BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM
MỘT SỐ CHẾ PHẨM PROBIOTIC CÓ CHỨA CHỦNG
BIFIDOBACTERIUM

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

CẦN THƠ - 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM
MỘT SỐ CHẾ PHẨM PROBIOTIC CÓ CHỨA CHỦNG
BIFIDOBACTERIUM

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
ThS. DƯƠNG THỊ TRÚC LY

CẦN THƠ - 2014


LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Dương Thị Trúc Ly, người đã trực
tiếp hướng dẫn đề tài, đã tận tình chỉ bảo, động viên và ln hỗ trợ em trong suốt
q trình thưc hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô bộ môn Vi Sinh (cô Nguyễn Thị Hải
Yến, cô Trần Thị Như Lê, thầy Dương Hồng Phúc, cô Đỗ Ánh Minh, cơ Phạm Thị
Ngọc Yến và thầy Lương Quốc Bình) đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất
để em có thể hồn thành luận văn đúng thời gian quy định.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô liên bộ mơn Hóa Phân Tích-Kiểm
Nghiệm-Độc Chất (thầy Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, cô Nguyễn Thị Ngọc Vân, cô
Nguyễn Thị Bích Thủy, cơ Nguyễn Thị Tường Vi, thầy Lữ Thiện Phúc, cô
Nguyễn Thị Đặng) đã tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn.
Em xin cảm ơn chị Trần Mộng Tố Tâm, bạn Trần Hữu Trí và Nguyễn Thanh
Nhàn đã luôn quan tâm, giúp đỡ, hỗ trợ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.


LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chưa ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Sinh viên


Nguyễn Phương Thảo


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................. 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 3
1.1. Tổng quan về probiotic .................................................................................. 3
1.2. Giới thiệu về vi khuẩn Bifidobacterium ......................................................... 8
1.3. Tổng quan về các phương pháp phân tích vi sinh vật .................................. 13
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 18
2.1. Vật liệu ......................................................................................................... 18
2.2. Địa điểm nghiên cứu..................................................................................... 19
2.3. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 19
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................... 34
3.1. Kết quả xây dựng qui trình ........................................................................... 34
3.2. Kết quả thẩm định qui trình .......................................................................... 41
3.3. Kết quả phân tích chế phẩm trên thị trường ................................................. 54
Chương 4. BÀN LUẬN ............................................................................................ 61
4.1. Xây dựng qui trình phân tích ........................................................................ 61
4.2. Thẩm định qui trình phân tích ...................................................................... 63
4.3. Áp dụng qui trình đã thẩm định phân tích một số chế phẩm trên thi trường 66
KẾT LUẬN ............................................................................................................... 69
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................. 70
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATP

Adenosine triphosphate
Phân tử mang năng lượng

B.

Bifidobacterium

cfu

Colony forming unit
Đơn vị hình thành khuẩn lạc

DNA

Deoxyribonucleic acid
Vật chất di truyền cấp độ phân tử

E.

Escherichia

EFFCA

European Food and Feed Cultures Association

Hiệp hội giống lương thực thực phẩm châu Âu

ELISA

Enzyme linked immuno sorbent assay
Phương pháp hấp thụ miễn dịch dùng enzym

En.

Enterococcus

FAO

Food and Agriculture Organization
Hiệp hội nông lương thế giới

GRAS

Generally recognized as safe
Nhóm vi khuẩn được xem như an tồn

Ig

Immunoglobulin
Globulin miễn dịch

L.

Lactobacillus


Le.

Leuconostoc

LAB

Lactic acid bacteria
Vi khuẩn sinh acid lactic

LOD

Limit of detection
Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of quantification
Giới hạn định lượng


MRSA

De Mann-Rogosa-Sharpe agar

Pe.

Pediococcus

Pr.


Propionibacter

PCR

Polymerase chain reaction
(Phản ứng chuỗi polymerase khuếch đại AND)

S.

Staphylococcus

Sa.

Saccharomyces

Sp.

Sporolactobacillus

St.

Streptococcus


DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bifidobacterium bifidum trên mơi trường
MRSAC .................................................................................................................. 35
Hình 3.2. Kết quả nhuộm Gram, nhuộm kháng acid, nhuộm bào tử của vi khuẩn
Bifidobacterium bifidum......................................................................................... 35
Hình 3.3.Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bifidobacterium breve trên mơi trường

MRSAL .................................................................................................................. 36
Hình 3.4. Kết quả nhuộm Gram, nhuộm kháng acid, nhuộm bào tử của vi khuẩn
Bifidobacterium breve ............................................................................................ 37
Hình 3.5. Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Bifidobacterium longum trên mơi trường
MRSAF .................................................................................................................. 38
Hình 3.6. Kết quả nhuộm Gram, nhuộm kháng acid, nhuộm bào tử của vi khuẩn
Bifidobacterium longum ......................................................................................... 39
Hình 3.7. Sơ đồ thể hiện tính tuyến tính của qui trình định lượng Bifidobacterium
bifidum trong khoảng nồng độ [25, 250] cfu/ml .................................................... 44
Hình 3.8. Sơ đồ thể hiện tính tuyến tính của qui trình định lượng Bifidobacterium
breve trong khoảng nồng độ [25, 250] cfu/ml ....................................................... 45
Hình 3.9. Sơ đồ thể hiện tính tuyến tính của qui trình định lượng Bifidobacterium
longum trong khoảng nồng độ [25, 250] cfu/ml .................................................... 46


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người .......................... 3
Bảng 1.2. Các chủng của lồi Bifidobacterium ........................................................ 9
Bảng 3.1. Mơi trường và điều kiện nuôi cấy chọn lọc cho Bifidobacterium ......... 34
Bảng 3.2. Kết quả định lượng vi khuẩn Bifidobacterium bifidum ......................... 36
Bảng 3.3. Kết quả định lượng vi khuẩn Bifidobacterium breve ............................ 38
Bảng 3.4. Kết quả định lượng vi khuẩn Bifidobacterium longum ......................... 39
Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm giới hạn vi sinh vật gây bệnh ................................ 40
Bảng 3.6. Kết quả thử nghiệm độ đặc hiệu, độ nhạy qui trình định danh
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum ......... 41
Bảng 3.7. Kết quả thử nghiệm giới hạn phát hiện đối với vi khuẩn Bifidobacterium
bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum .................................... 42
Bảng 3.8. Kết quả xác định độ đặc hiệu, độ nhạy qui trình định lượng
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum ......... 43
Bảng 3.9. Số khuẩn lạc đếm được ở 5 nồng độ vi khuẩn Bifidobacterium

bifidum .................................................................................................................... 44
Bảng 3.10. Số khuẩn lạc đếm được ở 5 nồng độ vi khuẩn Bifidobacterium
breve ....................................................................................................................... 45
Bảng 3.11. Số khuẩn lạc đếm được ở 5 nồng độ vi khuẩn Bifidobacterium
longum .................................................................................................................... 46
Bảng 3.12. Kết quả thử nghiệm độ lặp lại qui trình định lượng Bifidobacterium
bifidum .................................................................................................................... 47
Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm độ lặp lại qui trình định lượng Bifidobacterium
breve ....................................................................................................................... 48
Bảng 3.14. Kết quả thử nghiệm độ lặp lại qui trình định lượng Bifidobacterium
longum .................................................................................................................... 49
Bảng 3.15. Kết quả thử nghiệm độ đúng qui trình định lượng Bifidobacterium
bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum .................................... 50


Bảng 3.16. Kết quả giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Bifidobacterium
bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum .................................... 51
Bảng 3.17. Kết quả xác định độ đặc hiệu đối với Candida albicans, Escherichia
coli, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus ................................................ 52
Bảng 3.18. Kết quả xác định giới hạn phát hiện Candida albicans, Escherichia
coli, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus ................................................ 53
Bảng 3.19. Kết quả phân lập 2 mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium bifidum...... 54
Bảng 3.20. Kết quả nhuộm Gram, nhuộm kháng acid, nhuộm bào tử 2 chủng vi
khuẩn phân lập từ 2 mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium bifidum....................... 55
Bảng 3.21. Kết quả phản ứng sinh hóa 2 chủng vi khuẩn phân lập được từ 2 mẫu
chế phẩm chứa Bifidobacterium bifidum ............................................................... 55
Bảng 3.22. Kết quả số vi sinh vật sống trong 2 mẫu chế phẩm chứa
Bifidobacterium bifidum......................................................................................... 55
Bảng 3.23. Kết quả phân lập 2 mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium breve ......... 56
Bảng 3.24. Kết quả nhuộm Gram, nhuộm kháng acid, nhuộm bào tử 2 chủng vi

khuẩn phân lập từ 2 mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium breve .......................... 56
Bảng 3.25. Kết quả phản ứng sinh hóa 2 chủng vi khuẩn phân lập được từ 2 mẫu
chế phẩm chứa Bifidobacterium breve ................................................................... 56
Bảng 3.26. Kết quả số vi sinh vật sống trong 2 mẫu chế phẩm chứa
Bifidobacterium breve ............................................................................................ 57
Bảng 3.27. Kết quả phân lập 12 mẫu chế phẩm chứa Bifidobacterium longum .... 57
Bảng 3.28. Kết quả nhuộm Gram, nhuộm kháng acid, nhuộm bào tử 8 chủng vi
khuẩn phân lập từ 8 mẫu chế phẩm A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2 chứa
Bifidobacterium longum ......................................................................................... 58
Bảng 3.29. Kết quả phản ứng sinh hóa 8 chủng vi khuẩn phân lập được từ 8 mẫu
chế phẩm A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2 chứa Bifidobacterium longum .......... 59
Bảng 3.30. Kết quả số vi sinh vật sống trong 12 mẫu chế phẩm chứa
Bifidobacterium longum ......................................................................................... 59
Bảng 3.31. Kết quả phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong 12 mẫu chế phẩm chứa
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum ......... 60


DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Môi trường, thuốc thử ............................................................................PL1
Phụ lục 2. Một số tính chất sinh hóa của Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium
breve, Bifidobacterium longum ...............................................................................PL8
Phụ lục 3. Cách pha ống độ đục chuẩn McFarland, cách pha huyền dịch vi khuẩn
theo độ đục McFarland. ..........................................................................................PL9
Phụ lục 4. Hình ảnh kết quả xây dựng qui trình phân tích Bifidobacterium bifidum,
Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum ..................................................PL10
Phụ lục 5. Một số tính chất điển hình của Candida albicans, Escherichia coli,
Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus .......................................................PL15


1


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, khoa học công nghệ ngày càng phát triển làm cho đời sống con người
ngày càng tiện nghi. Nhưng bên cạnh những tích cực mang lại, nền kinh tế công
nghiệp cũng đặt cuộc sống con người vào khơng ít nguy cơ. Đó là sự ơ nhiễm mơi
trường, cường độ công việc tăng và áp lực căng thẳng trong cuộc sống. Vì thế, bệnh
tật cũng ngày càng gia tăng. Các cuộc cách mạng khoa học đã mang đến nhiều
thành tựu lớn lao, đặc biệt là cuộc cách mạng trong cơng nghiệp hóa học, nhờ đó,
con người đã có những bước tiến vượt bậc trong công tác điều trị bệnh. Tuy nhiên,
trong vài thập kỉ trở lại đây, người ta phát hiện việc sử dụng các thuốc men tổng
hợp hóa học chỉ hữu hiệu trên các bệnh cấp tính, cịn trên các bệnh mãn tính lại tỏ ra
khơng hồn tồn tối ưu. Các tác dụng phụ khơng mong muốn và các tác dụng có hại
được phát hiện ngày càng nhiều. Vì thế, xu hướng điều trị được ưa thích hiện nay là
“quay về với thiên nhiên”, “chữa bệnh không dùng thuốc”. Đó là ngun nhân giải
thích vì sao từ cuối thế kỷ 20 trở lại đây, việc sử dụng probiotic trở thành một chỉ
định thường xuyên và phổ biến.
Probiotic là các sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật sống, nhằm bổ sung các lợi
khuẩn vào hệ vi khuẩn cộng sinh tự nhiên ở người, một số sản phẩm trong thành
phần cịn bổ sung các vitamin, khống chất, đóng vai trị như thực phẩm chức năng.
Trên thị trường Việt Nam, các chế phẩm probiotic rất đa dạng và có xu hướng phát
triển ngày càng mạnh mẽ, với mục tiêu sử dụng chủ yếu để điều trị tiêu chảy do rối
loạn tiêu hóa khi sử dụng kháng sinh phổ rộng và được coi là một biện pháp hiệu
quả, an toàn, đặc biệt cho trẻ em.
Tuy nhiên, do đây là một lĩnh vực ứng dụng khá mới mẻ nên việc chuẩn hóa và
quản lý chất lượng các sản phẩm, cả thành phẩm và nguyên liệu vẫn còn là một
chuyên mục đang được xây dựng và hoàn thiện ở nhiều quốc gia, trong đó có Việt
Nam. Hiện nay, nước ta chưa có một tiêu chuẩn nào để áp dụng cho việc quản lý
chất lượng cho các chế phẩm probiotic, trong Dược điển Việt Nam IV chỉ có duy
nhất một chuyên luận kiểm nghiệm cho chế phẩm Biosubtyl.



2

Do tính đặc thù của sản phẩm là phải chứa các vi sinh vật sống và công nghệ bào
chế đặc biệt, nên qui trình kiểm nghiệm chung quy phải giải quyết được các câu
hỏi: sản phẩm có chứa đúng loại và số lượng vi khuẩn sống như đã ghi trên nhãn;
sản phẩm có nhiễm các vi sinh vật gây bệnh. Vì vậy, chúng tơi tiến hành thực hiện
đề tài “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số chế phẩm probiotic có
chứa chủng Bifidobacterium”.
Mục tiêu:
Xây dựng qui trình kiểm nghiệm các chế phẩm probiotic đa thành phần có chứa vi
khuẩn thuộc chi Bifidobacterium bao gồm định danh, định lượng và chỉ tiêu vi sinh.
Mục tiêu cụ thể:
1. Tìm được môi trường và điều kiện nuôi cấy chọn lọc cho phân lập vi khuẩn
Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum trong các
chế phẩm probiotic dạng đa chủng, dựa trên các vi khuẩn chủng gốc được cung cấp.
2. Xây dựng được qui trình định danh vi khuẩn Bifidobacterium bifidum,
Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum bằng phương pháp truyền thống.
3. Xây dựng được qui trình định lượng vi khuẩn Bifidobacterium bifidum,
Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
4. Xây dựng được qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh trên 5 chủng:
Candida albicans, Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus.
5. Thẩm định các qui trình đã xây dựng.
6. Áp dụng các qui trình đã thẩm định tiến hành kiểm nghiệm một số chế phẩm
probiotic đa thành phần có chứa vi khuẩn Bifidobacterium đang lưu hành.
Ý nghĩa khoa học:
Góp phần xây dựng tiêu chuẩn quốc gia về kiểm nghiệm các chế phẩm probiotic.
Ý nghĩa thực tiễn:
Ứng dụng qui trình trong kiểm nghiệm các chế phẩm probiotic đang lưu hành trên
thị trường, góp phần đảm bảo chất lượng cuộc sống cho người dân.



3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC
1.1.1. Định nghĩa probiotic
Khái niệm probiotic được xuất phát từ Hy Lạp, mang ý nghĩa “vì cuộc sống” (“for
life”).
Theo định nghĩa của EFFCA, probiotic là các vi sinh vật sống (vi khuẩn hoặc nấm
men) khi được uống hoặc sử dụng tại chỗ với một số lượng thích hợp thì sẽ đem lại
lợi ích sức khỏe cho vật chủ ngoài nguồn dinh dưỡng cơ bản vốn có. [19]
1.1.2. Những chủng vi sinh vật được sử dụng làm probiotic
Hiện nay, các chủng vi khuẩn được sử dụng với vai trò là các probiotic chủ yếu
thuộc chi Lactobacillus và Bifidobacterium, ngoài ra Enterococcus và
Streptococcus cũng được sử dụng nhưng ít hơn. Những vi khuẩn này thường cư
trú trong ruột. Bên cạnh những vi khuẩn còn có nấm men Saccharomyces
boulardii cũng được xem là probiotic.
Bảng 1.1. Những vi sinh vật được sử dụng làm probiotic ở người
Chủng
Lactobacillus
L.acidophilus
L.amylovocus
L.casei
L.crispatus
L.gallinarum
L.gasseri
L.johnsonii
L.paracasei

L.plantarum
L.reuteri
L.rhamnosus
L.salivarius

Chủng
Bifidobacterium
B.adolescentis
B.animalis
B.bifidum
B.breve
B.infantis
B.lactis
B.longum

Các chủng vi khuẩn
lactic khác
En.faecalis
En.faecium
Le.mesenteroides
Pe.acidilactici
Sp.inulinus
St.thermophilus

Các loài
vi sinh vật khác
Bacillus cereus
Pr.freudenreichii
Sa.cerevisiae
Sa.boulardii



4

1.1.3. Cơ chế tác động của probiotic
Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhưng phần lớn các tài
liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại trừ; (ii) đối kháng
vi khuẩn và (iii) điều chỉnh miễn dịch. [45]
Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các vi sinh vật. Hình
thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các vi sinh vật đường ruột là cạnh tranh vị trí
bám dính. Các vi sinh vật probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt các vị
trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các vi sinh vật khác như E.coli,
Salmonella,... Một số nấm men probiotic (Sa.cerevisiae, Sa.boulardii) khơng chỉ
cạnh tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn khác mà cịn gắn kết các vi khuẩn có roi
(phần lớn là những vi khuẩn có hại) thơng qua các cơ quan thụ cảm mannose và đẩy
chúng ra khỏi vị trí bám dính ở niêm mạc ruột. [15] Tuy nhiên, cạnh tranh dinh
dưỡng là phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì sự sinh sơi với số lượng lớn của
một lồi vi sinh vật nào đó là một đe dọa nghiêm trọng đối với các loài khác về
nguồn cơ chất cho sự phát triển.
Đồng thời với cạnh tranh loại trừ, các vi sinh vật probiotic cịn sản sinh ra các chất
kìm hãm vi khuẩn như lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxid cũng như một số axit
hữu cơ khác. Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn có hại chủ yếu là do sự
giảm thấp pH trong ruột. [13]
Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật có vú. Giữa hệ vi sinh vật ruột và hệ
thống miễn dịch có mối tương tác đặc thù. Năng lực miễn dịch dịch thể và miễn
dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đường ruột bị ảnh hưởng rất lớn bởi sự cân bằng
của hệ vi sinh vật đường ruột [29]. Thông qua tương tác với hệ thống miễn dịch ở
ruột, các probiotic có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động hoặc cả hai.
Tác động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của probiotic phụ thuộc vào chủng giống
hoặc các loài vi khuẩn probiotic. [16]



5

1.1.4. Những lợi ích của probiotic
1.1.4.1. Probiotic cho trẻ sơ sinh và trẻ em [25]
Nhiễm trùng đường ruột ở trẻ sơ sinh rất phổ biến, có thể gây ra tiêu chảy làm cho
tình trạng bệnh nặng thêm hoặc có thể gây tử vong. Viêm ruột kết gây tử vong là
một bệnh do rối loạn đường ruột. Những vi khuẩn cư trú hoặc nhiễm từ ngoài vào
đường ruột làm tăng nguy cơ gây bệnh có thể là Clostridium, Escherichia,
Klebsiella, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Enterococcus,… Theo thống kê, có
một mối tương quan giữa việc tăng tỉ lệ Lactobacillus với việc giảm nguy cơ bệnh
viêm ruột kết gây tử vong. Các nghiên cứu khác cũng chỉ ra Bifidobacterium định
cư ở ruột có thể giúp ngăn chặn nhiều tác nhân gây bệnh, làm giảm độc tố và cải
thiện bệnh viêm ruột kết.
Với bệnh tiêu chảy cấp tính do Rotavirus, sử dụng L.rhamnosus GG và
Bifidobacterium lactis BB-12 cho việc phòng bệnh và L.reuteri SD2222 cho việc
điều trị bệnh ở trẻ là rất hiệu quả.
1.1.4.2. Điều trị tiêu chảy
Ngoài nhiễm trùng do Rotavirus, nhiều loài vi khuẩn cũng có khả năng gây rối loạn
đường ruột. Có những bằng chứng in vitro cho thấy một số chủng probiotic có thể
ức chế sự phát triển và gắn kết lên màng của các tác nhân gây bệnh đường ruột. Cơ
chế chưa được giải thích rõ ràng nhưng có thể là do vi sinh vật probiotic ức chế
hoặc thậm chí tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh. Nghiên cứu trên động vật uống hàng
ngày L.rhamnosus GR-1, L.rhamnosus GG hoặc L.fermentum RC-14 sẽ làm tăng
sinh IgA và tăng hoạt tính thực bào, làm giảm đáng kể lượng vi khuẩn gây bệnh tại
vị trí cục bộ và tránh nhiễm trùng lan tỏa (đến gan và các tổ chức khác) do các loài
Salmonella. [46]
Vấn đề sử dụng kháng sinh là một trong những nguyên nhân gây tiêu chảy do
Clostridium difficile. Vi sinh vật này thường không chiếm ưu thế trong ruột nhưng

khi sử dụng kháng sinh, phá vỡ hệ sinh thái ruột dẫn đến làm gia tăng tỉ lệ vi khuẩn
này một cách bất thường và sau đó gây ra các triệu chứng liên quan đến việc sản
sinh độc tố. Khi dùng Saccharomyces boulardii sẽ làm giảm triệu chứng tiêu chảy,


6

có thể là do nấm men này tiết ra protease 54-kDA và enzym này sẽ tiêu hóa phân tử
độc tố A và B của Clostridium và đẩy chúng khỏi các thụ thể màng. [55]
1.1.4.3. Ức chế và tiêu diệt Helicobacter pylori [25]
Helicobacter pylori là vi khuẩn Gram âm liên quan tới bệnh viêm loét dạ dày tá
tràng và có thể là yếu tố nguy cơ gây ung thư dạ dày. Có các dữ liệu thử nghiệm
trên động vật và in vitro cho thấy vi khuẩn sinh acid lactic có thể ngăn cản sự phát
triển của vi khuẩn gây bệnh này và làm giảm hoạt tính enzym urease (là enzym giúp
Helicobacter pylori có thể tồn tại trong mơi trường acid của dạ dày). Cơ chế tác
dụng chưa rõ ràng nhưng có giả thuyết Lactobacillus cạnh tranh vị trí gắn với thụ
thể glycolipid.
1.1.4.4. Điều trị bệnh viêm ruột [36], [55]
Những thay đổi của hệ vi sinh đường ruột có thể gây ra hoặc làm nặng thêm các
bệnh viêm ruột như viêm túi ruột (biến chứng sau khi phẫu thuật do viêm loét dạ
dày tá tràng) hay bệnh Crohn. Những bằng chứng sơ bộ ban đầu cho thấy việc kết
hợp nhiều chủng vi sinh vật probiotic (chứ khơng dùng đơn lẻ) có khả năng làm
giảm nhẹ triệu chứng bệnh. Ví dụ như kết hợp các chủng Lactobacillus,
Bifidobacterium và Streptococcus thermophilus.
1.1.4.5. Tăng cường khả năng tiêu hóa sữa [26], [52]
L.bulgaricus được dùng cho những người khơng dung nạp lactose do thiếu men
chuyển hóa loại đường này.
1.1.4.6. Làm giảm cholesterol trong huyết tương [14], [33]
Cơ chế làm giảm cholesterol trong máu chưa được giải thích rõ ràng nhưng ở một
số chủng L.acidophillus tiết ra enzym thủy phân acid mật xúc tác phản ứng thủy

phân các acid mật dạng liên hợp với taurin hoặc glycin thành các đoạn amino acid
và các acid mật tự do. Các acid mật tự do này kém hòa tan hơn dạng liên hợp, kết
quả là chúng được hấp thu vào máu ít hơn. Một giả thuyết khác là các vi khuẩn có
khả năng gắn kết với một số cholesterol có trong môi trường lên trên thành tế bào,
điều này làm cholesterol cũng ít được hấp thu vào máu hơn. Giả thuyết thứ ba là vi
khuẩn có khả năng tiêu hóa cholesterol.


7

1.1.4.7. Khả năng phòng chống ung thư [46], [55]
Lactobacillus và Bifidobacterium có khả năng làm thay đổi hệ vi sinh đường ruột và
giảm nguy cơ ung thư là do khả năng làm giảm β-glucuronidase và giảm mức độ
các chất sinh ung thư. Khi uống probiotic, gồm L.casei cũng có thể làm giảm nguy
cơ ung thư ở các vị trí ngồi đường ruột như ung thư bàng quang. Các thử nghiệm
in vitro với L.rhamnosus GG và Bifidobacterium, thử nghiệm in vivo với
L.rhamnosus GG và LC-705 và Propionibacterium sp. cho thấy có sự giảm đáng kể
độc tố sinh ung thư aflatoxin. Bifidobacterium longum gây tăng hoạt tính của
glutathion transferase, NADPH-cytochrom P450 reductase ở ruột kết, tăng việc loại
bỏ O6-methylguanin từ chất nhầy của ruột kết cũng đóng vai trị trong việc phịng
chống bệnh.
1.1.4.8. Tăng cường khả năng miễn dịch [25], [55]
Một số probiotic có khả năng kích thích hệ miễn dịch. Chức năng hoạt động của
chúng không được biết rõ ràng, nhưng kết quả là tăng đáp ứng miễn dịch với nhiều
loại kháng nguyên.
Thành phần hệ vi sinh vật ở âm đạo người mẹ có thể ảnh hưởng đến bệnh hen sau
này ở trẻ em. Nếu âm đạo người mẹ có Staphylococci và có dùng kháng sinh trong
khi mang thai thì con dễ bị hen. Để phòng bệnh, người ta đã dùng thử probiotic
L.rhamnosus GG cho các bà mẹ mang thai trong 4 tuần trước khi sinh và cho trẻ sơ
sinh có nguy cơ dị ứng cao trong vòng 6 tháng đầu, nhận thấy vi sinh vật probiotic

có thể làm giảm đáng kể các triệu chứng dị ứng của bệnh. Cơ chế có thể là do
probiotic giúp làm giảm tính thấm ở đường ruột, tăng đáp ứng IgA đặc hiệu ở ruột,
tăng chức năng hàng rào bảo vệ của ruột để phục hồi lại hệ vi sinh vật bình thường,
tăng sản xuất interleukin-10 và các yếu tố tăng trưởng β cũng như cytokin, vì thế
thúc đẩy việc sản xuất kháng thể IgE. Ngồi ra, vai trị tăng tế bào T giúp đỡ loại 1
và giảm tế bào T giúp đỡ loại 2 còn cần phải chứng minh tiếp.
1.1.4.9. Tăng cường sức khỏe sinh sản ở phụ nữ [25]
Hệ vi sinh vật ở âm đạo phụ nữ thường dễ bị bất thường vào giai đoạn kinh nguyệt
hoặc thời kỳ hậu mãn kinh, mặc dù có thể khơng có biểu hiện bệnh lý. Một sự bất


8

thường của hệ vi sinh vật âm đạo sẽ dẫn đến nhiễm trùng âm đạo hoặc đường niệu.
Khôi phục lượng Lactobacilli ở âm đạo sẽ giúp ngăn ngừa nhiễm trùng. Uống hằng
ngày L.fermentum RC-14 sẽ giúp chuyển những vi sinh vật này từ trực tràng sang
âm đạo đồng thời làm suy yếu toàn bộ các Coliform và nấm men trong âm đạo.
Những nghiên cứu mở rộng kể từ sau những năm 70 còn cho thấy dùng probiotic
Lactobacilli dạng viên đặt âm đạo sẽ làm giảm nguy cơ nhiễm trùng đường niệu,
nhiễm nấm hay nhiễm trùng âm đạo.
Dùng probiotic uống cho phụ nữ mang thai phòng nguy cơ nhiễm trùng đường âm
đạo, đồng thời tránh nguy cơ nhiễm trùng gây tử vong cho trẻ sơ sinh là một biện
pháp rất hữu hiệu mà lại an toàn. Hiện nay, trên thị trường đã có những dạng
probiotic dạng thuốc đặt. Việc lựa chọn dùng probiotic thay thế thuốc chống nấm,
kháng sinh trong điều trị nhiễm trùng đường tiết niệu-sinh dục có tiềm năng nhưng
cũng cần phải có thêm nhiều bằng chứng lâm sàng.
1.2. GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN BIFIDOBACTERIUM
Bifidobacterium được phân lập và khám phá bởi một bác sĩ người Pháp tên là
Tissier khi ông nghiên cứu về bệnh tiêu chảy ở trẻ sơ sinh trong những năm 18991900. Ông đặt tên là Bacillus bifidus communis hoặc Bacillus bifidus. Sau đó vi sinh
vật này được phân loại thành Bifidobacterium. [42]

Bifidobacterium là loài vi sinh vật có trong ruột già của người, chiếm 5-35% tổng số
vi sinh vật trong đường ruột, được sử dụng như probiotic trong các sản phẩm sữa
lên men, có tác dụng: sản sinh acid lactic và acid acetic, làm giảm pH nên ức chế
được vi sinh vật gây bệnh (hiệu quả như chất kháng khuẩn), hạn chế amoniac tự do
vào máu do biến NH3 tự do thành NH4+, tổng hợp được vitamin nhóm B và các
enzym tiêu hóa như caseinphosphat và lyxozym, một số thành phần tế bào có khả
năng kích thích hoạt động miễn dịch của cơ thể, tạo sự cạnh tranh với các vi khuẩn
đường ruột khác. [28]


9

1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Bifidobacterium
1.2.1.1. Phân loại
Bifidobacterium là vi khuẩn Gram dương, khơng di động, kỵ khí bắt buộc và được
phân loại như sau:
Lớp: Actinobacteria
Lớp phụ: Actinobacteriadae
Bộ: Bifidobacteriales
Họ: Bifidobacteriaceae
Chi: Bifidobacterium [46]
Các chủng của loài Bifidobacterium:
Bảng 1.2. Các chủng của loài Bifidobacterium
Loài Bifidobacterium
B.adolescentis
B.animalis
B.asteroides
B.bifidum
B.breve
B.catenulatum

B.cuniculi
B.denticolens
B.dentium
B.gallicum
B.infantis
B.inopinatum
B.lactis
B.longum
B.merycicum
B.pseudocatenulatum
B.pseudolongum
B.pullorum
B.ruminantium
B.saeculare
B.scardovii
B.thermophilum

Nguồn
Phân của trẻ em và người lớn, ruột thừa
Phân của thỏ, chuột, gà, bê
Mật ong
Phân của trẻ em và người lớn
Phân trẻ em
Phân trẻ em và người lớn
Phân thỏ
Răng sâu của con người
Răng sâu của người, phân người lớn
Phân người trưởng thành
Phân trẻ em
Răng sâu của người

Sữa đã lên men
Phân người lớn và trẻ em
Dạ cỏ động vật nhai lại
Phân trẻ em
Phân của chuột, gà, bê, dạ cỏ của động vật nhai lại
Phân gà
Dạ cỏ của động vật nhai lại
Phân thỏ
Phân người trưởng thành
Phân gà, bê, dạ cỏ của động vật nhai lại


10

1.2.1.2. Hình thái
Vi khuẩn Bifidobacterium khơng di động, khơng sinh bào tử, hình que với nhiều
dạng khác nhau như dạng cong, dạng móc câu, dạng hình gậy, dạng phân nhánh,…
thường xuất hiện ở dạng chữ “Y”. Các tế bào vi khuẩn Bifidobacterium thường
đứng riêng lẻ, xếp thành cặp hoặc xếp thành hình chữ “V”. Kích thước tế bào vi
khuẩn khoảng 0.5-1,3mm.
Bifidobacterium với điều kiện tăng trưởng khác nhau thì các tế bào có nhiều hình
dạng khác nhau. Thành phần trong mơi trường ni cấy ảnh hưởng đến hình thái
của Bifidobacterium: N-acetylglucosamin, các thành phần liên quan đến tổng
hợp vách peptidoglycan, sự có mặt của các amino acid chính (alanin, acid aspartic,
acid glutamic, serin) và ion Ca2+. [42]
Tế bào Bifidobacterium không có vỏ bao và khơng có hệ thống tiêm mao bao
quanh. Vách tế bào được cấu tạo bởi ba thành phần chính: peptidoglycan,
polysaccharid, acid lipoteichoic. [30]
1.2.1.3. Đặc điểm sinh lý
Bifidobacterium có trong ruột già của người và động vật. Chúng đóng vai trị trong

việc kiểm sốt pH của đường ruột và kết tràng, tính ổn định của chúng liên quan
đến tuổi tác, tuổi càng lớn thì lượng vi khuẩn càng giảm. Ngồi ra lượng vi khuẩn
Bifidobacterium trong cơ thể cịn bị tác động bởi nhiều yếu tố như: thức ăn, nước
uống, sử dụng kháng sinh và tình trạng cơ thể. [41]
Nhu cầu oxy: Bifidobacterium là sinh vật kỵ khí bắt buộc, tuy nhiên tính nhạy cảm
với oxy thay đổi tùy theo loài và các giống khác nhau của mỗi loài. Một số lồi
cũng có thể chịu được oxy khi có sự hiện diện của CO2. Khi có mặt CO2, tính nhạy
cảm với oxy khác nhau phụ thuộc vào các dòng. Một số dịng có thể phát triển trong
sự hiện diện của oxy, một số dịng có thể âm tính hoặc dương tính với catalase.
Bifidobacterium có nhiều đường hơ hấp khác nhau bao gồm:
• Tăng trưởng hiếu khí khơng có sự tích lũy H2O2: một dịng vi khuẩn
B.bifidum chịu được điều kiện hiếu khí tạo ra một lượng nhỏ H2O2 bởi q trình
oxy hóa NADH.


11

• Tăng trưởng giới hạn với sự tích lũy H2O2: sự tích lũy H2O2 là một độc tố
đối với enzym fructose-6-phosphat phosphoketolase trong q trình chuyển hóa
đường của chi Bifidobacterium.
• Tăng trưởng khơng có sự tích lũy H2O2: một số dịng Bifidobacterium có
mức oxy hóa khử thấp trong q trình chuyển hóa các chất và tạo H2O2.
Nhiệt độ: nhiệt độ tối ưu cho sự tăng trưởng của vi khuẩn Bifidobacterium ở người
là từ 36-380C, ở động vật là 41-430C. Tế bào không tăng trưởng ở nhiệt độ dưới
200C và trên 460C. Tuy nhiên B.thermacidophilum có khả năng phát triển ở nhiệt độ
49,50C và B.psychraerophilum có thể phát triển ở nhiệt độ dưới 40C. [41], [42]
pH: pH tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn này là 6,5-7,0. Tế bào vi khuẩn
Bifidobacterium không tăng trưởng ở pH thấp hơn 4 và cao hơn 8. Riêng chủng
B.lactis và B.animalis có thể tăng trưởng ở pH 3,5. Bifidobacterium chịu được acid
nhưng không phải là vi sinh vật ưa acid. [41]

1.2.1.4. Nhu cầu dinh dưỡng
Bifidobacterium là lồi vi sinh vật hóa dị dưỡng, có khả năng lên men nhiều nguồn
carbon. Sản phẩm chính của quá trình lên men glucose chủ yếu là L(+)-lactat và
acetat với tỷ lệ 2:3, và một số sản phẩm phụ như acid formic, ethanol, acid succinic,
acid butyric, acid propionic,… và khơng tạo CO2. [42]
Khả năng chyển hóa carbohydrat khác nhau đáng kể giữa các chủng
Bifidobacterium. Hầu hết các chủng Bifidobacterium đều có thể chuyển hóa được
các nguồn đường ribose, galactose, fructose, glucose, sucrose, maltose, melibiose
nhưng không thể lên men L-arabinose, rhamnose, N-acetyl glucosamin, sorbitol,
melezitose, trehalose, glycerol, xylitol và inulin. [30]
Bifidobacterium đặc trưng bởi sự trao đổi chất hexose thông qua con đường
phosphoketolase-con đường “Bifid shunt”, bằng cách sử dụng một enzym chủ chốt
là fructose-6-phosphat phosphoketolase (F6PPK). Sự hiện diện của F6PPK thường
được sử dụng để phân biệt Bifidobacterium với các vi khuẩn khác có hình thái
tương tự như Lactobacillus, Arthrobacter, Propionibacterium, Corynebacterium,
Actinomycetaceae.


12

Bên cạnh việc sản xuất hỗn hợp L(+)-lactat và acetat với tỷ lệ 2:3, đặc điểm chức
năng probiotic của Bifidobacterium còn thể hiện bằng việc sản xuất các vitamin
ngoại bào (B1, B6, B9) và các acid amin như alanin, valin, aspartic và threonin.
1.2.2. Các chủng Bifidobacterium có giá trị thương mại
1.2.2.1. Bifidobacterium animalis
Mô tả chủng này dựa vào sự phân lập từ phân của các loài động vật khác nhau.
Ở một số tài liệu thì nó được mơ tả như Bifidobacterium lactis, được tách ra
từ các sản phẩm bơ sữa. Quá trình tách subsp. lactis thì chịu áp lực oxy
nhiều hơn subsp. animalis và điều đó có lợi trong ứng dụng của probiotic, nó
cho phép chúng có thể tồn tại trong điều kiện khơng kỵ khí của sản phẩm

thương mại, và điều khác biệt nữa giữa 2 chủng là sự sinh trưởng của chúng
trong sữa. Bifidobacterium animalis thuộc nhóm Bifidobacterium pseudolongum,
bao gồm Bifidobacterium choerinum, Bifidobacterium cuniculi, Bifidobacterium
gallicum và Bifidobacterium pseudolongum. Thành phần ADN G+C của loài này
chiếm 61%. Một loại Bifidobacterium animalis subsp. animalis là ATCC
25527T (LMG 10508T hay DSM 20104T), tách từ phân chuột, một loại
B.animalis subsp. lactis là LMG 18314T (DSM 10140T), được tách từ sữa đã
lên men.
1.2.2.2. Bifidobacterium bifidum
Bifidobacterium bifidum cực kì kỵ khí. Nó là một trong số những loài được
nhận biết dựa vào dấu hiệu q trình lên men và nó khác hồn tồn so với những
lồi khác trong nhóm Bifidobacteria. Trong điều kiện đặc biệt những tế bào
có hình dáng riêng giống “bình hai quai” và cũng thường xuất hiện như một
nhánh que. Loài này được phân lập từ phân của cả người lớn và trẻ em,
phân động vật, nó được sử dụng trong những sản phẩm của quá trình lên men
bơ sữa cho mục đích probiotic. Một loại của chủng này là ATCC 29521T
(DSM20239T hay LMG 10645T), tách ra từ phân của trẻ sơ sinh.
1.2.2.3. Bifidobacterium breve
Lồi này được đặc trưng bởi kích thước ngắn, có hay khơng có sự rẽ nhánh, với


13

lysin và glycin như là amino acid trong peptidoglycan và có thành phần gen GC
chiếm 58%. Lồi này được tách ra từ ruột người, nước cống. Loại chủng này
là ATCC 15700T (DSM20213T hay LMG 11042T).
1.2.2.4. Bifidobacterium longum
Khác với Bifidobacterium breve, tế bào của lồi này có hình dạng dài và
mỏng, ít phân nhánh. Nó kỵ khí và được xem là một trong những loài phổ
biến của Bifidobacterium, được tách ra từ phân của người lớn và cả phân của

động vật. Lồi gần nó nhất trong hệ thống phân lồi là Bifidobacterium
breve. Thành phần gen G+C của nó chiếm 60% hiện diện nhiều plasmid, tính
chất duy nhất trong số những Bifidobacterium tách ra từ phân. Một loại của B.
longum là ATCC 15707T (DSM 20219T hay LMG 13197T), tách ra từ phân của
người lớn.
1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT
1.3.1. Các phương pháp định danh vi sinh vật [3], [4], [6]
1.3.1.1. Phương pháp dựa trên kiểu hình và các phản ứng sinh hóa truyền thống
Xác định hình thái khuẩn lạc và tế bào: hình thái khuẩn lạc trên các mơi trường ni
cấy rắn, đặc tính ni cấy trong mơi trường lỏng, hình dạng, kích thước vi sinh vật,
sự có mặt và vị trí của lơng, roi, bào tử, sự bắt màu khi nhuộm, khả năng di động…
Đặc điểm nuôi cấy: kiểu hô hấp, nhu cầu dinh dưỡng, mơi trường phân lập, khả
năng quang hóa, nhiệt độ ni cấy,…
Các phản ứng sinh hóa: khả năng lên men đường, khả năng sinh hơi, sự thủy phân
tinh bột, hình thành indol, phản ứng catalase, oxydase, hình thành H2S, sự khử hóa
nitrat,…
Các phản ứng huyết thanh học để định danh các typ vi khuẩn.
Để thuận lợi hơn khi thực hiện các phản ứng sinh hóa truyền thống, trên thị trường
người ta đã pha chế sẵn các thuốc thử dạng que giấy, đĩa giấy hoặc cho phép thực
hiện hàng loạt thử nghiệm sinh hóa cùng lúc trên các bộ kit định danh. Điều này sẽ
tiết kiệm thời gian và công sức.


14

1.3.1.2. Phương pháp dựa trên tính miễn dịch
Nguyên tắc phản ứng miễn dịch: phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên)
với một kháng thể đặc hiệu của nó, loại kháng thể này đưọc đánh dấu, phản ứng
dương tính khi có sự ngưng kết kháng nguyên-kháng thể.
Một số kỹ thuật điển hình:

• Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang: kháng thể được gắn huỳnh quang để phát
hiện vi sinh vật.
• Kỹ thuật ELISA: kháng thể đơn dòng được phủ trên đĩa giếng microplate,
nếu có kháng nguyên mục tiêu (vi sinh vật) sẽ được giữ lại trên giếng, dùng một
kháng thể thứ cấp có gắn enzym tạo nên một dạng “kẹp sandwich” (kháng thểkháng nguyên-kháng thể), phát hiện nhờ cho vào một cơ chất đặc hiệu của
enzym, enzym sẽ xúc tác thủy phân cơ chất để tạo sản phẩm có màu hoặc phát
sáng.
1.3.1.3. Phương pháp dựa trên kỹ thuật phân tích acid nucleic
Định tính cơ bản: người ta sử dụng các kỹ thuật tách chiết để thu các phân tử acid
nucleic sạch ở trạng thái nguyên vẹn tối đa, không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ
học hay hóa học rồi tiến hành định tính chúng bằng kỹ thuật điện di. Nguyên tắc
phương pháp điện di dựa trên cấu trúc acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm,
dưới tác dụng điện trường sẽ di chuyển về cực dương. Tính linh động của phân tử
acid nucleic phụ thuộc vào khối lượng phân tử và cấu tạo gel chạy điện di. [4]
Phương pháp lai phân tử: cơ sở của hiện tượng này là sự tách rời hai mạch đôi của
chuỗi xoắn kép ADN khi nhiệt độ môi trường vượt quá nhiệt độ nóng chảy của
phân tử và sự tái bắt cặp của những trình tự tương đồng sau đó. Phương pháp này
cần sử dụng mẫu dò. Mẫu dò là những trình tự tương đồng với gen cần tìm được
đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ hoặc bằng phương pháp hóa học. Định danh vi
sinh vật nhờ việc phát hiện một đoạn gen đặc trưng của nó. Các kỹ thuật điển hình
của phương pháp lai phân tử như là:
• Lai trong pha lỏng: ứng dụng phát hiện các trình tự tương đồng giữa các lồi.
• Lai trên pha rắn: đoạn ADN kép của vi sinh vật được xử lý biến tính thành