lactis Bb-12 làm giảm tình trạng dị ứng nhanh chóng hơn so
với việc dùng thuốc điều trị thơng thường. [23]


11

1.1.7.4. Tác dụng bảo vệ trong ung thư ruột
Sự tiêu hóa probiotic sống có hiệu quả kháng khối u với cơ chế là sự khử độc
tính các gen gây độc trong ruột. Một số nghiên cứu mới chỉ ra rằng hỗn hợp dẫn
xuất được phân lập từ sữa lên men với chủng L.bulgaricus và Streptococcus
thermophilus có hiệu quả hơn trong sự khử hoạt tính các yếu tố nguy cơ gây bệnh
ung thư đại tràng so với các thành phần tế bào của vi khuẩn. Các LAB đóng vai trị
quan trọng trong sự ức chế hình thành khối u ung thư ruột do tác động lên chức
năng chuyển hóa, miễn dịch và bảo vệ. L.casei Shirota ức chế sự tổn thương ADN

do các tác nhân gây đột biến như N-methyl-N-nitroguanidin, N-nitrosoguanidin,
L.acidophilus và hỗn hợp chứa B.longum, L.gasseri, E.coli có tác dụng kháng gen
gây độc. [14]
1.1.7.5. Điều trị hiện tượng dung nạp lactose
Khi sinh ra trong cơ thể chúng ta sẽ có một lượng đáng kể β-galactosidase được
hiểu là lactase, khi lớn lên sự hiện diện của lactase trong hệ thống tiêu hóa sẽ giảm
và làm cho chúng ta khó tiêu hóa được lactose. Khi đó người ta đã tìm thấy nhiều
probiotic giúp cho việc tiêu hóa lactose. Lactobacilli có thể sản xuất enzym lactase,
Bifidobacteria dùng lên men để phân hủy lactose. Vi khuẩn phổ biến trong yogurt
có chứa enzym lactase như Lactobacillus acidophilus. [23]
1.1.7.6. Tác dụng trong bệnh tim mạch
Việc gia tăng cholesterol bất thường trong máu có thể dẫn đến nguy cơ bệnh
mạch vành trong khi đó các probiotic như Streptococcus, Lactobacillus,
Bifidobacterium có khả năng hạ thấp lượng cholesterol bất thường này. Ngày nay,
đã tìm được 11 chủng Lactobacillus có thể loại trừ đi cholesterol theo nhiều cơ chế
và có thể được dùng bổ sung thêm trong các bữa ăn hàng ngày, Lactobacillus
acidophilus có thể chuyển acid mật thành acid tự do và đào thải nhanh qua đường
tiêu hóa. [63]
Ngồi ra probiotic cịn có thể dùng trong bệnh tăng huyết áp, nhiều nghiên cứu
chỉ ra rằng Lactobacilli probiotic có khả năng sản xuất ra các enzym phân hủy các