0016 xây dựng quy trình định danh định lượng vi khuẩn lacidophilus và bsubtilis trong một số chế phẩm đang lưu hành tại cần thơ
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (62.08 MB, 102 trang )
(wroxr› Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
BỘ Y TÉ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CÀN THƠ
ĐÈ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CÁP TRƯỜNG
XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH, ĐỊNH LƯỢNG VI KHUÁN
L.ACIDOPHILUS VA B.SUBTILIS TRONG MOT SO CHE PHAM
DANG LUU HANH TAI CAN THO
Chi nhiệm đề tài: ThS. DƯƠNG THỊ TRÚC LY
Cán bộ tham gia: ThS. LỮ THIỆN PHÚC
CHỦ TỊCH HOI DONG
/4 wl
—
yes ,
CHỦ NHIỆM ĐÈ TÀI
—
jv yy Sv
|
\)ư ^“1
)
£
|
i
:
Jun
Can Tho— nam 2016
l
rĩ
ae
iy ‘Twe
i
4
(em
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
\
LỜI CAM
ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các sô liệu, kêt quả nêu trong đê tài là trung thực và chưa từng được ai công
bô trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả
Vode
Le
Dương Thị Trúc Ly
Qsrumeus
\ (
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
MUC LUC
Lời cam đoan
TMục lỤC. . . . . . . . .
5c =5 << se 9 S095 00055008599890888908604.9689990009000006089006006600505000500 i
Phan 1. Tom tat dé tai.......ssssccsscssccsssccsssssssnssssscssssssssnessssennsesecsnessnesenscansesens iv
Phần 2. Tồn văn cơng trình nghiên cứu...........................--«-s-=es
21111 2017277...
..................
Danh mục DANQ.......sccceeeeseessesseseeseesecsesseesssassecsessdessesseeseseeessesesezenteneseseeaeans
Danh muc hin... ......................
Vill
x
xI
57908)(9527.10077.................... 1
Chương 1 TÔNG QUAN TÀI LIỆU .....................
.--- -¿- 5-55 5<+c+2x+eeesersereerred 3
1.1. TÔNG QUAN VỀ PROBIOTIC..............................----c2ccvvvvvereeerrrree 3
1.1.1. Định nghĩa prObiOfC ..........................---- --- 52252 + x28 2 38558111..ee 3
1.1.2. Các vi sinh vật được sử dụng làm probiotiC .........................
-.- --------- + 3
1.1.3. Cơ chế tác dụng của probiotiC..................--¿--s- ccxccs+xezrerrrserkekrkserrerkees 3
1.1.4. Tính an tồn của các pFOIOIC.......................
-‹-- «s1 vn ng ng giết 4
1.1.5. Tác dụng của prOiOfHC.......................---- + +
tt 1141184818. 1 xx 4
1.1.6. Các tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật probiotic............. 7 |
1.1.7. Một số loại chế phâm probiotic trên thị trường .......................-----«- 9
1.2. TONG QUAN VE L.ACIDOPHILUS VA B.SUBTILIS....................... 10
1.2.1. Lactobacillus acidODÌÏÏHS........................
se co xe như ngàng nhờ 10
1.2.2. Bacillus stiÏiS..................o-. --c
11
1.3. TƠNG QUAN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VI SINH VẬT........... 13
1.3.1. Phương pháp định danh..............................- --- «5c < ST
series 13
‹- «=5 Series 14
1.3.2. Phương pháp định lượng...........................-.
1.3.3. Phương pháp thử nghiệm độ nhạy cảm của kháng sinh ................. 15
1.3.4. Phương pháp khảo sát khả năng khang vi khuẩn gây bệnh............ 17
1.4. TONG QUAN THAM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
CC
Tải liệu phục vụ họ tập, nghiên cứu khoa học
ũN
h
OWL SINE, VAT vecsecccsssccsssssscscsssseseessaseusnssssssenssseseesnnesesvvnseseenvnnssesunenseenee 18
1.4.1. Tham định quy trình định danh......................----s---©e+xssxxerxeerxeee 18
1.4.2. Thâm định quy trình định lượng ..........................---- ----+-c
1.5. MỘT SÓ NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN..........................---.------czeccccxe 19
Chương 2 ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 21
2.1. ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .......................--.--2-22 5++v++xv+reetrrrreres 21
2.2. ĐỊA ĐIÊM NGHIÊN CỨU...........................----22©c+vsserrerreerrrrrrke 21
2.3. TRANG THIET BI, DỤNG CỤ............................... t1 11111
21
2.4.1. MOE truOng a.‹ai.5.......
21
”w›
22
2.4. MƠI TRƯỜNG, HĨA CHẤTT................................------ccsccsreeererrrerrrie 21
no. sẽ a2...
2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................---252 ©s+x£2xet+s+xervezxee 22
2.5.1. Xây dựng quy trÌnh........................
. -- --- «v99 9 01 g0 00 1 re 22
2.5.2. Thâm định quy trình......................--:- St x2cx+reketrekrerrrerkerrrkrrvee 33
2.5.3. Áp dụng quy trình phân tích chế phẩm probiotic trên thị trường... 36
Chương 3 KÉT QUÁ NGHIÊN CỨU .........................---+ 5 +55++z+++ezzseeexerred 37
3.1. KÉT Q XÂY DỰNG QUY TRÌNH..........................-.----©5<©5s+xseccc+e 37
3.1.1. Quy trình phân tích ⁄.acidopliiÏus......................-csccằsceeeeeeeerrrrrrrrrreee 37
3.1.2. Quy trình phân tích B.sb#ilis .......................cccccccscecreeerierrerreerrie 40
3.1.3. Quy trình phát hiện vi khuẩn gây bệnh ............................-----««sec. 43
3.2. KÉT Q THẦM ĐỊNH QUY TRÌNH ...................... ơ.
43
3.2.1. Thõm nh quy trỡnh nh danh.......................... --s----+âc++x+c<+xexsxxerezxee 43
3.2.2. Thâm định quy trình định lượng .........................
-.-- + + s«ec++xeerexeee 44
3.2.3. Tham định quy trình phát hiện vi khuẩn gây bệnh......................... 49
3.3. KET QUA PHAN TICH CHE PHAM TREN THI TRUONG............. 51
3.3.1. Phân tich ché pham chtta L.acidophilUus...ccessecssscseesseeceeneeeee 51
3.3.2. Phân tich ché pham chita B.subtilis ......ccccscsssssescesseeseeceeseeeeeeteeeeeees 53
li
`
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
\ Vv
3.3.3. Phat hién vi khudn gay b@nh oo... csessssessssesseseeseeecseceesseeeneeeeeeeneesen 55
Chuong 4 BAN LUAN cccccsssessssssssessssnssssessnsestnessenssnsesnesssnsssnssunerents 56
4.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH...........................--.. 2-5555 56
....-- 56
4.1.1. Quy trình phân tích L.aciáophiiÏws..................
-- «<< << ssesiesesessesrrsee
4.1.2. Quy trình phân tích .swb/iÏis ..........................«eceeiheehihehreerrrreiesree 58
4.1.3. Quy trỡnh phỏt hin vi khun gõy bnh..........................-...-. --5-â-<-cô2 59
5-5-2 60
4.2. THÂM ĐỊNH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH............................--4.2.1. Thâm định quy trình định danh........................
«c5 csecxerereerrerrxiee 60
4.2.2. Thâm định quy trình định lượng ..............
--«- ........-.
5 <-c«+cecrercsrxsee 60
4.2.3. Thắm định quy trình phát hiện vi khuẩn gây bệnh ......................... 62
4.3. ÁP DỤNG QUY TRÌNH ĐÃ THÂM DINH PHAN TICH
CHE PHẨM TRÊN THỊ TRƯỜNG ...........................-..---
5-5 â2ô +eccxe+xerrererseee 63
4.3.1. Ch phm cha .aeidophilus......................-----cccccrreccerreccrrreevee 63
4.3.2. Ch phẩm chứa B.subiili......................... ¬
63
xe "
......-.
4.3.3. Phát hiện vi khuẩn gây bệnh .......................------
420067.) `01/.0-4i56c
ạ..........,Ô
Tài liệu tham khảo
Phụ lục
ill
64
65
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
V
PHAN 1
TOM TAT DE TAI
Gidi thiéu
Trong những năm gần đây, các chế phẩm thực phẩm chức năng và dược
phẩm chứa probiotic ra đời ngày càng nhiều và nhận được sự quan tâm lớn từ
cả người tiêu dùng lẫn các nhà khoa học. Trước đây đã có nhiều cơng trình
nghiên cứu trong và ngoài nước về các chế phẩm probiotic thuộc nhiều lĩnh
vực như định danh, định lượng các chủng probiotic, khảo sát các đặc điểm có
lợi, tính an tồn cũng như hiệu quả lâm sàng của các chủng này. Tuy nhiên đa
phần các nghiên cứu còn riêng rẽ, thiếu sự nhất quán trong cách đánh giá. Đặc
biệt ở Việt Nam chưa có tiêu chuẩn chung quy định về việc kiểm tra chất
lượng dược phẩm cũng như thực phẩm chức năng chứa các chủng probiotic,
gây nhiều khó khăn trong quản lý và đảm bảo chất lượng sản phẩm.
Mục đích thực hiện đề tài
Nhằm
xây dựng quy trình kiểm nghiệm chung cho các chế phẩm
chứa
L.acidophilus va B.subtilis dang don chủng.
Muc tiéu nghién ciru
Xây dựng và thẩm định quy trình phân lập, định danh, định lượng vi khuẩn
L.acidophilus va B.subtilis va phat hién một số vi khuẩn gây bệnh bằng các
phương pháp thường quy. Khảo sát và xây dựng phương pháp đánh giá các
đặc điểm có lợi của 2 lồi L.acidophilus và B.subtilis. Áp dụng quy trình đã
thẩm
định
kiểm
nghiệm
một
số
chế
phẩm
probiotic
chứa
vi
khuẩn
L.acidophilus va B.subtilis dang luu hành.
|
Đối tượng nghiên cứu
Vi khudn L.acidophilus, B.subiilis và các vì khuẩn gay bénh E.coli,
Shigella, Salmonella, S.aureus va P.aeruginosa.
iv
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
V1
Thiết kế nghiên cứu
Mơ hình nghiên cứu thực nghiệm trong phịng thí nghiệm kết hợp xử lý số
liệu bằng thống kê.
Cách thức tiến hành
Phân lập vi khuẩn trên môi trường thích hợp, chọn khuẩn lạc đặc trưng, giữ
chủng, tiến hành định danh bằng nhuộm Gram, nhuộm bào tử, nhuộm kháng
acid và các phản ứng sinh hóa. Định lượng bằng cách cấy trải dich khuẩn trên
môi trường chọn lọc và đếm số khuẩn lạc. Khảo sát khả năng đề kháng kháng
sinh và kháng vi sinh vật gây bệnh bằng phương pháp khuếch tán qua giếng
và khuếch tán qua đĩa giấy theo hướng dẫn của CLSI. Phát hiện vi sinh vật
gây bệnh bằng cách nuôi cấy trên đĩa thạch môi trường phù hợp và một số
phản ứng sinh hóa. Các quy trình định danh, định lượng và phát hiện vi sinh
vật gây bệnh được thâm định các chỉ tiêu độ đặc hiệu, độ nhạy, tính tuyến
tính, độ lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng theo quy
định của Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia và Dược điển
Mỹ 34. Lấy mẫu một số thuốc đang lưu hành, xử lý mẫu và kiểm nghiệm theo
quy trình đã xây dựng.
Kết quả nghiên cứu
1. Xây
dựng được quy trình phân lập, định danh, định lượng vi khuẩn
L.acidophilus va B.subtilis trong chế phẩm đơn chủng và phát hiện một số vi
khuẩn gây bệnh gồm E.coli, Shigella, Salmonella, S.aureus va P.aeruginosa
bằng các phương pháp truyền thống. Các quy trình được thâm định đều đạt
_ các chỉ tiêu theo quy định.
2. Khảo sát được khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh và khả năng
kháng kháng sinh của vi khudn L.acidophilus va B.subtilis.
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
n
{
3. Ứng dụng quy trình kiểm nghiệm 8 mau ché pham chita L. acidophilus va
8 mẫu chế phẩm chứa B.subtilis dang don ching dang hni hanh, két qua ca 16
mẫu đều đạt về định danh, định lượng và khơng có vỉ khuẩn gây bệnh.
Kết luận
Sau thời gian thực hiện, đề tài đã hoàn thành các mục tiêu đặt ra. Các quy
trình kiểm nghiệm chế phẩm chita L.acidophilus va B.subtilis dang don ching
được thầm định đều đạt theo tiêu chuẩn quốc tế. Do đó các quy trình này hồn
tồn có thể được đưa vào tiêu chuẩn quốc
gia, góp phần đảm bảo chất lượng
các chế phẩm chứa probiotic đang lưu hành trên thị trường.
VI
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
yn | \
PHAN 2
TOAN VAN CONG TRINH NGHIEN CUU
Vii
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Ỉ X
DANH MUC CHU VIET TAT
Từ viết tắt
AND
Từ nguyên
Y nghĩa
Acid deoxyribose nucleic
Vat chat di truyén phan ttr
Bacillus
Chi Bacillus
cfu
Colony form unit
Đơn vị hình thành khuân lạc
CV
Coefficient of variation
Hệ số biên thiên
B.
E.
Escherichia
Chi Escherichia
EMB
Eosin methylene blue agar _| Mi truéng chon loc E.coli
GRAS
Generally recognized as safe | Nhém vi sinh vat dugc xem như
an toan
Ig
KIA
Immunoglobulin
Globulin mién dich
Kligler’s iron agar
Môi trường thử lên men glucose,
lactose, sinh gas, H2S
L.
Lactobacillus
Chi Lactobacillus
LAB
Lactic acid bacteria
Vi khuan sinh acid lactic
LOD
Limit of detection
Gidi han phat hién
LOQ
Limit of quantification
Giới hạn định lượng
MC
MacConkey agar
Môi trường Mac Conkey
MPN
Most propable number
Phương pháp sô tôi khả
MRSA
De Mann-Rogosa-Sharpe
Môi trường thạch phân lập
agar
Lactobacillus
MSA
Mannitol salt agar
Môi trường thạch mảnnitol muỗi
NA
Nutrient agar
Môi trường thạch dinh dưỡng
NB
Nutrient broth
Môi trường dinh dưỡng lỏng
P.
Pseudomonas
Chi Pseudomonas
RSD
Relative standard deviation
vill
| Độ lệch chuẩn tương đôi
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
S.
Staphylococcus
Chi Staphylococcus
SD
Standard deviation
Độ lệch chuẩn
SIM
HạS-Indole-Motility
Môi trường thử khả năng sinh
H;S, indol, di động
SS
Shgella-Salmonella agar
Môi trường phân lap Shigella,
Salmonella
TSA
VP
Tryptic soy agar
Môi trường casein dau tương
Voges-Proskauer
Phản ứng tim acetoin tir glucose
ix
Qsrumeus
*4°A
A
+A
,
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
XỊ
r
DANH MỤC BẢNG
|
Bang 3.1. Két quả định danh vi khuẩn 7.acidophilus ...................... ...-...---- 37
Bang 3.2. Kết quả định lượng L.aeidophilus....................
555cc Scecxssveerce2 39
Bảng 3.3. Kết quả khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của Ƒ.acidophilus..... 39
Bang 3.4. Kết quả khả năng đề kháng kháng sinh của Ƒ.aeidophilus............ 39
Bảng 3.5. Kết quả định danh vi khuẩn Ö.szÖiiis..........................--5-cccccccccc 40
Bảng 3.6. Kết quả định lượng Ö.sb#ilis..................... _ằ..
42
Bảng 3.7. Kết quả khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh của B.sub/ilis............ 42
Bảng 3.8. Kết quả khả năng đề kháng kháng sinh của B.gubiilis.................. 42
Bảng 3.9. Kết quả xây dựng quy trình phát hiện vi khuẩn gây bệnh .............. 43
Bảng 3.10. Kết quả thử nghiệm độ đặc hiệu E.acidophilus và B.subtilis....... 43
Bảng 3.11. Kết quả giới hạn phát hiện đối với L.acidophilus và B.subtilis... 44
Bảng 3.12. Kết quả độ đặc hiệu, độ nhạy đối với L.acidophilus và B.subiilis
“H(-“..
Í.................
44
Bảng 3.13. Kết quả tính tuyến tính quy trình định luong L.acidophilus va
BSUDELIS
cọ
Họ.
Họ
TT
0800
1991.0149. 004 45
Bảng 3.14. Kết quả kiểm tra ý nghĩa các hệ số và tính tương thích của
phương trình hồi quy . . . . . . . . . . .
-- ¿5Ÿ + ©++S+*+E£EktEvZEEEEE+Eer+krkrrrrerrererskkerkerkei 46
Bang 3.15. Kết quả độ lặp lại quy trình định lượng Ƒ.acidophilus................ 46
Bảng 3.16. Kết quả độ lặp lại quy trình định lượng B.swbziis....................... 47
Bang 3.17. Kết quả độ đúng quy trình định lượng Ƒ.acidopbilus và
BiSUDUIIS
LG
TH
TH ng
TH
C39
v1 9xro 48
Bảng 3.18. Kết quả giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng L.acidophilus va
HD ĐT N LH
TH HE
S0 E010791701900190099008000000094 49
Bảng 3.19. Kết quả độ đặc hiệu, độ nhạy quy trình phát hiện vi khuẩn gây
1...
HH...
49
Qsrumeus
Ve
ata
A
+A
,
Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
N
KU
x
Bang 3.20. Két quả giới hạn phát hiện quy trình phát hiện vi khuẩn gây bệnh
sesaucsuessucsucsuceuesaucssssusnesnecsucsucsuecavesssssusassesuessucsusssessecsuesuscanssnecscseessecsessesseceueesses 50
Bang 3.21. Két quả phân lập 8 mẫu chế phẩm chứa Ƒ.acidophilws................ 51
Bảng 3.22. Kết quả định danh 8 mẫu chế phẩm chứa 7.acidophilus............. 52
Bảng 3.23. Kết quả định lượng § mẫu ché pham chtta L.acidophilus ........... 53
Bang 3.24. Kết quả phân lập 8 mẫu chế phẩm chứa B.subiils...................... 53
Bảng 3.25. Kết quả định danh 8 mẫu chế phẩm chứa B.swbilis.................... 54
Bảng 3.26. Kết quả định lượng 8 mẫu chế phẩm chứa B.subziiis.................. 54
Bảng 3.27. Kết quả phát hiện vi khuân gây bệnh trong 8 mẫu chế phẩm chứa
L.aeidophilus và 8 mẫu chế phâm chứa B.subtilis......................... cào
Xi
55
xttt
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
=
tt
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ khái qt tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật......... 9
Hình 2.1. Phương pháp khuếch tán ........................
2-2-2 2£ 5s++£xzzeezxezrsesrsree 27
Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc L.acidophilus trên mơi trường MRSA......... 37
Hình 3.2. Kết quả nhuộm Gram (a), nhuộm bào tử (b), nhuộm kháng acid (c)
I..2..2.....0080nẺn8n86
6.
e........
38
Hình 3.3. Kết quả phản ứng catalase (a), khả năng sinh acid lactic (b) của
L.aClODHÏÏUS...................
. SH
nh ng HH Hư V410111119118111
11k se rke 38
Hình 3.4. Kết quả phản ứng indol (a), khả năng di động (b) của
L.4CldODDHBÏÏHU..................
-
<<
HT HH TH
TH TH ng TH HT HH TỰ 1tr
38
Hình 3.5. Kết quả phản ứng lên men đường của E.acidopbilus..................... 39
Hình 3.6. Hình dạng khuẩn lạc B. subtilis trên mơi trường TSA..................... 40
Hình 3.7. Kết quả nhuộm Gram (a), nhuộm bào tử (b), nhuộm kháng acid (c)
Của Ð.SHPHÏÍN............... cọ.
HH TH HH
g r Hnvt 41
Hình 3.8. Kết quả phản ứng catalase (a), amylase (b) của B.subilis............. 4]
Hình 3.9. Kết quả phản ứng citrat (a), phản ứng VP (b) của B.subtilis......... 41
Hình 3.10. Kết quả khả năng chịu đựng NaCl 7% (a), kha nang sống ở 55 °C
(1...7. Me........................
42
Hình 3.11. Đồ thị tương quan giữa nồng độ vi khuẩn /.zcidopbilus (a) và
B.subiilis (b) với số khuẩn lạc trung bình đếm được ........................ -..----------: 46
xH
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
PHAN MO DAU
Vi sinh vật là những cơ thể sống hết sức nhỏ bé, tuy nhiên chúng lại đóng
vai trị vô cùng quan trọng trong đời sống con người. Sự phát triển của khoa
học giúp con người phát hiện ra vi sinh vật là tác nhân gây ra nhiều loại bệnh
nguy hiểm có thể gây tử vong. Những hiểu biết ngày càng sâu về vi sinh vật
đã cung cấp cho con người vũ khí chống lại nhiều bệnh tật do chúng gây ra.
Trong quá trình nghiên cứu lâu dài về các chỉ, loài vi sinh vật, các nhà khoa
học nhận thấy rằng có một bộ phận vi khuẩn khơng những khơng gây bệnh
mà cịn có tác dụng bảo vệ sức khỏe con người, đó là các probiotic.
Từ hàng ngàn năm nay, các sản phẩm thực phẩm lên men đã được con
người sử dụng, nhiều loại đã trở thành những món ăn truyền thống của các
quốc gia. Các loại vi sinh vật có lợi được phát hiện ngày càng nhiều. Chúng
khơng chỉ được sử dụng trong thực phẩm mà được dùng dưới nhiều dạng
khác nhau, nhất là dược phẩm probiotic. Ở Việt Nam và trên thế giới xuất
hiện rất nhiều loại dược phẩm và thực phẩm chức năng chứa lợi khuẩn đường
ruột với nhiều dạng bào chế khác nhau. Tuy nhiên, chất lượng thực sự của
những chế phẩm này vẫn còn là một dấu hỏi lớn.
Hiện nay ở nước ta việc quản lý chất lượng các chế phẩm men vi sinh trên
thị trường cịn chưa chặt chẽ. Nước ta chưa có bất kỳ một bộ tiêu chuẩn chung
nào để kiểm tra chất lượng chế phẩm probiotic. Đối với các chế phẩm men vi
sinh có 3 vấn đề cơ bản được đặt ra: thứ nhất, chế phẩm có đảm bảo đúng loại
vi sinh vật được công bố trên nhãn hay không? Thứ hai, lượng vi sinh vật
sống có đúng với số lượng ghi trên nhãn và có đủ theo yêu cầu hay khơng?
Thứ ba, chế phẩm có bị nhiễm các vi khuẩn gây bệnh hay khơng? Muốn kiểm
sốt đúng chất lượng các chế phẩm probiotic cần có quy trình đảm bảo giải
quyết triệt đề các vân dé vừa nêu. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đê tài
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
“Xây
dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm một số chế phẩm
có chứa vi khuẩn
probiotic đang lưu hành tại Cần Thơ”.
Mục tiêu tổng quát:
Xây dựng quy trình kiểm nghiệm ché pham chtta L.acidophilus va B.subtilis
bao gồm định danh, định lượng, khảo sát một số đặc điểm có lợi và kiểm
nghiệm chỉ tiêu vi sinh.
Mục tiêu cụ thể:
I. Xây
dựng quy trình phân lập; định danh, định lượng vi khuẩn
L.acidophilus va B.subtilis bang phuong phap truyén théng.
2. Khảo sát và xây dựng phương pháp đánh giá các đặc điểm có lợi của vi
khuan L.acidophilus va B.subtilis.
3. Xây dựng quy trình phát hiện vi khuẩn
gây bệnh gồm E.coli, Shigella,
Salmonella, S.aureus và P.aeruginosa bằng phương pháp cây trên đĩa thạch.
4. Ứng
dụng
quy trình đã thấm
định kiểm
nghiệm
một
số chế phẩm
probiotic chira vi khuẩn L.acidophilus và B.subfilis dạng đơn chủng đang lưu
hành.
Ý nghĩa khoa học:
Góp phần xây dựng chương trình giảng dạy mơn Kiếm nghiệm cho sinh
viên các lớp Dược.
Góp phần xây dựng tiêu chuẩn quốc gia về kiểm nghiệm các chế phẩm
probiotic.
|
Ý nghĩa thực tiễn:
Ứng dụng quy trình kiêm nghiệm ché pham probiotic dang lưu hành trên thị
trường, góp phần đảm bảo, nâng cao chất lượng cuộc sống cho người dân.
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Chương 1
TỎNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TONG QUAN VE PROBIOTIC
1.1.1. Dinh nghia probiotic
Thuật ngữ “probiotic” trong tiếng Anh có nghĩa là “cho sự séng” (for life)
và hiện tại nó được dùng để gọi tên những vi sinh vật có lợi cho con người và
động vật.
Probiotic được định nghĩa năm 2001 bởi một nhóm chun gia của Tổ chức
nơng lương thuộc Tổ chức Y tế thế giới: “Probiotic là những vi sinh vật sống
mà khi đưa vào cơ thể với lượng thích hợp sẽ mang lại những lợi ích về sức
khỏe cho vật chủ”. [23]
1.1.2. Các vỉ sinh vật được sử dụng làm probiofic
Các probiotic có thể là vi khuẩn, nắm mốc và nắm men, nhưng hầu hết
probiotic là vi khuẩn. Trong đó vi khuẩn sinh acid lactic (LAB) được sử dụng
phổ biến nhất. LAB là nhóm vi khuẩn Gram dương, khơng có độc tính, khơng
gây bệnh, có khả năng sản sinh acid lactic từ carbohydrat, vì thế chúng rất
hữu ích cho việc lên men thực phẩm. Nhóm LAB
bao gồm Streptococcus,
Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus
va Bifidobacterium.
Nhóm khơng sinh acid lactic bao g6m Bacillus va men Saccharomyces. Ngoai
ra một số nhóm vi sinh vật khác được sử dụng ít hơn. [49]
1.1.3. Cơ chế tác dụng của probiotic
Các probiotic có khả năng cạnh tranh chất dinh đưỡng sẵn có và tổng hợp
các chất kháng vi sinh vật như bacteriocin, giúp bảo vệ sinh vật chủ khỏi sự
phát triển quá mức của các tác nhân gây bệnh, đồng thời tăng cường khả năng
tự bảo vệ của vật chủ bằng cách tăng cường và điều hòa đáp ứng miễn dịch
nhày. Probiotic ảnh hưởng đến sự phát triển và hoạt tính của tế bào T điều
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
hòa, tạo hiệu quả lâm sàng rõ ràng trong quá trình miễn dịch thơng qua Tụl
và Tụ2, chịu trách nhiệm ngăn chặn tự miễn dịch với kháng thê đặc trưng mơ.
Bên cạnh đó probiotic cịn tác động trực tiếp thơng qua một số loại enzym và
làm thay đổi số lượng vi sinh vật tiết các chất có tác dụng sinh học. [13], [41]
Vi khuẩn probiotic bám vào tế bào ruột, ức chế sự gắn kết của các tác nhân
gây
bệnh
"với màng
nhày
ruột bằng
cách
sinh ra các
chất ức
chế như
bacteriocin, acid lactic và các dẫn chất oxy hóa chất độc. Trong đó sự sản
xuất hydro peroxid là quan trọng nhất vì có khả năng tiêu diệt hầu hết các tác
nhân gây bệnh. Sự sản xuất acid butyric bởi một số vi khuẩn probiotic trung
hòa hoạt tính các chất gây ung thư trong thực phẩm như nitrosamin. [26]
1.1.4. Tính an tồn của các probiofic
Cac loai Lactococcus va Lactobacillus hau hét thudc nhém vi sinh vat duge
xem
như
an tồn
(GRAS),
trong
khi
các
vi khuẩn
Enferococcus và một số chỉ khác thuộc nhóm LAB
chi
Streptococcus,
có một số tác nhân gây
bệnh cơ hội. LAB về bản chất đề kháng với nhiều kháng sinh. Sự đề kháng
kháng sinh gắn với plasmid là vấn đề cần quan tâm vì khả năng truyền sự đề
kháng cho các chủng vi khuẩn gây bệnh. Sự đề kháng của E/erococcus đối
với nhóm kháng sinh glycopeptid (vancomycin va teicoplanin) dac biét dang
lưu ý vi vancomycin 14 m6t trong những kháng sinh hiểm hoi có hiệu quả điều
trị các tác nhân gây bệnh đa kháng thuốc. [40]
Đến những năm đầu thế kỷ XXI, chưa có trường hợp nhiễm trùng lâm sàng
do sử dụng LAB probiotic gây ra. Một số ít trường hợp nhiễm nấm khi điều
trị bằng đường uống với men Šacecharomyces boulardii đã được báo cáo trong
một nghiên cứu của Pletinx và cộng sự năm 1995. Các bệnh lâm sàng do hiệu
ứng chuyển hóa có hại của probiotic ciing chwa cé bao cao. [1]
1.1.5. Tac dung cua probiotic
1.1.5.1. Điều trị bệnh đường tiêu hóa
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Điều trị tiêu chảy Tiêu chảy là bệnh thường gặp khi sử dụng
các kháng sinh phổ rộng
(ampicillin, amoxicillin, cephalosporin, clindamycin...). Trong một số trường
hợp, tac nhan gay bénh Clostridium difficile phat triển với số lượng lớn và
sinh chất độc gây tôn thương ruột. Thử nghiệm điều trị bằng Lacfobacillus
GG
và Saccharomyces
boulardii
cho thấy
có
hiệu
quả
giảm
tiêu chảy.
Lactobacillus GG bam dính với tế bào nhày, cạnh tranh chất dinh dưỡng và
sinh
các
chất
ức
chế
vi
khuẩn,
biến
đổi
-glucuronidase
trong
phân.
Saccharomyces boulardii san sinh protease bat hoat receptor déc tố A, làm
tăng mức độ tiết IgA và IgA kháng độc tố A, đồng thời cạnh tranh vị trí gắn ở
hồi tràng. Việc sử dụng đều đặn probiotic hoặc kết hợp probiotie với prebiotic
sẽ giảm nguy cơ và thời gian kéo dài của bệnh tiêu chảy ở trẻ em. [13], [18]
Điều trị bệnh viêm ruột
Bệnh viêm ruột (bệnh Crohn, viêm loét ruột) là một rối loạn tái phát mãn
tính liên quan tới rối loạn điều hịa vi sinh vật-vật chủ. Mặc dù kháng sinh có
vai trị trong điều trị biến chứng của bệnh viêm ruột, nhưng sử dụng kéo dài
kháng sinh là điều không mong muốn do nguy cơ ngộ độc, đề kháng kháng
sinh và mất cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Probiotic đang hứa hẹn là một
phương pháp an tồn kiểm sốt hệ vi sinh vật trong bệnh viêm ruột. Ở người,
đã có báo cáo về sử dụng thuốc thụt chứa hệ vi sinh vật ngoại sinh để làm
giảm bớt triệu chứng ở bệnh nhân viêm loét ruột. Trong viêm loét ruột, chủng
vi khuẩn
không
gây
bệnh
E.coli Nissle
có
hiệu
quả
tương
đương
với
mesalazin. [13], [22]
Hỗ trợ điều trị ung thư ruột
Sự tiêu hóa probiotic sống có hiệu quả kháng khối u với cơ chế là sự khử
độc tính các gen gây độc trong ruột. Một số nghiên cứu mới chỉ ra rằng hỗn
hop dẫn chất được phân lập từ sữa lên men với chủng L.bulgaricus va
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Streptococcus thermophilus co hiéu qua hơn trong sự khử hoạt tính các yếu tố
nguy cơ gây bệnh ung thư đại tràng so với các thành phân tế bào của vi
khuẩn. Các LAB đóng vai trị quan trọng trong sự ức chế hình thành khối u
ung thư ruột do tác động lên chức nắng chuyển hóa, miễn dịch và bảo vệ.
L.casei Shirota ức chế sự tổn thương ADN
methyl-N-nitro
va
N-nitrosoguanidin.
do tác nhân gây đột biến N-
7. acidophilus
và
hỗn
hợp
chứa
B.longum, L.gasseri, E.coli cé tac dung khang gen gay độc. [19], [25], [5S]
1.1.5.2. Tác dụng kháng khuẩn
Shigella,
Vibrio
cholera,
ching
E.coli
gây
bénh,
Campylobacter
va
Rotavirus là những nguyên nhân chính gây tử vong do nhiễm khuẩn ở các
nước đang phát triển. Các nghiên cứu cho thấy rằng probiotic có hiệu quả
điều trị một số bệnh nhiễm khuẩn như tiêu chảy cấp (do Rotavirus, do kháng
sinh hoặc tiêu chảy ở người đi du lịch), nhiễm khuẩn Helicobacter pylori va
một số vi khuẩn khác. Probiotic ngăn chặn sự nhiễm trùng do cải thiện môi
trường ruột (nồng độ acid hữu cơ và độ pH), điều hòa miễn dịch, kéo dài đời
sống các thực bào như đại thực bào và bạch cầu trung tính trong tủy xương và
tụy, ức chế sự bám dính vi khuân gây bệnh với biểu mô nhày. [32], [33]
1.1.5.3. Tác dụng đối với bệnh béo phì và tiểu đường
|
Nghiên cứu trên những bệnh nhân tiểu đường có mức đường huyết được
kiểm sốt tốt và khơng được kiểm soát cho thay sé long L.acidophilus trong
phân tăng đáng kể ở nhóm bệnh nhân tiểu đường khơng kiểm soát trong khi
chỉ số phần trăm thực bào giảm đáng kế ở nhóm này. Một số nghiên cứu cho
thấy chế độ ăn cũng có liên quan nhiều đến việc điều hòa cấu trúc hệ vi sinh
vật liên quan đến béo phì, cho thấy vai trị của vi sinh vật trong sự cân bằng
năng lượng đưới tác động của chế độ ăn. [21], [56]
1.1.5.4. Tác dụng dối với bệnh dị ứng
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Sử dụng lợi khuẩn đường ruột tạo thuận lợi cho sự phát triển miễn dịch và
sự dung nạp đường uống. Probiotic có tác dụng phục hồi tính thấm của đường
ruột và hệ vi sinh vật đường ruột. Chúng giúp tăng cường chức năng hàng rào
miễn dịch của ruột và giảm sự tạo thành các cytokin tiền viêm đặc trưng của
sự viêm dị ứng. Trong các thử nghiệm lâm sàng, probiotic hữu ích trong việc
điều trị đị ứng thực phẩm, viêm da dị ứng và viêm mũi dị ứng, đồng thời ngăn
chặn bước đầu các phản ứng đặc ứng. Một nghiên cứu cho thay L.rhamnosus
có thể ngăn chặn tình trạng q nhạy cảm trên mơ hình động vật. [44], [47]
1.1.5.5. Một số tác dụng khác
Một số nghiên cứu cho thấy probiotic cịn có một số tác dụng khác như tác
động đến khả năng chuyển hóa của hệ vi khuẩn đường ruột trên in vitro, tác
động tích cực đến hồi tràng trong hội chứng ruột ngắn, phục hồi hệ vi sinh
đường ruột và tăng cường enzym gan ở người bị bệnh gan do rượu, phục hồi
các
thông
số
huyết
học
bị thay
đổi
và tăng
cường
miễn
dịch
chống
Edwardsiella tarda [14], [27], [34], [43]. Sử dụng probiotic tạo hiệu quả có
lợi trên da thông qua cơ chế tác dụng trực tiếp trên da [28]. Chế độ ăn giàu
probiotic có tác dụng giảm cholesterol tồn phần và cholesterol có hại trong.
huyết tương [57].
1.1.6. Các tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật probiofic [23]
Các tiêu chuẩn để đánh giá hoạt tính của vi sinh vật probiotic dựa trên cơ SỞ
sự ức chế tăng trưởng vị sinh vật chỉ thị của các chủng probiotic.
1.1.6.1. Khả năng chịu acid
pH của dạ dày thường rất thấp do thành phần chính của dịch dạ dày là acid
hydroclorid. Chính vì vậy các vi khuẩn probiotic cần phải chịu được điều kiện
pH thấp hay dung nạp được với acid trong dạ dày và thì mới có thể phát huy
được tác dụng probiotic của chúng. Để kiểm tra khả năng này, người ta nuôi
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
cấy các vi khuẩn probiotic trên mơi trường thích hợp với điều kiện pH là 1,5; |
2; 3 và đối chứng trên môi trường thông thường.
1.1.6.2. Khả năng chịu muỗi mật
Có 2 loại muối mật là glycocholat natri và taurocholat natri. Muối mật có
chức năng quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu lipid ở ruột non kéo theo
sự hấp thu các vitamin tan trong lipid nhu A, D, E, K. Khi
xuống
đến hồi
tràng, 95% muối mật được tái hấp thu rồi theo tĩnh mạch chủ trở về gan và
được tái bài tiết, gọi là chu trình gan-ruột, cịn 5% muối mật được đào thải
theo phân có tác dụng giữ nước trong phân và duy trì nhu động ruột già.
Chính vì thế mà khả năng chịu được muối mật cũng là một điều kiện để đánh
giá hoạt tính của probiotic, địi hỏi các vi khuẩn probiotic khơng gây ảnh
hưởng tới lượng muối mật trong ruột.
Để kiểm tra khả năng này, tương tự như kiểm tra khả năng chịu pH thấp,
người ta dùng mơi trường thích hợp có bổ sung 0,15%; 0,3% và 0,5% muối
mật và đối chứng trên môi trường thơng thường.
1.1.6.3 Khả năng chịu ensym tiêu hóa
Enzym tiêu hố trong đường ruột là một loại enzym đo cơ thể con người sản
sinh ra có tác dụng hỗ trợ chuyển hóa các chất đạm, chất béo trong thức ăn.
Enzym tiêu hoá là những chất được sản sinh tại các tuyến tiêu hóa rồi đỗ vào
dạ dày, ruột, giúp biến đổi thức ăn thành nhũ trấp để nhung mao ruột hấp thụ
vào máu, ni dưỡng cơ thể. Mỗi tuyến có vai trò chức năng riêng. Dịch dạ
dày và pepsin giúp tiêu hóa protid và điều này có ảnh hưởng đến việc bỗ sung
probiotic vào cơ thê.
Đề khảo sát khả năng chịu enzym tiêu hóa, người ta bố sung các enzym này
vào môi trường MRS nuôi cấy vi khuẩn probiotic, các bước còn lại tiến hành
như thử nghiệm về khả năng chịu acid và muối mật, đo độ đục xác định sinh
khôi tê bào so với mâu đôi chứng không bô sung enzym.
:
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
1.1.6.4. Khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh
Để có tác dụng trên hệ vi khuẩn đường ruột, một điều quan trọng là các
probiotic phải có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh. Có rất nhiều.
nghiên cứu về các phương pháp kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật của vi
khuẩn probiotic. Điển hình nhất là dựa trên khả năng sinh chất có tác dụng
ngăn chặn, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh. Các chất này
thường là những chất chuyển hóa của probiotic như bacteriocin, HạO; acid
lactic,... Chúng có vai trị quan trọng trong việc chống lại các vi khuẩn gây
bénh nhu Salmonella, E.coli, Helicobacter,....
Probiotic
|
|
t
1
||
tiêu hóa |
| gây bệnh| ¡
|
irs
:
+
jin vivo
|
}*
|
I
||
"
,
|
MOE
mg
Hình 1.1. Sơ đồ khái quát tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật
1.1.7. Một số loại chế phẩm probiotic trên thị trường
1.1.7.1. Thực phẩm lên men
Thực phẩm lên men được sử dụng từ rất lâu ở nhiều nơi trên toàn thế giới.
Các thực phẩm này có thể chứa vơ số các vi sinh vật probiotic. Nhiều sản
phẩm lên men là thực phẩm truyền thống của các quốc gia trên thế giới. [9]
1.1.7.2. Thực phẩm chức năng
Những nghiên cứu thành công về hiệu quả của probiotic cho ra đời nhiều
thực phẩm chứa probiotic Lactobacillus va cac LAB
khac. Vào những năm
1940, sữa bifidus được dùng để chữa trị cho trẻ em suy dinh dưỡng. Số lượng
thực phẩm chức năng chứa probiotic ngày càng tăng trên toàn thế giới. [9]
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
1.1.7.3. Dược phẩm
Trên thị trường, rất nhiều được phẩm probiotic cho người sử dụng được bày
bán rộng rãi. Mục tiêu chính của những sản phẩm này nhằm đưa các vi khuẩn
probiotic định cư ở ruột trong suốt quá trình điều trị một số bệnh như những
rỗi loạn đường dạ dày-ruột (chứng táo bón kinh niên, chứng viêm tá tràng
kinh niên...). Hiện nay trên thị trường Việt Nam cũng như thế giới ngày càng
xuất hiện nhiều loại được phẩm với nhiều dạng bào chế khác nhau. [9]
1.2. TONG QUAN VE L.ACIDOPHILUS VA B.SUBTILIS
1.2.1. Lactobacillus acidophilus
—
1.2.1.1. Chi Lactobacillus
Lactobacillus duoc xem là chỉ lớn nhất trong các chỉ của vi khuẩn sinh acid
lactic. Lacfobaciiius là những trực khuẩn Gram dương, khơng hình thành bào
tủ, không kháng acid, không sinh catalase và không di động [19]. Chúng là
những vi khuẩn ky khí tùy nghi, thường phát triển chậm trong khơng khí. Về
nhu cầu dinh dưỡng, Ứacfobaeilius cần chế độ dinh dưỡng đặc biệt. Chúng
phát triển tốt trong môi trường nhiều phức chất. Nhiệt độ phát triển tối ưu là
_30-40 °C, nhưng chúng cũng có thé sinh trưởng trong phạm vi 5-53 °C. Chúng
có khả năng sống được trong mơi trường có tính acid, pH tối ưu cho sự phát
triển là 5,5-5,8 nhưng nhìn chung có thể sinh trưởng ở pH < 5. [12]
1.2.1.2. Lồi L.acidophilus
Vị trí trong hệ thống phân loại [38]
Giới:
—_ Bacteria
Ngành:
Firmicutes
Lớp:
Bacilli
Bộ:
Lactobacillales
Họ:
Lactobacillaceae
Chi:
Lactobacillus
Loai:
L.acidophilus
10
(Mruxr.s Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học
Đặc điểm
L.acidophilus được định danh là B.acidophilus bởi Moro (năm 1900), sau
đó được định danh lại là L.acidophilus nam
1970 bởi Hansen và Mocquot.
Tên gọi acidophilus nghĩa là ưa acid, bắt nguồn tir chit acidum
(acid) va
phios (ưa thích). Vì khuẩn Z.aeidopbilus là những tế bào hình que khơng di
động đầu trịn, kích thước 0,6-0,9 x 1,5-6 um, thường đứng riêng lẻ, thành
từng cặp hoặc chuỗi ngắn. Chúng thường được phân lập từ đường tiêu hóa
người và động vật, khoang miệng, nước bọt, bột chua và rượu vang. Nhu cầu
dinh dưỡng cần thiết bao gồm canxi pantothenat, acid folic, niacin va
riboflavin. [15]
Tinh chat sinh héa
L.acidophilus khơng có khả năng di động, phản ứng catalase âm tính. Lên
men
sinh acid nhưng khơng
sinh hơi các loại đường plucose,
sucrose và
lactose. Lên men sinh acid từ đường glucose, galactose, fructose, mannose,
maltose, lactose và sucrose. Một số canh cấy lên men raffinose và trehalose
và có hoạt tính yếu trên dextrin.
Khơng
có khả năng
lên men
xylose,
arabinose, rhamnose, glycerol, mannitol, sorbitol, dulcitol va inositol. [15]
L. acidophilus c6 kha nang tiết các chất diện hoạt ức chế một số vi khuẩn
nhu S.aureus va S.epidermidis. Mot số chủng L. acidophilus cé protein bé mặt
kháng một số enzym phân hủy protein nhưng nhạy với pronase, thành phần
amino acid khoảng 30% amino acid ky nước, tạo tính ky nước cho tế bào.
Nếu loại bỏ màng protein bề mặt với pronase sẽ làm mat đi bản chất ky nước
của tế bào. [20], [37], [48]
1.2.2. Bacillus subtilis
1.2.2.1. Chi Bacillus
Tu Bacillus duge su dung
lần đầu tiên từ Nhật Bản bắt nguồn từ chữ
“Bacillus natto” thudc ngành thực phẩm
11
lên men
của gạo rơm, đậu nành
