BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

TRẦN HỮU TRÍ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM
MỘT SỐ CHẾ PHẨM PROBIOTIC CÓ CHỨA CHỦNG
LACTOBACILLUS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
ThS. DƢƠNG THỊ TRÚC LY

Cần Thơ - Năm 2014


LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn Cô Dương Thị Trúc Ly đã hướng dẫn, động viên và giúp
đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn Thầy Trần Đỗ Hùng, khoa Điều Dưỡng và Kỹ Thuật Y
Học đã chỉ dẫn và giúp đỡ em trong quá trình làm luận văn.
Em xin gởi lời cảm ơn đến q Thầy Cơ bộ mơn Vi Sinh, đặc biệt là Cô Nguyễn Thị
Hải Yến, Cô Trần Thị Như Lê, Thầy Dương Hồng Phúc, Cô Đỗ Ánh Minh, Cơ
Phạm Thị Ngọc Yến và Thầy Lương Quốc Bình đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt
nhất để em có thể hồn thành luận văn đúng thời gian quy định.
Em xin gởi lời cảm ơn đến quí Thầy Cơ trong Liên bộ mơn Hóa phân tích-Kiểm
nghiệm-Độc chất, đặc biệt là Thầy Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, Cô Nguyễn Thị Ngọc

Vân, Cơ Nguyễn Thị Bích Thủy, Cơ Nguyễn Thị Tường Vi, Thầy Lữ Thiện Phúc và
Cô Nguyễn Thị Đặng đã động viên, tạo mọi điều kiện để em hoàn thành luận văn.
Em xin gởi lời cảm ơn đến Cô Phạm Thị Ngọc Nga, khoa Khoa Học Cơ Bản và
Chị Trần Mộng Tố Tâm, lớp Dược K34 đã góp ý và giúp đỡ em trong quá trình
thực hiện luận văn.
Xin gởi lời cảm ơn đến bạn Nguyễn Phương Thảo và bạn Nguyễn Thanh Nhàn, lớp
Dược K35, các bạn sinh viên lớp Dược K37 đã giúp đỡ và động viên mình rất nhiều
trong suốt quá trình làm luận văn.
Con xin cảm ơn cha mẹ đã động viên, chăm sóc, ủng hộ và tạo mọi điều kiện để con
hoàn thành luận văn.


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả trong luận
văn là trung thực và chưa ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Sinh viên

Trần Hữu Trí


i

MỤC LỤC
MỤC LỤC ................................................................................................................... i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT................................................................................. iv
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. vi
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ viii
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................3

1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC ......................................................................3
1.1.1. Lịch sử probiotic ........................................................................................3
1.1.2. Định nghĩa probiotic ..................................................................................4
1.1.3. Cơ chế tác dụng của probiotic ...................................................................4
1.1.4. Chức năng của probiotic ............................................................................6
1.2. TỔNG QUAN VỀ LACTOBACILLUS ............................................................7
1.2.1. Vị trí của Lactobacillus trong hệ thống phân loại .....................................7
1.2.2. Phân loại trong chi Lactobacillus ..............................................................9
1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT ....10
1.3.1. Các phƣơng pháp định danh vi sinh vật ..................................................10
1.3.2. Các phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật .................................................12
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ........................................................13
1.5. MỘT SỐ CHẾ PHẨM PROBIOTIC ĐA CHỦNG TRÊN THỊ TRƢỜNG ..15
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................16
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................16
2.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ............................................................................16
2.3. MƠI TRƢỜNG, HĨA CHẤT ........................................................................16
2.3.1. Mơi trƣờng ...............................................................................................16
2.3.2. Hóa chất ...................................................................................................17
2.4. TRANG THIẾT BỊ DỤNG CỤ ......................................................................17
2.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................18


ii

2.5.1. Xây dựng qui trình phân tích ...................................................................18
2.5.2. Thẩm định qui trình phân tích ..................................................................25
2.5.3. Áp dụng qui trình phân tích chế phẩm probiotic trên thị trƣờng .............28
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................30
3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG QUI TRÌNH ...........................................................30

3.1.1. Khảo sát để tìm mơi trƣờng phân lập, định danh và định lƣợng chọn lọc cho
các vi khuẩn.........................................................................................................30
3.1.2. Qui trình phân tích L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus ..........................33
3.1.3. Qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh .............................................35
3.2. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH ...................................36
3.2.1. Thẩm định qui trình định danh L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus...........36
3.2.2. Thẩm định qui trình định lƣợng L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus .........38
3.2.3. Kết quả thẩm định qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh ...............46
3.3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM PROBIOTIC TRÊN THỊ TRƢỜNG 48
3.3.1. Kết quả phân tích chế phẩm probiotic chứa L.acidophilus .....................48
3.3.2. Kết quả phân tích chế phẩm probiotic chứa L.kefir .................................50
3.3.3. Kết quả phân tích chế phẩm probiotic chứa L.rhamnosus ......................51
3.3.4. Kết quả thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh ...............................................52
Chƣơng 4. BÀN LUẬN ...........................................................................................53
4.1. XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN TÍCH .......................................................53
4.1.1. Khảo sát để tìm mơi trƣờng phân lập, định danh và định lƣợng chọn lọc cho
các vi khuẩn L.acidophillus, L.kefir, L.rhamnosus..................................................53
4.1.2. Qui trình phân tích L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus .........................54
4.1.3. Qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh .............................................56
4.2. THẨM ĐỊNH QUI TRÌNH PHÂN TÍCH ......................................................57
4.2.1. Thẩm định qui trình định danh L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus .......57
4.2.2. Thẩm định qui trình định lƣợng L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus .....58
4.2.3. Thẩm định qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh ...................................61


iii

4.3. ÁP DỤNG QUI TRÌNH ĐÃ THẨM ĐỊNH PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM
PROBIOTIC TRÊN THỊ TRƢỜNG .....................................................................62
4.3.1. Chế phẩm probiotic chứa L.acidophilus ..................................................62

4.3.2. Chế phẩm probiotic chứa L.kefir .............................................................63
4.3.3. Chế phẩm probiotic chứa L.rhamnosus ...................................................63
4.3.4. Thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh ...........................................................64
KẾT LUẬN ..............................................................................................................66
KIẾN NGHỊ .............................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết

Từ nguyên

Ý nghĩa

tắt
a.pro

acid propionic

Acid propionic

ADN

Acid deoxyribose nucleic

Vật chất di truyền cấp độ phân tử


BA

Blood agar

Môi trƣờng thạch máu

Ba.sub

Bacillus subtilis

Loài Bacillus subtilis

Ba.coa

Bacillus coagulans

Loài Bacillus coagulans

Bi.bifi

Bifidobacterium bifidum

Loài Bifidobacterium bifidum

Bi.bre

Bifidobacterium breve

Loài Bifidobacterium breve


Bi.lac

Bifidobacterium lactis

Loài Bifidobacterium lactis

Bi.long

Bifidobacterium longum

Loài Bifidobacterium longum

BE

Bile esculin

Muối mật bile esculin

CA

Columbia agar

Môi trƣờng thạch columbia

C.

Candida

Chi Candida


chloram

chloramphenicol

Kháng sinh chloramphenicol

cfu

Colony forming unit

Đơn vị khuẩn lạc

đvcp

Đơn vị chế phẩm

Đơn vị chế phẩm

E.

Escherichia

Chi Escherichia

En.

Enterococcus

Chi Enterococcus


ELISA

Enzyme-linked immuno sorbent

Kỹ thuật sinh hóa phát hiện kháng

assay

nguyên, kháng thể

EMB

Eosin methylene blue

Môi trƣờng chọn lọc E.coli

gen

gentamycin

Kháng sinh gentamycin

kan

kanamycin

Kháng sinh kanamycin

KIA


Kligler’s iron agar

Môi trƣờng thử khả năng lên men
glucose, lactose


v

KN

Kháng nguyên

Nguyên nhân gây ra sự kháng

KT

Kháng thể

Chất gắn đặc hiệu với kháng nguyên

L.

Lactobacillus

Chi Lactobacillus

L.a

Lactobacillus acidophilus


Loài Lactobacillus acidophilus

L.c

Lactobacillus casei

Loài Lactobacillus casei

L.k

Lactobacillus kefir

Loài Lactobacillus kefir

L.p

Lactobacillus plantarum

Loài Lactobacillus plantarum

L.r

Lactobacillus rhamnosus

Loài Lactobacillus rhamnosus

LC

Level critical


Lƣợng vi sinh vật thấp nhất trong
mẫu cho 50% kết quả dƣơng tính

LOD

Limit of detection

Giới hạn phát hiện

L-cys

L-cystein

Cystein đồng phân L

LOQ

Limit of quantification

Giới hạn định lƣợng

MPN

Most propable number

Phƣơng pháp ƣớc đốn số lƣợng vi
khuẩn

MRSA


De Mann-Rogosa-Sharpe agar

Mơi trƣờng thạch MRS

MR-VP

Methyl red, Voges-Proskauer

Thử nghiệm MR - VP

MSA

Mannitol salt agar

Môi trƣờng MSA

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi polymerase khuếch
đại ADN

ARN

Acid ribose nucleic

Vật chất di truyền cấp độ phân tử


S.

Staphylococcus

Chi Staphylococcus

Strep.the

Streptococcus thermophilus

Loài Streptococcus thermophilus

spp

species pluriel

Nhiều lồi

ssp.

sub species

Lồi phụ

SIM

H2S-indole-motility

Mơi trƣờng tìm H2S, indol, khả
năng di động


Van

vancomycin

Kháng sinh vancomycin


vi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Tóm tắt cơ chế tác dụng của các chủng probiotic ......................................6
Bảng 1.2. Bảng phân loại các nhóm vi khuẩn chi Lactobacillus .............................10
Bảng 2.1. Trang thiết bị dụng cụ sử dụng.................................................................17
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tìm môi trƣờng phân lập, định danh và định lƣợng chọn lọc
cho các vi khuẩn L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus ....................................................30
Bảng 3.2. Kết quả định danh L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus .............................34
Bảng 3.3. Kết quả định lƣợng L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus ............................35
Bảng 3.4. Kết quả thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh................................................35
Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm độ đặc hiệu, độ nhạy qui trình định danh
L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus ..............................................................................36
Bảng 3.6. Kết quả thử nghiệm giới hạn phát hiện qui trình định danh L.acidophilus,
L.kefir, L.rhamnosus ....................................................................................................37
Bảng 3.7. Kết quả thử nghiệm độ đặc hiệu, độ nhạy qui trình định lƣợng
L.acidophilus, L.kefir, L.rhamnosus ..............................................................................38
Bảng 3.8. Số khuẩn lạc đếm đƣợc ở 5 nồng độ vi khuẩn L.acidophilus ..................38
Bảng 3.9. Số khuẩn lạc đếm đƣợc ở 5 nồng độ vi khuẩn L.kefir..............................39
Bảng 3.10. Số khuẩn lạc đếm đƣợc ở 5 nồng độ vi khuẩn L.rhamnosus .................39
Bảng 3.11. Kết quả thử nghiệm độ lặp lại của qui trình định lƣợng L.acidophilus .40
Bảng 3.12. Kết quả thử nghiệm độ lặp lại của qui trình định lƣợng L.kefir.............41

Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm độ lặp lại của qui trình định lƣợng L.rhamnosus ..42
Bảng 3.14. Kết quả thử nghiệm độ đúng của qui trình định lƣợng L.acidophilus ...43
Bảng 3.15. Kết quả thử nghiệm độ đúng của qui trình định lƣợng L.kefir...............43
Bảng 3.16. Kết quả thử nghiệm độ đúng của qui trình định lƣợng L.rhamnosus ....44
Bảng 3.17. Kết quả giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng L.acidophilus .............44
Bảng 3.18. Kết quả xác định độ đặc hiệu, độ nhạy đối với qui trình thử giới hạn
C.albicans, E.coli, Salmonella, Shigella, S.aureus ..................................................46


vii

Bảng 3.19. Kết quả xác định giới hạn phát hiện C.albicans, E.coli, Salmonella,
Shigella, S.aureus .....................................................................................................47
Bảng 3.20. Kết quả định danh chế phẩm chứa L.acidophilus .................................49
Bảng 3.21. Kết quả định lƣợng chế phẩm chứa L.acidophilus................................49
Bảng 3.22. Kết quả định danh chế phẩm chứa L.kefir.............................................50
Bảng 3.23. Kết quả định lƣợng chế phẩm chứa L.kefir ...........................................50
Bảng 3.24. Kết quả định danh chế phẩm chứa L.rhamnosus ..................................51
Bảng 3.25. Kết quả định lƣợng chế phẩm chứa L.rhamnosus .................................52
Bảng 3.26. Kết quả thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh trong 10 mẫu chế phẩm .......52
Bảng 4.1. Điều kiện phân lập, định danh và định lƣợng chọn lọc cho ...........................54
L.acidophillus, L.kefir, L.rhamnosus ............................................................................54
Bảng 4.2. Cách tính độ đặc hiệu và độ nhạy của qui trình phân tích vi sinh vật ...............57
Bảng 4.3. Kiểm tra tính tƣơng thích, ý nghĩa các hệ số trong phƣơng trình hồi qui
...................................................................................................................................58


viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của vi khuẩn probiotic .....................................................5
Hình 1.2. Sơ đồ định danh trực khuẩn Gram dƣơng ..................................................8
Hình 1.3. Sự khác nhau của L.acidophilus với L.delbrueckii ssp. bulgaricus,
Bacillus lactis trên môi trƣờng MRS-fructose agar (a) và với L.paracasei trên
mơi trƣờng MRS-maltose agar (b) ...........................................................................9
Hình 1.4. Một số chế phẩm probiotic đa chủng .......................................................15
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc L.acidophilus trên mơi trƣờng MRSA-salicin 1% ..33
Hình 3.2. Hình dạng khuẩn lạc L.kefir trên mơi trƣờng MRSA pH 4,58 ................33
Hình 3.3. Hình dạng khuẩn lạc L.rhamnosus trên môi trƣờng MRSA-vancomycin
1mg/l, 430C................................................................................................................33


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ hàng nghìn năm về trƣớc, con ngƣời đã biết sử dụng các thực phẩm chứa vi sinh
vật sống có lợi nhƣ các sản phẩm lên men có nguồn gốc từ sữa, rau củ. Các vi sinh
vật này khi vào cơ thể sẽ sống cộng sinh ở ruột. Chúng giúp cơ thể chống lại các vi
khuẩn gây bệnh đƣờng ruột thông qua việc tiết ra acid hữu cơ và các chất kháng
khuẩn, ngồi ra chúng cịn giúp làm giảm cholesterol trong máu, tăng cƣờng khả
năng miễn dịch, kháng ung thƣ,… [20], [35], [36], [43]
Ngày nay, các công ty dƣợc trong và ngoài nƣớc đã nghiên cứu, sản xuất nhiều
dƣợc phẩm chứa lợi khuẩn đƣờng ruột với nhiều dạng bào chế khác nhau và đƣợc
gọi chung là chế phẩm probitic. Có nhiều chủng lợi khuẩn đƣờng ruột đƣợc biết đến
nhƣ: Lactobacillus, Bacillus, Bifidobacterium,… trong đó các vi khuẩn thuộc chi
Lactobacillus đƣợc ƣa chuộng làm probiotic. Một vấn đề khiến nhiều ngƣời quan
tâm là chất lƣợng những chế phẩm probiotic đang lƣu hành có đáp ứng đúng nhƣ
tiêu chuẩn mà nhà sản xuất công bố? Theo báo cáo mới nhất của Viện kiểm nghiệm,
tiêu chuẩn chất lƣợng của các chế phẩm probiotic đăng ký dƣới dạng thực phẩm
chức năng chỉ công bố một số chỉ tiêu chất lƣợng, mà không đề cập đến phƣơng

pháp để kiểm tra chỉ tiêu đó. Đối với chế phẩm đăng ký dạng thuốc thì tiêu chuẩn
chất lƣợng có đầy đủ cả chỉ tiêu chất lƣợng và phƣơng pháp thử. Tuy nhiên, ở một
số ít chế phẩm thuộc loại này tiêu chuẩn chất lƣợng đƣa ra phƣơng pháp định danh
vi sinh vật dựa trên một vài đặc điểm đơn giản, vì vậy, khơng thể kết luận chính xác
tên của vi sinh vật có trong chế phẩm. Nghiêm trọng hơn, tiêu chuẩn chất lƣợng của
một số chế phẩm cịn cơng bố sai cả về mặt đặc điểm hình thái của lồi vi sinh vật
có mặt trong chế phẩm đó, tức là có sự nhầm lẫn về mặt khoa học, dẫn đến sai lệch
kết quả định danh vi sinh vật [4].
Nƣớc ta vẫn chƣa có một bộ tiêu chuẩn chung nào để kiểm tra chất lƣợng chế phẩm
probiotic. Bên cạnh những chế phẩm probiotic đơn chủng cịn có những chế phẩm
probiotic đa chủng, nhƣng hầu nhƣ ở Việt Nam chƣa có đề tài nghiên cứu về kiểm
nghiệm chế phẩm probiotic đa chủng. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi thực hiện


2

đề tài: “Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số chế phẩm probiotic
có chứa chủng Lactobacillus”.
Mục tiêu tổng quát:
Xây dựng qui trình kiểm nghiệm chế phẩm probiotic dạng đa chủng có chứa chi
Lactobacillus bao gồm phân lập, định danh, định lƣợng và thử giới hạn vi sinh vật
gây bệnh.
Mục tiêu chuyên biệt:
1. Xây dựng qui trình phân lập, định danh vi khuẩn Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus kefir, Lactobacillus rhamnosus bằng phƣơng
pháp sinh hóa thƣờng qui.
2. Xây dựng qui trình định lƣợng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus kefir, Lactobacillus rhamnosus bằng phƣơng pháp đếm số
khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch chọn lọc.
3. Xây dựng qui trình thử giới hạn vi sinh vật gây bệnh gồm Candida

albicans, Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Staphylococcus aureus.
4. Thẩm định qui trình định danh, định lƣợng vi khuẩn Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus kefir, Lactobacillus rhamnosus và qui trình thử
giới hạn vi sinh vật gây bệnh.
5. Áp dụng qui trình đã thẩm định vào kiểm nghiệm một số chế phẩm
probiotic đa chủng chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus
kefir, Lactobacillus rhamnosus.
Ý nghĩa khoa học:
Góp phần xây dựng tiêu chuẩn quốc gia về kiểm nghiệm các chế phẩm
probiotic.
Ý nghĩa thực tiễn:
Ứng dụng qui trình trong kiểm nghiệm các chế phẩm probiotic đang lƣu hành trên
thị trƣờng, góp phần đảm bảo chất lƣợng cuộc sống cho ngƣời dân.


3

Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ PROBIOTIC
1.1.1. Lịch sử probiotic
Việc sử dụng vi sinh vật sống nhằm tăng cƣờng sức khỏe con ngƣời không phải là
mới. Hơn hàng nghìn năm về trƣớc, khi nhân loại chƣa tìm ra thuốc kháng sinh, con
ngƣời đã biết tiêu thụ các thực phẩm chứa vi sinh vật sống có lợi chẳng hạn nhƣ các
sản phẩm sữa lên men. Theo Ayurveda, một trong số những ngành y học lâu đời
nhất đã có ghi nhận vào những năm 2500 trƣớc công nguyên, sự tiêu thụ sữa chua
đã đƣợc ủng hộ để duy trì sức khỏe tốt. Các nhà khoa học đầu tiên nhƣ Hippocrates
và những ngƣời khác cũng chỉ định sữa lên men để trị các rối loạn về ruột và dạ dày
[36].
Một nghiên cứu lần đầu tiên về ảnh hƣởng có lợi của các vi khuẩn sinh acid lactic

có trong sữa lên men, đã đoạt giải Nobel vào năm 1907, do nhà sinh lý học ngƣời
Nga Elie Metchnikoff thực hiện. Metchnikoff đƣa ra giả thuyết rằng cuộc sống khoẻ
mạnh và lâu dài của nông dân Bungari là nhờ sử dụng các sản phẩm sữa lên men.
Ông tin rằng khi đƣợc tiêu thụ, các vi khuẩn lên men trong sản phẩm sẽ ảnh hƣởng
tốt đến hệ vi sinh vật ở ruột, giảm hoạt động của vi khuẩn độc, bằng cách ấy dẫn
đến tăng tuổi thọ [38]. Những thập niên sau đó, ơng tiếp tục nghiên cứu để chứng
minh vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus có khả năng kháng và làm giảm độc tố của
các vi sinh vật gây bệnh. Cũng vào thời điểm đó, Henry Tissier là một bác sĩ khoa
nhi ngƣời Pháp, đã quan sát thấy trong phân những đứa trẻ bị tiêu chảy có một số
lƣợng ít vi khuẩn lạ hình “Y” sau đó ơng đã định danh đƣợc vi khuẩn này thuộc chi
Bifidobacterium. Và điều ngạc nhiên là chúng lại chiếm số lƣợng lớn trong phân
những đứa trẻ khỏe mạnh. Tissier cho rằng những vi khuẩn này có khả năng chống
lại bệnh tiêu chảy, giúp khôi phục hệ thống lợi khuẩn đƣờng ruột [20], [28].
Những nghiên cứu về việc sử dụng vi khuẩn sinh acid lactic và tác dụng của chúng
đã đƣợc thực hiện tiếp tục trong suốt các thế kỷ qua. Từ các kiến thức có đƣợc về vi


4

khuẩn sinh acid lactic thông qua những nghiên cứu này, đã thúc đẩy mạnh mẽ
ngành công nghiệp sản xuất các sản phẩm sữa và dƣợc phẩm có chứa vi khuẩn sinh
acid lactic. Và đến ngày hơm nay, đã có một thị trƣờng sản phẩm probiotic khổng lồ
xuất hiện trên toàn thế giới.
1.1.2. Định nghĩa probiotic
Từ “probiotic” có nguồn gốc từ Hi Lạp, có nghĩa là “cho cuộc sống”. Tuy nhiên,
định nghĩa về probiotic đã phát triển nhiều theo thời gian. Metchnikoff và Tissier là
những ngƣời đầu tiên đƣa ra giả thuyết về probiotic. Lilly và Stillwell (1965) đã mô
tả probiotic là một hỗn hợp đƣợc tạo thành bởi vi sinh vật, giúp thúc đẩy sự phát
triển của sinh vật khác [20], [57].
Năm 1989, Fuller định nghĩa: “Probiotic là những vi sinh vật sống, mà khi sử dụng

chúng mang lại những lợi ích cho vật chủ bằng cách củng cố cân bằng hệ thống vi
sinh vật đƣờng ruột”. Đến nay, còn rất nhiều định nghĩa về probiotic nhƣng tất cả
các định nghĩa này đều có những điểm chung cơ bản sau: probiotic là những vi sinh
vật sống, khi đƣợc cung cấp với liều lƣợng thích hợp thì mang lại những hiệu quả
mong muốn [55].
1.1.3. Cơ chế tác dụng của probiotic
Vi khuẩn probiotic góp phần tạo nên hệ vi sinh vật đƣờng ruột lành mạnh. Chúng
kết bám vào biểu mô ruột với số lƣợng lớn và đa dạng, nhờ đó cải thiện chế độ bảo
vệ đối với vật chủ bằng cách: cạnh tranh với vi sinh vật gây bệnh về thức ăn và vị
trí kết bám, tổng hợp các chất kháng vi sinh vật gây bệnh, cảm ứng huy động tế bào
miễn dịch và hoạt động đáp ứng miễn dịch thích hợp [20], [39], [54].
Vi khuẩn probiotic có khả năng sống sót khi đi qua dạ dày, chịu đƣợc pH acid và
men tiêu hóa. Khi vào cơ thể chúng sẽ bám trên bề mặt biểu mô ruột để sinh trƣởng
đồng thời cạnh tranh vị trí bám dính và nguồn dinh dƣỡng với các vi sinh vật gây
bệnh. Vi khuẩn probiotic có khả năng bám dính cao với biểu mơ ruột, hạn chế q
trình đào thải ra ngồi, do vậy chúng có khả năng bảo vệ cơ thể. [54]
Một trong những cơ chế quan trọng của vi khuẩn probiotic là khả năng tổng hợp các
chất có hoạt tính đối kháng vi sinh vật gây bệnh. Chúng làm giảm pH môi trƣờng


5

thông qua việc tổng hợp các acid hữu cơ nhƣ acid lactic, acid acetic và acid
propionic. Ở pH của ruột, 8,4% acid acetic và 1,1% acid lactic ở dạng không phân
ly. Acid không phân ly đƣợc xem là chất đối kháng chống lại sự tăng trƣởng của
nhiều loại vi sinh vật gây bệnh và vi khuẩn gây thối. Những acid khơng phân ly có
thể thấm qua màng tế bào vi khuẩn, khi vào mơi trƣờng nội bào có pH cao, chúng
phân ly tạo ra ion hydrogen, ảnh hƣởng đến các hoạt động chức năng trao đổi chất
của tế bào nhƣ sự di chuyển cơ chất và sự phosphoryl hóa [39].
Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật có vú. Giữa hệ vi sinh vật ruột và hệ

thống miễn dịch có mối tƣơng tác đặc thù. Năng lực miễn dịch thể dịch và miễn
dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đƣờng ruột bị ảnh hƣởng rất lớn bởi sự cân bằng
của hệ vi sinh vật ruột [29]. Thông qua tƣơng tác với hệ thống miễn dịch ruột, các
probiotic có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ động và chủ động hoặc cả hai. Tác
động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của probiotic phụ thuộc vào từng loài vi khuẩn
probiotic. Tuy nhiên, cơ chế tác động của probiotic đối với việc nâng cao chức năng
miễn dịch vẫn còn chƣa đƣợc hiểu biết đầy đủ [20].

Hình 1.1. Cơ chế tác dụng của vi khuẩn probiotic [39]


6

Bảng 1.1. Tóm tắt cơ chế tác dụng của các chủng probiotic [31]
Vi khuẩn sinh acid lactic

Vi khuẩn Bacillus

Nấm men

- Sinh bacteriocin.

Sinh enzym phân giải - Sinh acid hữu cơ,

- Cạnh tranh vị trí bám.

các cơ chất nhƣ tinh kích thích tiêu hố.

- Sinh các peptid, kích thích hệ


bột, cellulose; kích - Hấp thu chất độc và

thống miễn dịch của vật chủ.

thích tiêu hố.

cạnh tranh dinh dƣỡng,

- Cạnh tranh dinh dƣỡng và vị

vị trí bám trên biểu mơ

trí bám vào biểu mô.

với vi sinh vật gây

- Sinh các acid hữu cơ, tăng

bệnh.

hiệu quả hấp thu chất dinh
dƣỡng.
1.1.4. Chức năng của probiotic
Hiện tƣợng khơng có khả năng tiêu hóa lactose đƣợc tìm thấy khắp trên thế giới ở
những ngƣời cơ thể khơng có enzym lactase để thủy phân lactose. Triệu chứng của
bệnh thƣờng gặp là đầy hơi, tiêu chảy. Theo kết quả nghiên cứu của Rasstal và
cộng sự cho thấy 2000 vi khuẩn Lactobacillus và Bifidobacterium làm tăng enzym
lactase trong ruột non, giúp phân giải lactose [40].
Giảm thiểu tiêu chảy do kháng sinh. Khoảng 20% ngƣời dùng thuốc kháng sinh,
đặc biệt là clindamycin, cephalosporin, penicillin bị mắc bệnh tiêu chảy. Nguyên

nhân là do kháng sinh sẽ giết các vi sinh vật đƣờng ruột làm mất cân bằng hệ vi
sinh đƣờng ruột. Clostridium difficile và Klebsiella oxytoca là những tác nhân gây
bệnh chính, khi hệ vi sinh đƣờng ruột ổn định chúng vẫn tồn tại với số lƣợng ít
trong ruột, khi mất cân bằng thì chúng tăng lên nhanh và giải phóng độc tố gây
bệnh tiêu chảy và viêm ruột. Có nhiều nghiên cứu sử dụng probiotic để chữa bệnh
tiêu chảy do kháng sinh. Kết quả cho thấy chủng Saccharomyces boulardii,
L.rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt, chúng làm giảm
đáng kể thời gian phục hồi khi mắc bệnh và sử dụng L. acidophilus để trị bệnh tiêu
chảy do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin thì mang lại hiệu quả [33], [34].


7

Vi khuẩn probiotic có tác dụng kích thích hệ miễn dịch. Nhiều vi khuẩn
Lactobacillus có khả năng hoạt hóa đại thực bào, kích thích hình thành bạch cầu
trung tính, kích thích tế bào tua làm tăng khả năng tổng hợp IgA và interferon
gamma [29].
Ngồi ra, vi khuẩn probiotic cịn có tác dụng ngăn ngừa ung thƣ. Một số loài vi
khuẩn gây bệnh đƣờng ruột có khả năng tiết ra các enzym nhƣ glycosidase,
azoreductase, nitroreductase and -glucoronidase, chúng sẽ hoạt hóa các chất tiền
ung thƣ thành các chất ung thƣ hoạt hóa. Những nghiên cứu trên ngƣời sử dụng
L.acidophilus hoặc L.casei làm giảm đáng kể hoạt động của các enzym trên [20],
[42].
1.2. TỔNG QUAN VỀ LACTOBACILLUS
1.2.1. Vị trí của Lactobacillus trong hệ thống phân loại
Theo hệ thống phân loại Bergey, Lactobacillus đƣợc phân loại nhƣ sau
Giới:

Bacteria


Ngành:

Firmicutes

Lớp:

Bacilli

Bộ:

Lactobacillales

Họ:

Lactobacillaceae

Chi:

Lactobacillus

Lactobacillus đến nay đƣợc xem là chi lớn nhất trong những chi của vi khuẩn sinh
acid lactic. Chi Lactobacillus là những vi khuẩn Gram dƣơng, không hình thành bào
tử, khơng kháng acid, khơng sinh catalase và không di động. [58], [59]. Về nhu cầu
oxy, chúng là những vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, thƣờng phát triển chậm trong khơng
khí. Về nhu cầu dinh dƣỡng, Lactobacillus cần chế độ dinh dƣỡng đặc biệt. Chúng
phát triển tốt trong môi trƣờng nhiều phức chất. Nhiệt độ phát triển tối ƣu của chúng
là 30-400C, nhƣng chúng cũng có thể sinh trƣởng trong phạm vi 5-530C. Chúng có
khả năng sống đƣợc trong mơi trƣờng có tính acid, pH tối ƣu cho sự phát triển là
5,5-5,8 nhƣng nhìn chung chúng có thể sinh trƣởng ở pH < 5 [20].



8

Bacillus spp.
Clostridium spp.
Corynebacterium spp.
Lactobacillus spp.
Mycobacterium spp.

Nhuộm bào tử
Mycobacterium smegmatis

-

+
Bacillus spp.
Clostridium spp.

+

Corynebacterium spp.
Lactobacillus spp.
Mycobacterium spp.

Nhuộm kháng acid

Corynebacterium spp.
Lactobacillus spp.

Catalase


-

+
Corynebacterium spp.

Lactobacillus spp.

Lên men glucose
Sinh acid

+
Lactobacillus casei

Lactobacillus casei
Lactobacillus delbrueckii

Sinh acid và hơi

Mannitol

Lactobacillus
ferrmenti

Lactobacillus delbrueckii

Hình 1.2. Sơ đồ định danh trực khuẩn Gram dƣơng [59]


9


1.2.2. Phân loại trong chi Lactobacillus
Việc định danh các loài Lactobacillus khác nhau có thể sử dụng mơ hình lên men
các carbohydrat, sự thủy phân arginin, hàm lƣợng peptidoglycan… Ngoài ra, nhằm
gia tăng sự chính xác trong việc phân loại vi khuẩn đến mức lồi, phƣơng pháp
phân tích so sánh trình tự gen 16S rARN của Lactobacillus với ngân hàng dữ liệu
gen thƣờng đƣợc sử dụng [20].
Theo khóa phân loại Bergey, Lactobacillus có khoảng 100 lồi khác nhau. Ngƣời ta
có thể dựa trên các sản phẩm cuối cùng của quá trình biến dƣỡng để phân loại các
lồi Lactobacillus thành 2 loại: lên men đồng hình và lên men dị hình. Các lồi
thuộc nhóm lên men đồng hình tạo ra 85% acid lactic từ glucose, trong khi các loài
lên men dị hình chỉ tạo ra 50% acid lactic và một lƣợng đáng kể carbon dioxid,
ethanol. Các loài Lactobacillus lên men đồng hình đáng chú ý gồm: Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus leichmannii,… Các lồi lên
men dị hình gồm: Lactobacillus brevus, Lactobacillus casei, Lactobacillus
fermentum,… Mặc dù tất cả các loài Lactobacillus đều tạo ra acid lactic nhƣng các
lồi khác nhau có thể tạo ra các acid lactic khác nhau về đồng phân quang học. Một
số loài tạo ra acid lactic L(+) gồm: L.salivarius, L.casei,… Một số loài khác tạo acid
lactic D(-) nhƣ: L.bulgaricus, L.jensenii,… Ngồi ra, các lồi nhƣ: L.acidophilus,
L.helveticus,… có thể tạo hỗn hợp các acid lactic D(-) và L(+) [59].

Hình 1.3. Sự khác nhau của L.acidophilus với L.delbrueckii ssp. bulgaricus,
Bacillus lactis trên môi trƣờng MRS-fructose agar (a) và với L.paracasei trên
môi trƣờng MRS-maltose agar (b) [49]


10

Một tiêu chuẩn khác để nhận diện các loài Lactobacillus là khả năng sinh khí từ các
nguồn carbon gồm: glucose và gluconat. Ngƣời ta nhận thấy có một sự đa dạng lớn

giữa nhiều loài Lactobacillus về khả năng lên men các đƣờng pentose nhƣ: ribose
và xylose. Điều đó đƣợc thể hiện qua bảng 1.2
Bảng 1.2. Bảng phân loại các nhóm vi khuẩn chi Lactobacillus [20]
Nhóm I

Nhóm II

Nhóm III

(lên men đồng

(lên men dị

(lên men dị

hình bắt buộc)

hình tùy ý)

hình bắt buộc)

Lên men pentose

-

+

+

Sinh CO2 từ glucose


-

-

+

Sinh CO2 từ gluconat

-

+

+

FDP aldolase

+

+

-

Phosphoketolase

-

+

+


L.acidophilus

L.casei

L.brevis

L.delbrueckii

L.curvatus

L.buchneri

L.helveticus

L.plantarum

L.fermentum

L.salivarius

L.sake

L.reuteri

Đặc điểm

Các lồi trong nhóm

1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT

1.3.1. Các phƣơng pháp định danh vi sinh vật
1.3.1.1. Phương pháp dựa trên kiểu hình và các phản ứng sinh hóa truyền thống [3]
Để xác định vi sinh vật dựa trên đặc điểm kiểu hình thì những vi sinh vật cần phát
hiện trong mẫu phải có những đặc điểm đặc trƣng. Trong một số trƣờng hợp, chỉ
cần quan sát một đặc điểm là có thể kết luận đƣợc sự hiện diện của vi sinh vật.
Trong những trƣờng hợp khác, cần thiết phải xác định lần lƣợt nhiều đặc điểm khác
nhau để phân biệt các vi sinh vật mục tiêu với các vi sinh vật khác. Việc xác định rõ
ràng một vi sinh vật trên cơ sở kiểu hình là cơng việc khó khăn bởi vì ngay cả
những vi sinh vật có mối quan hệ họ hàng xa cũng có thể có kiểu hình tƣơng tự ở


11

một số đặc điểm. Vì vậy, phải kết hợp giữa đặc điểm kiểu hình và các phản ứng
sinh hóa của vi khuẩn mới có thể kết luận tƣơng đối chính xác đƣợc.
Đặc điểm kiểu hình thƣờng áp dụng đó là quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào,
thơng qua việc nuôi cấy trên môi trƣờng đĩa thạch và các phƣơng pháp nhuộm vi
khuẩn.
Các phản ứng sinh hóa có thể kể đến nhƣ: khả năng lên men đƣờng, khả năng sinh
hơi, sự thủy phân tinh bột, hình thành indol, phản ứng catalase, oxydase, hình thành
H2S, sự khử hóa nitrat, MR-VP,...
1.3.1.2. Phương pháp dựa trên tính miễn dịch [13]
Nguyên tắc phản ứng miễn dịch: phản ứng kết hợp giữa một tế bào (kháng nguyên)
với một kháng thể đặc hiệu của nó, loại kháng thể này đƣợc đánh dấu, phản ứng
dƣơng tính khi có sự ngƣng kết kháng nguyên - kháng thể.
Một số kỹ thuật điển hình:
- Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang: kháng thể đƣợc gắn huỳnh quang để phát hiện vi
sinh vật.
- Kỹ thuật ELISA (phƣơng pháp hấp phụ miễn dịch dùng enzym): kháng thể đơn
dòng đƣợc phủ trên đĩa giếng microplate, nếu có kháng nguyên mục tiêu (vi sinh

vật) sẽ đƣợc giữ lại trên giếng, dùng một kháng thể thứ cấp có gắn enzym tạo nên
một dạng kẹp “sandwich” (KT-KN-KT), phát hiện nhờ cho vào một cơ chất đặc
hiệu của enzym, enzym sẽ xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo sản phẩm có
màu hoặc phát sáng.
1.3.1.3. Phương pháp dựa trên kỹ thuật phân tích acid nucleic [15]
Phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để phân tích acid nucleic là PCR do nhà khoa
học Kary Mullis phát minh. Trƣớc tiên ngƣời ta phải sử dụng các kỹ thuật tách chiết
để thu nhận đƣợc các phân tử acid nucleic sạch ở trạng thái nguyên vẹn tối đa,
không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học rồi tiến hành định tính bằng
phƣơng pháp PCR. PCR trải qua ba giai đoạn khác biệt nhau đƣợc điều hòa bởi
nhiệt độ:


12

- Giai đoạn 1: chuỗi xoắn kép ADN khuôn bị biến tính, tách khỏi nhau thành hai
chuỗi đơn.
- Giai đoạn 2: nhiệt độ đƣợc hạ xuống về nhiệt độ gắn mồi cho phép các đoạn
oligonucleotid gắn với sợi ADN khuôn. Trong quá trình gắn mồi, enzym ADN
polymerase bền với nhiệt sẽ đƣợc hoạt hóa và bắt đầu giai đoạn kéo dài mồi.
- Giai đoạn 3: nhiệt độ đƣợc nâng lên đến nhiệt độ tối ƣu của enzym xúc tác cho quá
trình kéo dài.
Kỹ thuật PCR sẽ khuếch đại thành một số lƣợng lớn các bản sao của trình tự ADN
mục tiêu và có thể nhận biết (khi nhuộm bằng ethidium bromid) qua quá trình điện
di trên gel. Để thực hiện đƣợc kỹ thuật này phải có thơng tin tối thiểu về trình tự của
ADN mục tiêu đủ để tạo ra các mồi chuyên biệt.
1.3.2. Các phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật
1.3.2.1. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi
[3]
Số lƣợng vi sinh vật trong mẫu có thể đƣợc xác định bằng cách đếm trực tiếp trên

kính hiển vi. Phƣơng pháp đếm trực tiếp bằng kính hiển vi cho phép ƣớc lƣợng
nhanh chóng số lƣợng vi sinh vật có trong mẫu. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có
những điểm hạn chế nhất định nhƣ không phân biệt đƣợc số lƣợng tế bào sống và số
lƣợng tế bào chết, dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các mảnh vỡ nhỏ của mẫu và
không cho phép tìm hiểu các đặc điểm khác của vi sinh vật đƣợc quan sát.
1.3.2.2. Các kỹ thuật định lượng vi sinh vật trong mẫu bằng phương pháp ni cấy
Có hai cách để xác định số lƣợng vi khuẩn bằng phƣơng pháp nuôi cấy: phƣơng
pháp đếm khuẩn lạc và phƣơng pháp ƣớc đoán số lƣợng vi khuẩn MPN. Định lƣợng
vi khuẩn trong mẫu bằng phƣơng pháp nuôi cấy đều yêu cầu các tế bào vi khuẩn
phải đƣợc tách rời nhau, qua q trình ni cấy các tế bào này phát triển thành các
dòng riêng biệt hay còn gọi là khuẩn lạc. Các qui trình định lƣợng bằng phƣơng
pháp ni cấy nhằm chọn lọc một hay nhiều nhóm vi khuẩn nhất định nào đó, mức
độ chọn lọc phụ thuộc vào từng qui trình cụ thể [3].


13

Phương pháp đếm khuẩn lạc [13]
Cho phép xác định số vi sinh vật sống còn hiện diện trong mẫu. Nguyên tắc là mỗi
khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng thạch sau thời gian ni cấy đƣợc coi là có nguồn
gốc từ một tế bào vi sinh vật sống ban đầu. Mẫu đƣợc pha lỗng bậc mƣời liên tiếp
sao cho có độ pha lỗng với mật độ tế bào thích hợp để các khuẩn lạc mọc riêng rẽ
và có số lƣợng đủ lớn để tránh sai số. Thƣờng số khuẩn lạc tối ƣu là từ 25250cfu/đĩa.
Phương pháp ước đoán số lượng vi sinh bằng kỹ thuật MPN [3]
Phƣơng pháp MPN là phƣơng pháp có thể thay thế phƣơng pháp đếm khuẩn lạc để
xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu, phƣơng pháp này đƣợc dựa trên nguyên tắc
xác suất thống kê sự phân bố vi sinh vật trong các độ pha lỗng khác nhau của mẫu.
Mỗi độ pha lỗng đƣợc ni cấy lặp lại nhiều lần trong các môi trƣờng lỏng đã
đƣợc chọn, thông thƣờng phải cấy lặp lại từ 3-10 lần tại mỗi nồng độ pha loãng.
Các độ pha loãng đƣợc tiến hành sao cho trong các lần lặp lại có một số lần cho dấu

hiệu dƣơng tính và một số lần cho dấu hiệu âm tính. Số lần lặp lại cho dấu hiệu
dƣơng tính và âm tính đƣợc ghi nhận để đối chiếu với bảng thống kê sẽ đƣợc giá trị
ƣớc đoán số lƣợng vi sinh vật trong mẫu. Qui trình MPN cho giá trị số lƣợng vi sinh
vật trong mẫu có ý nghĩa thống kê theo xác suất phân bố vi sinh vật trong mẫu khi
sử dụng một số lần lặp lại, vì thế khoảng tin cậy là rất lớn. Phƣơng pháp MPN để
định lƣợng vi sinh vật cho đến nay đã có nhiều cải tiến cho phép tiến hành qui trình
dễ dàng và tốn ít sức lao động hơn và cho giá trị chính xác cao hơn.
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN
Năm 2009, Nguyễn Thị Bích Thùy tiến hành phân lập vi khuẩn lactic có nguồn gốc
từ thực phẩm và dƣợc phẩm mang hoạt tính probiotic. Kết quả đã phân lập đƣợc 20
chủng thuộc giống Lactobacillus và 2 chủng thuộc giống Lactococcus.
Năm 2008, Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phƣơng, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh,
Nguyễn Thị Giang nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic
phân lập trên địa bàn thành phố Hà Nội, đăng trên tạp chí Khoa học Đại Học Quốc
Gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ số 24.


14

Năm 2008, Nguyễn Thị Nghi Trung nghiên cứu định danh vi khuẩn Lactobacillus
acidophilus bằng phƣơng pháp sinh học phân tử. Kết quả giải trình tự các chủng vi
khuẩn phân lập đƣợc từ các chế phẩm trên thị trƣờng có sự tƣơng đồng với gen
chuẩn của L.acidophilus ATCC 4356 là 97%.
Năm 2007, Nguyễn Văn Liêm nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền vào việc
định danh một số vi khuẩn thuộc chi Lacbacillus đƣợc dùng làm probiotic. Kết quả
cho thấy phƣơng pháp phân tích đa hình ADN cho kết quả tƣơng tự nhƣ việc định
danh bằng KIT API 50 CHL, nhƣng nhanh hơn.
Năm 2012, M.M.Locascio, R.Alesso, V.I.Morata và S.N.González nghiên cứu môi
trƣờng để phân biệt Lactobacillus casei và Lactobacillus acidophilus trong dạng bột
khô chứa hỗn hợp hai vi khuẩn đƣợc đăng trên tạp chí Medium for Differential

Enumeration.
Năm 2012, Reza Karimi và cộng sự nghiên cứu phƣơng pháp đếm chọn lọc một số
vi khuẩn probiotic có trong phơ mai, kết quả cho thấy có thể đếm chọn lọc các vi
khuẩn probiotic với nồng độ bằng nhau trong một hỗn hợp vi khuẩn, nghiên cứu
đƣợc đăng trên tạp chí Food Microbiology.
Năm 2011, Rabia Ashraf, Nagendra P. Shah nghiên cứu đếm chọn lọc các vi khuẩn
Lactobacillus

delbrueckii

subsp.

bulgaricus,

Streptococcus

thermophilus,

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei và Bifidobacterium spp. có trong sữa
lên men, nghiên cứu đƣợc đăng trên tạp chí International Journal of Food
Microbiology 149.
Năm 2004, A.Talwalkar và K.Kailasapathy có nghiên cứu về việc so sánh môi
trƣờng chọn lọc cho hỗn hợp các vi khuẩn Lactobacillus acidophilus,
Bifidobacterium spp. và Lactobacillus casei có trong sữa lên men, đƣợc đăng trên
tạp chí International Dairy Journal 14.